CN101736064A

CN101736064A - 酶解海洋贝类免疫增强肽的制备方法与应用

Info

Publication number: CN101736064A
Application number: CN201010011892A
Authority: CN
Inventors: 张玉忠; 王昱凯; 何海伦; 陈秀兰; 周百成
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2010-01-20
Filing date: 2010-01-20
Publication date: 2010-06-16

Abstract

本发明涉及利用酶工程技术酶解海洋扇贝、四角蛤、牡蛎等海洋贝类，制备免疫增强肽的技术方法，属于应用海洋生物技术领域。本发明通过利用枯草芽孢杆菌(Bacillus.Subtilis SM98011)产生的蛋白酶对海洋贝类进行酶解，得到了具有抗肿瘤活性与免疫增强活性的活性肽。由于海洋蛋白具有其特殊性和丰富性，因此为人类研究肿瘤发病机理，研制抗肿瘤药物，提高免疫机能提供了新的途径。

Description

酶解海洋贝类免疫增强肽的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及利用酶工程技术酶解海洋扇贝、四角蛤、牡蛎等海洋贝类，制备免疫增强肽的技术方法，属于应用海洋生物技术领域。

背景技术

免疫是机体对病原微生物侵袭的防卫功能及维持内环境的稳定—清除衰老、死亡、受伤细胞和监视、清除突变细胞的功能，当机体免疫功能低下或障碍时，将会发生重症感染、肿瘤和肌体早衰等。随着人们对疾病治疗观念的转变，治疗的重点已经由直接杀伤外源性病原体转向调整生物机体自身功能，从而免疫增强剂在医学的应用引起了广泛的关注，免疫增强剂的研究已经成为医学最活跃的研究领域之一，寻找天然的免疫调节剂，增强机体免疫是当今肿瘤治疗的重要而有效的途径。

多数海洋贝类提取物的抗肿瘤活性与其免疫增强活性相关，即通过增强机体免疫能力而达到抑制和消除肿瘤的功效。目前人们已经从海洋贝类动物中发现了多种有抑瘤作用的物质。如从文蛤(Meretrix meretrixLin-naeus)中提取的蛤素(mercenene)对肿瘤和白血病有预防和抑制作用；从虾夷盘扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)分离的扇贝多肽，糖蛋白都有抗癌作用。从紫贻贝(Mytilus edulis)和地中海贻贝(Mytilusgalloprovincials)中分离出的多种抗菌肽：防御素(defensin)、贻贝素(mytilin)、贻贝肽(myticin)和贻贝霉素(mytimycin)，皆为小分子肽。

活性肽的抗肿瘤作用大多是通过增强机体特异性和非特异性免疫功能、促进细胞活性因子生成、抗自由基与辐射损伤、促进癌细胞凋亡及直接作用于肿瘤细胞等多种机制而实现的。运用生物技术手段从大量的蛋白资源中酶解获取新的免疫增强肽，这是在功能肽的研究与开发过程中解决肽源问题、实现海洋水产品综合利用的一个可行的现实途径。如公开号为CN1660888的中国专利，公开了利用枯草芽孢杆菌(Bacillus.Subtilis SM98011)从中国毛虾的蛋白酶解产物中分离纯化出新的具有六个氨基酸的降压肽，具有较高的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。

已有报道从陆地蛋白资源的酶解物中分离到的免疫增强活性肽具有很好的免疫促进及抑制肿瘤的效果，而来源于海洋蛋白酶解产物的免疫增强肽及相应的疗效还少有报道，海洋蛋白以其特殊性和丰富性必将成为酶解制备新型免疫增强肽的更大的资源库。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用酶工程和生化工程技术，酶解海洋贝类制备具有免疫增强活性的酶解短肽产品，可用于肿瘤患者或免疫力低下的人群的康复治疗。

一种酶解海洋贝类免疫增强肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus.Subtilis SM98011)依次经种子培养基、三角瓶液体发酵培养基、罐发酵培养基发酵培养后，离心，取上清液，得粗酶液；

(2)取海洋贝类，去壳后，经匀浆机(江苏省金坛市宏华仪器厂，型号FSH-2)匀浆，得贝类糜；

(3)向步骤(2)制得的贝类糜中加入步骤(1)制得的粗酶液，添加量为每千克贝类糜添加450,000～550,000活力单位的粗酶液，45～55℃酶解4～6h，然后升温至90℃，保温15min灭酶活，然后降温至70℃，取酶解液，离心机(德国eppendorf，5804R)离心，浓缩，干燥(无锡博达化机厂，QZ-5型移动式喷雾干燥机)，得酶解海洋贝类免疫增强肽。

