CN112226477A - 一种新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法和应用，包括以下步骤：S1、取海洋贝类去壳去脏后进行清洗、打浆、匀浆，制得肉糜；S2、在经步骤S1制得的所述肉糜中加3‑6倍体积水，pH为6.4‑7.4，煮沸15‑30min，冷却至室温后先加入粗酶液，再加入蛋白酶进行酶解，酶解过程中同时进行超声处理，酶解结束后进行灭酶处理，在8000‑13000r/min的转速下离心10‑15min，上清液通过孔径为30‑55nm的滤膜进行超滤分离，收集经滤膜截留的大分子多肽液，喷雾干燥后，制得新型海洋贝类小分子免疫活性肽。本发明制备的新型海洋贝类小分子免疫活性肽除了具有显著的抗氧化活性外，还具有抑制酪氨酸酶活性、减少紫外损伤、抑制黑色素生成、促进皮肤新陈代谢和伤口愈合、促进毛发生长等作用。
Description
技术领域
本发明涉及应用海洋生物技术领域，尤其涉及一种新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法和应用。
背景技术
我国作为贝类养殖大国，海洋贝类养殖产量已达年均1000万吨以上，并且数量仍在不断增长，是我国海水养殖业的极其重要的一部分。但是，我国贝类除鲜销以外，贝类加工方式仍以人力为主，加工的产品以干制品和冷冻品等传统食品占主导，发展停滞在初级阶段。马氏珠母贝、翡翠贻贝、波纹巴非蛤等低值海洋贝类，其蛋白质营养价值高，氨基酸含量丰富且均衡，是优质的食品蛋白源。同时，这些海洋贝类蛋白酶解物中富含多肽、低聚肽、氨基酸等功能性营养成分，能够产生一些具有特殊生理功能的生物活性肽，可作为化妆品、营养食品和天然药物等的优质来源，具有广泛的应用前景，能使海洋低值贝类得到充分利用，实现其经济价值，为我国海洋贝类资源的高值化发展拓宽新的渠道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法和应用，使海洋贝类得到充分利用，实现其经济价值，对我国海洋贝类资源的高值化发展具有十分重要的意义。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明第一方面提供一种新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取海洋贝类去壳去脏后进行清洗、打浆、匀浆，制得肉糜；
S2、在经步骤S1制得的所述肉糜中加3-6倍体积水，pH为6.4-7.4，煮沸15-30min，冷却至室温后先加入粗酶液，再加入蛋白酶进行酶解，酶解过程中同时进行超声处理，酶解结束后进行灭酶处理，在8000-13000r/min的转速下离心10-15min，上清液通过孔径为30-55nm的滤膜进行超滤分离，收集经滤膜截留的大分子多肽液，并于进风温度为180-220℃，进料速度为30-45ml/min的条件下进行喷雾干燥后，制得新型海洋贝类小分子免疫活性肽；
其中，所述粗酶液的制备过程为：取假单胞菌(Pseudomonas sp.)nic22依次经种子培养基、罐发酵培养基发酵培养后，离心，取上清液，得粗酶液；
所述种子培养基组份如下：1％蛋白胨、1％氯化钠、0.5％酵母提取物、余量水，pH7.6-8.0；培养条件：32-35℃，150rpm，摇床培养18小时；
所述罐发酵培养基组份如下：1.6％玉米粉、0.1％MnSO4、0.08％KH2PO4、1％KCl、余量水，pH7.6-8.0；接种量：7wt％液体种子，培养条件：溶氧DO维持在40％以上，32-35℃，培养18小时。
优选地，S1中，所述海洋贝类为珍珠贝、扇贝、四角蛤和牡蛎中的一种或几种。
优选地，S1中，所述匀浆处理的搅拌速率为2000-10000rpm，时间为10-15min。
优选地，S2中，所述蛋白酶为诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的混合物，且所述诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的体积比为1-3:3-15。
优选地，S2中，所述酶解的时间为1-2h。
优选地，S2中，所述超声处理的功率为180-200W，所述超声处理的温度为25-40℃，所述声处理的时间为10-15min。
优选地，S2中，所述灭酶处理的具体过程为：加热至90-120℃并保持搅拌2-12min。
优选地，S2中，膜过滤的压强为1.0-1.5MPa，分离温度为40-50℃。
