CN110698548A - 一种蛹虫草活性蛋白CMPr及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种蛹虫草活性蛋白CMPr及其制备方法与应用，其中，所述制备方法包括以下步骤：步骤S10、用PBS缓冲液溶解蛹虫草子实体总蛋白，使蛋白浓度为15～20mg/mL；步骤S20、取2～3mL蛹虫草子实体总蛋白溶液，过滤后上样到分子筛Sephadex G‑50层析柱，用PBS缓冲液洗脱，获取第一洗脱图谱；步骤S30、根据所述第一洗脱图谱，收集含有蛹虫草活性蛋白CMPr的组分；步骤S40、将所述含有蛹虫草活性蛋白CMPr的组分浓缩至蛋白浓度为15‑20mg/mL；步骤S50、取2～3mL浓缩溶液上样到Superdex 75凝胶层析柱中，用PBS缓冲液洗脱，获取第二洗脱图谱，并根据所述第二洗脱图谱收集纯的蛹虫草活性蛋白CMPr。本发明旨在从蛹虫草子实体中分离出一种具有免疫激活活性的单一蛋白CMPr。

Description

一种蛹虫草活性蛋白CMPr及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，特别涉及一种蛹虫草活性蛋白CMPr及其制备方法与应用。

背景技术

蛹虫草属于子囊菌门、肉座目、麦角菌科、虫草属的一类可食药两用的大型真菌。蛹虫草活性成分与药理作用被报道与中国传统名贵中草药冬虫夏草相似，并且蛹虫草已实现规模化人工种植，因此现已作为冬虫夏草的理想替代品，在食品以及中药等领域被广泛使用。大量科学研究论证，蛹虫草含有多种活性成分，如虫草酸、虫草素、虫草多糖等，这些活性成分使蛹虫草表现出抗肿瘤、抵抗炎症以及增强免疫等药理活性。因此，蛹虫草不仅可作为食用菌具有较高的营养价值，而且在保健品和药物中有广泛应用。有大量研究报导表明，蛹虫草子实体的一些活性成分具有增强免疫的药理效果。但目前对具有免疫增强活性的蛹虫草成分的研究主要集中在虫草素以及虫草多糖上，蛋白作为蛹虫草子实体的重要组成成分，其分离和活性却鲜有报道。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种蛹虫草活性蛋白CMPr及其制备方法与应用，旨在从蛹虫草子实体中分离出一种具有免疫激活活性的单一蛋白CMPr。

为实现上述目的，本发明提出一种蛹虫草活性蛋白CMPr的制备方法，所述蛹虫草活性蛋白CMPr的制备方法包括以下步骤：

步骤S10、用PBS缓冲液溶解蛹虫草子实体总蛋白，使蛋白浓度为15～20mg/mL；

步骤S20、取2～3mL蛹虫草子实体总蛋白溶液，过滤后上样到分子筛Sephadex G-50层析柱，用PBS缓冲液洗脱，获取第一洗脱图谱；

步骤S30、根据所述第一洗脱图谱，收集含有蛹虫草活性蛋白CMPr的组分；

步骤S40、将所述含有蛹虫草活性蛋白CMPr的组分浓缩至蛋白浓度为15-20mg/mL；

步骤S50、取2～3mL浓缩溶液上样到Superdex 75凝胶层析柱中，用PBS缓冲液洗脱，获取第二洗脱图谱，并根据所述第二洗脱图谱收集纯的蛹虫草活性蛋白CMPr。

可选地，PBS的pH为7.2～7.5，浓度为8～10mM；PBS中氯化钠的浓度为130～150mM。

可选地，所述步骤S20中，所述第一洗脱图谱中，纵坐标为280nm吸收峰，横坐标为洗脱时间；

所述上样的流速为0.3～0.5mL/min。

可选地，所述步骤S40中，所述浓缩采用截留分子量为3～3.5kDa的超滤管。

可选地，所述步骤S50中，所述第二洗脱图谱中，纵坐标为280nm吸收峰，横坐标为洗脱时间；

所述上样的流速为0.5～0.8mL/min。

可选地，所述步骤S10之前还包括以下步骤：

步骤S100、将蛹虫草子实体磨粉后，加水搅拌均匀，0～4℃静置10～15h后，离心收集上清液，得蛹虫草子实体水溶性提取物；

步骤S200、对所述蛹虫草水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀，收集沉淀，0～4℃静置10～15h后，离心收集沉淀；