所述步骤(2)中的海洋贝类，选自扇贝、四角蛤或牡蛎之一或其组合。

所述步骤(1)中的种子培养基组份如下：蛋白胨1％，酵母粉0.3％，葡萄糖1％，琼脂1.6％，余量水，pH 7.2-7.5；培养条件：28～30℃，120rpm，摇床培养36小时。

所述步骤(1)中的三角瓶液体发酵培养基组份如下：玉米粉2％，麸皮1％，豆粕2％，Na₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄ 0.03％，CaCl₂ 0.1％，Na₂CO₃ 0.1％，余量水，pH 7.2-7.5；接种量：5wt％液体种子，培养条件：28～30℃，180rpm，摇床培养36小时。

所述步骤(1)中的罐发酵培养基组份如下：玉米粉2％，麸皮1％，豆粕2％，Na₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄ 0.03％，CaCl₂ 0.1％，Na₂CO₃ 0.1％，余量水，pH 7.2-7.5；接种量：5wt％液体种子，培养条件：溶氧DO维持在20％以上，28～30℃，培养36小时。

所述步骤(3)中的活力单位定义为在最适酶活温度下，每分钟催化酪蛋白水解生成1微克酪氨酸的酶量为1个活力单位。

由上述制备方法制得的海洋贝类免疫增强肽。该产品呈金黄色略带绿色粉末状，带海洋贝类的鲜香味，易溶于水，水溶液澄清透明，略带金黄色。

上述海洋贝类免疫增强肽在抗肿瘤活性与免疫增强活性治疗中的应用。

本发明通过利用枯草芽孢杆菌(Bacillus.Subtilis SM98011)产生的蛋白酶对海洋贝类进行酶解，得到了具有抗肿瘤活性与免疫增强活性的活性肽。由于海洋蛋白具有其特殊性和丰富性，因此为人类研究肿瘤发病机理，研制抗肿瘤药物，提高免疫机能提供了新的途径。

附图说明

图1是海洋贝类小试、中试及工业化生产的酶解液中贝类免疫增强肽的HPLC图谱；其中：A、工业化生产酶解液，B、中试酶解液，C、小试酶解液；

图2是海洋贝类工业化生产的酶解液、浓缩液及喷雾干燥样品中肽谱的HPLC图谱；其中：A、喷雾干燥样品，B、酶解上清液，C、浓缩酶解液；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例

1、粗酶液的发酵制备：

(1)本发明使用的菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus.Subtilis SM98011)。

(2)种子培养基及其制备：采用LB培养基：蛋白胨1％，酵母粉0.3％，葡萄糖1％，pH7.2-7.5。装液量100mL/500mL三角瓶，28～30℃，120rpm，培养36小时。斜面固体培养基添加琼脂1.6％。

(3)三角瓶液体发酵培养基及发酵产酶：玉米粉2％，麸皮1％，豆粕2％，Na₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄ 0.03％，CaCl₂ 0.1％，Na₂CO₃ 0.1％，pH 7.5，装液量50mL/500mL三角瓶，180rpm，发酵72h，离心，上清液即为粗酶液(蛋白酶SM98011)。

(4)5L罐发酵培养基及发酵产酶：玉米粉2％，麸皮1％，豆粕2％，Na₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄0.03％，CaCl₂ 0.1％，Na₂CO₃ 0.1％，pH 7.5。装3.5L培养基，灭菌后pH 7.5，接种5％(重量百分比)液体种子，溶氧DO维持在20％以上，控制培养温度为28℃，发酵36h，离心得上清液即为粗酶液(蛋白酶SM98011)。

(5)200L发酵罐培养基及发酵产酶：玉米粉2％，麸皮1％，豆粕2％，Na₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄ 0.03％，CaCl₂ 0.1％，Na₂CO₃ 0.1％，pH 7.5。装150L培养基，灭菌后pH 7.5，接种5％(重量百分比)液体种子，控制通气量为5L/min，控制培养温度为28℃，发酵36h，离心得上清液即为粗酶液(蛋白酶SM98011)。

