CN103278585A - 一种尿液中肌氨酸的衍生化方法 - Google Patents
一种尿液中肌氨酸的衍生化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103278585A CN103278585A CN2013101851247A CN201310185124A CN103278585A CN 103278585 A CN103278585 A CN 103278585A CN 2013101851247 A CN2013101851247 A CN 2013101851247A CN 201310185124 A CN201310185124 A CN 201310185124A CN 103278585 A CN103278585 A CN 103278585A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ampoule bottle
- urine
- derivatization method
- derivatization
- supernatant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明属于分析化学领域，涉及一种尿液中肌氨酸的衍生化方法。具体步骤为：将尿液离心，取上清液，用酸调节上清液的pH值为4-5；上清液加入阳离子交换柱中，用去离子水充分清洗；用氨水洗脱阳离子交换柱，用安瓿瓶收集洗脱液；在45-55℃下用氮气吹干；加入甲苯、多聚甲醛固体颗粒和丙烯酸丁酯衍生化试剂，将安瓿瓶封口后混合均匀，随后置于80-150℃下烘箱中反应15-30min。冷却至室温后，加入含叔丁基茴香醚内标的甲醇溶液，混合均匀，取1μL进行气相色谱-质谱检测。具有很好的创新性，克服了传统硅烷化衍生方法的缺点。反应过程快速、简单、条件容易控制，反应产物单一，稳定性强。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体地涉及一种尿液中肌氨酸的衍生化方法。
背景技术
肌氨酸即N-甲基甘氨酸，又名2-甲氨基乙酸，化学式为CH3NHCH2COOH。肌氨酸有甜味，溶于水。它是胆碱自然代谢为甘氨酸过程中的一个中间体。肌氨酸是蛋白质的重要组成部分，在活细胞代谢过程中起到非常重要的作用。肌氨酸在人体内的基本功能为：（1）增加肌肉细胞的含水量，当所有的肌肉细胞都吸收较多量的水分而增加容积时，肌肉会变得更加饱满、有形；（2）肌氨酸可帮助肌肉细胞储存能量，人体的肌纤维中含有未键结的肌氨酸和带有磷酸根的磷酸肌氨酸，其中磷酸肌氨酸约占了三分之二总肌氨酸的含量。当肌肉收缩产生运动时，身体会利用三磷酸腺苷(ATP)当作其能量来源，但由于人体的肌肉细胞只可提供低于十秒急速收缩所需的ATP能量，必须要有更多的ATP产生才能维持持续的运动，此时存于肌肉中的磷酸肌氨酸会提供磷酸根而使得ATP再次生合成。因此，当肌肉内的肌氨酸较多时，肌肉便有更大的潜在力量得以发挥。
Sreekumar等研究发现，在转移性前列腺癌样本中，有79％样本肌氨酸的水平是显著增高，在局限性前列腺癌样本中有42％的样本肌氨酸水平增加。但在良性前列腺组织中，未测到肌氨酸。这表明在监测前列腺癌进展和侵袭过程中，肌氨酸具有作为前列腺癌标志的潜能。
因此，因此对尿液中的肌氨酸进行检测可提高前列腺癌诊断的敏感性及特异性，有非常重要的意义。
传统的分析肌氨酸的方法主要有氨基酸分析仪、电位滴定分析、高效液相色谱和液/质联用法，这些方法受价格昂贵、灵敏度、选择性等的限制，无法实现普遍应用。气相色谱-低分辨率质谱联用仪（GC-LRMS）因其通用性、可靠性和高性价比，广泛装备于各类医疗检测室和科研实验室，是最容易实现广泛应用的仪器。在常用的GC/MS分析肌氨酸方法中，多采用硅烷化衍生化方法，此衍生化方法干扰多，专一性差，且衍生化产物不稳定。因此开发一种基于GC/MS方法的新型衍生化方法以测定尿样代谢物中肌氨酸成为现实的需要，对于前列腺癌患者的早期诊断和治疗有着重大的现实意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种尿液中肌氨酸的衍生化方法。
本发明提出的一种尿液中肌氨酸的衍生化方法，具体步骤如下：
（1）将尿液离心，取上清液，用酸调节上清液的pH值为4-5；
（2）将步骤（1）所得的上清液加入阳离子交换柱中，用去离子水充分清洗；
（3）用氨水洗脱步骤（2）中的阳离子交换柱，用安瓿瓶收集洗脱液2-3mL；
（4）步骤（3）所得的洗脱液在45-55℃下用氮气吹干；
（5）在步骤（4）所得的产物中加入50-200 μL甲苯、1-5 mg多聚甲醛固体颗粒和10-30 μL丙烯酸丁酯衍生化试剂，将安瓿瓶封口后混合均匀，随后置于80-150℃下烘箱中反应15-30 min；
（6）步骤（5）所得产物冷却至室温后，加入含叔丁基茴香醚内标的甲醇溶液，混合均匀，取1 μL进行气相色谱-质谱检测。
本发明中，步骤（1）中使用的酸为HCl，浓度是2 mol/L。
