CN105859816A

CN105859816A - 火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法、应用及产品

Info

Publication number: CN105859816A
Application number: CN201610287531.2A
Authority: CN
Inventors: 戚建华; 孙玉娟; 陈海轶; 向兰
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-05-03
Filing date: 2016-05-03
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2036-05-03
Also published as: CN105859816B

Abstract

本发明涉及一种火麻仁中提取β‑谷甾醇和β‑胡萝卜苷的方法，包括如下步骤：1)将火麻仁研磨成粉末，置于甲醇中浸提，得浸提物；2)用乙酸乙酯和水对浸提物进行萃取，分别得到水层和酯层的粗提物；3)分别对水层和酯层的粗提物进行分离纯化，即得β‑谷甾醇和β‑胡萝卜苷。该发明提供新型的提取方法，从火麻仁中提取β‑谷甾醇和β‑胡萝卜苷，该方法简单易行。同时提供了β‑谷甾醇和β‑胡萝卜苷对延缓衰老及治疗衰老性疾病方面的新药研发进行基础性研究，具有重要的现实意义。

Description

火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法、应用及产品

技术领域

本发明涉及药物提取领域，具体涉及一种火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法及应用和产品。

背景技术

根据最新统计数据，全世界60岁及以上老龄人口在2013年已经达到了8.14亿，预计到2050年这个数字将会超过20亿。世界已进入老龄化社会，随之而来的与衰老相关的疾病成为日益凸显的问题。包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病是世界性的公共卫生难题之一。仅在中国，阿尔茨海默病的患者数量在2010年已增加至569万。在医药学领域，寻找防治老年性疾病的药物已经成为当务之急。

经过对衰老机制的长期研究，本领域内已形成多种衰老学说，包括程序衰老说、体细胞突变说、错误成灾说，自由基说、神经内分泌说、免疫衰老说、细胞之学说，等等。由此可见，衰老是一个十分复杂的过程，即便是同一类抗衰老药物，其发挥药效的方式也不尽相同，彼此之间无必然联系。

火麻仁是桑科植物大麻的种子，其作为一种食物具有悠久的历史。我国广西的巴马村是国际自然医药协会认定的“长寿村”，2004年的一份数据显示巴马村有74位健康的百岁老人。在巴马村当地，火麻仁汤被称作“长寿汤”，火麻仁的营养价值和诸如增强免疫力、降血压、通便等保健功能已经被许多研究人员报道过，但长期以来火麻仁的抗衰老活性一直被人们忽视。因此，寻找火麻仁中潜在的抗衰老活性化合物对于解开巴马村“长寿汤”之谜是十分必要的，更重要的是可以将火麻仁推广为世界性的抗衰老保健食品。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法及应用和产品。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法，其中，包括如下步骤：

1)将火麻仁研磨成粉末，置于甲醇中浸提，得浸提物；

2)用乙酸乙酯和水对浸提物进行萃取，分别得到水层和酯层的粗提物；

3)分别对水层和酯层的粗提物进行分离纯化，即得β-谷甾醇和β-胡萝卜苷。

上述技术方案中提供了一种新型的提取方法，从火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷，该方法简单易行，收率高。

作为优选，所述的步骤1)中浸提时间为5～10天。由于甲醇的破壁效果较好，提取效率较高，将火麻仁粉末置于甲醇中5～10天，能够得到合适的浸提物，以提高后续β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的产率。

作为优选，所述的步骤2)中乙酸乙酯和水的体积比为1:1～3。

作为优选，所述的步骤3)中对酯层的粗提物分离纯化包括以下步骤：a1)以正己烷与乙酸乙酯溶剂系统作洗脱剂，对酯层的粗提物进行分离，获得目标组分；a2)将目标组分在乙酸乙酯中重结晶纯化，得到β-谷甾醇。作为进一步优选，所述的步骤a1)中采用硅胶开口柱对酯层的粗提物进行分离。

