CN111875683A - 蛹虫草凝集素基因及其制备方法、重组表达载体、菌株、及蛹虫草凝集素的制备方法和应用 - Google Patents

蛹虫草凝集素基因及其制备方法、重组表达载体、菌株、及蛹虫草凝集素的制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111875683A
CN111875683A CN202010764971.9A CN202010764971A CN111875683A CN 111875683 A CN111875683 A CN 111875683A CN 202010764971 A CN202010764971 A CN 202010764971A CN 111875683 A CN111875683 A CN 111875683A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cordyceps militaris
agglutinin
gene
cma
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010764971.9A
Other languages
English (en)
Inventor
杨庆
宫智勇
许琳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Polytechnic University
Original Assignee
Wuhan Polytechnic University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Polytechnic University filed Critical Wuhan Polytechnic University
Priority to CN202010764971.9A priority Critical patent/CN111875683A/zh
Publication of CN111875683A publication Critical patent/CN111875683A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种蛹虫草凝集素基因及其制备方法、重组表达载体、菌株、及蛹虫草凝集素的制备方法和应用，其中，所述蛹虫草凝集素基因CMA用于编码蛹虫草凝集素，所述蛹虫草凝集素基因CMA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的蛹虫草凝集素基因CMA，为从蛹虫草基因组中克隆出的部分基因片段，并确定了其为蛹虫草凝集素编码基因；此外，该蛹虫草凝集素基因CMA可以编码出一种蛹虫草凝集素，该蛹虫草凝集素能特异性凝集大鼠的红细胞，还对糖结构的识别和结合具有高度特异性，同时能特异性的识别、结合并激活巨噬细胞。

Description

蛹虫草凝集素基因及其制备方法、重组表达载体、菌株、及蛹 虫草凝集素的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种蛹虫草凝集素基因CMA及其制备方法、以及重组表达载体、重组表达菌株、蛹虫草凝集素的制备方法和应用。
背景技术
凝集素是一类可选择性识别与结合特定糖结构的非免疫原性球蛋白。凝集素在自然界中分布较为广泛，在细菌、真菌、藻类、哺乳动物以及植物中均鉴定到凝集素的存在。大型真菌是较为珍贵的凝集素资源库，很多真菌来源的凝集素被报道对糖的识别与结合具有高度的特异性与选择性，并已被广泛应用于糖生物学研究中。另一方面，真菌凝集素具有广泛的生物活性，例如抗菌、抗肿瘤以及免疫调节等，作为一类重要的潜在试剂/药物受到研究者的广泛关注。
蛹虫草属于一种重要的食药两用大型真菌，含有多肽、多糖、虫草素、虫草酸等多种活性成分。这些活性成分赋予蛹虫草一些重要的药理活性，如抗菌、抑炎、调节免疫以及抗肿瘤等。然而，目前关于蛹虫草凝集素基因特征以及功能的研究还较少。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种蛹虫草凝集素基因及其制备方法、重组表达载体、菌株、及蛹虫草凝集素的制备方法和应用，旨在提供一种蛹虫草凝集素基因，该基因能编码具有特异性功能的蛹虫草凝集素。
为实现上述目的，本发明提出一种蛹虫草凝集素基因CMA，用于编码蛹虫草凝集素，所述蛹虫草凝集素基因CMA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提出一种蛹虫草凝集素基因CMA的制备方法，包括以下步骤：
从蛹虫草中提取总RNA；
将提取到的所述总RNA进行反转录，获得cDNA；
以所述cDNA为模板，用特异性引物对进行PCR扩增，得到蛹虫草凝集素基因CMA；
其中，所述特异性引物包括第一引物对和第二引物对中任意一种，所述第一引物对包括正向引物PF1和反向引物PR1，所述第二引物对包括正向引物PF2和反向引物PR2；