本发明第二方面提供由上述制备方法制得的新型海洋贝类小分子免疫活性肽。
本发明第三方面提供所述新型海洋贝类小分子免疫活性肽在护肤品中的应用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明制备的新型海洋贝类小分子免疫活性肽除了具有显著的抗氧化活性外，还具有抑制酪氨酸酶活性、减少紫外线引起的皮肤损伤、抑制黑色素生成、促进皮肤新陈代谢和伤口愈合、促进毛发生长等作用，对肽的抗氧化活性也有显著的增强作用。
附图说明
图1为本发明中新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
如图1所示，本发明第一方面提供一种新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取海洋贝类去壳去脏后进行清洗、打浆、匀浆，制得肉糜；
S2、在经步骤S1制得的所述肉糜中加3-6倍体积水，pH为6.4-7.4，煮沸15-30min，冷却至室温后先加入粗酶液，再加入蛋白酶进行酶解，酶解过程中同时进行超声处理，酶解结束后进行灭酶处理，在8000-13000r/min的转速下离心10-15min，上清液通过孔径为30-55nm的滤膜进行超滤分离，收集经滤膜截留的大分子多肽液，并于进风温度为180-220℃，进料速度为30-45ml/min的条件下进行喷雾干燥后，制得新型海洋贝类小分子免疫活性肽；
其中，所述粗酶液的制备过程为：取假单胞菌(Pseudomonas sp.)nic22依次经种子培养基、罐发酵培养基发酵培养后，离心，取上清液，得粗酶液；
所述种子培养基组份如下：1％蛋白胨、1％氯化钠、0.5％酵母提取物、余量水，pH7.6-8.0；培养条件：32-35℃，150rpm，摇床培养18小时；
所述罐发酵培养基组份如下：1.6％玉米粉、0.1％MnSO4、0.08％KH2PO4、1％KCl、余量水，pH7.6-8.0；接种量：7wt％液体种子，培养条件：溶氧DO维持在40％以上，32-35℃，培养18小时。
作为一个优选实施例，S1中，所述海洋贝类为珍珠贝、扇贝、四角蛤和牡蛎中的一种或几种。
作为一个优选实施例，S1中，所述匀浆处理的搅拌速率为2000-10000rpm，时间为10-15min。
作为一个优选实施例，S2中，所述蛋白酶为诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的混合物，且所述诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的体积比为1-3:3-15。
作为一个优选实施例，S2中，所述酶解的时间为1-2h。
作为一个优选实施例，S2中，所述超声处理的功率为180-200W，所述超声处理的温度为25-40℃，所述声处理的时间为10-15min。
作为一个优选实施例，S2中，所述灭酶处理的具体过程为：加热至90-120℃并保持搅拌2-12min。
作为一个优选实施例，S2中，膜过滤的压强为1.0-1.5MPa，分离温度为40-50℃。
本发明第二方面提供采用上述制备方法制得的新型海洋贝类小分子免疫活性肽。
本发明第三方面提供采用上述新型海洋贝类小分子免疫活性肽在护肤品中的应用。
实施例1
一种新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取珍珠贝去壳去脏后进行清洗、打浆、匀浆，所述匀浆处理的搅拌速率为2000rpm，时间为10min，制得肉糜；
S2、在经步骤S1制得的所述肉糜中加3倍体积水，pH为6.4，煮沸15min，冷却至室温后先加入粗酶液，再加入蛋白酶进行酶解，酶解的时间为1h，所述蛋白酶为诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的混合物，且所述诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的体积比为1:3，酶解过程中同时进行超声处理，所述超声处理的功率为180W，所述超声处理的温度为25℃，所述声处理的时间为10min，酶解结束后加热至90℃并保持搅拌2min进行灭酶处理，在8000r/min的转速下离心10min，上清液通过孔径为30nm的滤膜进行超滤分离，膜过滤的压强为1.0MPa，分离温度为40℃，收集经滤膜截留的大分子多肽液，并于进风温度为180℃，进料速度为30ml/min的条件下进行喷雾干燥后，制得新型海洋贝类小分子免疫活性肽；