作为优选，所述的步骤a1)中将正己烷与乙酸乙酯溶剂系统按体积比95:5、90:10、85:15、80:20、70:30依次洗脱，获得目标馏分。

作为优选，所述的步骤3)中对水层的粗提物分离纯化包括以下步骤：b1)将水层的粗提物以甲醇与水溶剂系统作洗脱剂进行第一次分离，获得目标馏分；b2)以氯仿与甲醇溶剂系统作洗脱剂，对目标馏分进行第二次分离，得到β-胡萝卜苷。作为进一步优选，所述的步骤b1)中采用十八烷基键合硅胶开口柱进行第一次分离，所述的步骤b2)中采用硅胶开口柱对目标馏分进行第二次分离。

作为优选，所述的步骤b1)中将甲醇与水溶剂系统按照体积比50:50，60:40，70:30，80:20，100:0依次洗脱，取体积比80:20洗脱的馏分，获得目标馏分。

作为优选，所述的步骤b2)中将氯仿与甲醇溶剂系统按照体积比95:5，90:10，80:20依次洗脱目标馏分，获得β-胡萝卜苷。

本发明提供一种上述的方法提取的β-谷甾醇和β-胡萝卜苷在制备抗衰老药物中的应用。

研究发现，这两种活性化合物在抗衰老化合物的体外筛选模型中，可以显著延长酵母细胞的复制性寿命。为了研究作用机制，我们采用变异酵母菌株进行了抗衰老机理研究，发现这两种化合物是通过调节UTH1基因、SOD基因的表达，提高抗氧化能力，从而实现酵母细胞复制性寿命的延长的。

根据氧化自由基学说，氧化压力是导致衰老的主要原因。UTH1是一个与氧化应激相关的基因。UTH1敲除后的酵母不仅能显著延长其在营养缺乏时的寿命，还能增强其对过氧化物的耐受性。本发明发现，β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的抗衰老活性与基因UTH1相关。

SOD也是与氧化应激相关的基因，表达的超氧化物歧化酶能够清除氧自由基，缓解氧化压力。本发明发现，β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的抗衰老活性也与基因SOD相关。

本发明还提供一种抗衰老药物或保健品，由上述的方法提取的β-谷甾醇和β-胡萝卜苷与药学上可接受的载体组成。

所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂等。所述的填充剂可采用淀粉、蔗糖或微晶纤维素；所述的粘合剂可采用淀粉浆、羟丙纤维素、明胶或聚乙二醇；所述的湿润剂可采用硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇类；所述的吸收促进剂可采用聚山梨脂或卵磷脂；所述的表面活性剂可采用伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦或聚山梨脂。另外还可以加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

所述的抗衰老药物或保健品的剂型可以是片剂，丸剂，粉剂，分散片，小药囊剂，酏剂，混悬剂，乳剂，溶液剂，糖浆剂，气雾剂，软胶囊，硬胶囊，无菌注射液，搽剂或栓剂；可制成常规、速释、缓释或延迟释放制剂。

本发明的抗衰老药物或保健品可通过各种途径给予，包括口服、鼻腔、肌肉注射、皮下注射、静脉注射等。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明提供新型的提取方法，从火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷，该方法简单易行。

(2)本发明对延缓衰老及治疗衰老性疾病方面的新药研发进行基础性研究，具有重要的现实意义。

附图说明

图1为从火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的化学结构式；其中，A表示β-谷甾醇，B表示β-胡萝卜苷；

图2为本发明火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷对酵母k6001的复制性寿命的影响结果；其中，Control为阴性对照，Res为白藜芦醇，A图中1表示β-谷甾醇，B图中2表示β-胡萝卜苷；

图3为本发明火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷在氧化性环境下对BY4741酵母细胞生存率的影响；其中，Control为阴性对照，PC为根皮苷(阳性对照)，A图中1表示β-谷甾醇，B图中2表示β-胡萝卜苷；

图4为本发明火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷对K6001背景的uth1突变株的复制性寿命的影响结果；其中，Control为阴性对照，Res为白藜芦醇，A图中1表示β-谷甾醇，B图中2表示β-胡萝卜苷；