(6)蛋白酶SM98011的酶活测定

采用福林酚法，以2wt％酪蛋白为底物。用0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.0)将酶液稀释合适的倍数，取1mL稀释好的酶液，在一定的温度下保温2min，加入同样温度的底物1mL，恒温下反应10min后，加入2mL 0.4mol/L的三氯乙酸终止反应，在40℃下保温15min后，10,000g离心10min，取1mL上清液加入5mL 0.4mol/L的碳酸钠，混匀后加入1mL福林试剂，混匀后在40℃保温20min，然后用722分光光度计测定660nm处的OD值。标准曲线用不同浓度的酪氨酸来制定。酶活力定义为在最适酶活温度下，每分钟催化酪蛋白水解生成1微克酪氨酸的酶量为1个单位(U)。

2、免疫增强肽的制备

(1)海洋贝类酶解的小试工艺

将去壳鲜贝类(扇贝、四角蛤、牡蛎等)用匀浆机匀浆，称重50g到250mL的三角瓶中，每瓶中加入活力为2500U/mL的酶液10mL和40mL的蒸馏水，对照瓶中加入50mL的蒸馏水，混匀，放入50℃的水浴摇床在150转/分钟的转速下酶解5h，然后迅速把酶解液加热到90℃，保温10min，使酶灭活。取酶解物8000g离心20min，将上清用分子量3000Da的膜超滤(Amicon PM-3 membrane，Milllipore Co.Bediord，USA)，得到分子量小于3000Da的滤过液，即为酶解液，冻干备用。

(2)海洋贝类酶解的中试及工业化生产技术工艺

100L罐酶解：鲜贝类(扇贝、四角蛤、牡蛎等)去壳后用搅拌机匀浆，称取40kg贝类糜到100L的酶解罐中，然后加入500,000U/kg的酶液，最后用水补足到总体积75L，连续搅拌，在50℃下酶解5h，然后迅速把酶解罐加热到90℃，保温15min使酶灭活。降到70℃后，将酶解液放出，用连续离心机离心，然后经过二级浓缩塔(恒泰化工设备厂，WZ型系列)浓缩，将得到的浓缩液在喷雾干燥器里喷雾干燥。

10吨罐酶解：将从大鱼岛集团购得的牡蛎去壳后搅拌机匀浆，称取3000kg到10吨的酶解罐中，然后加入500,000U/kg的酶液，最后用水补足到总体积7500L，连续搅拌，在50℃下酶解5h，然后迅速把酶解罐加热到90℃，保温15min使酶灭活。降到70℃后，将酶解液放出，用连续过滤机过滤(江苏巨能机械有限公司，GXG系列多功能过滤机)，然后泵入三级浓缩塔(恒泰化工设备厂，WZ型系列)浓缩，将得到浓缩液在干燥塔里喷雾干燥。

3、免疫增强肽的质量检测

(1)海洋贝类小试、中试酶解产物的氨基酸组成分析

游离氨基酸测定方法：酶解液上清(1mL)加入4％的磺基水杨酸(1mL)，混匀，静置30min，4℃ 10,000g离心15min。上清游离氨基酸分析在HITACHI 835氨基酸自动分析仪上进行。

全水解氨基酸：取1mL的蛋白酶酶解液，加入等体积的6mol/L HCl，在110℃水解22h，然后通过真空干燥使HCl完全挥发，干燥的样品重新溶于0.1mol/L的琥珀酸缓冲液中(pH 2.2)。重溶的样品在HITACHI 835氨基酸自动分析仪分析，所得结果为样品的全水解氨基酸。

肽含量：T肽(％)＝(W总-WFAA)/W总，

其中W总：肽与游离氨基酸混合物重；WFAA：游离氨基酸重。

上述中试及工业化酶解过程中，上清液颜色橙黄，沉淀为深黄色，都带有浓郁的鲜香味。然后在50℃左右经真空浓缩得到浓缩液，酶解液被浓缩了8倍左右。最后喷雾干燥得到粉状制品，制品呈金黄色略带绿色粉末状，带海洋贝类的鲜香味，易溶于水，水溶液澄清透明，略带金黄色。得到上清液中肽的含量为可溶性蛋白的58.6％。说明海洋贝类在经过蛋白酶SM98011酶解后的酶解产物绝大多数为肽类物质。