本发明中，步骤（5）中烘箱的温度为110-120℃，反应时间为 20 min。
本发明中，步骤（6）中含叔丁基茴香醚内标的甲醇溶液的浓度是0.1μg/μL。
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种新的衍生化反应。该反应是利用肌氨酸与多聚甲醛在甲苯试剂作用下生成1,3-偶极体，1,3-偶极体与丙烯酸丁酯环加成为五元杂环化合物。此衍生反应生成的杂环化合物挥发性好，稳定性强，且由于衍生物是环状化合物，质谱图中的分子离子峰强，易于辨认。
本发明中，肌氨酸的1,3-偶极加成衍生化的反应机制为：
在本发明中，提出了一种新的衍生化方法用于尿液中肌氨酸的定性定量检测，该发明具有很好的创新性，克服了传统硅烷化衍生方法的缺点。反应过程快速、简单、条件容易控制，反应产物单一，稳定性强。同时本发明采用了气相色谱-质谱联用的分析检测技术，具有毛细管色谱的高分离和质谱的精确鉴定等特点，能够准确地对肌氨酸进行定性定量分析，弥补了目前使用的其他检测方法所面临的如仪器昂贵和分析成本较高等缺点，特别适合尿液中肌氨酸的快速定性定量分析。
本发明的有益效果在于：本发明提出的1,3-偶极加成衍生化方法，不仅方便快速、条件易控，而且产物稳定，具有良好的气相色谱-质谱行为，可以很好地解决传统的硅烷化衍生方法在鉴定肌氨酸所存在的反应产物稳定性差及容易受到丙氨酸衍生物干扰的缺点。
附图说明
图1为实施例1中的色谱图；
图2为实施例2中的质谱图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1
取健康人群尿样置于-4℃下保存。样品解冻后8000r离心5分钟，取上清液10mL放入试管中，用2 mol/L的HCl调节尿样pH至4-5，加入到已经活化好的阳离子交换柱（Dowex 50W-X8）中。先用去离子水清洗交换柱以除去各种杂质，再用5 mL浓度为2 mol/L的氨水将吸附在柱上的肌氨酸洗脱，用安瓿瓶接取3mL洗脱液，50℃下氮气吹干供下一步分析使用。
在上述吹干的安瓿瓶中加入200 μL甲苯，适量的5 mg多聚甲醛固体颗粒和适量30 μL丙烯酸丁酯衍生化试剂，煤气灯上封口后涡旋振荡混合均匀，随后置于120℃下烘箱中反应20 min。
反应冷却至室温后，加入一定量的叔丁基茴香醚内标的甲醇溶液。混合均匀后，取1 μL进行常规的气相色谱-质谱检测。
气相色谱-质谱检测的检测条件如下：
检测仪器： Thermo Focus DSQ气相色谱-质谱联用仪
色谱柱： HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）石英毛细管色谱柱
柱温： 100℃(保持2min) ～ 300℃ (保持5min)
升温速度： 20℃/min
气化室温度： 250℃
载气(流量)： He，纯度99.999% (1.0 mL/min)
进样量： 1 μL
分流比： 10:1
质谱检测器： EI源，电离电压70eV，离子源温250℃
检索谱库： NIST库
扫描质量范围： 41～350 amu
扫描速度： 0.5秒/次
检测结果：如附图1和图2所示，图1是检测所得的色谱图，其中，保留时间为5.80分钟时为肌氨酸衍生物，保留时间为7分钟时为内标。图2是检测所得的质谱图。经内标工作曲线法计算，尿样中的肌氨酸的含量为42 μg/mL。
上述实例表明，本发明提出的1,3-偶极加成衍生化结合GC/MS 法测定尿液中肌氨酸，是一种可靠而实用的检测方法，为前列腺癌患者尿液代谢物中的生物标志物—肌氨酸的检测提供了有效的分析手段，为前列腺癌症的早期诊断提供数据支持。
实施例2
取健康人群尿样置于-4℃下保存。样品解冻后8000r离心5分钟，取上清液5 mL放入试管中，用2 mol/L的HCl调节尿样pH至4-5，加入到已经活化好的阳离子交换柱（Dowex 50W-X8）中。先用去离子水清洗交换柱以除去各种杂质，再用5 mL浓度为2 mol/L的氨水将吸附在柱上的肌氨酸洗脱，用安瓿瓶接取2mL洗脱液，50℃下氮气吹干供下一步分析使用。
在上述吹干的安瓿瓶中加入100 μL甲苯， 2 mg多聚甲醛固体颗粒和15μL丙烯酸丁酯衍生化试剂，煤气灯上封口后涡旋振荡混合均匀，随后置于150℃下烘箱中反应15 min。
反应冷却至室温后，加入10μL的叔丁基茴香醚内标的甲醇溶液。混合均匀后，取1 μL进行常规的气相色谱-质谱检测
气相色谱-质谱检测的检测条件如下：
检测仪器： Thermo Focus DSQ气相色谱-质谱联用仪，检测条件与实施例1相同。
检测结果：经内标工作曲线法计算，尿样中的肌氨酸的含量为38 μg/mL。
实施例3
取健康人群尿样置于-4℃下保存。样品解冻后8000r离心5分钟，取上清液2 mL放入试管中，用2 mol/L的HCl调节尿样pH至4-5，加入到已经活化好的阳离子交换柱（Dowex 50W-X8）中。先用去离子水清洗交换柱以除去各种杂质，再用3 mL浓度为2 mol/L的氨水将吸附在柱上的肌氨酸洗脱，用安瓿瓶接取2mL洗脱液，50℃下氮气吹干供下一步分析使用。
