CN104530191A

CN104530191A - 一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN104530191A
Application number: CN201410831470.2A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 潘欣; 迟长凤; 胡发远; 陈荫
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2014-12-29
Filing date: 2014-12-29
Publication date: 2015-04-22

Abstract

本发明公开了一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽及其制备方法和用途，该抗前列腺癌多肽的氨基酸序列为Pro-Gln-Trp-Pro-Pro（PEWPP），ESI/MS检测分子量为624.65 Da。该抗前列腺癌多肽的制备方法包括组织绞碎、酶解、超滤和层析等步骤。制备得到的高活性多肽Pro-Gln-Trp-Pro-Pro（PEWPP）对人前列腺癌PC-3细胞具有显著的增殖抑制作用，可用作抗前列腺癌药品或保健食品。 <u/>

Description

一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽，本发明还涉及该抗前列腺癌血蚶蛋白多肽的制备方法，本发明还涉及该抗前列腺癌血蚶蛋白多肽在抗肿瘤方面的用途。

背景技术

血蚶（Tegillarca granosa）属于软体动物“瓣鳃类”，在我国南北沿海各地均有分布。血蚶肉柱紫赤色，味极鲜美，在江苏、浙江和福建等地深受消费者喜爱。另外，传统本草著作记载蚶肉具有补益气血、健脾益胃、散结消痰之功效，常用于症瘕痞块、老痰积结等病症。

目前，申请人研究发现，以血蚶为原料，利用酶解技术制备抗前列腺癌多肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性抗前列腺癌多肽及其应用更是未见报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽，该多肽对前列腺癌PC-3细胞的增值具有显著的抑制作用。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽在制备抗前列腺癌药物或保健食品中的应用。

本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列为Pro-Gln-Trp-Pro-Pro（PEWPP），ESI/MS检测分子量为624.65 Da。

本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）以血蚶作为原料，取蚶肉组织绞碎，按固液比1 g：3~5 mL加入异丙醇，于30~35 ℃脱脂处理36~54 h后，于6 000 r/min离心10~15 min，取沉淀，干燥，得脱脂蚶肉；

（2）将脱脂蚶肉按固液比1 g：15~25 mL加磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.0），按照脱脂蚶肉质量的1.0~2.0%加入中性蛋白酶（酶活力≥1.5 AU/g），于55~65℃温度下酶解5~8 h；

（3）将酶解液加热到90~95℃灭活10~15 min，以12 000 r/min离心10~15 min，去除沉淀，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗前列腺癌多肽。

作为改进，所述步骤（3）的超滤和层析的具体过程为：

超滤：将上清液用截留分子量1 kDa的超滤膜进行超滤处理，根据对人前列腺癌PC-3细胞的抑制活性，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解物；

层析：将上述超滤酶解物用双蒸水配成35~45 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.08~0.12 mol/L、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人前列腺癌PC-3细胞抑制活性最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成20~30 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人前列腺癌PC-3细胞抑制活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~55 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据对人前列腺癌PC-3细胞的抑制活性得1个高活性多肽Pro-Gln-Trp-Pro-Pro（PEWPP）。

优选，所述阴离子交换树脂为DEAE-52 纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25。

再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 μL；色谱柱为Zorbax SB C-18（4.6 × 250 mm）；柱温为30 ℃；流动相：0~5 min为水，5~30 min乙腈浓度从0匀速升至40%，30~40 min 为100%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm。

本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽的应用，其特征在于Pro-Gln-Trp-Pro-Pro（PEWPP）对人前列腺癌PC-3细胞具有显著的增殖抑制作用，可用作为抗前列腺癌方面的药品或保健食品。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明选用中性蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，制得的多肽具有较强的抗前列腺癌活性；与化学合成的抗肿瘤药物相比较，本发明制得的抗前列腺癌多肽具有强的前列腺癌细胞增殖抑制作用、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作抗前列腺癌方面的药品或保健食品。

附图说明

图1是本发明的阴离子交换树脂DEAE-52纤维素层析图。

图2是本发明的葡聚糖凝胶G-25层析图。

图3 是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物的RP-HPLC分析图。

图4是本发明的Pro-Gln-Trp-Pro-Pro（PEWPP）的质谱（ESI-MS）图。

图5是Pro-Gln-Trp-Pro-Pro（PEWPP）对人前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽的制备方法，制备工艺流程如下：血蚶"蛋白脱脂"酶解"酶解物"超滤"离子交换层析"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"抗前列腺癌多肽。