所述第一引物对的核苷酸序列为：
正向引物PF1：5-’ATGGAGATCGCAGAACAGAACGTC’-3，
反向引物PR1：5-’TTACACGGTAATGATCTTATAGTCGCC’-3；
所述第二引物对的核苷酸序列为：
正向引物PF2：5-’ATGGAGATCGCAGAACAGAACGTCGGT’-3，
反向引物PR2：5-’TTACACGGTAATGATCTTATAGTCGCCTT’-3。
本发明还提出一种重组表达载体，包括如上所述的蛹虫草凝集素基因CMA。
可选地，所述重组表达载体的表达载体为质粒pGEX-6P-1。
本发明还提出一种菌株，包括如上所述的蛹虫草凝集素基因CMA。
可选地，所述菌株的宿主细胞为BL21(DE3)。
本发明还提出一种蛹虫草凝集素的制备方法，培养如上所述的菌株，得到蛹虫草凝集素。
本发明还提出一种如上所述的蛹虫草凝集素在制备特异性巨噬细胞激活试剂中的应用。
本发明还提出一种如上所述的蛹虫草凝集素在制备特异性凝集大鼠红细胞的试剂中的应用。
本发明还提出一种如上所述的蛹虫草凝集素在制备特异性识别和结合糖结构的试剂中的应用。
本发明提供的蛹虫草凝集素基因CMA，为从蛹虫草基因组中克隆出的部分基因片段，并确定了其为蛹虫草凝集素编码基因；此外，该蛹虫草凝集素基因CMA可以编码出一种蛹虫草凝集素，该蛹虫草凝集素能特异性凝集大鼠的红细胞，还对糖结构的识别和结合具有高度特异性，同时能特异性的识别、结合并激活巨噬细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的蛹虫草凝集素基因CMA的制备方法中对编码CMA的DNA进行PCR扩增后的电泳图；
图2为本发明提供的蛹虫草凝集素基因CMA在重组菌株中的表达的SDS-PAGE测试结果图；
图3为本发明提供的蛹虫草凝集素CMA经谷胱甘肽亲和层析柱纯化的洗脱图谱；
图4为本发明提供的蛹虫草凝集素CMA纯化中的SDS-PAGE测试结果图；
图5为本发明提供的蛹虫草凝集素对各种细胞的表面结合情况的流式检测图；
图6为本发明提供的蛹虫草凝集素0.25μM浓度条件下对巨噬细胞M1型和M2型极化因子的影响；
图7为本发明提供的蛹虫草凝集素对糖芯片中的结合强度前10位的结合情况；
图8为图7提供的结合强度前10位的糖结构的具体糖链结构。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种蛹虫草凝集素基因CMA，用于编码蛹虫草凝集素，所述蛹虫草凝集素基因CMA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。具体地，所述蛹虫草凝集素基因CMA的cDNAORF全长411bp，共编码137个氨基酸，分子量大小～15.3kDa。
本发明提供的蛹虫草凝集素基因CMA，为从蛹虫草基因组中克隆出的部分基因片段，并确定了其为蛹虫草凝集素编码基因；此外，该蛹虫草凝集素基因CMA可以编码出一种蛹虫草凝集素，该蛹虫草凝集素能特异性凝集大鼠的红细胞，还对糖结构的识别和结合具有高度特异性，同时能特异性的识别、结合并激活巨噬细胞。
本发明还提出一种蛹虫草凝集素基因CMA的制备方法，包括以下步骤：
步骤S10、从蛹虫草中提取总RNA。
具体地，将蛹虫草子实体(购自广州粤微食用菌技术有限公司)粉碎，然后使用天根mirVanaTMmiRNA分离试剂盒提取蛹虫草子实体的总RNA。
步骤S20、将提取到的所述总RNA进行反转录，获得cDNA。
以蛹虫草子实体中提取的总RNA为模板，利用逆转录酶和引物合成了cDNA。
步骤S30、以所述cDNA为模板，用特异性引物对进行PCR扩增，得到蛹虫草凝集素基因CMA。
具体地，以cDNA为模板，用特异性引物对进行PCR扩增，得到蛹虫草基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，并命名为CMA。
需要说明的是，本发明对特异性引物不做具体限制，只要可以PCR扩增得到蛹虫草凝集素基因CMA即可。在本发明中，提出了特异性引物的2个具体实施例，即特异性引物包括第一引物对和第二引物对，其中，第一引物对包括正向引物PF1和反向引物PR1，第二引物对包括正向引物PF2和反向引物PR2；第一引物对的核苷酸序列为：
正向引物PF1：5-’ATGGAGATCGCAGAACAGAACGTC’-3，
反向引物PR1：5-’TTACACGGTAATGATCTTATAGTCGCC’-3；
第二引物对的核苷酸序列为：
正向引物PF2：5-’ATGGAGATCGCAGAACAGAACGTCGGT’-3，
反向引物PR2：5-’TTACACGGTAATGATCTTATAGTCGCCTT’-3。
本发明还提出一种重组表达载体，包括如上所述的蛹虫草凝集素基因CMA。
表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。在本发明中，表达载体为质粒pGEX-6P-1。具体地，将蛹虫草凝集素基因CMA通过Bam H1和Xho1酶切插入到表达载体pGEX-6P-1中，即可得到重组表达载体。