在上述吹干的安瓿瓶中加入50 μL甲苯，1 mg多聚甲醛固体颗粒和10μL丙烯酸丁酯衍生化试剂，煤气灯上封口后涡旋振荡混合均匀，随后置于80℃下烘箱中反应30 min。
反应冷却至室温后，加入10μL的叔丁基茴香醚内标的甲醇溶液。混合均匀后，取1 μL进行常规的气相色谱-质谱检测
气相色谱-质谱检测的检测条件与实施例1相同。
检测结果：经内标工作曲线法计算，尿样中的肌氨酸的含量为35 μg/mL。
Claims (4)
1.一种尿液中肌氨酸的衍生化方法，其特征在于具体步骤如下：
将尿液离心，取上清液，用酸调节上清液的pH值为4-5；
将步骤（1）所得的上清液加入到阳离子交换柱中，用去离子水充分清洗；
用氨水洗脱步骤（2）中的阳离子交换柱，用安瓿瓶收集洗脱液2-3mL；
步骤（3）所得的洗脱液在45-55℃下用氮气吹干；
在步骤（4）所得的产物中加入50-200 μL甲苯、1-5 mg多聚甲醛固体颗粒和10-30 μL丙烯酸丁酯衍生化试剂，将安瓿瓶封口后混合均匀，随后置于80-150℃下烘箱中反应15-30 min；
步骤（5）所得产物冷却至室温后，加入含叔丁基茴香醚内标的甲醇溶液，混合均匀，取1 μL进行气相色谱-质谱检测。
2.根据权利要求1所述的一种尿液中肌氨酸的衍生化方法，其特征在于步骤（1）中使用的酸为HCl，浓度是2 mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种尿液中肌氨酸的衍生化方法，其特征在于步骤（5）中烘箱的温度为110-120℃，反应时间为 20 min。
4.根据权利要求1所述的一种尿液中肌氨酸的衍生化方法，其特征在于步骤（6）中含叔丁基茴香醚内标的甲醇溶液的浓度是0.1μg/μL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310185124.7A CN103278585B (zh) | 2013-05-20 | 2013-05-20 | 一种尿液中肌氨酸的衍生化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310185124.7A CN103278585B (zh) | 2013-05-20 | 2013-05-20 | 一种尿液中肌氨酸的衍生化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103278585A true CN103278585A (zh) | 2013-09-04 |
| CN103278585B CN103278585B (zh) | 2014-08-06 |
Family
ID=49061165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310185124.7A Expired - Fee Related CN103278585B (zh) | 2013-05-20 | 2013-05-20 | 一种尿液中肌氨酸的衍生化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103278585B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113480587A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-10-08 | 徐州工程学院 | 一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 |
-
2013
- 2013-05-20 CN CN201310185124.7A patent/CN103278585B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (6)
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113480587A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-10-08 | 徐州工程学院 | 一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 |
| CN113480587B (zh) * | 2021-05-20 | 2024-05-03 | 湖南合健生物科技有限公司 | 一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103278585B (zh) | 2014-08-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104330515B (zh) | 测定13c标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法 | |