步骤S300、将所述沉淀溶于水后，装入透析袋进行流水透析；

步骤S400、收集透析产物并真空冷冻干燥，得蛹虫草子实体总蛋白。

可选地，所述步骤S300中，采用的透析袋截留分子量为3～3.5kDa，透析时间为20～24h，透析期间每3～4h更换一次透析液。

此外，本发明还提出一种蛹虫草活性蛋白CMPr，所述蛹虫草活性蛋白CMPr由如上所述的制备方法制得，所述蛹虫草活性蛋白CMPr包括如下所示的氨基酸序列：

MSFQTRFIGSNVLTNELGPDVKEMTLEFKEGEPIMIPQDATGTVKGECYEILVTFLNGTLRRYNAMNDYTFKEHVASKATMREGHTRVSIIGDSGVGGNFELVTRSA。

本发明还提出一种提高免疫力的产品，所述提高免疫力的产品包括如上所述的蛹虫草活性蛋白CMPr以及药学上可用的辅料。

本发明还提出一种体外激活免疫细胞增殖试剂，所述体外激活免疫细胞增殖试剂包括如上所述的蛹虫草活性蛋白CMPr以及药学上可用的辅料。

本发明选用Sephadex G-50柱以及Superdex 75柱作为两次纯化的洗脱柱，控制上样前蛋白浓度保持在15～20mg/mL、两次上样流速分别为0.3～0.5mL/min和0.5～0.8mL/min，上样体积为2～3mL，从蛹虫草子实体总蛋白中提取出一种高纯度的蛹虫草单一活性蛋白CMPr，该活性蛋白可以促进免疫细胞增殖，提高机体免疫力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中蛹虫草子实体总蛋白溶液上样Sephadex G-50获得的第一洗脱图谱；

图2为实施例1中Sephadex G-50洗脱组分的SDS-PAGE检测图；

图3为实施例1中组分四Superdedx-75柱纯化获得的第二洗脱图谱；

图4为实施例2中蛹虫草蛋白CMPr的SDS-PAGE检测图；

图5为实施例2中蛹虫草蛋白CMPr质谱鉴定的肽段序列；

图6为实施例3中蛹虫草蛋白CMPr刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞增殖变化图；

图7为实施例3中蛹虫草蛋白CMPr刺激小鼠脾脏淋巴细胞的细胞增殖变化图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

蛹虫草含有多种活性成分，如虫草酸、虫草素、虫草多糖等，这些活性成分使蛹虫草表现出抗肿瘤、抵抗炎症以及增强免疫等药理活性。因此，蛹虫草不仅可作为食用菌具有较高的营养价值，而且在保健品和药物中有广泛应用。有大量研究报导表明，蛹虫草子实体的一些活性成分具有增强免疫的药理效果。但目前对具有免疫增强活性的蛹虫草成分的研究主要集中在虫草素以及虫草多糖上，蛋白作为蛹虫草子实体的重要组成成分，其分离和活性却鲜有报道。

鉴于此，本发明对现有的蛋白分离纯化方法做出特异性的改进，提出一种蛹虫草活性蛋白CMPr的制备方法，使用该制备方法可以从蛹虫草子实体中分离出一种具有免疫激活活性的单一蛋白CMPr。

本实施例所述蛹虫草活性蛋白CMPr的制备方法包括以下步骤：

步骤S10、用PBS缓冲液溶解蛹虫草子实体总蛋白，使蛋白浓度为15～20mg/mL；

步骤S20、取2～3mL蛹虫草子实体总蛋白溶液，过滤后上样到分子筛Sephadex G-50层析柱，用PBS缓冲液洗脱，获取第一洗脱图谱；

步骤S30、根据所述第一洗脱图谱，收集含有蛹虫草活性蛋白CMPr的组分；

步骤S40、将所述含有蛹虫草活性蛋白CMPr的组分浓缩至蛋白浓度为15-20mg/mL；

步骤S50、取2～3mL浓缩溶液上样到Superdex 75凝胶层析柱中，用PBS缓冲液洗脱，获取第二洗脱图谱，并根据所述第二洗脱图谱收集纯的蛹虫草活性蛋白CMPr。

