CN101012151B - 一种从发酵液中分离1,3-丙二醇的双水相萃取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及从发酵液中提取分离1，3-丙二醇的双水相萃取技术。本发明的特征在于向1，3-丙二醇的发酵液中加入无机盐和亲水有机物形成新型双水相，从而达到萃取分离发酵液中1，3-丙二醇的目的。本发明的效果和益处是解决了目前发酵法生产1，3-丙二醇分离工艺中存在的产品难以分离、成本高等问题。该方法工艺简单，分离时间短，分离成本低，是一种具有工业应用前景的1，3-丙二醇分离方法。

Description

一种从发酵液中分离1，3-丙二醇的双水相萃取方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及到微生物发酵液的分离技术，特别涉及到从发酵液中分离1，3-丙二醇的方法。

背景技术

1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，与乙二醇、1，2-丙二醇和1，4-丁二醇有着同样的用途，但它与对苯二甲酸合成的新型聚酯材料——聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)具有许多聚酯材料所不具备的优良特性，如尼龙样的弹性恢复、抗紫外、臭氧及氮氧化物的着色性、低静电、低水吸附、全色范围内无需添加任何特殊化学品而呈现出的良好的连续印染性及可生物降解性等。这些都表现出了1，3-丙二醇美好的应用前景，但其昂贵的价格却阻碍了其应用。自从发酵法生产1，3-丙二醇成为可能以来，科研工作者一直努力探索一条既省事又可降低成本的分离方法。

目前从微生物发酵液中提取分离1，3-丙二醇，多采用带菌发酵液经高速离心或经膜(如纤维膜)过滤分离细胞，然后通过萃取、离子交换树脂或分子筛吸附、减压蒸馏等方法提取1，3-丙二醇。Mi-Hae Cho等用有机萃取法(ProcessBiochemistry，2006，41：739-744)对1，3-丙二醇进行分离研究，所用萃取剂为乙酸乙酯，分离对象为模拟发酵液。向波涛等研究了萃取法(清华大学学报(自然科学版)，2001，41(12)：53-55)自稀溶液中分离1，3-丙二醇的过程，结果表明普通有机萃取(用氯仿作萃取剂)和络合萃取法(用磷酸三丁酯(TBP)、辛酸、己酸等作络合剂)均不能有效地分离1，3-丙二醇。Baltycka等人报导过反应萃取法(Biotechnology Progress，2000，16：76-79)，其一般步骤是在模拟发酵液中加入醛，使其与1，3-丙二醇缩合，用邻二甲苯或甲苯或乙苯萃取，然后通过水解得到1，3-丙二醇。刘德华等(CN1634823A)用丁醛等非水溶性醛通过缩醛反应萃取发酵液中的1，3-丙二醇。反应萃取需要多步操作，工艺复杂，操作条件不易控制，分离效率较低。另外由于反应萃取使用大量醛类物质，其残余醛对1，3-丙二醇的聚合反应产生不利影响，因此其工业化前景不容乐观。

双水相萃取技术始于20世纪60年代，双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于水中并达到一定浓度时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的分子空间阻碍作用，无法相互渗透，从而形成不互溶的两相，称为双水相，其常用的体系为聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/无机盐等。由于双水相萃取条件温和，容易放大，可连续操作，因此该技术已成功地应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化中，也有抗生素、中药有效成分等小分子分离方面的尝试。但由于水溶性高聚物大多黏度较大，难以挥发，需要反萃取，使后续的分离较为麻烦，且所用高聚物一般价格比较昂贵，使工业化应用受到限制。近几年一些研究者在进行溶剂析出结晶研究时发现，在适当温度条件下，如果体系中无机盐、有机溶剂和水的浓度适当，这类体系中的盐可能不会析晶，而是出现液液分相现象。如果所用有机溶剂是亲水的低分子物质，如甲醇、乙醇、丙酮等，就可以形成一种新型的双水相萃取体系。与传统的高分子聚合物双水相体系相比，这种新型的双水相体系分相更清晰，成本更低，萃取相不含黏度大、难处理的聚合物。尽管这方面研究在国内外刚刚起步，但已表现出良好的分离性能，如Louwrier用磷酸氢二钾/乙醇体系萃取牛血清蛋白、α-酪蛋白、核糖核酸酶等生物质大分子(Biotechnology Techniques，1998，12(5)：363-365)，李全民、高云涛等人用丙酮/氯化钠体系萃取金属络合物或金属离子(应用化学，2001，18(3)：241-243；分析测试学报，2002，21(3)：75-77)均得到相当满意的结果。亲水有机物/无机盐双水相体系在发酵液中多元醇的分离方面尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是针对目前从发酵液中分离1，3-丙二醇存在的分离工艺复杂，分离能力小，总体收率低，成本高等问题，提供了一种采用双水相萃取的方法从发酵液中分离1，3-丙二醇。

本发明的技术方案：

1，3-丙二醇发酵液可以用絮凝、过滤、微滤或离心的方法进行预处理，除去菌体得到清液，也可以是未经预处理的发酵原液，或者是经过浓缩的原液或清液，其中1，3-丙二醇的浓度范围为30-700g/L。向上述发酵液或清液中添加一种或二种以上可溶性无机盐，所加盐为固体或浓盐溶液，加盐后发酵液中盐的饱和度达到10％～100％；然后加入醇类或酮类亲水性有机物，含盐发酵液和亲水性有机物的体积比为1∶0.1～1∶5。