本发明还提出一种菌株，包括如上所述的蛹虫草凝集素基因CMA。
该菌株即为重组菌株，可以由包含上述的蛹虫草凝集素基因CMA的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)获得。即，重组菌株还可以包含上述重组表达载体。将上述重组表达载体导入宿主细胞中即可获得重组菌株，目的基因即可随着宿主细胞的繁殖而复制。通常来说，宿主细胞可以是大肠杆菌，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞例如动物细胞等，在本实施例中，表达细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
鉴于此，上述重组菌株可以通过下述步骤制得：
步骤S1：将蛹虫草凝集素基因CMA通过Bam H1和Xho1酶切插入到表达载体pGEX-6P-1中，即可得到重组表达载体；
步骤S2：将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组表达载体的重组大肠杆菌BL21(DE3)，即为重组菌株。
而基于上述菌株的制备方法，可以得出培养上述菌株以形成上述蛹虫草凝集素的制备方法，该制备方法具体操作时可以通过以下步骤实现：
步骤A10、N端融合GST的蛹虫草凝集素基因CMA在菌株中的表达：将上述得到的蛹虫草凝集素基因CMA的N段插入GST标签，然后将含有GST标签的蛹虫草凝集素基因CMA的大肠杆菌BL21(DE3)菌液按照1％(V/V)的比例接种到加有氨苄抗生素的液体LB培养基(氨苄抗生素与LB培养基的体积比为1:1000)中，于37℃，200rpm条件下培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度0.5mM，18℃，200rpm培养14～16h，然后在4℃，4000～5000rpm下离心20min后收集菌体沉淀，再加入PBS缓冲液重悬菌体沉淀进行超声破碎(功率为200W，超声10s、间歇10s，重复90次)，然后在10000rpm，4℃下离心20min，收集上清；
步骤A20、蛹虫草凝集素CMA的纯化：取50mL PBS缓冲液平衡谷胱甘肽琼脂糖柱，流速设置为1mL/min，然后取步骤A10中收集的上清，以500μL/min的速度上样到谷胱甘肽琼脂糖柱中，上样完毕后，用PBS缓冲液洗涤柱子，洗去非特异性结合的杂蛋白，待A280 nm值平稳，用洗脱缓冲液对目标蛋白蛹虫草凝集素CMA进行洗脱，得到蛹虫草凝集素；
其中，PBS缓冲液的pH值为7.4，PBS缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：140mM的NaCl、2.7mM的KCl、10mM的Na2HPO4·12H2O和1.8mM的KH2PO4；洗脱缓冲液的PH值为7.4，洗脱缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：140mM的NaCl、2.7mM的KCl、10mM的Na2 HPO4·12H2 O、1.8mM的KH2PO4和10mM的GSH。
需要说明的是，上述涉及到基因克隆、重组表达载体及重组菌株制备、以及重组菌株培养获得重组蛋白等实施方式中，未说明具体实验方式、实验原材料者，均按照基因工程及基于基因工程进行微生物发酵培养制备蛋白质的常规方法进行。
本发明还提出一种如上所述的蛹虫草凝集素在制备特异性巨噬细胞激活试剂中的应用。
蛹虫草凝集素基因CMA编码蛹虫草凝集素，通过克隆蛹虫草基因组的部分基因片段，并且其为蛹虫草凝集素基因CMA，然后将蛹虫草凝集素基因CMA导入大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中，获得重组菌株，再对重组菌株进行培养，即可制得蛹虫草凝集素。蛹虫草凝集素可以特异性的识别、结合并且激活巨噬细胞M1型极化，可以应用到特异性巨噬细胞激活试剂的制备中。
本发明还提出一种如上所述的蛹虫草凝集素在制备特异性凝集大鼠红细胞的试剂中的应用。
本发明还提出一种如上所述的蛹虫草凝集素在制备特异性识别和结合糖结构的试剂中的应用。
目前，对糖结构的研究没有特异性抗体，所以研究较为困难。而本发明制得的蛹虫草凝集素，能特异性的识别与结合以核心五碳糖为骨架，后续连接有多个Gal-GlcNAc-单元的糖结构，可以应用到特异性识别和结合糖结构的试剂的制备中，也就可以应用于糖链结构的研究中。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1蛹虫草凝集素基因CMA的获得
(1)将蛹虫草子实体(购自广州粤微食用菌技术有限公司)粉碎，然后使用天根mirVanaTMmiRNA分离试剂盒提取蛹虫草子实体的总RNA；
(2)以提取的总RNA为模板，利用逆转录酶和引物合成了cDNA；