其中，步骤S10、步骤S20和步骤S50中采用的PBS均为pH为7.2～7.5、浓度为8～10mM的PBS，PBS中含有130～150mM氯化钠。

步骤S20中，所述第一洗脱图谱中，纵坐标为280nm吸收峰，横坐标为洗脱时间；步骤S20中，上样的流速为0.3～0.5mL/min，洗脱的流速为0.3～0.5mL/min。

步骤S40中，所述浓缩采用截留分子量为3～3.5kDa的超滤管，且在使用超滤管浓缩操作时，离心转速为3000r/min。

步骤S50中，所述第二洗脱图谱中，纵坐标为280nm吸收峰，横坐标为洗脱时间；上样的流速为0.5～0.8mL/min，洗脱的流速为0.5～0.8mL/min。

作为本发明的优选实施例，本实施例制备方法具体实施时，按以下步骤操作：用PBS(pH7.4，含有150mM NaCl)缓冲液溶解真空冷冻干燥后的蛹虫草子实体总蛋白，使蛋白浓度为15-20mg/mL，用0.45μm孔径的滤膜过滤。取2～3mL蛹虫草子实体总蛋白溶液，上样到分子筛Sephadex G-50层析柱中，用PBS缓冲液(pH7.4，含150mM NaCl)进行洗脱，上样以及洗脱流速为0.3～0.5mL/min，以洗脱时间为横坐标，280nm紫外吸收峰为纵坐标获得第一洗脱图谱，根据第一洗脱图谱分段收集蛋白分离组分。将分段收集的组分，用SDS-PAGE进行检测，根据SDS-PAGE结果，收集含有CMPr的组分。将收集的含有CMPr的组分用截留分子量为3～3.5kDa的超滤管进行浓缩至蛋白浓度为15～20mg/mL。将2～3mL浓缩后的蛋白样品，0.22μm孔径的滤膜过滤后上样到Superdex 75凝胶层析柱中，用PBS缓冲液(pH7.4，含150mMNaCl)进行洗脱，上样以及洗脱流速为0.5～0.8mL/min。以洗脱时间为横坐标，280nm吸收峰为纵坐标获得第二洗脱图谱，根据第二洗脱图谱收集蛹虫草子实体蛋白CMPr洗脱液，蒸馏水透析后，真空冷冻干燥，得蛹虫草子实体蛋白CMPr。

蛹虫草子实体总蛋白可以自行制备。在本发明的另一实施例中，所述步骤S10之前还包括以下提取蛹虫草子实体总蛋白的步骤：

步骤S100、将蛹虫草子实体磨粉后，加水搅拌均匀，0～4℃静置10～15h后，离心收集上清液，得蛹虫草子实体水溶性提取物；

步骤S200、对所述蛹虫草水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀，收集沉淀，0～4℃静置10～15h后，离心收集沉淀；

步骤S300、将所述沉淀溶于水后，装入透析袋进行流水透析；

步骤S400、收集透析产物并真空冷冻干燥，得蛹虫草子实体总蛋白。

步骤S300中，采用的透析袋截留分子量为3～3.5kDa，透析时间为20～24h，透析期间每3～4h更换一次透析液。

此外，本发明还提出一种蛹虫草活性蛋白CMPr，所述蛹虫草活性蛋白CMPr由如上所述的制备方法制得，所述蛹虫草活性蛋白CMPr包括如下所示的氨基酸序列：

MSFQTRFIGSNVLTNELGPDVKEMTLEFKEGEPIMIPQDATGTVKGECYEILVTFLNGTLRRYNAMNDYTFKEHVASKATMREGHTRVSIIGDSGVGGNFELVTRSA。

该活性蛋白可以提高机体免疫力，因此，可以将其作为活性成分制备增强机体免疫力的产品，例如保健品或者食品等。基于此，本发明还提出一种提高免疫力的产品，所述提高免疫力的产品包括如上所述的蛹虫草活性蛋白CMPr以及药学上可用的辅料。其中，辅料可以包括维持蛹虫草活性蛋白CMPr稳定性的稳定剂、药学上可用的防腐剂、药学上可用的调节体系pH的缓冲液以及其他活性组分。

