CN102100690B

CN102100690B - 黄酮类化合物在制备抗补体药物中的用途

Info

Publication number: CN102100690B
Application number: CN2009102013626A
Authority: CN
Inventors: 陈道峰; 何常明
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2009-12-17
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2029-12-17
Also published as: CN102100690A

Abstract

本发明属中药制药领域，涉及式1的黄酮类化合物在制备抗补体药物中的新用途。本发明从豆科槐属植物苦参(Sophora flavescens)乙酸乙酯部位提取黄酮类化合物并通过体外抗补体活性筛选试验证实其对补体系统的经典途径和旁路途径具有较强的抑制作用。所述化合物对补体系统的经典途径抑制作用的CH₅₀为0.12±0.02mg/mL～0.35±0.03mg/mL，对旁路途径抑制作用的AP₅₀为0.45±0.05mg/mL。本发明的黄酮类化合物可进一步制备抗补体的药物。

Description

黄酮类化合物在制备抗补体药物中的用途

技术领域

本发明属中药制药领域，涉及药物新用途，具体涉及苦参中的黄酮类化合物在制备抗补体药物中的新用途。

背景技术

已知补体系统是人体重要的免疫防御系统之一，在消灭外来微生物、维持机体的平衡等生理过程中起着重要作用。补体系统的过度激活会引发系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病。目前对此类疾病尚无理想的治疗药物，因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。直接从天然产物中研究开发补体抑制剂的成本低，并且大多数活性成分作为天然产物的一部分可以直接被机体消化吸收，因此近年来从天然来源中寻找新的具有抗补体活性的药物受到人们越来越多的关注。国内外的学者已从天然产物中筛选得到大量的具有补体系统抑制作用的单体化合物，为抗补体药物的研究与开发提供了广阔的前景。

苦参为豆科(Leguminosae)槐属(Sophora)植物苦参(S.flavescens)的干燥根，味苦性寒，具有清热燥湿，杀虫，利尿的功效，主治热痢、便血、黄疸尿闭、赤白带下、阴肿阴痒、湿疹、湿疮、皮肤瘙痒和疥癣麻风等症，外治滴虫性阴道炎。苦参含有丰富的生物碱、黄酮和三萜类成分，其中生物碱类成分一直是苦参的研究热点。近年来，越来越多的研究表明苦参中黄酮成分具有良好的抗肿瘤、抗氧化、止痒、抑制cGMP磷酸二酯酶等药理作用，但是迄今为止尚未见苦参中黄酮成分对补体系统具有抑制作用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供新的具有抗补体活性的物质，具体涉及苦参中的黄酮类化合物，包括7，4’-二羟基黄酮(1)、降脱水淫羊藿素(2)。

本发明的进一步目的是提供上述苦参中的黄酮类化合物在制备抗补体药物中的用途。

本发明应用现代药理筛选方法，对植物药中抗补体活性物质进行研究，从豆科槐属(Sophora)植物苦参(S.flavescens)的乙酸乙酯部位分离得到黄酮类化合物并证实其对补体系统的经典途径和旁路途径均有较强的抑制作用。

本发明的活性黄酮类化合物具有如下的化学结构：

其中，R₁＝R₂＝H时，为化合物7，4’-二羟基黄酮(1)；

R₁＝OH，

时，为化合物降脱水淫羊藿素(2)。

本发明所述的黄酮类化合物通过下述方法制备：

苦参药材粗粉17kg，室温下以95％乙醇反复冷浸、渗漉提取数次，提取液减压浓缩得乙醇浸膏2.7kg。取乙醇浸膏1.2kg，悬浮于蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，并分别浓缩至干，其中乙酸乙酯萃取物460g。取乙酸乙酯部位萃取物160g，进行硅胶柱色谱(柱规格：11x85cm，硅胶：200-300目，1.8kg)，以石油醚-丙酮梯度洗脱，所得流份再以不同洗脱剂进行硅胶及SephadexLH-20柱色谱，分离得到化合物7，4’-二羟基黄酮(1)、降脱水淫羊藿素(2)。

其中，7，4’-二羟基黄酮(1)：C₁₅H₁₀O₄，淡黄色粉末。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δppm 7.96(2H，d，J＝8.4Hz，H-2’，6’)、7.86(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)、6.96(1H，d，J＝2.2Hz，H-8)、6.90(2H，d，J＝8.4Hz，H-3’，5’)、6.88(1H，dd，J＝8.4，2.2Hz，H-6)、6.71(1H，s，H-3)；¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δppm 176.2(C-4)，162.5(C-7)，162.4(C-2)，160.7(C-8a)，157.3(C-4’)，128.1(C-2’，6’)，126.4(C-5)，121.8(C-1’)，116.1(C-4a)，115.9(C-3’，5’)，114.8(C-6)，104.4(C-3)，102.4(C-8)。

其中，降脱水淫羊藿素(2)：C₂₀H₁₈O₆，黄色针状晶体。¹H NMR(acetone-d₆，400MHz)δppm 12.15(1H，s，H-5)，8.20(2H，d，J＝9.0Hz，H-2’，6’)，7.00(2H，d，J＝9.0Hz，H-3’，5’)，6.36(1H，s，H-6)，5.24(1H，t，J＝6.8Hz，H-2”)，3.58(2H，m，H-1”)，1.78(3H，s，H-5”)，1.60(3H，s，H-4”)；¹³C NMR(acetone-d₆，100MHz)δppm 176.8(C-4)，162.0(C-7)，160.1(C-4’)，159.9(C-8a)，155.0(C-5)，146.9(C-2)，136.5(C-3)，132.1(C-3”)，130.4(C-2’，6’)，123.7(C-2”)，123.5(C-1’)，116.3(C-3’，5’)，107.2(C-8)，104.2(C-4a)，98.8(C-6)，25.8(C-5”)，22.2(C-1”)，18.1(C-4”)。