(3)以上述的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，得到蛹虫草凝集素CMA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其中，特异性引物为第一引物对和第二引物对中任意一种，第一引物对的核苷酸序列为：
正向引物PF1：5-’ATGGAGATCGCAGAACAGAACGTC’-3，
反向引物PR1：5-’TTACACGGTAATGATCTTATAGTCGCC’-3；
第二引物对的核苷酸序列为：
正向引物PF2：5-’ATGGAGATCGCAGAACAGAACGTCGGT’-3，
反向引物PR2：5-’TTACACGGTAATGATCTTATAGTCGCCTT’-3。
实施例2重组表达载体的制备
将实施例1制得的蛹虫草凝集素基因CMA通过Bam H1和Xho1酶切插入到表达载体pGEX-6P-1中，即可得到重组表达载体。
实施例3菌株的制备
将实施例2制得的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组表达载体的重组大肠杆菌BL21(DE3)，即为菌株，也就是重组菌株。
实施例4蛹虫草凝集素的制备
(1)N端融合GST的蛹虫草凝集素CMA在菌株中的表达：将实施例3制备得到的重组菌株的菌液(菌液中的蛹虫草凝集素基因CMA的N端插入了GST标签)按照1％(V/V)的比例接种到加有氨苄抗生素的液体LB培养基(氨苄抗生素与LB培养基的体积比为1:1000)中，于37℃，200rpm条件下培养至OD600为0.6～0.8(收集适量菌体，PBS重悬后，超声破碎，制备细菌全裂解液用以检测)，加入IPTG至终浓度0.5mM，18℃，200rpm诱导培养16h(收集适量诱导后的菌体，PBS重悬后，超声破碎，制备细菌全裂解液用以检测)，然后在4℃，5000rpm下离心20min后收集菌体沉淀，再加入PBS缓冲液重悬菌体沉淀进行超声破碎(功率为200W，超声10s、间歇10s，重复90次)，然后在10000rpm，4℃下离心20min，收集上清，并取适量菌体沉淀用ddH2O重悬，得沉淀重悬液，用以检测；
(2)蛹虫草凝集素CMA的纯化：取50mL PBS缓冲液平衡谷胱甘肽琼脂糖柱，流速设置为1mL/min，然后取上述收集的上清，以500μL/min的速度上样到谷胱甘肽琼脂糖柱中，上样完毕后，用PBS缓冲液洗涤柱子，洗去非特异性结合的杂蛋白，待A280 nm值平稳，用洗脱缓冲液对目标蛋白蛹虫草凝集素CMA进行洗脱，得到蛹虫草凝集素；其中，PBS缓冲液的pH值为7.4，PBS缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：140mM的NaCl、2.7mM的KCl、10mM的Na2 HPO4·12H2O和1.8mM的KH2PO4；洗脱缓冲液的PH值为7.4，洗脱缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：140mM的NaCl、2.7mM的KCl、10mM的Na2 HPO4.12H2 O、1.8mM的KH2PO4和10mM的GSH。
对实施例1制备的的蛹虫草凝集素基因CMA进行验证，然后对蛹虫草凝集素基因CMA在实施例3制备的重组菌株中的表达进行验证，以及对实施例4制备的蛹虫草凝集素进行特异性检测，测定方法及结果如下：
1、蛹虫草凝集素基因CMA的验证
制备2％(w/v)的琼脂糖凝胶，即将20g琼脂糖加入到1L TAE电泳缓冲液中(TAE电泳缓冲液，4.84g Tris-base,0.37g EDTA,1.14mL冰乙酸，ddH2O定容至1L，pH 8.0)；混匀后，微波加热至琼脂糖完全溶解；取20mL琼脂糖凝胶，冷却至60℃，加入20μL的0.5mg/mL EB染色液，并且充分混匀后倒入制胶板中，室温冷却凝固；将凝固的琼脂糖凝胶置入电泳槽中，加入TAE电泳缓冲液(4.84g Tris-base,0.37g EDTA,1.14mL冰乙酸，ddH2O定容至1L，pH8.0)，垂直向上取出梳子；移液枪吸取5μL PCR扩增的基因片段样品，再加入1μL 6×核酸上样缓冲液，充分混匀后，加入点样孔；核酸分子标尺用于验证所扩增的基因片段分子大小；调节电压至120V，电泳20min；关闭电源，取出凝胶后置于紫外透射检测仪上检测并记录DNA条带荧光。结果如图1所示(图1中，第1泳道代表核酸分子量标记物；第2泳道代表编码蛹虫草凝集素CMA蛋白的DNA)。
由图1可知，PCR扩增的基因片段得到了分子量大小～400bp的单一条带，与蛹虫草凝集素基因CMA的理论分子量大小411bp相符合。
2、蛹虫草凝集素基因CMA在重组菌株中的表达
分别取10μL实施例4的步骤(1)收集的未经IPTG诱导的细菌全裂解液、经过IPTG诱导后的细菌全裂解液、上清和沉淀(即沉淀重悬液)进行SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝R-250染色4h后脱色处理，鉴定重组融合表达GST的蛹虫草凝集素CMA的表达情况，其结果如图2所示(图2中，第1泳道代表蛋白分子量标记物；第2泳道代表未经IPTG诱导的细菌全裂解液；第3-5泳道分别代表经过IPTG诱导后的细菌全裂解液、上清和沉淀)。
