CN107254501A - 一种具有显著增强免疫力的蛹虫草蛋白肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能性食品加工领域，具体公开了一种能够显著增强免疫力的蛹虫草蛋白肽及其制备方法。所述蛹虫草蛋白肽是由蛹虫草子实体或经热水浸提虫草素所得蛹虫草剩余物，经菠萝蛋白酶酶解得到的，具有显著增强体液免疫力和细胞免疫力的功能。本发明的制备方法简单，从原料粉到终端产品得率可达10％，易工业化生产，具有较高的社会效益和经济效益。

Description

一种具有显著增强免疫力的蛹虫草蛋白肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及功能性食品加工领域，具体的说，涉及到一种具有显著增强免疫力的蛹虫草蛋白肽及其制备方法。
背景技术
蛹虫草又称北冬虫夏草或者北虫草，属于子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科，虫草菌属。研究发现蛹虫草与冬虫夏草有非常相似的营养价值及药用价值，现代研究表明,其具有增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化等多种功能。蛹虫草营养丰富，既有蛋白质、脂肪、碳水化合物三大基本营养素，还含有很多功能性成分，如虫草酸、虫草素、虫草多糖、腺苷等。目前，对虫草素和虫草多糖的提取研究较多，热水浸提虫草素后的剩余物一般作为残渣废弃，这不仅造成环境的污染，更造成严重的资源浪费。剩余物中蛋白质含量较高，而且浸提后还有很多功能性物质的残留，将其作为生产功能性蛋白肽的原料，不仅可充分利用物料，也可保护生态资源。
免疫力作为人体自身的一种防御和保护机制，能够识别和清除外来异物的侵袭，处理衰老、变异、受损、死亡的自体细胞，消灭体内突变细胞和遭病毒感染细胞，是人体自我保护的生理反应。免疫力低下的表现为长期疲乏无力、精神不振、营养不良、体质虚弱，此类人群更易感染各种疾病，而且容易罹患癌症等。
现有技术中有蛹虫草多肽的制备工艺，也有提高免疫力的食品的加工制备，而国内专利中未见有从蛹虫草中提取显著增强免疫力的蛋白肽的方法和报道。目前人工养殖蛹虫草的数量越来越多，虫草素、虫草多糖的提取也越来越多，从其剩余物中提取具有生物活性的蛋白肽的方法，不仅实现了蛹虫草的综合利用，也为特医食品和保健食品提供一种更安全优质的功能性蛋白肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够显著增强人体免疫力的蛹虫草蛋白肽及其制备方法。
蛹虫草蛋白肽的制备方法包括以下步骤：
(1)将原料进行超微粉碎，加水搅拌；
(2)加入蒸馏水调节底物质量浓度为10-100mg/mL，温度为35-75℃，加入菠萝蛋白酶0.1-5％，水解1-10h，水解结束，沸水浴5min终止酶解反应。离心取上清液。
(3)活性炭脱色：在上清液中加入0.1-1.1％的活性炭，30-70℃条件下脱色15-75min，脱色结束后，离心取上清液。
(4)将所得上清液通过超滤处理，收集所得滤液。
进一步，步骤(1)中，原料为蛹虫草子实体和/或蛹虫草子座经热水浸提虫草素后的剩余物。原料经超微粉碎后，应在热水浴中进行搅拌，温度为90-95℃，搅拌时间15min，此温度条件下足以对原料进行灭菌并且让原料中的蛋白质适度变性，提高蛋白对于酶的敏感性，利于后续酶解反应的发生。
作为优选，步骤(2)中，离心的条件为4000-10000g，时间5-15min。该离心条件下能够实现物料的有效分离，且产品具有较高的得率。
进一步，步骤(3)中的活性炭添加量为上清液体积的0.1-1.1％，离心条件为4000-10000g，离心时间5-15min。
进一步，步骤(4)中的超滤法为先用孔径为5000D的膜超滤上清液，收集滤出液，得到分子量小于5000D的蛋白肽酶解液。再将滤液过3000D的膜，收集滤出液和浓缩液，分别得到分子量小于3000D和3000D-5000D的酶解液。此酶解液即为具有显著增强免疫力的蛹虫草蛋白肽液。
进一步，将步骤(4)中的蛹虫草蛋白肽液进行浓缩干燥即得到具有显著增强免疫力的蛹虫草蛋白肽粉。
上述方法制备的蛹虫草蛋白肽属于本发明的保护范围。本发明通过实验发现，本发明上述方法制备得到的蛹虫草蛋白肽能够显著增强人体免疫力。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明开发的能够显著增强人体免疫力的蛹虫草蛋白肽制备方法简单，较易实现产业化生产。
(2)本发明整个酶解过程无需调节pH，不添加酸或碱，产品灰分较低。