(2)海洋贝类小试、中试、工业化生产的酶解产物的肽谱分析

将海洋贝类的酶解产物用分子量3000 Da的膜超滤(Amicon PM-3 membrane MillliporeCo.Bediord，USA)，得到分子量小于3000Da的滤过液。

再将超滤液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将滤过液上高压液相色谱(HPLC)反相柱进行肽的分析。洗脱方法为：前40min内，洗脱液从95％的流动相A(含0.1％TFA的蒸馏水)变化到50％流动相B(含0.1％TFA的甲醇溶液)，再回到95％流动相A，整个梯度洗脱过程为60min，流速为0.8mL/min，紫外检测器的检测波长为214nm。结果见图1，从HPLC检测表明，虽然试验规模不断放大，但酶解液的肽分布基本上没有变化，呈现较稳定的规律性，为该产品实行规模化生产提供了可靠的依据。

进一步将海洋贝类工业化生产过程中得到的酶解上清液，浓缩液和干粉分别进行稀释离心和重溶稀释离心处理，将配制好的合适浓度的样品溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将滤过液上高压液相色谱反相柱进行肽的分析，结果如图2所示。

从HPLC检测表明，虽然在整个海洋贝类工业化生产的过程中经过了50℃高速搅拌酶解，90℃高温灭酶活，高温浓缩和喷雾干燥等条件剧烈的加工步骤，但是各部之间酶解液中的肽分布还是保持了较好的重复性，说明剧烈的加工条件对分子量较小的肽的影响不大，为进一步功能评价提供了可靠的依据。

4、免疫增强肽的性能检测

(1)实验动物及细胞

普通级BALB/c小鼠，6～8周龄共63只，雌性，体重18～22g；腹水瘤小鼠2只。YAC-1细胞系。

(2)分组及给药剂量

63只BALB/c小鼠置于密封特殊动物房适应性喂养2天后平均分成7个组，分别为空白对照组，低剂量组(灌胃剂量250mg/kg)，中剂量组(500mg/kg)，高剂量组(1000mg/kg)，粗品组(未经超滤粗样1000mg/kg)，阴性对照组(灌胃生理盐水25mL/kg)，阳性对照组(腹腔注射环磷酰氨20mg/kg)。阳性对照组腹腔注射环磷酰氨2日一次，每次0.2mL；其它组灌胃牡蛎酶解液每日一次，一次0.5mL，连续给药14天。

(3)瘤种准备及接种

除正常对照组，其他小鼠提前一天接种鼠肉瘤细胞株S180。肿瘤移植要求在无菌条件下进行。将腹水瘤种鼠拉颈处死，用酒精棉球消毒其腹部皮肤，再用无菌注射器抽取腹水，用生理盐水稀释5倍，混匀。用无菌注射器按0.2mL/只接种于小鼠右前侧腋下皮下，建立实体瘤模型。整个接种时间应尽量短，一般不超过30min以上。接完后分笼贴标签饲养。

(4)小鼠体重变化及脏器/体重比值

用电子称称量小鼠每日体重变化。最后拉颈处死动物，无菌条件下取胸腺、脾脏称重，计算脏器/体重比值。同时制备脾细胞悬液，进行淋巴细胞转化试验和NK细胞活性试验。

^*与阴性对照组相比显著性P＜0.05.^**与阴性对照组相比显著性P＜0.01.^***与阴性对照组相比显著性P＜0.001.

(5)瘤重及抑瘤率

拉颈处死小鼠后，取瘤称重。

(6)小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验

鸡红细胞悬液制备：活鸡心脏取血，按30U/mL鸡血加入肝素钠，用生理盐水洗涤2-3次后离心(2000r/min，10min)，去上清，用生理盐水配成20％(v/v)的鸡红细胞悬液。

吞噬功能测定：实验前2天向小鼠腹腔注射3％淀粉溶液(含0.4％台盼蓝，起标记作用)进行免疫以刺激腹腔产生较多的巨噬细胞。实验时向小鼠腹腔注射20％的鸡红细胞悬液1mL，轻揉腹部使鸡红细胞分散。15～20min后，拉颈处死小鼠。将小鼠置于解剖盘中，剪开腹腔，把内脏推向一侧，用吸管吸取腹腔液，滴在载玻片上，用瑞氏染液染色3min，漂洗晾干后镜检。

油镜计数巨噬细胞：每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。

(7)ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)