由图2可知，蛹虫草凝集素基因CMA可实现在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达，且在上清和沉淀中均检测到蛹虫草凝集素基因CMA的表达。
3、蛹虫草凝集素基因CMA的纯化的验证
在实施例4的步骤(2)过程中，得到蛹虫草凝集素CMA经谷胱甘肽亲和层析柱纯化的洗脱图谱，结果如图3所示。由图3可知，蛹虫草凝集素CMA的洗脱峰较为单一。
分别收集上样前的上清(重组菌株经IPTG诱导后收集的上清)、上样过程中的穿透液(重组菌株全裂解液上清经谷胱甘肽柱纯化的穿透液)以及最终的洗脱液(洗脱缓冲液洗脱出的目的蛋白蛹虫草凝集素CMA)，并进行SDS-PAGE检测，其结果如图4所示(图4中，泳道1代表蛋白分子量标记物；泳道2为上清液；泳道3为穿透液；泳道4为洗脱液洗脱出的目的蛋白蛹虫草凝集素CMA，带有GST标签的目的蛋白蛹虫草凝集素CMA的相对分子质量为～41kDa，二聚体分子质量为～82kDa)。
由图4可知，IPTG诱导的全裂解液的上清经谷胱甘肽柱纯化后可以得到目标蛋白蛹虫草凝集素CMA，且分子量大小为～40kDa和～80kDa，与带有GST标签的蛹虫草凝集素CMA单体分子量大小～41kDa(其中，GST标签分子量大小26kDa，蛹虫草凝集素CMA分子量为～15.3kDa)和二聚体大小～82kDa相符合。
4、蛹虫草凝集素对巨噬细胞的特异性检测
分别收集1×106个RAW264.7(巨噬细胞)、H22(小鼠肝癌细胞22)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、HeLa(海拉细胞系)、HepG2(来源于一个15岁白人的肝癌组织)以及4T1(小鼠乳腺癌细胞)细胞，然后分别用100μL PBS缓冲液(pH 7.4)重悬后，加入生物素标记的蛹虫草凝集素蛋白(实施例4制备的)溶液，至蛹虫草凝集素蛋白的终浓度为5μM；在4℃条件下，旋转混合孵育2h；然后2000g离心5min，弃掉上清；用1mL PBS缓冲液(pH 7.4)分别洗涤细胞2次；用100mL PBS缓冲液重悬细胞，再加入0.5μLStreptavidin-Alexa-488，4℃条件下，旋转混合孵育30min；然后用1mL PBS缓冲液分别洗涤细胞1次；最后用1mL PBS重悬细胞，300目纱布将细胞过滤，最终用流式细胞仪检测细胞表面被蛹虫草凝集素蛋白标记的情况，其结果如图5所示。
由图5可知，实施例4中纯化制备的蛹虫草凝集素蛋白仅对巨噬细胞RAW264.7有特异性地识别与结合，在5μM浓度条件下，对1×106个RAW264.7细胞的标记比例为62.92％；而对其他几种检测的细胞H22、MCF-7、HeLa、HepG2以及4T1的标记率均<10.1％，因此，本发明制备的蛹虫草凝集素蛋白能特异性地识别与结合巨噬细胞。
进一步地，取实施例4制备的蛹虫草凝集素蛋白10mg，用Detoxin-GelTM内毒素去除柱进行脱内毒素处理，然后，用Toxin-SensorTMChromogenic LALEndotoxin试剂盒检测内毒素的去除效率，检测过程按照说明书进行；
将RAW264.7细胞按照1×106/孔的接种到96孔板中，37℃，5％CO2浓度条件下贴壁培养3h；用0.25μM进行上述脱毒后的蛹虫草凝集素蛋白处理细胞3h，0μM的蛹虫草凝集素蛋白处理组为空白对照组；收集细胞，用于提取RNA进行荧光定量PCR检测；将收集的细胞用Trizol充分裂解，再按照氯仿/Trizol 1:5(V/V)的比例加入氯仿，振荡15s后，冰浴静置3min；12000g离心10min，吸取上层水相层到不含RNase的EP管中，再按照异丙醇/Trizol1:2(v/v)的比例加入异丙醇溶液，充分混匀，冰浴静置10min；然后12000g离心10min,弃掉上清，RNA沉淀用75％的乙醇洗涤两次；7500g，离心5min弃掉上清，EP管敞口静置冰上将RNA干燥。最终加入20μL DEPC水溶解RNA；逆转录酶将RNA反转录为cDNA；
利用Primer bank在线软件设计用于荧光定量检测巨噬细胞M1型极化细胞因子IL-6(正向引物：5’-TAGTCCTCCCTACCCCAATTTCC-3’，反向引物：5’-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3’)、TNF-α(正向引物：5’-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3’，反向引物：5’-GCTACGACGTGGGCTACAG-3’)和iNOS(正向引物：5’-CAGATCCCGAAACGCTTCA-3’，反向引物：5’-TGTTGAGGTCTAAAGGCTCCG-3’)以及巨噬细胞M2型极化细胞因子Arg-1(正向引物：5’-GCCTTTGTTGATGTCCCTAATGA-3’，反向引物：5’-CCACACTGACTCTTCCATTCTTC-3’)、CCL22b(正向引物：5’-AGGTCCCTATGGTGCCAATGT-3’，反向引物5’-CGGCAGGATTTTGAGGTCCA-3’)和CCL17(正向引物：5’-TACCATGAGGTCACTTCAGATGC-3’，反向引物：5’-GCACTCTCGGCCTACATTGG-3’)的引物，并由擎科创新生物科技有限公司合成；