图5为本发明火麻仁中提取β-谷甾醇对K6001背景的sod1和sod2突变株的复制性寿命的影响结果；其中，Control为阴性对照，Res为白藜芦醇，1表示β-谷甾醇；

图6为本发明火麻仁中提取β-胡萝卜苷对K6001背景的sod1和sod2突变株的复制性寿命的影响结果；其中，Control为阴性对照，Res为白藜芦醇，2表示β-胡萝卜苷。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例:火麻仁提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷

火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法，包括以下步骤：

(1)将1.0kg火麻仁粉末置于8L甲醇(工业级)中，室温下浸提一周(震荡)；经抽滤浓缩后，得到甲醇浸提物。

(2)将(1)中所得甲醇浸提物悬浮于500mL水中，用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯的体积为250mL，静置过夜，得到酯层粗样13.5g和水层粗样30.2g。

(3)将酯层粗样用硅胶开口柱进行分离(200-300目)，对酯层粗样进行TLC分析，确定溶剂系统，以正己烷与乙酸乙酯溶剂系统作洗脱剂，按正己烷与乙酸乙酯的体积比＝95:5，90:10，85:15，80:20，70:30依次洗脱，得到15个馏分，将第3-5个馏分合并，在乙酸乙酯中重结晶纯化，得到无色针晶，即β-谷甾醇。

(4)将水层粗样用十八烷基键合硅胶开口柱进行分离，对水层粗样进行TLC分析，确定溶剂系统，以甲醇与水溶剂系统作洗脱剂，按甲醇与水的体积比＝50:50，60:40，70:30，80:20，100:0依次洗脱，取体积比80:20洗脱的馏分，得到目标组分2.0g。

(5)以氯仿与甲醇溶剂体系(体积比＝95:5，90:10，80:20)，采用硅胶开口柱依次洗脱(4)所得目标组分，得到10个馏分，将第7-9个馏分合并得到132mg无色粉末，即β-胡萝卜苷。

(6)对所得两种化合物的理化特征及化学结构经¹³C NMR、MS、[α]_D进行分析结果如下：

β-谷甾醇的理化性质：白色固体；分子式为C₂₉H₅₀O；质谱ESI-MS m/z 437[M+Na]⁺；¹³C-NMR(CDCl₃,125MHz)δppm:140.8(C,C-5),121.7(CH,C-6),71.8(CH,C-3),56.8(CH,C-14),56.1(CH,C-17),50.2(CH,C-9),45.9(CH,C-24),42.3(C,C-13),42.3(CH₂,C-4),39.8(CH₂,C-12),37.3(CH₂,C-1),36.5(C,C-10),36.1(CH,C-20),34.0(CH₂,C-22),31.9(CH,C-8),31.9(CH₂,C-7),31.7(CH₂,C-2),29.2(CH,C-25),28.2(CH₂,C-16),26.1(CH₂,C-23),24.3(CH₂,C-15),23.1(CH₂,C-28),21.1(CH₂,C-11),19.8(CH₃,C-27),19.4(CH₃,C-19),19.0(CH₃,C-26),18.8(CH₃,C-21),12.0(CH₃,C-29),11.9(CH₃,C-18).

β-胡萝卜苷的理化性质：无色粉末；分子式为C₃₅H₆₀O₆；质谱ESI-MS m/z 599[M+Na]⁺.¹³C-NMR(pyridine-d₅,125MHz)δppm:140.7(C,C-5),121.7(CH,C-6),102.5(CH,C-1′),78.4(CH,C-3),78.2(CH,C-5′),77.9(CH,C-3′),75.1(CH,C-2′),71.5(CH,C-4′),62.6(CH2,C-6′),56.6(CH,C-14),56.0(CH,C-17),50.1(CH,C-9),45.8(CH,C-24),42.3(C,C-13),39.7(CH₂,C-12),39.1(CH₂,C-4),37.3(CH₂,C-1),36.7(C,C-10),36.1(CH,C-20),34.0(CH₂,C-22),31.9(CH₂,C-7),31.8(CH,C-8),30.0(CH₂,C-2),29.3(CH,C-25),28.3(CH₂,C-16),26.2(CH₂,C-23),24.3(CH₂,C-15),23.2(CH₂,C-28),21.1(CH₂,C-11),19.7(CH₃,C-27),19.2(CH₃,C-19),19.0(CH₃,C-26),18.8(CH₃,C-21),11.9(CH₃,C-29),11.7(CH₃,C-18).