其中，所述粗酶液的制备过程为：取假单胞菌(Pseudomonas sp.)nic22依次经种子培养基、罐发酵培养基发酵培养后，离心，取上清液，得粗酶液；
所述种子培养基组份如下：1％蛋白胨、1％氯化钠、0.5％酵母提取物、余量水，pH7.6；培养条件：32℃，150rpm，摇床培养18小时；
所述罐发酵培养基组份如下：1.6％玉米粉、0.1％MnSO4、0.08％KH2PO4、1％KCl、余量水，pH7.6；接种量：7wt％液体种子，培养条件：溶氧DO维持在50％，32℃，培养18小时。
实施例2
一种新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取扇贝去壳去脏后进行清洗、打浆、匀浆，所述匀浆处理的搅拌速率为6000rpm，时间为13min，制得肉糜；
S2、在经步骤S1制得的所述肉糜中加5倍体积水，pH为7.0，煮沸25min，冷却至室温后先加入粗酶液，再加入蛋白酶进行酶解，酶解的时间为1h，所述蛋白酶为诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的混合物，且所述诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的体积比为2:10，酶解过程中同时进行超声处理，所述超声处理的功率为190W，所述超声处理的温度为30℃，所述声处理的时间为13min，酶解结束后加热至100℃并保持搅拌8min进行灭酶处理，在11000r/min的转速下离心12min，上清液通过孔径为45nm的滤膜进行超滤分离，膜过滤的压强为1.3MPa，分离温度为45℃，收集经滤膜截留的大分子多肽液，并于进风温度为200℃，进料速度为35ml/min的条件下进行喷雾干燥后，制得新型海洋贝类小分子免疫活性肽；
其中，所述粗酶液的制备过程为：取假单胞菌(Pseudomonas sp.)nic22依次经种子培养基、罐发酵培养基发酵培养后，离心，取上清液，得粗酶液；
所述种子培养基组份如下：1％蛋白胨、1％氯化钠、0.5％酵母提取物、余量水，pH8.0；培养条件：35℃，150rpm，摇床培养18小时；
所述罐发酵培养基组份如下：1.6％玉米粉、0.1％MnSO4、0.08％KH2PO4、1％KCl、余量水，pH8.0；接种量：7wt％液体种子，培养条件：溶氧DO维持在60％，35℃，培养18小时。
实施例3
一种新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取四角蛤去壳去脏后进行清洗、打浆、匀浆，所述匀浆处理的搅拌速率为10000rpm，时间为15min，制得肉糜；
S2、在经步骤S1制得的所述肉糜中加6倍体积水，pH为7.4，煮沸30min，冷却至室温后先加入粗酶液，再加入蛋白酶进行酶解，酶解的时间为2h，所述蛋白酶为诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的混合物，且所述诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的体积比为3:15，酶解过程中同时进行超声处理，所述超声处理的功率为200W，所述超声处理的温度为40℃，所述声处理的时间为15min，酶解结束后加热至120℃并保持搅拌12min进行灭酶处理，在13000r/min的转速下离心15min，上清液通过孔径为55nm的滤膜进行超滤分离，膜过滤的压强为1.5MPa，分离温度为50℃，收集经滤膜截留的大分子多肽液，并于进风温度为220℃，进料速度为45ml/min的条件下进行喷雾干燥后，制得新型海洋贝类小分子免疫活性肽；
其中，所述粗酶液的制备过程为：取假单胞菌(Pseudomonas sp.)nic22依次经种子培养基、罐发酵培养基发酵培养后，离心，取上清液，得粗酶液；
所述种子培养基组份如下：1％蛋白胨、1％氯化钠、0.5％酵母提取物、余量水，pH7.8；培养条件：34℃，150rpm，摇床培养18小时；
所述罐发酵培养基组份如下：1.6％玉米粉、0.1％MnSO4、0.08％KH2PO4、1％KCl、余量水，pH7.8；接种量：7wt％液体种子，培养条件：溶氧DO维持在50％，33℃，培养18小时。
应用例
1.实验原理：CAM方法常用于皮肤刺激的检测中。利用CAM膜或者血管呈现的特定信息，如出血、血管溶解、凝血、小血管直径微小改变等，可以评估受试物产生的刺激能力。
2.实验材料：实施例1-3中制备的新型海洋贝类免疫活性肽。