按照5μL SyBr Green mix、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物，1μL cDNA模板，3μLddH2O的反应体系制备反应样品；样品混匀后，实时荧光定量PCR检测mRNA的表达情况；PCR反应条件为95℃反应1min，然后95℃反应15s、60℃反应15s、72℃反应25s为一次，如此循环45次；溶解温度设置为65℃至95℃；GAPDH设置为内参基因，基因相对表达2-△△CT。其结果如图6所示。
由图6可知，蛹虫草凝集素蛋白处理巨噬细胞RAW264.7可以显著地激活巨噬细胞M1型极化因子IL-6、TNF-α和iNOS的mRNA的表达，而对巨噬细胞M2型极化因子Arg-1、CCL22b以及CCL17的表达有一定的抑制效果。
综上所述，蛹虫草凝集素可以特异性的识别与结合巨噬细胞，因此，蛹虫草凝集素可以应用到特异性巨噬细胞激活试剂的制备中，进一步地，蛹虫草凝集素能特异性的激活并诱导巨噬细胞M1型极化细胞因子的表达。
5、蛹虫草凝集素凝血活性的特异性检测
取“V”型96孔板，每孔中加入生理盐水；在左侧第一孔中加入50μL实施例4中制备的蛹虫草凝集素蛋白溶液(1mg/mL，生理盐水溶解)混匀，后续孔进行梯度稀释；其中，生理盐水作为阴性对照，Con A凝集素(500μg/mL，生理盐水溶解)为阳性对照；再向每孔中加入50μL由生理盐水稀释的1％的大鼠、小鼠、猪、猫、牛以及人A/B/AB/O型红细胞，混匀；静置30min，观察记录红细胞的凝集情况。其结果如表1所示。
表1蛹虫草凝集素对不同类型红细胞的凝集效应
红细胞类型 凝血滴度
大鼠 2<sup>5</sup>
小鼠 无凝血效应
猪 无凝血效应
猫 无凝血效应
牛 无凝血效应
人A型血 无凝血效应
人B型血 无凝血效应
人AB型血 无凝血效应
人O型血 无凝血效应
由表1可知，蛹虫草凝集素仅表现出对大鼠红细胞的凝集，且在500μg/mL初始浓度下，凝血滴度为25，而对其他检测的血红细胞均没有凝集效应。因此，本发明提供的蛹虫草凝集素能特异性凝集大鼠红细胞，可以应用于特异性凝集大鼠红细胞试剂的制备中。
6、蛹虫草凝集素结合糖结构的特异性检测
利用糖芯片检测蛹虫草凝集素的糖结合特异性，该芯片含有600种结构不同的糖，芯片上每个糖均有6个重复点；将实施例4制备的蛹虫草凝集素蛋白配制为50μg/mL与芯片进行孵育，最终用带有荧光标记的抗GST标签的抗体进行检测。其结果如图7和图8所示。
由图7和图8可知，检测结果中相对荧光强度(RFU)前10的糖链结构中均含有核心五碳糖结构(Mana1-6(Mana1-3)Manb1-4GlcNAcb1-4GlcNAc)后续连接有多个Gal-GlcNAc-单元的糖结构，因此，蛹虫草凝集素能特异性识别并结合糖结构，可以应用到特异性识别和结合糖结构的试剂的制备中，也就可以应用于糖链结构的研究中。
综上所述，本发明从蛹虫草基因组中克隆出了部分基因片段，即蛹虫草凝集素基因CMA，并确定了其为蛹虫草凝集素编码基因；此外，该蛹虫草凝集素基因CMA可以编码出一种蛹虫草凝集素，该蛹虫草凝集素能特异性凝集大鼠的红细胞，还对糖结构的识别和结合具有高度特异性，同时能特异性的识别、结合并激活巨噬细胞。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉轻工大学
<120> 蛹虫草凝集素基因及其制备方法、重组表达载体、菌株、及蛹虫草凝集素的
制备方法和应用
<130> 2020.7.30
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 411
<212> DNA
<213> Cordyceps militaris
<400> 1
atggagatcg ctgagcagaa cgttggcaag tcttgtgcca ttgtcaacct catcccccca 60
aaggagggta gcaacatctg gacggccaag caggtcacca ttgctcggaa ccttcctccc 120
aatcgtggaa ctggccgcca ccagattgac tggtcctttg ggcccgtcaa ggttaccggt 180
tatgttgata ccaccaactg ggagattggt gtgactgtta gcatcatggg aatcgacctt 240