两种化合物的结构式如图1所示，其中A为β-谷甾醇，B为β-胡萝卜苷。

应用例1：β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的抗衰老活性分析

目前用于抗衰老研究的生物模型主要有老鼠，线虫，果蝇和酵母。本应用例选择酿酒酵母作为抗衰老研究的活性系统，因为酵母是单细胞的真核生物，生命周期短，已获其完整的基因组数据，是目前常用的衰老模型生物。同时以白藜芦醇作为阳性对照，白藜芦醇是目前众所周知的、在多种动物模型上显示抗衰老作用的小分子化合物。

分析方法包括以下步骤：

(1)从-30℃冰箱取出K6001酵母菌株，用PBS洗涤三次，每次5ml，除去其中的甘油。最后加入1ml PBS，吹打，使其悬浮后加入到5ml液体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，3％的半乳糖)中。28℃振摇(160r/min)培养48小时。

(2)培养结束后用5ml PBS洗涤三次，除去其中的液体培养基，用血球计数板计数，计算酵母的浓度。

(3)采用无水乙醇作溶剂，分别配制3μM、10μM、30μM的β-谷甾醇和β-胡萝卜苷，备用。

(4)在灭过菌的培养皿中加入5ml的固体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％的琼脂粉)，待培养基凝固后，向其中分别加入步骤(3)中配制好的样品，溶剂挥发后加入4000个酵母，用涂布器涂抹均匀，28℃恒温培养48小时。

(5)显微镜下每皿随机数出40个母细胞分别产生的子细胞个数，并记录、作图分析，结果见图2。

图2中，阴性对照(control)的K6001的平均寿命为8.90，阳性对照(Res)10μM的白藜芦醇是11.03**；图2A中，3、10和30μM浓度的活性化合物β-谷甾醇的平均寿命分别是10.48**,10.95**,10.03*；图2B中3、10和30μM浓度的活性化合物β-胡萝卜苷的平均寿命分别是10.03*，10.98***，10.70**，其中1表示β-谷甾醇，2表示β-胡萝卜苷。

因此，说明两种化合物均能延长酵母的复制性寿命(*p<0.01，**p<0.01和***p<0.001表明有显著性差异)。

应用例2：β-谷甾醇和β-胡萝卜苷提高酵母生存率的活性分析

测试β-谷甾醇和β-胡萝卜苷能否提高酵母的生存率，测试方法如下：

(1)将-30℃保存的野生型酵母BY4741用5ml PBS洗涤三次，除去其中的甘油；加入1ml无菌水，吹打使其悬浮，加入到5ml葡萄糖培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖)中；将其放入摇床，28℃振摇(160r/min)培养48小时，使其恢复生长能力。

(2)将BY4741接种到25mL新的葡萄糖培养基，调整OD₆₀₀值为0.1，然后分别与3μM、10μM、30μM的β-谷甾醇，3μM、10μM、30μM的β-胡萝卜苷，阴性对照品、阳性对照品(10μM的根皮苷，Phloridzin)孵育12小时。

(3)BY4741与胆固醇孵育12小时后，取每组约200个细胞分别涂在含有和不含有4.5mM H₂O₂的葡萄糖固体培养基上；28℃培养2天后计算酵母细胞生存率；

酵母细胞生存率(％)＝(含4.5mM H₂O₂的葡萄糖固体培养基上的酵母菌落数/不含H₂O₂的葡萄糖固体培养基上的酵母菌落数)×100％；计算结果见图3。

由图3(A)可见，阴性对照(control)的酵母细胞生存率为61.04％±1.04％，3μM、10μM和30μM的β-谷甾醇孵育下，酵母细胞生存率分别提高到了70.71％±2.74％(p<0.05)、74.88％±0.80％(p<0.001)和87.28％±0.72％(p<0.001)；由图3(B)可见，3μM、10μM和30μM的β-胡萝卜苷孵育下，酵母细胞生存率分别提高到了79.61％±1.00％(p<0.001),73.96％±0.88％(p<0.001)，和75.28％±0.98％(p<0.001)。其中1表示β-谷甾醇，2表示β-胡萝卜苷。由此，可以推断这两种化合物能够提高酵母的生存率。

