CN1165610C - 一种黑曲霉菌及用其生产香草酸和香草醛的微生物转化方法 - Google Patents
一种黑曲霉菌及用其生产香草酸和香草醛的微生物转化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物转化制造香草酸与香草醛的方法，该方法利用发明人筛选并保藏的能使阿魏酸转化成香草酸的微生物菌株黑曲霉菌(Aspergillus niger)SW-3305(即CGMCCNo.0774)，在优化条件下发酵培养菌丝体，发酵液或游离菌丝体或其固定化细胞用于阿魏酸转化3～4天，转化液中含香草酸1～2g/L，对底物摩尔转化率50～90%；发酵液或菌丝体转化液中未检测到残余底物阿魏酸及其它降解产物，转化液中的香草酸用乙酸乙酯等溶剂萃取，得到白色粉状结晶香草酸，提取得率为75～80%；产品纯度为90%。用含香草酸的转化液，或者用提取的结晶香草酸，加入朱红密孔菌(Pycnporus cinnabarnus)SW-0203发酵培养液，可得到转化产物香草醛。
Description
所属领域
本发明涉及一种新的用于微生物转化反应生产香草酸和香草醛的黑曲霉菌(Aspergillus niger)，以及利用该黑曲霉菌生产香草酸和香草醛的微生物转化方法。
背景技术
香草酸(Vanillic acid)即4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(4-Hydroxy-3-methoxybenzoic acid)，又称香荚兰酸，分子式为C8H8O4，分子量168.15。作为香草醛生物合成途径中的中间体，与香草醛同属肉桂酸类衍生物，广泛存在于自然界中，如在香荚兰豆、香子兰的荚、秘鲁香膏、安息香膏、爪哇香毛油、丁香花蕾油、丁子香芽油中等许多植物及精油中均有发现。
香草醛(Vanillin)，即香兰素，又名香草素、香兰醛或香茅醛，化学名：4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde)。分子式C8H8O3，分子量152.15。
随着世界各国对食品安全越来越重视，对天然香草醛的需求越来越大。由于采用植物组织提取的方法生产的天然香草醛产率低，成本高，价格昂贵，不能满足日益增长的需求，由此促使研究人员去寻找生产天然香兰素的替代方法。天然香料是指由动植物材料经物理(包括蒸馏、溶剂萃取)方法、酶法或微生物方法得到的，可通过传统的食品加工方法(包括干燥、焙烤、发酵)加工后用于人类消费的物质。用生物法生产的香草醛，属天然产品，可以生物降解，符合消费者追求天然产品的消费心理。因此，利用微生物细胞转化等生物技术过程生产生物香兰素，成为一种有效的、很有前途的替代方法。
许多微生物(包括细菌、放线菌和霉菌)都可以降解阿魏酸产生香草醛，已有很多报道丝状真菌和担子菌类的白腐真菌，可以转化阿魏酸生成香草酸或香草醛，但香草醛的产量总是很低。一般情况下香草醛只是代谢的中间产物，会继续发生降解而不易积累。已报道微生物转化法的研究有多种技术路线。如：
瑞士Givaudan Roure研究公司的Muheim Andreas等人申请了专利(USP6,235,507)，用Streptomyces.setoniiATCC 39116培养5～40h，至碳源葡萄糖几乎消耗完后，在发酵液中按分批方法添加阿魏酸5～40g/L，继续培养(生物转化)约5～50h，阿魏酸转化香草醛积累达到8～16g/L，但副产物较多，有香草醇、香草酸、愈创木酚、对-乙烯基愈创木酚和2-甲基4-乙基-苯酚等，不利于转化产物的分离提取。
