CN104926925B

CN104926925B - 一种带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN104926925B
Application number: CN201510117782.1A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 迟长凤; 邓尚贵; 孙坤来; 陈荫
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Beijing Simeitol Biotechnology Co ltd; Hefei Little Hedgehog Information Technology Co ltd
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2035-03-18
Also published as: CN104926925A

Abstract

本发明公开了一种带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途，具体讲是以带鱼鱼肉为原料，通过脱脂、protamex复合蛋白酶和中性蛋白酶双酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、大孔树脂纯化、阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Asn‑Trp‑Asp‑Met‑Glu‑Lys‑Ile‑Trp，ESI‑MS测定分子量为1121.25 Da。本发明制备的高活性抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用。具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品或食品添加剂等。

Description

一种带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及到蛋白抗氧化肽，具体指涉及一种带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽及其制备方法。

背景技术

抗氧化剂是一类可以减弱或者祛除自由基对人体损害和保护食品免受氧化损伤变质的一类物质。目前，化学合成抗氧化剂由于价格便宜，被广泛地应用到食品工业中。但是，化学合成抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯 (BHT)、没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)等，在不同程度上损伤人体的肝脏、肾脏等器官。因此，部分国家和地区已经明确限量或禁止使用对人体有毒副作用的化学合成抗氧化剂。寻找高效、安全的天然抗氧化剂替代化学合成抗氧化剂成为研究热点，而抗氧化肽由于其食用安全、利用度高、无毒副作用等优点受到广泛重视。

带鱼又叫刀鱼、裙带、肥带、油带、牙带鱼等，属于脊索动物、脊椎动物亚门、硬骨鱼纲、鲈形目、带鱼科，主要分布于西太平洋和印度洋，在我国的黄海、东海、渤海和南海均有分布。带鱼富含脂肪、蛋白质、维生素A、不饱和脂肪酸、微量元素等多种营养成分，具有暖胃、泽肤、补气、养血、健美以及强心补肾、舒筋活血、消炎化痰、清脑止泻、消除疲劳、提精养神之功效。

但是，申请人发现，以带鱼鱼肉为原料，利用酶解技术制备带鱼鱼肉抗氧化肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性抗氧化肽及其应用更是未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种能够清除自由基和抑制脂质过氧化作用的带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽，其可作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽为八肽化合物，氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp(NWDMEKIW)，ESI-MS测定分子量为1121.25 Da。

上述带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

1）带鱼鱼肉预处理：取带鱼鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至80~100℃后保温5~10min，然后按照料液比1g:2~4mL加入异丙醇，于20~25℃脱脂18~24 h，然后于4℃、4500~6000 rpm离心15~20min除去异丙醇，收集脱脂带鱼鱼肉固形物；

2）带鱼鱼肉蛋白的酶解：将上述脱脂带鱼鱼肉固形物按固液比1g:20~25mL加入磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 6.5~7.5），混合液温度升至55~65℃搅拌预热10~15 min，按脱脂带鱼鱼肉固形物质量的1.0~1.5%加入protamex复合蛋白酶，在55~65℃酶解4~6 h；然后将酶解液升温至90~95℃后恒温保持10~15 min，将酶解液温度降至45~50℃，按脱脂带鱼鱼肉固形物质量的1.5~2.0%加入中性蛋白酶，在45~50℃酶解3~5 h，冷却至20~25℃，于5000~6000 rpm离心20~25min，除去沉淀物，得到酶解液；

3）带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得到超滤酶解液，将超滤酶解液按照体积比加入到装有8～10倍D201大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的30%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽。

作为优选，所述的步骤1）中的带鱼为日本带鱼（Trichiurus japonicus）。

作为优选，所述步骤4）的阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：

阳离子交换树脂层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45~50 mg/mL的溶液，经过强酸性阳离子交换树脂(732)层析柱分离，收集双蒸水洗脱组分，即为离子交换层析酶解物；

凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为15~20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据230 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高羟基自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物；

RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对羟基自由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp (NWDMEKIW)。

再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量10~15 μL；色谱柱Kromasil C₁₈（250 mm×4.6mm，5 μm）；流动相：40%乙腈；洗脱速度0.8~1.0 mL/min；紫外检测波长230 nm。

与现有技术相比，本发明所提供的带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp(NWDMEKIW)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp(NWDMEKIW) 具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品的添加剂。

附图说明

图1是本发明的葡聚糖凝胶Sephadex G-25层析图。

图2 葡聚糖凝胶Sephadex G-25制备酶解物的RP-HPLC分析。

图3 Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp的质谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下：带鱼鱼肉"脱脂"酶解"酶解物"超滤"大孔树脂纯化"阳离子交换层析"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"抗氧化肽。