应用例3：β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的抗衰老机制分析

(1)测试β-谷甾醇及β-胡萝卜苷在3μM，10μM和30μM的活性浓度下是否能够延长敲除了UTH1基因的K6001酵母突变菌株(Δuth1)的复制性寿命，分析方法同应用例1，分析结果见图4。

(2)测试β-谷甾醇在3μM，10μM和30μM的活性浓度下是否能够延长分别敲除了SOD1，SOD2基因的K6001酵母突变菌株(Δsod1，Δsod2)的复制性寿命，分析方法同应用例1，分析结果见图5。

(3)测试β-胡萝卜苷在3μM，10μM和30μM的活性浓度下是否能够延长分别敲除了SOD1，SOD2基因的K6001酵母突变菌株(Δsod1，Δsod2)的复制性寿命，分析方法同应用例1，分析结果见图6。

由图4可见，10μM的β-谷甾醇和β-胡萝卜苷能延长K6001的复制性寿命，但却不能延长Δuth1的复制性寿命，说明β-谷甾醇和β-胡萝卜苷通过调节基因UTH1的表达延长酵母细胞的复制性寿命。

由图5和6可见，10μM的β-谷甾醇和β-胡萝卜苷能延长K6001的复制性寿命，但却不能延长Δsod1和Δsod2的复制性寿命，说明β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的抗衰老活性与SOD基因有关。

Claims

1.一种火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将火麻仁研磨成粉末，置于甲醇中浸提，得浸提物；

2.根据权利要求1所述的火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法，其特征在于，所述的步骤1)中浸提时间为5～10天。

3.根据权利要求1所述的火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法，其特征在于，所述的步骤2)中乙酸乙酯和水的体积比为1:1～3。

4.根据权利要求1所述的火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法，其特征在于，所述的步骤3)中对酯层的粗提物分离纯化包括以下步骤：

a1)以正己烷与乙酸乙酯溶剂系统作洗脱剂，对酯层的粗提物进行分离，获得目标组分；

a2)将目标组分在乙酸乙酯中重结晶纯化，得到β-谷甾醇。

5.根据权利要求4所述的火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法，其特征在于，所述的步骤a1)中将正己烷与乙酸乙酯溶剂系统按体积比95:5、90:10、85:15、80:20、70:30依次洗脱，获得目标馏分。

6.根据权利要求1所述的火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法，其特征在于，所述的步骤3)中对水层的粗提物分离纯化包括以下步骤：

b1)将水层的粗提物以甲醇与水溶剂系统作洗脱剂进行第一次分离，获得目标馏分；

b2)以氯仿与甲醇溶剂系统作洗脱剂，对目标馏分进行第二次分离，得到β-胡萝卜苷。

7.根据权利要求6所述的火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法，其特征在于，所述的步骤b1)中将甲醇与水溶剂系统按照体积比50:50，60:40，70:30，80:20，100:0依次洗脱，获得目标馏分。

8.根据权利要求7所述的火麻仁中提取β-谷甾醇和β-胡萝卜苷的方法，其特征在于，所述的步骤b2)中将氯仿与甲醇溶剂系统按照体积比95:5，90:10，80:20依次洗脱目标馏分，获得β-胡萝卜苷。

9.一种如权利要求1～8任一所述的方法提取的β-谷甾醇和β-胡萝卜苷在制备抗衰老药物中的应用。

10.一种抗衰老药物或保健品，其特征在于，由权利要求1～8任一所述的方法提取的β-谷甾醇和β-胡萝卜苷与药学上可接受的载体组成。