法国国家农业研究所(INRA，Institut National de la Recherche Agronomique)生物技术实验室的Asther Marcel的课题组开发了用丝状真菌二步法生产香草醛工艺，在该工艺中先用黑曲霉(Aspergillus niger)将阿魏酸转化为香草酸，再用朱红密孔菌(Pycnporus cinnabarnus)或黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)将香草酸还原成香草醛。Lesage-Meessen L等申请了专利(US6,162,637)。用黑曲霉菌株Aspergillus niger MIC 373的发酵培养液，按每24小时加阿魏酸430mg/L均衡方式添加了5.05g/L阿魏酸。培养发酵15天后HPLC检测培养液中的香草酸最终浓度为3.30g/L，添加的阿魏酸完全消耗，很大部分转化为香草酸(82％)，小部分(2％)为代谢产物甲氧基氢醌，没有香草醛和香草醇。添加大豆磷脂激活阿魏酸向香草酸的生物转化，以加快生物转化。提取的香草酸用作生物转化香草醛的前体，并选用选择性树脂XAD-2使培养基中的香草醛浓度减少，减小了香草醛对菌体的毒性，也同时限制了进一步还原成香草醇，香草醛的浓度达到1,575mg/L(Stenielaire C.，Lesage-meessen.L.，Oddou J.等，J of Biosci and Bioengineering.2000，89，223-230)。但该方法生物转化阿魏酸到香草酸的时间仍然很长，需要6-7天，生产效率低。而且，发酵培养需要添加大豆磷脂、盐酸硫胺素(VB1)等促生长剂，增加了生产成本。另外，转化产物中仍然含有较多量的甲氧基氢醌，给分离与后续香草醛的转化带来困难。
技术方案
本发明的目的是提供一种能有效转化反式阿魏酸为香草酸的微生物新菌株，并提供一种新的微生物转化反应生成香草酸和香草醛的方法。
本发明的能有效转化反式阿魏酸为香草酸的微生物新菌株，在马铃薯或米饭培养基上，菌丝生长初期无色，成熟时为深褐色至近黑色。菌丝有分隔，有厚壁而膨大的足细胞，有直立的分生孢子梗有子囊，孢子头上有梗基，孢子头黑色孢子头球形至放射形，紧接顶囊处分生孢子梗不缢缩，分生孢子梗光滑。根据K.B.Raper和D.I.Fennell《曲霉属》(The GenusAspergillus，1965)，该菌株具有典型的黑曲霉表征。对照《真菌鉴定手册》(魏景超遗著，上海科学技术出版社，1979，上海p609～638)，按渥仑韦柏和莱因钦(Wollenweber & Reinking)的分类系统，应属于曲霉属中的黑曲霉Aspergillus niger，命名为黑曲霉菌Aspergillus niger SW-3305。
此菌株是选择Aspergillus nigerSW-33为出发菌株，按常规方法进行紫外线、Co-60诱变处理制得。紫外线照射为15W，距离27cm，时间2～3分钟；Co-60照射为剂量2～8万伦琴，时间为20～30分钟。经处理的菌丝体移种到含香草酸的基本培养基及完全培养基上，20～40℃培养3～7天，检出在含香草酸的基本培养基不长、在完全培养基上生长的菌落。与此同时，将上述诱变和筛选的菌丝体移种到含阿魏酸的筛选培养基上，20～40℃培养3～7天，检出不生长或生长势较弱的菌落。
含香草酸或阿魏酸的基本培养基包含Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、维生素、微量元素溶液和琼脂诸组分。
此菌株已于2002年7月19日保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保存号CGMCC No.0774。
本发明生产香草酸的微生物转化方法，包括：
(1)将菌株SW-3305进行常规培养、发酵，获得湿菌丝体或用卡拉胶等载体固定化后作为生物催化剂；
(2)以米糠、麸皮等为原料，采用微生物或酶降解法，制备得到的反式阿魏酸，精制后配制成溶液作为生物转化底物；
(3)将(1)的发酵液，或过滤收集的湿菌丝体，或用卡拉胶等载体固定化后的湿菌丝体，加入(2)的底物溶液进行转化反应，生成香草酸；
(4)将(3)的转化液，用乙酸乙酯萃取，再脱水，脱色，蒸发回收溶剂，得到白色粉状结晶香草酸。