本发明所述的黄酮类化合物经体外抗补体活性筛选试验，结果证实，其中化合物7，4’-二羟基黄酮(1)对补体系统的经典途径和旁路途径均有较好的抑制作用，经典途径50％抑制溶血所需供试品浓度(CH₅₀)为0.12±0.02mg/mL；旁路途径50％抑制溶血所需供试品浓度(AP₅₀)为0.45±0.05mg/mL。降脱水淫羊藿素(2)对补体系统的经典途径有抑制作用，CH₅₀为0.35±0.03mg/mL。

本发明所述的黄酮类化合物可进一步制备抗补体的药物。

表1是苦参中黄酮类化合物对补体系统经典途径和旁路途径抑制作用的数据。

表1黄酮类化合物的抗补体活性结果(x±SD，n＝3)

附图说明：

图1是苦参中黄酮类化合物1～2的提取分离流程图。

具体实施方式

实施例1黄酮类化合物的制备

取苦参干燥根17kg，室温下以95％乙醇反复冷浸、渗漉提取数次，提取液减压浓缩得浸膏2.7kg。取浸膏1.2kg，悬浮于蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，并分别浓缩至干，其中乙酸乙酯萃取物460g。取乙酸乙酯部位萃取物160g，进行硅胶柱色谱(柱规格：11x85cm，硅胶：200-300目，1.8kg)，以石油醚-丙酮梯度洗脱，所得流分再以不同洗脱剂进行硅胶及Sephadex LH-20柱色谱，具体步骤如下：

石油醚-丙酮(10∶1)洗脱所得的流份以石油醚-乙酸乙酯(5∶1，3∶1)硅胶柱色谱得4个流份A～D。流份A重结晶得降脱水淫羊藿素(2，35mg)；流份B以氯仿-甲醇(40∶1)硅胶柱色谱和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇＝1∶1)凝胶柱色谱得到7，4’-二羟基黄酮(1，10mg)。

实施例2体外抗补体经典途径试验

取补体(豚鼠血清)0.04mL，加入BBS 0.36mL，配制成1∶10溶液，用BBS对倍稀释成1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320和1∶640溶液。取1∶1000溶血素、2％SRBC各0.1mL及各浓度补体0.2mL溶于0.2mL BBS中，混匀，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在4000rpm、4℃条件下离心5min。分别取每管上清0.2mL于96孔板，在405nm下测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.1mL 2％SRBC溶于0.5mL三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。用BBS溶解并制备不同浓度的供试品溶液各0.2mL，分别依次加入临界浓度的补体0.2mL、溶血素和2％SRBC各0.1mL。将供试品组37℃水浴30min后放入低温高速离心机，4000rpm、4℃条件下离心5min后分别取上清0.2mL于96孔板，405nm下测定吸光度。实验同时设置对照组、补体组(观察补体是否有效)和全溶血组(见表2)。将供试品组吸光度值扣除相应对照组吸光度值后计算溶血抑制率。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算CH₅₀值。

实施例3体外抗补体旁路途径试验

取补体(人血清)0.06mL，加入AP稀释液0.24mL，配制成1∶5稀释溶液，并对倍稀释成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320和1∶640溶液。取各浓度补体0.15mL、AP稀释液0.15mL及0.5％RE 0.20mL，混匀，37℃水浴30min后放置入低温高速离心机，在4000rpm、4℃条件下离心5min。分别取每管上清0.2mL于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.20mL0.5％RE溶于0.3mL三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。用AP溶解并制备不同浓度的供试品溶液各0.15mL，分别依次加入临界浓度的补体0.15mL和0.5％RE 0.2mL。将每管37℃水浴30min后放置入低温高速离心机，4000rpm、4℃，离心5min后分别取每管上清0.2mL于96孔板，405nm下测定吸光度。实验同时设置对照组、补体组(观察补体是否有效)和全溶血组(见表3)。将供试品组吸光度值扣除相应对照组吸光度值后计算溶血抑制率。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图。计算AP₅₀值。

本发明实验采用的试剂均为本领域公知技术，可市购。

Claims

1.式I的黄酮类化合物在制备抗补体药物中的用途，

其中，R₁＝R₂＝H；或者R₁＝OH，

2.按权利要求1所述的用途，其特征是所述的黄酮类化合物是7，4’-二羟基黄酮。

3.按权利要求1所述的用途，其特征是所述的黄酮类化合物是降脱水淫羊藿素。

4.按权利要求2所述的用途，其特征是所述的7，4’-二羟基黄酮对补体系统的经典途径和旁路途径有抑制作用；经典途径50％抑制溶血所需浓度为0.12±0.02mg/mL；旁路途径50％抑制溶血所需浓度为0.45±0.05mg/mL。

5.按权利要求3所述的用途，其特征是所述的降脱水淫羊藿素对补体系统的经典途径有抑制作用，50％抑制溶血所浓度为0.35±0.03mg/mL。