在对蛹虫草活性蛋白CMPr活性的试验中，发明人还发现用蛹虫草活性蛋白CMPr处理小鼠脾脏淋巴细胞和小鼠巨噬细胞RAW264.7 24h后，可以显著促进小鼠脾脏淋巴细胞和小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖，并且细胞增殖的倍数随着蛹虫草活性蛋白的浓度增加而增加，基于此，本发明还提出一种体外激活免疫细胞增殖试剂，所述体外激活免疫细胞增殖试剂包括如上所述的蛹虫草活性蛋白CMPr以及药学上可用的辅料。同样地，辅料可以包括维持蛹虫草活性蛋白CMPr稳定性的稳定剂、药学上可用的防腐剂、药学上可用的调节体系pH的缓冲液以及其他活性组分。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1蛹虫草子实体蛋白CMPr的制备

(1)蛹虫草子实体水溶性提取物的制备：蛹虫草子实体购自广州粤微食用菌技术有限公司，将蛹虫草子实体粉碎，称取蛹虫草子实体粉末100g,加入1L蒸馏水充分搅拌，静置于4℃浸提12h后，8000r/min、4℃离心20min,收集上清，即为蛹虫草子实体水溶性提取物。

(2)蛹虫草子实体总蛋白的制备：向蛹虫草水溶性提取物中加入硫酸铵，边加入边搅拌，直至硫酸铵达到80％饱和度，于4℃静置12h，8000r/min离心30min，收集沉淀。将沉淀用去离子水重悬，然后用1L去离子水进行透析，每4h更换一次透析液，共更换6次透析液。透析袋的截留分子量为3kDa。透析完成后，收集透析袋内样品，10000r/min、4℃离心20min，收集上清，并将上清进行真空冷冻干燥，得到蛹虫草子实体总蛋白。

(3)蛹虫草活性蛋白CMPr的纯化：取蛹虫草子实体总蛋白30-40mg溶解于2mL PBS中，取2mL上样到Sephadex G-50色谱层析柱中，用PBS(pH7.4，含有150mM NaCl)进行洗脱，上样以及洗脱流速为0.3-0.5mL/min。根据色谱层析的第一洗脱图谱(图1)分5个组分进行收集。通过对收集的5个组分进行SDS-PAGE检测(图2)，收集含有CMPr的组分四。将组分四用截留分子量大小为3kDa的超滤管进行浓缩，浓缩至蛋白浓度为15～20mg/mL。取浓缩溶液2mL上样到Superdedx-75进行进一步分离，PBS(pH7.4，含有150mM NaCl)进行洗脱，上样以及洗脱流速为0.5mL/min。根据第二洗脱图谱(图3)，收集第一个峰洗脱的蛋白，即为蛹虫草活性蛋白CMPr。

实施例2蛹虫草活性蛋白CMPr的肽段序列鉴定

(1)蛹虫草蛋白CMPr胶内酶解：

取实施例1中纯化的CMPr蛋白15μg，用分离胶浓度为15％，浓缩胶浓度为4％的SDS-PAGE进行检测(图4)，用新配制的考马斯亮蓝R-250染色液染色过夜后，用新配置的脱色液进行胶脱色，每2h更换一次脱色液，直至CMPr条带清晰可见。在切胶板上切下CMPr条带，进行胶内酶解。流程如下：将胶块充分切碎为1mm³左右，用去离子水浸洗胶块10min，500L乙腈浸洗胶块10min，1500rpm离心5min，弃掉上清，真空抽干胶块。胶块用含有10mM二硫苏糖醇(DTT)的NH₄HCO₃缓冲液，37℃浸润孵育1h。吸除浸洗液，再加入含有55mM碘乙酰胺(IAA)的NH₄HCO₃缓冲液，室温避光孵育1h。吸除孵育液，再依次用25mM NH₄HCO₃，NH₄HCO₃/50％乙腈以及100％乙腈依次浸洗胶块每次浸洗10min，弃掉浸洗液，真空抽干胶块。向胶块中加入60％乙腈/5％乙酸溶液，混匀胶块，超声处理10min，2000rpm离心5min，将上清收集到Eppendorf管，真空抽干酶解好的肽段。