| CN103278585B (zh) | 一种尿液中肌氨酸的衍生化方法 | |
| CN106932502B (zh) | 一种索拉菲尼中4-氯-2-吡啶甲酸甲酯含量的测定方法 | |
| CN110609106B (zh) | 利用超高效液相色谱-质谱联用技术检测白芍中11种有机磷农药残留的方法 | |
| CN101762517A (zh) | 同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)及同型半胱氨酸浓度测定方法 | |
| Walker et al. | Application of gas chromatography–tandem mass spectrometry (GC/MS/MS) for the analysis of deuterium enrichment of water | |
| Todua et al. | Stepwise extraction, chemical modification, GC–MS separation, and determination of amino acids in human plasma# | |
| Jia et al. | Quantitative determination of helicid in rat plasma by liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry and its application to preliminary pharmacokinetic studies | |
| Mathews | Quantitation of Glutathione and Oxidized Glutathione Ratios from Biological Matrices Using LC-MS/MS | |
| CN103175919A (zh) | 尿液中(s)-nnal和(r)-nnal的气相色谱-质谱-质谱联用检测方法 | |
| CN107290449A (zh) | 一种纺织品中三（2‑氯乙基）磷酸酯快速筛选检测方法 | |
| CN105717210A (zh) | 一种蔬菜和水果中硅噻菌胺残留量的测定方法 | |
| Tea et al. | Determination of the natural abundance δ15N of taurine by gas chromatography–isotope ratio measurement mass spectrometry | |
| CN104330370A (zh) | 一种甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法 | |
| CN114942282A (zh) | 一种快速检测烫发产品中还原剂的方法 | |
| CN101620172A (zh) | 同型半胱氨酸诊断试剂盒及同型半胱氨酸浓度测定方法 | |
| CN113341047A (zh) | 一种气相色谱仪测定化妆品中苯酚、氢醌的方法 | |
| CN101762550A (zh) | 同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)及同型半胱氨酸浓度测定方法 | |
| CN103439427A (zh) | 一种测定塞来昔布中三氟乙酸残留量的方法 | |
| CN101620173A (zh) | 同型半胱氨酸诊断试剂盒及同型半胱氨酸浓度测定方法 | |
| CN101762509A (zh) | 同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)及同型半胱氨酸浓度测定方法 | |
| CN101762518A (zh) | 同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)及同型半胱氨酸浓度测定方法 | |
| CN101609013A (zh) | 同型半胱氨酸诊断试剂盒及同型半胱氨酸浓度测定方法 | |
| Yoon et al. | Determination of pipecolic acid following trimethylsilyl and trifluoroacyl derivatisation on plasma filter paper by stable isotope GC-MS for peroxisomal disorders | |
| CN106596817A (zh) | 采用气相色谱-质谱法测定血液中的百草枯含量的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140806 Termination date: 20190520 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |