CN104491834A - 含有稠李多糖的抗胃癌保健品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有稠李多糖的抗胃癌保健品。按重量百分比组成如下：稠李多糖30％-50％，稠李花色苷20％-40％，高粱米多肽5％-10％，板栗多肽5％-10％，生米仁提取物5％-10％，丹参提取物5％-10％，麝香提取物5％-10％，藤梨根提取物5％-10％。对其所具有的预防和抗胃癌功能进行动物实验研究，发现含有稠李多糖的组合物具有抗胃癌肿瘤的活性与功能，可以代替化学合成药物，避免过多的化学合成药物造成的毒副作用，使得稠李多糖组合物具有更广阔的发展前景，并且成为可以应用于保健品、药品中的新兴成分。

Description

含有稠李多糖的抗胃癌保健品

技术领域

本发明属于保健品领域，具体的涉及一种具有抗胃癌功能的含有稠李多糖的保健品。

背景技术

在我国胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居各类肿瘤的首位，我国每年约有17万人死于胃癌，接近所有恶性肿瘤死亡人数的1/4，且每年还有2万多新生胃癌患者，胃癌严重威胁着人类的健康，给患者带来无尽的痛苦，给社会带来沉重的负担。比起其它癌症，胃癌是一类更复杂，具有多因素的疾病，有研究表明，90％以上的胃癌都是胃腺癌，其它的或是以间质组织为主的肉瘤或是淋巴瘤，在全球范围都有很高的死亡率。

胃癌的发病原因有多种因素，如没有良好的生活习惯、饮食不规律、病因来自父母的遗传、与患者的精神因素等有关，也可能由慢性胃炎、胃黏膜异形增生、胃息肉、手术后残胃以及长期幽门螺杆菌(HP)的感染等有关。胃癌可发生在胃的任何部位，多见于胃窦部，尤其是胃小弯侧。胃癌根据癌组织浸润深度可分为早期胃癌、中期胃癌和晚期胃癌。胃癌早期症状可能是简单的上腹部不适、泛酸、隐痛、食欲减退，容易被忽略其严重性，但随着病情的发展，胃部症状渐渐转变成明显的上腹部疼痛、贫血、食欲不振、体重减轻等症状，待胃癌后期常常伴有癌肿转移、腹部出现肿块、淋巴结转移、黑便、腹水及严重营养不良等。

目前，治疗胃癌的方法有手术治疗、化疗、化学药物治疗、免疫治疗和内镜下治疗等。而化学药物治疗在胃癌的治疗方案中越来越占主要的地位。化学药物治疗虽然可直接杀伤肿瘤细胞，但其副反应严重，使患者免疫力下降。

随着国内生活水平的逐步提高和人们对化学药物疗法副作用的意识增强，天然物质作为治疗胃癌的有效药物成为近年来研究的热点。天然植物多糖、花色苷的独特的抗癌作用越来越多的被发掘和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种不仅有明显的抗胃癌功效并可以明显的起到预防胃癌的功能，无毒副作用，绿色的含有稠李多糖的抗胃癌保健品。

本发明采用的技术方案是：含有稠李多糖的抗胃癌保健品，由以下原料按重量百分比组成：

本发明涉及的稠李多糖是由稠李提取的，采用超声波-微波-复合酶酶解分步法的工艺组合提取稠李多糖。稠李花色苷也是由稠李提取的，采用复合酶酶解-微波-超声波分步法的工艺组合提取稠李花色苷。

采用超声波-微波-复合酶酶解分步法的工艺组合提取稠李多糖并通过Sephadex G-200层析纯化的步骤如下：

1)超声浸提：将稠李果实去柄，破碎，去核，放入零下80℃冰箱冷冻过夜，在冷冻干燥机中干燥，待干燥之后取出，研磨成粉。将稠李冻干粉溶于水中，料液比按质量比1:10-1:50，控制温度为50-90℃，pH值5.0-9.0，超声波功率为100W-500W，超声时间为10min-50min，离心，收集提取液继续进行微波提取；

2)微波辅助提取：取提取液，微波功率300W-500W，微波时间为20min-60min，离心，收集提取液继续进行复合酶酶解；

3)复合酶酶解提取：取提取液，加入提取液重量1.0％-5.0％的复合酶，控制温度为30-60℃，pH 3.0-6.0，酶解时间为30min-60min，离心，抽滤，取滤液，滤液旋转蒸发浓缩，加入4倍体积的95％乙醇沉淀多糖，3000r/min离心后去除上清液，沉淀冷冻干燥，得稠李粗多糖。所述的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:0.5～2的混合；

4)将冷冻干燥的稠李粗多糖加入适量蒸馏水重新溶解，Sephadex G-200层析进行分离纯化，用蒸馏水洗脱，流速为1ml/min，每2ml收集一试管，用硫酸-蒽酮法跟踪检测至无糖，收集含量最多的多糖组分在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥，进行后续实验。用DEAE-32进一步纯化，磷酸盐缓冲液-水作为流动相，梯度模式进行洗脱，流速为0.8ml/min，每2ml收集一试管，用硫酸-蒽酮法跟踪检测至无糖，收集含量最多的多糖组分。

采用复合酶酶解-微波-超声波分步法的工艺组合提取稠李花色苷并用AB-8大孔树脂进行静态纯化的步骤如下：

1)复合酶酶解提取：将稠李果实去柄，破碎，去核，放入零下80℃冰箱冷冻过夜，在冷冻干燥机中干燥，待干燥之后取出，研磨成粉。料液比按质量比1:10-1:50，将稠李冻干粉溶于水，复合酶加入量为稠李冻干粉的总重量的1.0％-5.0％，进行热水浸提，控制温度为30-70℃，pH范围值3.0-6.0酶解时间为30min-60min，离心，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行微波提取；所用的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:0.5～2的混合；

2)微波辅助提取：料液比按质量比1:10-1:15，将酶解后的沉淀物溶于水，微波功率300W-500W，微波时间为20min-60min，离心，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行超声浸提；

3)超声浸提：料液比按质量比1:10-1:15，将微波后的沉淀物溶于乙醇中，超声波功率为100W-500W，超声时间为10min-50min，pH值为2-6，抽滤，提取液备用；

4)合并复合酶酶解的提取液、微波辅助的提取液和超声浸提的提取液，提取液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到粗稠李花色苷干粉；

5)大孔树脂静态纯化：粗稠李花色苷干粉配成8mg/ml的水溶液，静态吸附条件是：温度20℃，树脂的添加量为0.16g/ml；解析条件是：解吸剂70％乙醇，pH值为3，温度为60℃，得稠李花色苷干粉。

本发明的有益效果是：首次采用天然植物稠李果实提取的多糖、花色苷作为活性物质，制备抗胃癌保健品，不存在合成药剂的毒副作用，而且服用和携带十分方便，吸收快速且效果好，因此拥有十分广阔市场前景。

附图说明

图1是实施例1稠李多糖组合物对人胃癌细胞BGC823生长影响。

图2是实施例1稠李多糖组合物抑制人胃癌细胞BGC823集落形成的集落试验结果。

图3稠李多糖组合物对人胃癌细胞BGC823进行细胞迁移实验。

具体实施方式

实施例1 含有稠李多糖的抗胃癌保健品

(一)稠李多糖的制备

采用超声波-微波-复合酶酶解分步法的工艺组合提取稠李多糖并通过Sephadex G-200层析纯化的步骤如下：

1)超声浸提：将稠李果实去柄，破碎，去核，放入零下80℃冰箱冷冻过夜，在冷冻干燥机中干燥，待干燥之后取出，研磨成粉。将稠李冻干粉溶于水中，料液比按质量比1:30，控制温度为60℃，pH值7.0，超声波功率为400W，超声时间为40min，3000r/min进行离心15min，收集提取液继续进行微波提取；

2)微波辅助提取：取超声后的提取液，微波功率400W，微波时间为40min，3000r/min进行离心15min，收集提取液继续进行复合酶酶解；

3)复合酶酶解提取：取微波后的提取液，加入其总重量4.0％的复合酶，控制温度为50℃，pH 4.0，酶解时间为40min，3000r/min进行离心15min，抽滤，滤液旋转蒸发浓缩，加入4倍体积的95％乙醇沉淀多糖，3000r/min离心后去除上清液，冷冻干燥，得稠李粗多糖。所述的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:1的混合；

4)将冷冻干燥的稠李粗多糖加入适量蒸馏水重新溶解，Sephadex G-200层析进行分离纯化，用蒸馏水洗脱，流速为1ml/min，每2ml收集一试管，用硫酸-蒽酮法跟踪检测至无糖，收集含量最多的多糖组分在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥，进行后续实验。用DEAE-32进一步纯化，磷酸盐缓冲液-水作为流动相，梯度模式进行洗脱，流速为0.8ml/min，每2ml收集一试管，用硫酸-蒽酮法跟踪检测至无糖，收集含量最多的多糖组分。

(二)稠李花色苷的制备

本实施例采用超声波-微波-混合酶酶解分步法的工艺组合提取稠李花色苷并用AB-8大孔树脂进行静态纯化，步骤如下：

1)复合酶酶解提取：将稠李果实去柄，破碎，去核，放入零下80℃冰箱冷冻过夜，在冷冻干燥机中干燥，待干燥之后取出，研磨成粉。将稠李冻干粉溶于水，料液比按质量比1:30，所用的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:1的混合，复合酶加入量为稠李冻干粉的总重量的3.0％，进行热水浸提，控制温度为50℃，pH范围值5.0酶解时间为50min，6000r/min进行离心10min，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行微波提取；

2)微波辅助提取：料液比按质量比1:10，将酶解后的沉淀物溶于水中，微波功率400W，微波时间为40min，6000r/min进行离心10min，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行超声浸提；

3)超声浸提：料液比按质量比1:10，将微波后的沉淀物溶于60％乙醇中，超声波功率为400W，超声时间为30min，pH值为4，抽滤，提取液备用；

4)合并复合酶酶解的提取液、微波辅助的提取液和超声浸提的提取液，提取液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到粗稠李花色苷干粉；

5)大孔树脂静态纯化：粗稠李花色苷干粉配成8mg/ml的水溶液，静态吸附条件是：温度20℃，树脂的添加量为0.16g/ml；解析条件是：解吸剂70％乙醇，pH值为3，温度为60℃，得稠李花色苷干粉。

(三)高粱米多肽的制备

木瓜蛋白酶提取高粱米多肽步骤如下：

1)将高粱米粉碎，按料液比为1:15，在pH为10的氢氧化钠溶液中浸泡3h，提取温度为50℃，5000r/min离心20min，取上清液，用90％硫酸铵进行沉淀，再次离心，分离得到沉淀，进行冷冻干燥得到高粱米蛋白；

2)将高粱米蛋白配成8％的水溶液，pH调节为6.5，酶活添加量为6000u/g料，温度为60℃，提取时间为3h，然后沸水浴10min灭酶，3500r/min离心15min，取上清，纯净水透析、采用截留分子量为l0kDa超滤板超滤后进行冷冻干燥，得到高粱米多肽粉末。

(四)板栗多肽的制备

1)板栗去皮干燥后，用粉碎机粉碎，按料液比为1:10，加入pH为11的NaOH溶液中，提取温度为50℃，时间为3h，离心收集沉淀，冷冻干燥制备板栗蛋白。

2)复合酶分步水解：首先，以复合风味蛋白酶进行水解，然后再以碱性蛋白酶水解制备板栗多肽，复合风味蛋白酶酶解条件为：pH6，酶活添加量为6000u/g料，时间1h，温度55℃，碱性蛋白酶酶解条件为：pH 8，酶活添加量为6000u/g料，时间3h，温度50℃；将水解液加热到100℃，保持10min杀灭酶的活力；采用截留分子量为l0kDa超滤板超滤得到的酶解液，收集分子量为10kDa以下的酶解液；将酶解液用低温冷冻干燥机制得板栗多肽粉末。

(五)生米仁提取物的制备

在室温条件下，称量粉碎成200目的生米仁固体粉末；按质量比1:10比例称取生米仁固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得生米仁提取物。

(六)丹参提取物的制备

在室温条件下，称量粉碎成200目的丹参固体粉末；按质量比1:10比例称取丹参固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得丹参提取物。

(七)麝香提取物的制备

在室温条件下，称量粉碎成200目的麝香固体粉末；按质量比1:10比例称取麝香固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得麝香提取物。

(八)藤梨根提取物的制备

在室温条件下，称量粉碎成200目的藤梨根固体粉末；按质量比1:10比例称取藤梨根固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得藤梨根提取物。

(九)含有稠多糖的抗胃癌保健品组合物

由以下原料按重量百分比组成：

(十)含有稠多糖的抗胃癌保健品组合物在体外抑制人胃癌细胞生长

本实施例使用人胃癌细胞BGC823，采用MTT法检测稠李多糖组合物体外抗癌活性，实验步骤如下：

1)取对数生长期的胃癌细胞BGC823接种于96孔板，过夜培养使其贴壁；

2)稠李多糖组合物的浓度(25、50、100、150和200μg/ml)；

3)分别在24,48,or 72h后加入MTT(5mg/ml)；

4)然后将96孔板放在37℃恒温培养箱中继续培养4h；

5)处理结束后，将MTT吸出，加入150μl的DMSO，使甲瓒晶体完全溶解；

6)通过测量每个孔在490nm处的吸光度值来评估BGC823细胞的增值；

由图1可见，稠李多糖组合物在体外对人胃癌细胞的生长情况起到很强的抑制作用。当稠李多糖组合物浓度为50μg/mL，培养72h时，人胃癌细胞BGC823的活力就降低了22％；当稠李组合物物浓度为100μg/mL，培养72h时，人胃癌细胞BGC823的活力就降低了34％；当稠李组合物物浓度为200μg/mL，培养72h时，人胃癌细胞BGC823的活力就降低了50％。因此，稠李多糖组合物对胃癌细胞具有很强的抑制作用。

(十一)含有稠李多糖的抗胃癌保健品组合物集落形成实验

不同的处理组的BGC823细胞以每孔1000个细胞的密度接种于孔板上，培养过夜使其贴壁。分别加入100μg/ml和200μg/ml的稠李多糖组合物培养10d，吸出培养基，每孔用PBS仔细洗两次。使用甲醇将集落固定20分钟，然后用0.5％结晶紫染色15分钟，用清水冲洗并拍照。将集落大于0.2mm的集落进行计数。结果如图2所示。

如图2所示，稠李多糖组合物抑制人胃癌细胞BGC823细胞集落形成。随着稠李多糖组合物浓度的增加，人胃癌细胞BGC823的集落数在显著减少。说明稠李多糖组合物处理人胃癌细胞BGC823的集落形成具有抑制作用。

(十二)含有稠李多糖的抗胃癌保健品组合物的Transwell实验

肿瘤细胞迁移实验采用直径为6.5mm的transwell小室，其中内孔大小为8.0μm。将BGC823细胞血清饥饿24h，然后使用胰蛋白酶消化，计数，并用无血清DMEM培养基重悬。大约1×105细胞被接种到上层小室，下层小室加入含有10％胎儿牛血清的DMEM培养基。细胞放在37℃培养24h。培养后，上层小室内表面的细胞被迁移。将穿过小室的细胞固定和染色并在显微镜下统计。每个实验组做三个平行取其平均值。结果如图3所示。

由图3可见，第一组为对照组；第二组为稠李多糖组合物为50μg/ml；第三组为稠李多糖组合物200μg/ml，结果表明与对照组相比，稠李多糖组合物组随着浓度的增加，对人胃癌细胞BGC823的迁移能力抑制作用增加。以上结果证明，稠李多糖组合物在一定的剂量范围内，对胃癌细胞具有较好的抑制作用，对于胃癌的防治有着非常显著的效果。