(3)本发明采用菠萝蛋白酶在较高温度对蛹虫草子实体和/或用热水浸提虫草素后的蛹虫草子实体剩余物进行酶解，该酶解条件下得到的蛹虫草蛋白肽具有较好的风味，苦味略低。
(4)本发明开发的蛹虫草蛋白肽，其原料来源是食品，所用的蛋白酶也是食品级的，经过特定的酶解和分离技术获得，安全性高。
(5)本发明开发的能够显著增强人体免疫力的蛹虫草蛋白肽能够广泛应用于功能性食品和特医食品。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但是不用来限制本发明的范围。除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为市售品或者可以通过公知的方法制得的产品。
实施例1：具有显著增强人体免疫力的蛹虫草蛋白肽的制备方法
(1)选用经热水浸提虫草素后的蛹虫草剩余物100g进行超微粉碎，加入蒸馏水，使其底物浓度为50mg/mL，温度调节至95℃，搅拌10min。
(2)将步骤(1)原料浆的温度调节到75℃，然后按照原料粉重量的3％加入3g菠萝蛋白酶，酶解1.5h，沸水浴5min，终止酶解反应，在4000g条件下离心5min，收集上清液。
(3)将上清液温度调至45℃，加入0.5％的活性炭，脱色30min，脱色结束后，4000g条件下离心10min，取上清液。
(4)步骤(3)中的上清液先用孔径为5000D的膜超滤上清液，收集滤出液，得到分子量小于5000D的蛋白肽酶解液。再将滤液过3000D的膜，收集滤出液和浓缩液，分别得到分子量小于3000D和3000D-5000D的酶解液。
(5)将蛋白肽溶液真空浓缩到蛋白肽浓度为30-45％，再利用冷冻干燥得到。
实施例2：具有显著增强人体免疫力的蛹虫草蛋白肽的制备方法
(1)选用蛹虫草子实体100g进行超微粉碎，加入蒸馏水，使其底物浓度为50mg/mL，温度调节到95℃，搅拌10min。
(2)将步骤(1)原料浆的温度调节到75℃，然后按照原料粉重量的5％加入5g菠萝蛋白酶，酶解1.5h，沸水浴5min，终止酶解反应，在4000g条件下离心5min，收集上清液。
(3)将上清液温度调到45℃，加入0.5％的活性炭，脱色30min，脱色结束后，4000g条件下离心10min，取上清液。
(4)步骤(3)中的上清液先用孔径为5000D的膜超滤上清液，收集滤出液，得到分子量小于5000D的蛋白肽酶解液。再将滤液过3000D的膜，收集滤出液和浓缩液，分别得到分子量小于3000D和3000D-5000D的酶解液。
(5)将蛋白肽溶液真空浓缩到蛋白肽浓度为30-45％，再利用冷冻干燥得到。实验例1：脾淋巴细胞增殖实验
通过脾淋巴细胞增殖实验，优选施例1不同分子量的蛹虫草蛋白肽的增殖效果，采用增殖效果好的分子量段的活性肽，进行增强免疫力效果评价。
1、脾淋巴细胞增殖实验
小鼠脾淋巴细胞制备：小鼠禁食12h，摘眼球放血后脱颈致死，在75％的乙醇中浸泡3-5min，于超净工作台上打开腹腔，取出小鼠脾脏置于无菌的平皿中，去除外周结缔组织，用含双抗的PBS培养液清洗脾脏，去除血液。吸取PBS，再次用5mLPBS进行清洗，转移至200目不锈钢筛网上，挤压研磨，并用PBS轻轻冲洗筛网，制成细胞悬液。1500rpm离心5min，弃上清液。在细胞沉淀中加入2mL无菌水裂解红细胞20s，迅速加入2mL的2×PBS溶液摇匀终止裂解，再用4mL的1×PBS溶液振匀后1500rpm离心8min。PBS洗沉淀两次。将沉淀细胞悬浮于含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液中，放置在5％的CO2培养箱37℃孵育4h，除去贴壁的细胞，悬浮的即为小鼠脾淋巴细胞。调整细胞浓度为2*10^6个/mL。
MTT法测定脾淋巴细胞增殖：取96孔板，每孔加入脾细胞悬液100ul,再加入100ul样品。实验设置一个空白对照组，＜3000D和3000D-5000D低中高各三组，放置在5％的CO2培养箱中37℃培养，培养结束前4h加入MTT20ul，1500rpm离心5min，弃上清液，加入二甲亚矾，570nm比色，计算增殖率。
增殖率(％)＝(A样-A0)/A0*100％
结果见表1：
表1不同分子量的蛹虫草蛋白肽对小鼠脾淋巴细胞增殖率的影响
注：﹡与3000-5000D组相比，P＜0.01
由表1可见，不同分子量的蛹虫草蛋白肽均能提高小鼠的脾淋巴细胞增殖活性，且随剂量的增加呈上升趋势，分子量＜3000D的蛹虫草蛋白肽对脾淋巴细胞增殖活性的影响，显著高于分子量在3000D-5000D的蛹虫草蛋白肽(P＜0.01)。因此，以下进行的增强免疫力的效果评价实验，均选择分子量＜3000D的蛹虫草蛋白肽。