(2)蛹虫草活性蛋白CMPr的酶解肽段脱盐：

酶解肽段用C18柱(Water，

Vac C18)进行脱盐处理。柱子先用甲醇浸润，在加入一倍柱体积的80％乙腈/0.1％三氟乙酸清洗脱盐柱。然后用两倍柱体积的0.1％三氟乙酸平衡脱盐柱。CMPr酶解肽段用TFA调整至pH6，将肽段上样到脱盐柱中。用两倍柱体积的1％乙酸清洗脱盐柱。最后用2倍柱体积的80％乙腈/0.1％乙酸溶液洗脱肽段。收集洗脱的肽段，真空抽干。

(3)蛹虫草活性蛋白CMPr酶解后肽段的质谱鉴定：

将上述酶解的肽段用QSTAR Elite的液相色谱-二级质谱(LC-MS/MS)进行肽段序列鉴定。Mascot软件对鉴定肽段进行搜库和序列比对。鉴定序列与比对见图5，图5中灰色标记为质谱鉴定序列。

实施例3蛹虫草活性蛋白CMPr的促进免疫细胞增殖实验

(1)供试细胞株小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院细胞库，培养条件为含有10％胎牛血清和双抗的DMEM高糖培养基，37℃，5％CO₂。

(2)小鼠脾脏淋巴细胞的分离：C57小鼠颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡3min。在超净工作台中解剖小鼠，取出小鼠脾脏。用毛玻璃片研磨脾脏，将研磨液用300目尼龙筛网过滤。取含有细胞的滤液，向滤液中加入等体积的小鼠红细胞裂解液，37℃裂解5min，2000r/min离心5min，取细胞沉淀。再加入1mL小鼠红细胞裂解液重悬细胞，37℃裂解5min，2000r/min离心5min，取细胞沉淀即为小鼠脾脏淋巴细胞。用含有10％胎牛血清的1640培养基培养细胞重悬细胞后，37℃、5％CO₂条件下进行培养。

(3)采用CCK-8检测实施例1中的蛹虫草蛋白CMPr对小鼠脾脏淋巴细胞以及小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖的影响，具体方法如下：以5×10⁵个/mL的浓度分别将小鼠巨噬细胞RAW264.7和脾脏淋巴细胞接种到96孔板中，待RAW264.7细胞完全贴壁后，分别随机选取36孔分为6组，分别为DMEM或1640培养基空白孔，CMPr 0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL和50μg/mL CMPr蛋白处理组，每一组6个孔重复。培养基空白对照孔没有细胞，仅为培养基对照；0μg/mL组的每孔细胞加入100μL培养基；10μg/mL实验组每一孔中加入含有CMPr浓度为10μg/mL的培养基100μL；20μg/mL实验组每一孔中加入含有CMPr浓度为20μg/mL的培养基100μL；30μg/mL实验组每一孔中加入含有CMPr浓度为30μg/mL的培养基100μL；50μg/mL实验组每一孔中加入含有CMPr浓度为50μg/mL的培养基100μL。含有CMPr的培养基加入细胞后，细胞37℃，5％CO₂处理24h。然后每一孔加入10μL的CCK-8试剂，避光继续培养1～4h，每一小时取出，在450nm波长检测吸光度，以对照组的细胞量为100％，计算实验组细胞的增殖率：实验组细胞增值率＝(OD_实验组-OD_{培养基对照})/(OD _0μg/mL组-OD_{培养基对照})×100％。实验所得数据采用GraphPad Prism软件的独立样本t检验处理统计。CCK-8检测结果表明，实施例1中所分离纯化的蛹虫草蛋白CMPr可以有效刺激小鼠脾脏淋巴细胞和小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖，并且增值率表现出剂量依赖性，与CMPr浓度为0μg/mL相比，随着CMPr浓度的增加，小鼠脾脏淋巴细胞和RAW264.7细胞的数量均增高，具体的增殖比例效果见图6和图7。图6和图7中纵坐标cell proliferation ration为细胞增值率，横坐标为CMPr浓度。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种蛹虫草活性蛋白CMPr的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S10、用PBS缓冲液溶解蛹虫草子实体总蛋白，使蛋白浓度为15～20mg/mL；