转化用菌株的培养和发酵：
斜面培养：配制含葡萄糖1～10％，马铃薯浸汁5～30％，琼脂1～2.5％，pH6～9的培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，下同。100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、制成斜面、接种，20～40℃培养3～7天。
种子培养和发酵：麦芽糖5～50g/L、酒石酸二铵0～10g/L、酵母膏1～5g/L、磷酸二氢钾0～2g/L、氯化钙1～10g/L、硫酸镁0～5g/L，pH值为4～9的培养基，装液量20～150ml/250ml三角瓶，100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、接种，接种量5～10％，20～40℃，摇瓶转速100～250r/min。在上述条件下进行摇瓶发酵试验，培养1～5天，分别作为种子或发酵培养液。
底物阿魏酸钠盐溶液的制备：用0.1mol/L的NaOH溶液，按每g阿魏酸约66ml的碱溶液配制成100g/L的钠盐溶液，中和至中性(终pH7.2)，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物，避光保藏待用。
微生物转化反应：
用培养后的发酵液作为酶源，以阿魏酸钠盐溶液为底物，底物浓度为1～10g/L，加湿菌体量为1～50g/g底物，转化反应温度为20～50℃，转化反应时间为5～48小时。在此条件下所得的转化液进行高压液相色谱分析(HPLC)及薄层层析法(TLC)测定表明，已转化的主要组分为香草酸。
或者，发酵产得湿菌丝体，或用生理盐水制成菌丝体悬液，以海藻酸钠、卡拉胶、明胶、几丁质等载体包埋等方法制得固定化细胞。以此作为酶源进行生物转化。菌丝体或固定化细胞可反复回用，进行多次生物转化反应。
分批补料转化法：于发酵培养基中，或菌丝体悬浮液中，每天一次加入阿魏酸0.1g的阿魏酸钠盐底物溶液进行转化，连续四天，最后一次加底物后再转化24小时。
阿魏酸与香草酸的HPLC测定：柱型为RP-18(Lichrospher 100，5μm，125×4mm)。分步洗脱溶剂为A：0.01％的醋酸溶液和B：甲醇。洗脱曲线：开始为B 20％，A 80％，维持4min，第24min增加B至40％，第27min增加B至100％，维持2min，第30min再回至B 20％。流速为1ml/min，紫外检测波长为280nm。
阿魏酸与香草酸的TLC测定：硅胶GF254层析板，将待测转化样品用乙酸乙酯萃取后静置分层，用微量进样器在干燥的薄板上点样，将薄板放入层析缸中层析。展开剂正己烷∶三氯甲烷∶五水乙醚∶冰醋酸的比例4∶3∶2∶0.1。碘蒸气显色，呈现黄褐色色斑。
香草酸的提取：发酵液用布氏漏斗滤去菌丝体，收集发酵液，真空蒸发浓缩，以等体积的乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液，反萃乙酸乙酯萃取液，再进一步无水硫酸钠脱水。乙酸乙酯萃取脱水液中加入1-4％(w/v)的活性炭，加热脱色过滤，收集滤液。将所得的脱色有机相再次真空蒸发，回收乙酸乙酯，蒸至晶体将要析出时停止，倾出，于培养皿中，干燥，得白色或微黄色粉状结晶香草酸，称重。
本发明生产香草醛的微生物转化方法，是用含香草酸的转化液，或者用提取的结晶香草酸，加入朱红密孔菌(Pycnporus cinnabarnus)SW-0203发酵培养液，得到转化产物香草醛。
附图说明
图1是本发明的工艺流程示意图。
有益效果
本发明微生物转化法相对于传统的化学合成法或从香兰属植物中提取的方法具有以下优点：①有害物质含量极低，安全无毒副作用；②可进行大规模生产，不受季节影响；③生产操作简便，产品得率高；④比提取法费用低，节省成本；⑤反应条件温和，环境友好。