实施例2 含有稠李多糖的抗胃癌保健品

含有稠李多糖的抗胃癌保健品，由以下原料按重量百分比组成：

实施例3 含有稠多糖的抗胃癌保健品

含有稠李多糖的抗胃癌保健品，由以下原料按重量百分比组成：

Claims (9)

1.含有稠李多糖的抗胃癌保健品，其特征在于由以下原料按重量百分比组成：

2.如权利要求1所述的含有稠李多糖的抗胃癌保健品，其特征在于：稠李多糖的制备方法如下：

1)超声浸提：料液比按质量比1:10-1:50，将稠李冻干粉溶于水中，控制温度为50-90℃，pH值5.0-9.0，超声波功率为100W-500W，超声时间为10min-50min，离心，取提取液继续进行微波提取；

2)微波辅助提取：取提取液，微波功率300W-500W，微波时间为20min-60min，离心，取提取液继续进行复合酶酶解；

3)复合酶酶解提取：取提取液，复合酶加入量为提取液重量的1.0％-5.0％，控制温度为30-60℃，pH 3.0-6.0，酶解时间为30min-60min；抽滤，滤液旋转蒸发浓缩，加入4倍体积的95％乙醇沉淀多糖，离心，去除上清液，冷冻干燥。

3.如权利要求2所述的含有稠李多糖的抗胃癌保健品，其特征在于：所述的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:0.5～2的混合。

4.如权利要求1所述的含有稠李多糖的抗胃癌保健品，其特征在于：所述的稠李花色苷的制备方法如下：

1)复合酶酶解提取：料液比按质量比1:10-1:50，将稠李冻干粉溶于水，复合酶加入量为稠李冻干粉的总重量的1.0％-5.0％，进行热水浸提，控制温度为30-70℃，pH范围值3.0-6.0，酶解时间为30min-60min，离心，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行微波提取；

2)微波辅助提取：料液比按质量比1:10-1:15，将沉淀物溶于水，微波功率300W-500W，微波时间为20min-60min，离心，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行超声浸提；

3)超声浸提：料液比按质量比1:10-1:15，将沉淀物溶于乙醇中，超声波功率为100W-500W，超声时间为10min-50min，pH值为2-6，抽滤，提取液备用；

4)合并复合酶酶解的提取液、微波辅助的提取液和超声浸提的提取液，提取液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到粗稠李花色苷干粉；

5)大孔树脂静态纯化：粗稠李花色苷干粉配成8mg/ml的水溶液，静态吸附条件是：温度20℃，树脂的添加量为0.16g/ml；解析条件是：解吸剂70％乙醇，pH值为3，温度为60℃，得稠李花色苷干粉。

5.如权利要求4所述的含有稠李多糖的抗胃癌保健品，其特征在于：所述的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:0.5～2的混合。

6.如权利要求1所述的含有稠李多糖的抗胃癌保健品，其特征在于：所述的生米仁提取物的制备方法：在室温条件下，称量粉碎成200目的生米仁固体粉末；按质量比1:10比例称取生米仁固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得生米仁提取物。

7.如权利要求1所述的含有稠李多糖的抗胃癌保健品，其特征在于：所述的丹参提取物的制备方法：在室温条件下，称量粉碎成200目的丹参固体粉末；按质量比1:10比例称取丹参固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得丹参提取物。

8.如权利要求1所述的含有稠李多糖的抗胃癌保健品，其特征在于：所述的麝香提取物的制备方法：在室温条件下，称量粉碎成200目的麝香固体粉末；按质量比1:10比例称取麝香固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得麝香提取物。

9.如权利要求1所述的含有稠李多糖的抗胃癌保健品，其特征在于：所述的藤梨根提取物的制备方法：在室温条件下，称量粉碎成200目的藤梨根固体粉末；按质量比1:10比例称取藤梨根固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得藤梨根提取物。