一种或二种以上可溶性无机盐是氯化钠、硫酸铵、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等。

醇类或酮类亲水性有机物为乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇或丙酮等。

亲水性有机物可以选择甲醇，使用甲醇时，发酵液中添加无机盐的阴离子为三价；阴离子为三价的无机盐为磷酸氢二钾/钠、磷酸钾/钠等或其混合物。

将此含盐发酵液和亲水性有机物的混合液充分混合，静置至分相，上相即为富含1，3-丙二醇的溶剂相或萃取相，下相为富盐相或萃余相。用蒸馏或精馏法从溶剂相或萃取相中回收溶剂，并得到1，3-丙二醇粗品和固体盐；富盐相或萃余相经蒸馏浓缩得到的浓盐液可以循环使用，也可以加入回收的有机溶剂使盐结晶析出。

萃取操作方式可以是间歇的，也可以是连续的；对于分配系数较小的体系可以采用多级萃取的方式。

如果发酵液不经预处理直接进行萃取操作，这时往往在上下相之间形成一个富含菌体的固相层，有时也在下相底部形成固相层，这个系统被称为多相系统。

萃取操作一般在低于溶剂易挥发的温度下进行。为了使1，3-丙二醇尽可能多地分配到上相，蛋白、核酸、多糖等大分子和无机盐尽可能保留在下相，可以调节体系的pH值或者向体系中添加络合剂。pH值范围一般在3-10之间，络合剂可以是无机盐类，也可以是有机化合物，如磷酸三丁酯(TBP)、辛酸、己酸等。

本发明的效果和益处：

克服了目前从微生物发酵液中提取分离1，3-丙二醇工艺存在的诸多弊端，使工艺得以简化，分离时间短，成本降低，经济可行。具体表现在：亲水性有机溶剂和无机盐形成的双水相对1，3-丙二醇有较好的萃取效果，解决了传统萃取剂萃取效率较低的难题；双水相萃取可以直接处理发酵液，免除了菌体分离步骤，并且可以将发酵液中大量的核酸、蛋白、多糖除掉，解决了超滤除杂动力消耗较大、需要对膜进行清洗、菌体浓缩液中残留较多的1，3-丙二醇无法回收等问题。

具体实施方式

以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。

本实施例中所用克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，菌种保藏号：1.1736。培养基中必须具备微生物生长所需的营养成分，如甘油或葡萄糖等碳源，酵母浸膏或酵母粉等氮源，钠、钾、氨、镁、钙等阳离子和磷酸根、硫酸根、氯离子等阴离子，以及锌、铁、锰、铜、钴、硼、和钼等微量元素。发酵液是采用克雷伯氏杆菌批式流加甘油发酵得到的，其中1，3-丙二醇的浓度为41g/L。

实施例一：

用切割分子量为5,000道尔顿、有效面积为1.5m²的乙酸纤维素超滤膜(日本NIPRO公司的产品，型号FB-150AGA)处理发酵液，得到澄清的滤液。取100mL滤液，加入70g的三水磷酸三钾，盐溶后得127ml溶液，再加入50mL 95％乙醇，混合、静置、分相，得萃取相87mL，萃余相88mL。1，3-丙二醇的分配系数为6.29，回收率为86.2％。

实施例二：

取2100mL发酵液，加入750g硫酸铵，待盐溶解后再加入1100mL的95％乙醇，混合、静置，体系分为三相。上相体积为1200mL，其中1，3-丙二醇含量较高；中间相主要为菌体和蛋白，体积为300mL；下相中盐浓度较高，体积为2000mL。将中间相取出在3000转/分下低速离心后又分为三相，上相中1，3-丙二醇含量较高，体积为130mL；中间相为菌体和蛋白，体积为40mL；下相中盐浓度较高，体积为130mL。将两个上相合并得清液1330mL，即为萃取相，1，3-丙二醇的分配系数为1.84。将两个下相合并，加入95％乙醇1000mL，混合静置后得富含1，3-丙二醇的萃取相1900mL，萃余相1230mL，1，3-丙二醇的分配系数为3.12，两次萃取1，3-丙二醇的总回收率为92.0％。

Claims (6)

1.一种从发酵液中分离1，3-丙二醇的双水相萃取方法，其特征是向1，3-丙二醇的发酵液中添加一种或二种以上可溶性无机盐以及亲水有机物形成双水相体系；加盐后发酵液中盐的饱和度达到10％～100％，亲水性有机物为亲水性的醇类或酮类；含盐发酵液与亲水性有机物的体积比为1∶0.1～1∶5；亲水性的醇类或酮类为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇或丙酮。

2.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离1，3-丙二醇的双水相萃取方法，其特征是其中的发酵液是未经预处理含有菌体的发酵液、未经预处理含有菌体的浓缩液、去除菌体的清液或去除菌体的浓缩液，发酵液中1，3-丙二醇的浓度为30-700g/L。

3.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离1，3-丙二醇的双水相萃取方法，其特征是可溶性无机盐为氯化钠、硫酸铵、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。

4.根据权利要求1所述一种从发酵液中分离1，3-丙二醇的双水相萃取方法，其特征是萃取时pH值为3-10。

5.根据权利要求1所述一种从发酵液中分离1，3-丙二醇的双水相萃取方法，其特征是双水相萃取是间歇的或连续的。

6.根据权利要求3所述一种从发酵液中分离1，3-丙二醇的双水相萃取方法，其特征是可溶性无机盐为固体的或浓盐溶液。