实验例2：蛹虫草蛋白肽增强免疫力效果评价
1、实验动物：昆明雄性小白鼠420只，体重为18-22g，共5项实验，每项实验7组，每组小白鼠12只。
实验设计：
实验组1：实施例1的低剂量组
实验组2：实施例1的中剂量组
实验组3：实施例1的高剂量组
实验组4：实施例2的低剂量组
实验组5：实施例2的中剂量组
实验组6：实施例2的高剂量组
实验组7：阴性对照组
2、剂量：实施例1-2中的蛹虫草蛋白肽用蒸馏水分别配制成4.17mg/mL、8.33mg/mL、16.67mg/mL的溶液，蛹虫草蛋白肽的人体推荐剂量为0.5g/60kgBW,分别按照人体推荐用量的5、10、20倍给予小鼠灌胃。给予小鼠上述三种不用浓度的蛹虫草蛋白肽溶液，灌胃剂量为10mL/kgBW，阴性对照组给予相同体积的蒸馏水。每天灌胃一次，连续30天。末次灌胃1h后参照《保健食品检验与评价技术规范》中的方法对小鼠进行免疫功能测定。
3、检测指标：脏器/体重比值测定二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应(DTH)、血清血溶素的测定、腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞的能力、NK细胞活性
4、实验方法：
(1)脏器/体重比值测定：试验结束处死动物，取小鼠胸腺、脾脏，称量后计算脏器/体重比值。
脏器/体重比值(％)＝脏器重(g)/终体重(g)×100
(2)二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应(DTH)
给样至25d将小鼠腹部皮肤脱毛后，用二硝基氟(DNFB)溶液涂抹致敏，5d后将DNFB涂抹于小鼠右耳耳廓进行过敏原攻击，24h后处死小鼠，取8mm直径的耳片称重，左右耳重量之差表示DTH的程度。
肿胀度(mg)＝右耳耳片重量(mg)-左耳耳片重量(mg)
(3)血清溶血素的测定
末次给样前5d给受试小鼠每只腹腔注射0.2mL2％绵羊红细胞(SRBC)液进行免疫
5天后从眼内眦取血分离血清用生理盐水倍比稀释，分别置于微量血凝板内，37℃孵育3h，观察血球凝集程度，利用血球凝集程度检测溶血素水平。血球凝集程度分为5级。
抗体积数＝(S1+2S2+3S3…….nSn)
式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数,S代表凝集程度的级别。
(4)腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞的能力
末次给样后1h，给小鼠腹腔注射鸡红细胞悬液，注射后30min处死小鼠，腹腔注入2mL生理盐水，取腹腔洗液制片，放37℃培养箱内孵育30min，取出于生理盐水中漂洗后晾干，用1:1丙酮甲醛溶液固定，4％(V/V)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水晾干。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，观察记录吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数及被吞噬的鸡红细胞数。
吞噬百分率(％)＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
(5)NK细胞活性
末次给样1h后处死小鼠，无菌取脾，制成脾细胞悬液(2×107个/mL))，取靶细胞(4×105个/mL))和效应细胞各100ul，加入U型96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100ul，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100ul，上述各项各设3个平行孔，置于5％CO2、37℃培养箱中培养4h，然后将96孔板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100ul置于96孔培养板中，同时加入LDH基质液100ul，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl30ul，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。NK细胞活性按下式计算：
NK细胞活性(％)＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％
5、实验结果：