ggcaccgtct atggaaacct cagagacgga gtcgtcctca acgttgacct tttcctagcc 300
aagggccagg tccggttcta cctgaagaac ggcaacgaag tttgggttca cctgagtgtt 360
gagatcagat tcgacggaaa gttcgagggc gactacaaga ttatcacagt t 411

Claims (10)

1.一种蛹虫草凝集素基因CMA，用于编码蛹虫草凝集素，其特征在于，所述蛹虫草凝集素基因CMA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种如权利要求1所述的蛹虫草凝集素基因CMA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
从蛹虫草中提取总RNA；
将提取到的所述总RNA进行反转录，获得cDNA；
以所述cDNA为模板，用特异性引物对进行PCR扩增，得到蛹虫草凝集素基因CMA；
其中，所述特异性引物包括第一引物对和第二引物对中任意一种，所述第一引物对包括正向引物PF1和反向引物PR1，所述第二引物对包括正向引物PF2和反向引物PR2；
所述第一引物对的核苷酸序列为：
正向引物PF1：5-’ATGGAGATCGCAGAACAGAACGTC’-3，
反向引物PR1：5-’TTACACGGTAATGATCTTATAGTCGCC’-3；
所述第二引物对的核苷酸序列为：
正向引物PF2：5-’ATGGAGATCGCAGAACAGAACGTCGGT’-3，
反向引物PR2：5-’TTACACGGTAATGATCTTATAGTCGCCTT’-3。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求1所述的蛹虫草凝集素基因CMA。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的表达载体为质粒pGEX-6P-1。
5.一种菌株，其特征在于，包括如权利要求1所述的蛹虫草凝集素基因CMA。
6.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述菌株的宿主细胞为BL21(DE3)。
7.一种蛹虫草凝集素的制备方法，其特征在于，培养如权利要求5或6所述的菌株，得到蛹虫草凝集素。
8.一种如权利要求1所述的蛹虫草凝集素在制备特异性巨噬细胞激活试剂中的应用。
9.一种如权利要求1所述的蛹虫草凝集素在制备特异性凝集大鼠红细胞的试剂中的应用。
10.一种如权利要求1所述的蛹虫草凝集素在制备特异性识别和结合糖结构的试剂中的应用。
CN202010764971.9A 2020-07-31 2020-07-31 蛹虫草凝集素基因及其制备方法、重组表达载体、菌株、及蛹虫草凝集素的制备方法和应用 Pending CN111875683A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010764971.9A CN111875683A (zh) 2020-07-31 2020-07-31 蛹虫草凝集素基因及其制备方法、重组表达载体、菌株、及蛹虫草凝集素的制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010764971.9A CN111875683A (zh) 2020-07-31 2020-07-31 蛹虫草凝集素基因及其制备方法、重组表达载体、菌株、及蛹虫草凝集素的制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111875683A true CN111875683A (zh) 2020-11-03

Family

ID=73205376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010764971.9A Pending CN111875683A (zh) 2020-07-31 2020-07-31 蛹虫草凝集素基因及其制备方法、重组表达载体、菌株、及蛹虫草凝集素的制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111875683A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013016896A1 (zh) * 2011-08-01 2013-02-07 武汉奥力生物科技有限公司 杨树菇凝集素aal-2及其编码基因、其制备方法和应用
CN105063076A (zh) * 2015-08-11 2015-11-18 集美大学 大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法和应用
CN106397554A (zh) * 2016-10-19 2017-02-15 上海市农业科学院 一种蛹虫草凝集素蛋白Lectin‑ccm3及其制备方法和应用