脾细胞悬液制备：无菌取脾，用镊子将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，用无菌Hank’s液洗涤2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL的RPMI1640完全培养液中，调整细胞浓度为5×10⁶个/mL。

淋巴细胞增殖反应：将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μL100μg/mL的ConA液，另一孔作为对照。置5％CO₂，37℃CO₂培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3～6孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值，以加ConA孔的OD值减去不加ConA孔的OD值代表示淋巴细胞的增殖能力。

(8)NK细胞活性测定

靶细胞的制备(YAC-1细胞)：实验前24h将靶细胞进行传代培养。使用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×10⁴个/mL。

NK细胞活性检测：在U型96孔培养板的实验孔中分别加入效应细胞和靶细胞各100μL，效靶比例为50∶1；在效应细胞对照孔，加入效应细胞100μL和RPMI 1640液100μL；在靶细胞对照孔，加入靶细胞100μL和RPMI 1640液100μL；上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养20h，然后每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h，吸去部分上清，100μL/孔，各孔加入100％ DMSO，100μL/孔，振荡、溶解，10min后，在酶联免疫吸附测定仪上，579nm处测定光密度值(OD)。

其中OD_s为实验孔的平均OD值，OD_E是效应细胞对照孔的平均OD值，OD_T是靶细胞对照孔的平均OD值。

运用balb/c小鼠接种S180瘤种建立荷瘤小鼠模型，灌胃牡蛎酶解产品检测其对小鼠体内S180肉瘤生长的影响。并选用单核-巨噬细胞吞噬功能、NK细胞杀伤活性及ConA诱导的淋巴细胞转化能力测定等几项实验，研究牡蛎酶解物的免疫增强活性。结果表明，牡蛎酶解物对S180肉瘤生长有抑制作用，同时能提高胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、NK细胞活性及淋巴细胞转化能力，对单核-巨噬细胞吞噬能力无影响。实验说明牡蛎酶解物有增强小鼠免疫能力的作用。为开发牡蛎抗肿瘤活性药物和功能性食品奠定了一定的试验基础。

^*与阴性对照组相比显著性P＜0.05.^**与阴性对照组相比显著性P＜0.01.^***与阴性对照组相比显著性P＜0.001。

Claims

1.一种酶解海洋贝类免疫增强肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(2)取海洋贝类，去壳后，经匀浆机匀浆，得贝类糜；

(3)向步骤(2)制得的贝类糜中加入步骤(1)制得的粗酶液，添加量为每千克贝类糜添加450,000～550,000活力单位的粗酶液，45～55℃酶解4～6h，然后升温至90℃，保温15min灭酶活，然后降温至70℃，取酶解液，离心机离心，浓缩，干燥，得酶解海洋贝类免疫增强肽。

2.如权利要求1所述的酶解海洋贝类免疫增强肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的海洋贝类，选自扇贝、四角蛤或牡蛎之一或其组合。

3.如权利要求1或2所述的酶解海洋贝类免疫增强肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的种子培养基组份如下：蛋白胨1％，酵母粉0.3％，葡萄糖1％，琼脂1.6％，余量水，pH 7.2-7.5；培养条件：28～30℃，120rpm，摇床培养36小时。

4.如权利要求1或2所述的酶解海洋贝类免疫增强肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的三角瓶液体发酵培养基组份如下：玉米粉2％，麸皮1％，豆粕2％，Na₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄ 0.03％，CaCl₂ 0.1％，Na₂CO₃ 0.1％，余量水，pH 7.2-7.5；接种量：5wt％液体种子，培养条件：28～30℃，180rpm，摇床培养36小时。

5.如权利要求1或2所述的酶解海洋贝类免疫增强肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的罐发酵培养基组份如下：玉米粉2％，麸皮1％，豆粕2％，Na₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄ 0.03％，CaCl₂ 0.1％，Na₂CO₃ 0.1％，余量水，pH 7.2-7.5；接种量：5wt％液体种子，培养条件：溶氧DO维持在20％以上，28～30℃，培养36小时。

6.如权利要求1或2所述的酶解海洋贝类免疫增强肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的活力单位定义为在最适酶活温度下，每分钟催化酪蛋白水解生成1微克酪氨酸的酶量为1个活力单位。

7.由上述权利要求1制备方法制得的海洋贝类免疫增强肽。

8.权利要求7所述的海洋贝类免疫增强肽在抗肿瘤活性与免疫增强活性治疗中的应用。