(1)蛹虫草蛋白肽对小鼠脏器/体重比值的影响
蛹虫草蛋白肽对小鼠脏器/体重比值的影响结果见表2。
表2蛹虫草蛋白肽对小鼠脏器/体重比值的影响
注：﹡与阴性对照组相比，P＜0.01
由表2可见，实验组和阴性对照组的数据无显著性差异，表明蛹虫草蛋白肽对小鼠的免疫器官重量无明显影响。
(2)蛹虫草蛋白肽对小鼠细胞免疫的影响
表3蛹虫草蛋白肽对小鼠迟发型变态反应的影响(DTH)
注：﹡与阴性对照组相比，P＜0.01
由表3，我们看到实验组各剂量数据均大于阴性对照组，实施例1和2的低、中、高剂量组与对照组相比均有显著性差异(P＜0.01)，表明蛹虫草蛋白肽能够提高DNFB诱导小鼠耳肿胀程度，促进迟发型变态反应。
(3)蛹虫草蛋白肽对小鼠体液免疫的影响
表4蛹虫草蛋白肽对小鼠血清溶血素抗体积数的影响
注：﹡与阴性对照组相比，P＜0.01
由表4看到实验组的血清溶血素抗体积数均高于阴性对照组，且低、中、高剂量组与对照组有极显著性差异(P＜0.01)，表明蛹虫草蛋白肽能提高小鼠的血清溶血素水平。
(4)蛹虫草蛋白肽对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响
表5蛹虫草蛋白肽对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响
注：﹡与阴性对照组相比，P＜0.01
由表5结果可知，实验组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬率均高于阴性对照组，而且有极显著性差异(P＜0.01)，表明蛹虫草蛋白肽有促进小鼠巨噬细胞吞噬功能的作用。
(5)蛹虫草蛋白肽对小鼠NK细胞活性的影响
表6蛹虫草蛋白肽对小鼠NK细胞活性的影响
注：﹡与阴性对照组相比，P＜0.01
由表6可知，实验组小鼠的NK细胞活性均明显高于阴性对照组，且实验组与对照组有极显著性差异(P＜0.01)，表明蛹虫草蛋白肽能显著提高小鼠的NK细胞活性。
6、实验结论
经给予小鼠不同剂量的产品灌胃30天，小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞吞噬功能及NK细胞活性测试结果均为阳性。结果表明，实施例1-2产品均具有显著增强免疫力的功能，对本发明的功能性进行了验证。
以上所述仅为本发明的两项实施例而已，并不用以限制本发明，在不偏离本发明精神基础上所做的修改或改进，均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种具有显著增强免疫力的蛹虫草蛋白肽，其特征在于，其是由蛹虫草子实体或蛹虫草子座经热水浸提虫草素后的剩余物经菠萝蛋白酶酶解所得的。
2.制备权利要求1所述的蛹虫草蛋白肽的方法，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
(1)原料粉碎：将原料进行超微粉碎，加水搅拌；
(2)多肽提取：加入蒸馏水调节底物质量浓度为10-100mg/mL，温度为35-75℃，加入菠萝蛋白酶0.1-5％，水解1-10h，水解结束，沸水浴15min终止酶解反应，离心取上清液。
(3)活性炭脱色：在上清液中加入0.1-1.1％的活性炭，30-70℃条件下脱色15-75min，脱色结束后，离心取上清液。
(4)多肽分离：将所得上清液通过超滤处理，收集所得滤液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，原料为蛹虫草子实体和/或蛹虫草子座经热水浸提虫草素后的剩余物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，离心的条件为4000-10000g，时间5-15min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，离心条件为4000-10000g，时间15-75min。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的超滤法为先用孔径为5000D的膜超滤上清液，收集滤出液，得到分子量小于5000D的蛋白肽酶解液；再将滤液过3000D的膜，收集滤出液和浓缩液，分别得到分子量小于3000D和3000D-5000D的酶解液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法得到的蛹虫草蛋白肽。
8.含有权利要求7所述蛹虫草蛋白肽的食品、保健品、药品。
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