具体步骤为：

1）带鱼鱼肉预处理：取日本带鱼（Trichiurus japonicus）鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至85℃后保温10min，然后按照料液比1g:4 mL加入异丙醇，于25℃脱脂24h，然后于4℃、6000 rpm离心15 min除去异丙醇，收集脱脂带鱼鱼肉固形物；

2）带鱼鱼肉蛋白的酶解：将上述脱脂带鱼鱼肉固形物按固液比1g:25mL加入磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.0），混合液温度升至60℃搅拌预热10 min，按脱脂带鱼鱼肉固形物质量的1.5%加入protamex复合蛋白酶，在60℃酶解4~6 h；然后将酶解液升温至95℃后恒温保持15 min，将酶解液温度降至50℃，按脱脂带鱼鱼肉固形物质量的1.5%加入中性蛋白酶，在50℃酶解4 h，冷却至20℃，然后于6000 rpm离心25min，除去沉淀物，得到酶解液；

3）带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得到超滤酶解液，将超滤酶解液按照体积比加入到装有10倍D201大孔树脂的层析柱中，用5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用8倍柱体积的30%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽，利用氨基酸序列分析仪和质谱测定其结构，具体过程为：

①阳离子交换层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45 mg/mL的溶液，经过强酸性阳离子交换树脂(732)层析柱分离，收集双蒸水洗脱组分，即为离子交换层析酶解物；

②凝胶色谱层析：将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成浓度为20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据230 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高羟基自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物F3（图1）。

③高效液相色谱精制：将上述凝胶层析酶解物（F3）用双蒸水配成浓度为80 μg/mL的溶液，用RP-HPLC进行纯化（进样量20 μL；色谱柱Kromasil C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相40%乙腈；紫外检测波长230 nm），根据230 nm下的吸光度曲线和羟基自由基清除活性得1个高活性抗氧化肽（图2）。

④结构检测：收集羟基自由基清除活性最高的1个抗氧化肽，经RP-HPLC检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp(NWDMEKIW)，ESI-MS测定分子量为1121.25 Da（[M+H]⁺ 1122.23）（图3）。

将制得的带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp(NWDMEKIW)进行自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验，实验结果表明：Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp (NWDMEKIW)对DPPH 自由基（EC₅₀ 1.37 mg/mL）、羟基自由基（EC₅₀0.172 mg/mL）和超氧阴离子自由基(EC₅₀ 0.083 mg/mL）具有良好的清除作用；同时，Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp (NWDMEKIW)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋学院

<120> 一种带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途

<130> zjou-wb-201504

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Asn Trp Asp Met Glu Lys Ile Trp

1 5

Claims

1.一种带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽为八肽化合物，氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp，ESI-MS测定分子量为1121.25Da。

2.权利要求1所述的带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

1）带鱼鱼肉预处理：取带鱼鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至80~100℃后保温5~10min，然后按照料液比1g:2~4mL加入异丙醇，于20~25℃脱脂18~24h，然后于4℃、4500~6000rpm离心15~20min除去异丙醇，收集脱脂带鱼鱼肉固形物；

2）带鱼鱼肉蛋白的酶解：将上述脱脂带鱼鱼肉固形物按固液比1g:20~25mL加入浓度为0.05mol/L，pH 6.5~7.5的磷酸盐缓冲液，然后将混合液温度升至55~65℃搅拌预热10~15min，按脱脂带鱼鱼肉固形物质量的1.0~1.5%加入protamex复合蛋白酶，在55~65℃酶解4~6h；然后将酶解液升温至90~95℃后恒温保持10~15min，将酶解液温度降至45~50℃，按脱脂带鱼鱼肉固形物质量的1.5~2.0%加入中性蛋白酶，在45~50℃酶解3~5h，冷却至20~25℃，然后于5000~6000rpm离心20~25min，除去沉淀物，得到酶解液；

3）带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得到超滤酶解液，将超滤酶解液按照体积比加入到装有8～10倍D201大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的30%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得到带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽；

所述步骤3）的阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：

阳离子交换树脂层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45~50mg/mL的溶液，经过强酸性阳离子交换树脂(732)层析柱分离，收集双蒸水洗脱组分，即为离子交换层析酶解物；

凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为15~20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶SephadexG-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据230nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高羟基自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物；

RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，流动相为40%乙腈，洗脱速度0.8~1.0mL/min，紫外检测波长230nm），收集羟基自由基清除活性最高的1个抗氧化肽，经 RP-HPLC检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp。

3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤1）中所述的带鱼为日本带鱼（Trichiurus japonicus）。

4.权利要求1所述的一种带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽用于制备抗氧化药物和保健品的用途。