3.实验方法：在常规温度和湿度条件下，进行受精鸡卵的孵育阶段，每组实验鸡胚数分别为15只。在每个鸡胚的绒毛尿囊膜上放置1个硅酮橡胶环，内加35mg样品(粉末状)。将天窗用透明胶封住，放入(37.5±0.5)℃培养箱。加样40m in后，将鸡胚从培养箱中取出，移去透明胶和天窗周围的蛋壳以便观察。用放大镜灯观察硅酮橡胶环和鸡胚绒毛尿囊膜的状况，环外有异常情况的鸡胚将被剔除，计算RC50值进行皮肤刺激性试验。结果如表1所示：
表1
| 试验样品 | RC<sub>50</sub>(％) | CAMVA试验分级 |
| 实施例1 | 100 | Ⅲ |
| 实施例2 | 99 | Ⅲ |
| 实施例3 | 100 | Ⅲ |
注：CAM VA试验分级中，RC50＜1.0％，判定化学物为轻刺激及以上，设为“Ⅰ”；RC50为1.0～20.0％，判定化学物为微刺激，设为“Ⅱ”；RC50＞20.0％，判定化学物为无刺激，设为“Ⅲ”。
由表1中数据可知，采用本发明方法制备的新型海洋贝类小分子免疫活性肽对皮肤无刺激性，是一款天然、安全、高效的产品。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取海洋贝类去壳去脏后进行清洗、打浆、匀浆，制得肉糜；
S2、在经步骤S1制得的所述肉糜中加3-6倍体积水，pH为6.4-7.4，煮沸15-30min，冷却至室温后先加入粗酶液，再加入蛋白酶进行酶解，酶解过程中同时进行超声处理，酶解结束后进行灭酶处理，在8000-13000r/min的转速下离心10-15min，上清液通过孔径为30-55nm的滤膜进行超滤分离，收集经滤膜截留的大分子多肽液，并于进风温度为180-220℃，进料速度为30-45ml/min的条件下进行喷雾干燥后，制得新型海洋贝类小分子免疫活性肽；
其中，所述粗酶液的制备过程为：取假单胞菌(Pseudomonas sp.)nic22依次经种子培养基、罐发酵培养基发酵培养后，离心，取上清液，得粗酶液；
所述种子培养基组份如下：1％蛋白胨、1％氯化钠、0.5％酵母提取物、余量水，pH 7.6-8.0；培养条件：32-35℃，150rpm，摇床培养18小时；
所述罐发酵培养基组份如下：1.6％玉米粉、0.1％MnSO4、0.08％KH2PO4、1％KCl、余量水，pH7.6-8.0；接种量：7wt％液体种子，培养条件：溶氧DO维持在40％以上，32-35℃，培养18小时。
2.根据权利要求1所述的新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，其特征在于，S1中，所述海洋贝类为珍珠贝、扇贝、四角蛤和牡蛎中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，其特征在于，S1中，所述匀浆处理的搅拌速率为2000-10000rpm，时间为10-15min。
4.根据权利要求1所述的新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，其特征在于，S2中，所述蛋白酶为诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的混合物，且所述诺维信碱性蛋白酶和诺维信风味蛋白酶的体积比为1-3:3-15。
5.根据权利要求1所述的新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，其特征在于，S2中，所述酶解的时间为1-2h。
6.根据权利要求1所述的新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，其特征在于，S2中，所述超声处理的功率为180-200W，所述超声处理的温度为25-40℃，所述声处理的时间为10-15min。
7.根据权利要求1所述的新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，其特征在于，S2中，所述灭酶处理的具体过程为：加热至90-120℃并保持搅拌2-12min。
8.根据权利要求1所述的新型海洋贝类小分子免疫活性肽的制备方法，其特征在于，S2中，膜过滤的压强为1.0-1.5MPa，分离温度为40-50℃。
9.由权利要求1-8中任一项所述的制备方法制得的新型海洋贝类小分子免疫活性肽。
10.权利要求9所述的新型海洋贝类小分子免疫活性肽在护肤品中的应用。
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