实施例：（1）以血蚶作为原料，取蚶肉组织绞碎，按固液比1 g：4 mL加入异丙醇，于35 ℃脱脂处理48 h后，于6 000 r/min离心15 min，取沉淀，干燥，得脱脂蚶肉；

（2）将脱脂蚶肉按固液比1 g：20 mL加磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.0），按照脱脂蚶肉质量的1.5%加入中性蛋白酶（酶活力≥1.5 AU/g），于60℃温度下酶解6 h；

（3）将酶解液加热到95℃灭活10 min，以12 000 r/min离心10 min，去除沉淀，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗前列腺癌多肽，利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为：

①超滤：将上清液用截留分子量1 kDa的超滤膜进行超滤处理，根据对人前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制活性，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解物；

②阴离子交换层析：将上述超滤酶解物用双蒸水配成40 mg/mL的溶液，经过DEAE-52 纤维素阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.10 mol/L 、0.50 mol/L和1.00 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人前列腺癌PC-3细胞增殖抑制活性最高组分（F4）为离子交换层析酶解物（图1）。

③凝胶过滤层析：将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成25 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人前列腺癌PC-3细胞增殖抑制活性最高组分（F44）为凝胶层析酶解物（图2）。

④高效液相色谱精制：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成50 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化（进样量20 μL；色谱柱为Zorbax SB C-18（4.6 × 250 mm）；柱温为30 ℃；流动相：0~5 min为水，5~30 min乙腈浓度从0匀速升至40%，30~40 min 为100%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm，根据对人前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制活性得1个高活性多肽（图3）。

⑤结构检测：收集活性最高的1个抗前列腺癌多肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Pro-Gln-Trp-Pro-Pro（PEWPP），ESI/MS检测分子量为624.65 Da（[M+H]⁺ 625.64 Da）（图4）。

将上述制得的前列腺癌血蚶蛋白多肽Pro-Gln-Trp-Pro-Pro（PEWPP）进行人前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制实验。实验结果表明：该多肽对PC-3细胞的增殖抑制呈现出量效关系（图5），半数抑制浓度（IC₅₀）为1.53 mg/mL。

最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋学院

<120> 一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽及其制备方法和用途

<130> zjou-wb-2014

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Pro Glu Trp Pro Pro

1 5

Claims

1.一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽，其特征在于该抗前列腺癌血蚶蛋白多肽的氨基酸序列为Pro-Gln-Trp-Pro-Pro，ESI/MS检测分子量为624.65 Da。

2.一种权利要求1所述的一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

离心干燥步骤：以血蚶作为原料，取蚶肉组织绞碎，按固液比1 g：3~5 mL加入异丙醇，于30~35 ℃脱脂处理36~54 h后，于6 000 r/min离心10~15 min，取沉淀，干燥，得脱脂蚶肉；

酶解步骤：将脱脂蚶肉按固液比1 g：15~25 mL加磷酸盐缓冲液，按照脱脂蚶肉质量的1.0~2.0%加入中性蛋白酶，于55~65℃温度下酶解5~8 h；

提纯步骤：将酶解液加热到90~95℃灭活10~15 min，以12 000 r/min离心10~15 min，去除沉淀；上清液依次经超滤和层析，得到抗前列腺癌多肽；

酶解步骤中，所述的中性蛋白酶的酶活力≥1.5 AU/g；

酶解步骤中，所述的磷酸盐缓冲液浓度为0.02 mol/L，pH 为7.0；。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述提纯步骤的超滤和层析的具体过程为：

超滤：将上清液用截留分子量1 kDa的超滤膜进行超滤处理，根据对人前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制活性，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解物；

层析：将上述超滤酶解物用双蒸水配成35~45 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.08~0.12 mol/L、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人前列腺癌PC-3细胞增殖抑制活性最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成20~30 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人前列腺癌PC-3细胞增殖抑制活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~55 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据对人前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制活性得1个高活性多肽Pro-Gln-Trp-Pro-Pro。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 μL；色谱柱为Zorbax C18，规格为4.6 × 250 mm；流动相：0~5 min为水，5~30 min为乙腈， 30~40 min为100%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm；所述的5~30 min所采用的乙腈浓度从0匀速升至40%。

5.根据权利要求2所述的一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽的制备方法，其特征在于所制备的抗肿瘤肽Pro-Gln-Trp-Pro-Pro对PC-3细胞的增殖的半数抑制浓度为1.99 mg/mL。

6.权利要求1所述的一种血蚶蛋白多肽用于制备抗前列腺癌药物或保健食品的用途。