本发明的优点是选育了一株能使阿魏酸转化成香草酸、且不利用不降解香草酸的微生物菌株黑曲霉菌Aspergillus niger CGMCC No.0774，而且，发酵培养不需添加大豆磷脂、盐酸硫胺素(VB1)等促生长剂，转化阿魏酸后的产物为香草酸，没有甲氧基氢醌、香草醛、香草醇等代谢副产物，提取得率为75～80％％；产品纯度为90％。该菌株不利用不降解香草酸，微生物转化收率高，对底物摩尔转化率30～90％。本发明的转化工艺可以直接用发酵培养液添加阿魏酸进行转化，也可以用发酵后分离得到的游离菌丝体或其固定化细胞加阿魏酸底物溶液进行转化，菌丝体或其固定化细胞可反复利用多次。
实施例
实施例1
斜面培养：培养基为100ml马铃薯浸汁(含去皮马铃薯20g)，葡萄糖2g，琼脂2g，pH6.5，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种，菌种为黑曲霉菌Aspergillus nigerSW-3305 CGMCCNo.0774，30℃培养3天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵：培养基为麦芽糖30g/L、酒石酸二铵5g/L、酵母膏5g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钙10g/L、硫酸镁5g/L，pH6.0，装液量为250ml三角瓶装液100ml，120℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，150rpm摇床，30℃培养2天，作为种子或发酵酶液。
发酵酶液中湿菌体量为2.5g/100ml，按25g湿菌体/g底物的浓度添加阿魏酸，150rpm摇床，30℃继续培养(转化)48小时，转化过程中每隔12小时取样HPLC测定香草酸生成量，结果如下表1：
表1 黑曲霉菌Aspergillus niger SW-3305转化阿魏酸生成香草酸
| 转化时间 | 12h | 24h | 36h | 48h |
| 香草酸浓度mg/L | 103.0 | 306.5 | 350.9 | 365.3 |
| mol转化率％ | 11.9 | 35.4 | 40.5 | 42.2 |
实施例2
黑曲霉菌Aspergillus niger SW-3305 CGMCC No.0774，按实例1方法发酵培养48小时后，发酵酶液中湿菌体量为2.5g/100ml，每天一次按25g湿菌体/g底物的浓度添加阿魏酸进行转化，每次加入阿魏酸量为0.1g，连续四天，共加入阿魏酸0.4g。最后一次加底物后继续转化24小时，HPLC检测转化液中的香草酸的浓度为1.46g/L，mol转化率为50.58％。再继续转化24小时，HPLC检测转化液中的香草酸的浓度为2.61g/L，mol转化率为90.43％。
实施例3
用黑曲霉菌Aspergillus niger SW-3305 CGMCC No.0774，按实例1方法发酵，过滤得到菌丝体，将制备的湿菌丝体，按每瓶湿菌丝体(2.5g)加入100ml灭过菌的pH6.0磷酸氢二钠一磷酸二氢钾缓冲液中，加入10g/L的阿魏酸底物溶液10ml(计算加湿菌体量为25g/g底物)进行转化，30℃，150rpm，转化12小时，取样测定转化液中香草酸含量，反应结束后滤出的菌丝体，再次加入新的反应底物(含10ml 10g/L的阿魏酸底物溶液的100ml灭过菌的pH6.0磷酸氢二钠一磷酸二氢钾缓冲液)进行转化，在同一条件转化12小时，如此反复转化重复利用5次。结果表明，滤出的发酵湿菌丝体在配制的底物溶液中经过24小时生物转化后，得到的mol酶转化率为30％左右。菌体使用5次后，转化率仍然没有明显的下降。结果如表2所示：
表2 发酵湿菌丝体反复分批酶转化结果
| 转化次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| mol转化率(％) | 30.5 | 31.1 | 29.3 | 28.6 | 29.3 |