步骤S20、取2～3mL蛹虫草子实体总蛋白溶液，过滤后上样到分子筛Sephadex G-50层析柱，用PBS缓冲液洗脱，获取第一洗脱图谱；

步骤S30、根据所述第一洗脱图谱，收集含有蛹虫草活性蛋白CMPr的组分；

步骤S40、将所述含有蛹虫草活性蛋白CMPr的组分浓缩至蛋白浓度为15-20mg/mL；

步骤S50、取2～3mL浓缩溶液上样到Superdex 75凝胶层析柱中，用PBS缓冲液洗脱，获取第二洗脱图谱，并根据所述第二洗脱图谱收集纯的蛹虫草活性蛋白CMPr。

2.如权利要求1所述的蛹虫草活性蛋白CMPr的制备方法，其特征在于，PBS缓冲液的pH为7.2～7.5，浓度为8～10mM；PBS缓冲液中氯化钠的浓度为130～150mM。

3.如权利要求1所述的蛹虫草活性蛋白CMPr的制备方法，其特征在于，所述步骤S20中，所述第一洗脱图谱中，纵坐标为280nm吸收峰，横坐标为洗脱时间；

所述上样的流速为0.3～0.5mL/min。

4.如权利要求1所述的蛹虫草活性蛋白CMPr的制备方法，其特征在于，所述步骤S40中，所述浓缩采用截留分子量为3～3.5kDa的超滤管。

5.如权利要求1所述的蛹虫草活性蛋白CMPr的制备方法，其特征在于，所述步骤S50中，所述第二洗脱图谱中，纵坐标为280nm吸收峰，横坐标为洗脱时间；

所述上样的流速为0.5～0.8mL/min。

6.如权利要求1所述的蛹虫草活性蛋白CMPr的制备方法，其特征在于，所述步骤S10之前还包括以下步骤：

步骤S100、将蛹虫草子实体磨粉后，加水搅拌均匀，0～4℃静置10～15h后，离心收集上清液，得蛹虫草子实体水溶性提取物；

步骤S200、对所述蛹虫草水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀，收集沉淀，0～4℃静置10～15h后，离心收集沉淀；

步骤S300、将所述沉淀溶于水后，装入透析袋进行流水透析；

步骤S400、收集透析产物并真空冷冻干燥，得蛹虫草子实体总蛋白。

7.如权利要求6所述的蛹虫草活性蛋白CMPr的制备方法，其特征在于，所述步骤S300中，采用的透析袋截留分子量为3～3.5kDa，透析时间为20～24h，透析期间每3～4h更换一次透析液。

8.一种蛹虫草活性蛋白CMPr，其特征在于，由如权利要求1至6任一项所述的制备方法制得，所述蛹虫草活性蛋白CMPr包括如下所示的氨基酸序列：

MSFQTRFIGSNVLTNELGPDVKEMTLEFKEGEPIMIPQDATGTVKGECYEIL VTFLNGTLRRYNAMNDYTFKEHVASKATMREGHTRVSIIGDSGVGGNFEL VTRSA。

9.一种提高免疫力的产品，其特征在于，包括如权利要求8所述的蛹虫草活性蛋白CMPr以及药学上可用的辅料。

10.一种体外激活免疫细胞增殖试剂，其特征在于，包括如权利要求8所述的蛹虫草活性蛋白CMPr以及药学上可用的辅料。

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