CN110698548A (zh) * 2019-11-01 2020-01-17 武汉轻工大学 一种蛹虫草活性蛋白CMPr及其制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013016896A1 (zh) * 2011-08-01 2013-02-07 武汉奥力生物科技有限公司 杨树菇凝集素aal-2及其编码基因、其制备方法和应用
CN105063076A (zh) * 2015-08-11 2015-11-18 集美大学 大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法和应用
CN106397554A (zh) * 2016-10-19 2017-02-15 上海市农业科学院 一种蛹虫草凝集素蛋白Lectin‑ccm3及其制备方法和应用
CN110698548A (zh) * 2019-11-01 2020-01-17 武汉轻工大学 一种蛹虫草活性蛋白CMPr及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KE-CHUN BAI等: "A novel protein from edible fungi Cordyceps militaris that induces apoptosis", 《JOURNAL OF FOOD AND DRUG ANALYSIS》 *
ZHENG,P.等: "Coedyceps militaris CM01 hypothetical protein (CCM_01955)，partial mRNA", 《NCBI GENEBANK》 *
杨庆: "大型真菌凝集素的生物活性研究及应用", 《《中国优秀博士学位论文全文数据库（电子期刊）》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110117323B (zh) 一种可溶性人源角蛋白及其应用
CN111423486A (zh) 新型冠状病毒重组蛋白包涵体的复性方法
CN108929874A (zh) 一种特异性结合高表达pdl1蛋白的细胞的核酸适配体及其应用
CN108929873A (zh) 一种特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体及其应用
CN113186109A (zh) 一种酿酒酵母表达长效重组纤连蛋白及其在化妆品中的应用
CN101205544A (zh) 肿瘤靶向性重组新城疫病毒及其构建方法
CN106834336A (zh) 一种哈茨木霉酸性蛋白酶p6281的异源表达及纯化方法
JP5947720B2 (ja) ｉｎｖｉｖｏ用途のためのバイオセンサーの安定化
CN107090442B (zh) 一种N糖基转移酶BtNGT及其应用
CN111499759A (zh) 一种具有细胞穿膜性的锌指蛋白-乳铁蛋白融合蛋白质及其制备与应用
CN103146709A (zh) 云南红梨PybHLH基因及其原核表达载体和应用
CN111875683A (zh) 蛹虫草凝集素基因及其制备方法、重组表达载体、菌株、及蛹虫草凝集素的制备方法和应用
CN112625141A (zh) 一种番茄斑萎属病毒的蛋白标准物质及其应用
CN105624082B (zh) 表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒及其应用
CN103360497A (zh) 一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用
US10676534B2 (en) Vaults engineered for hydrophobic drug delivery
CN102899293A (zh) 促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞、及其构建方法与应用
CN103739696B (zh) 一种半滑舌鳎雌性特异csw3蛋白及其基因与应用
CN110759986A (zh) 一种可逆自组装蛋白的高效制备方法
CN106913864A (zh) 融合蛋白tat‑dcf1的新用途
CN114736265A (zh) 一种四肽-9的合成方法
CN107936107A (zh) 长牡蛎干扰素调节因子CgIRF‑1基因重组蛋白、制备方法及应用
CN107746432A (zh) 一种Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法
CN108165539A (zh) 一种梨S7-RNase蛋白的体外表达方法及其多克隆抗体的制备方法
CN113667652A (zh) 一种提高sod3可溶性表达及酶活性的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201103