实施例4
按实例1方法，发酵，得湿菌丝体100g，加100ml生理盐水制成菌丝体悬液，30℃保温；另称取20g卡拉胶，加400ml生理盐水，加热溶解后，冷却到55℃保温。两者在50℃以下混匀，倒入平皿，冷却，加KCl溶液，放冰箱中硬化3hr，称重得约500g固定化细胞。将此固定化细胞，按实例3方法进行生物转化。反复分批生物转化10次结果见表3。
表3 固定化细胞反复分批酶转化结果
| 转化次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| mol转化率(％) | 28.5 | 30.1 | 32.2 | 30.5 | 29.3 | 29.6 | 30.5 | 31.2 | 28.6 | 31.5 |
实施例5
按实施例2的方法，所得转化液3500ml，转化液中的香草酸的浓度为1.06g/L，过滤所得的清液，真空旋转蒸发浓缩，至原体积的1/10左右。用体积比为1∶1的乙酸乙酯萃取3次，用HPLC或TLC检测水相中无残留香草酸，合并的乙酸乙酯萃取液。向乙酸乙酯萃取液中加入4％(w/v)的活性炭，加热脱色，滤纸过滤，收集滤液。再用100ml的饱和氯化钠溶液进行反萃乙酸乙酯萃取液，脱除其中残留水份，再加约1％(w/v)的无水硫酸钠，搅拌，进一步脱水。将按以上步骤处理所得到的脱色有机相再次真空蒸发，回收溶剂。将浓缩至接近油状的乙酸乙酯相倾入蒸发皿中，室温自然干燥，即得白色粉状结晶香草酸，称重为2.78g。经HPLC测定，纯度为85.9％，计算香草酸收率为64.34％。
实施例6
用朱红密孔菌(Pycnporus cinnabarnus)SW-0203，在土豆斜面上培养7天的菌丝接入装100ml液体培养基(采用实例1发酵培养基)的250ml三角瓶中，30℃，150rpm，培养3天。将按实施例5的方法提取的香草酸粗晶体0.1g(纯度85.9％)，用0.5mol/l的NaOH溶液将其溶解并中和至pH7.0，用去离子水定容到100ml，无菌过滤处理后作为添加的底物溶液。取30ml底物溶液加入到朱红密孔菌的培养液中，30℃，120rpm转化12小时，再向培养液中加入30ml底物，第24小时再加入30ml底物，三次总共向培养基中添加了77.3mg的香草酸。在第三次添加底物后，再转化12小时，HPLC测定，香草醛的浓度达到0.118g/L，190ml转化液中共生成香草醛22.4mg，由此计算相应的香草醛mol转化率为32.03％。
Claims (4)
1.一种能有效转化反式阿魏酸为香草酸的微生物菌株，它是黑曲霉菌(Aspergillusniger)SW-3305 CGMCC No.0774。
2.一种生产香草酸的微生物转化方法，包括：
(1)将权利要求1所述的菌株SW-3305，进行常规培养，发酵，获得湿菌丝体或用卡拉胶等载体固定化后做为生物催化剂；
(2)将反式阿魏酸精制后配制成溶液作为生物转化底物；
(3)将(1)的发酵液，或过滤收集的湿菌体，或用卡拉胶等载体固定化后的湿菌体，加入(2)的底物溶液进行转化反应，生成香草酸；
(4)将(3)的转化液，用乙酸乙酯萃取，再脱水，脱色，蒸发回收溶剂，得到白色粉状结晶香草酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中菌株SW-3305发酵培养条件为：250ml三角瓶装液量20～150ml，培养温度20～40℃，摇床转速100～250r/min，培养1～7天。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中底物浓度为1～20g/L，加湿菌体量为1～50g/g底物，转化反应温度为20～50℃，转化反应时间为5～48小时。
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