CN107827967A - 一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽，本发明还公开了该五肽在制备抗氧化保健品中的应用。有益效果为：本发明所提供的鮸鱼鱼肉抗氧化肽对1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼（DPPH）自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；五肽能显著提高细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH‑Px）的活力，并显著降低胞内一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）的含量，对双氧水诱导HUVEC细胞氧化损伤起到保护作用；五肽具有安全无毒、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品的添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及到抗氧化寡肽，尤其是涉及一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽及其应用。
背景技术
生物活性肽是氨基酸以不同排列方式和组合构成的包括二肽和复杂的环形、线形结构的不同肽类的总称。不同的生物肽具有不同的结构和生理功能，如抗病毒、抗癌、抗血栓、抗高血压、免疫调节、激素调节、抑菌、降胆固醇等作用。目前，肽类物质主要用于开发功能性食品、肽类试剂和肽类药物。
海洋来源的蛋白质、多肽及氨基酸与陆地有较大的差异，其中海洋多肽以其良好的生物活性及稳定的理化性质，越来越多的受到研究者的关注。因此，以大宗海洋生物资源极其加工副产物进行活性肽的开发成为研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽，该五肽能够清除自由基、抑制脂质过氧化和保护细胞免受氧化损伤。
本发明的另一目的在于将源于鮸鱼鱼肉的五肽用于制备抗氧化保健品中的用途，以五肽为活性成分，能够保护细胞免受氧化损伤，起到调节免疫、抗衰老、抗癌防癌等作用，提高了人们的健康水平。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽在制备抗氧化保健品中的应用，该五肽的氨基酸序列为：IRWWW，ESI-MS测定分子量为846.00Da。五肽能够清除自由基、抑制脂质过氧化和保护细胞免受氧化损伤。
作为优选，源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽的制备方法包括以下步骤：
鮸鱼鱼肉预处理：鮸鱼去鱼皮和鱼骨，鱼肉匀浆至糊状后，按料液比1g:4～6mL加入乙酸乙酯溶液，搅拌脱脂20～24h，过滤，干燥，得脱脂鮸鱼鱼肉；
鮸鱼鱼肉的酶解：取脱脂鮸鱼鱼肉，按料液比1g:5～7mL加入蒸馏水，调节pH值至6.5～7.5，加入鱼肉重量1.0%～1.5%木瓜蛋白酶，45～55℃酶解3～5h，在90～100℃持续10min灭酶活，样品降温至50℃，调节pH值至8.5～10.0，加入碱性蛋白酶1.0%～2.0%，反应3～5h，在90～100℃下持续10min灭酶活，冷却至常温，12000rmp离心20min，收集上清液，得鮸鱼鱼肉酶解液，该条件下，酶活力高，酶解反应速度快，且使鮸鱼鱼肉得到了充分利用；
鮸鱼鱼肉抗氧化寡肽的制备：将鮸鱼鱼肉酶解液经截留分子量为1kDa、3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于1kDa组分，得到超滤酶解液，将超滤酶解液按照体积比加入到装有8～10倍D101大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液在50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鮸鱼鱼肉抗氧化寡肽。该条件下，所获得的五肽纯度高，品质好，为五肽的应用研究提供了良好的条件。
作为优选，离子交换树脂层析的具体过程为：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45～50mg/mL的溶液，加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1 mol/L的NaCl溶液洗脱，收集最高自由基清除活性组分，即为离子交换层析酶解物，该过程操作简单，重复性好，且洗脱范围广，可根据实际情况进行放大条件实现工业化生产；
作为优选，凝胶柱层析的具体过程为：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为15～20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物，该过程利用不同分子量大小的物质在层析柱中流动速度的不同实现了物质的分离，操作简单，且不影响酶解物的品质；
作为优选，反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化的具体过程为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80～100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对羟基自由基的清除活性得五肽，其中，RP-HPLC条件为：进样量10～15μL；色谱柱Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：40%乙腈；洗脱速度0.8～1.0mL/min；紫外检测波长280nm，该过程利用反向高效液相色谱制备出超高纯度的抗氧化五肽。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所提供的鮸鱼鱼肉抗氧化肽对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；五肽能显著提高细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活力，并显著降低胞内一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）的含量，对双氧水诱导HUVEC细胞氧化损伤起到保护作用；五肽具有安全无毒、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品的添加剂。
附图说明
图1是本发明的DEAE-52阴离子交换树脂层析图；
图2是本发明的葡聚糖凝胶Sephadex G-15层析图；
图3是葡聚糖凝胶Sephadex G-15制备酶解物的RP-HPLC分析；
图4是五肽的质谱图；
图5是五肽对DPPH自由基的清除作用；
图6是五肽对羟基自由基的清除作用；
图7是五肽对HUVEC细胞的增殖活性的影响；
图8是五肽对氧化损伤HUVEC细胞的保护作用；
图9是不同浓度五肽对氧化损伤HUVEC细胞的保护作用；
图10是五肽对氧化损伤HUVEC细胞的保护作用的Hoechst 33342染色实验结果；
图11是五肽对氧化损伤HUVEC细胞内GSH-Px含量的影响；
图12是五肽对氧化损伤HUVEC细胞内SOD含量的影响；
图13是五肽对氧化损伤HUVEC细胞内MDA含量的影响；
图14是五肽对氧化损伤HUVEC细胞内NO含量的影响。
具体实施方式
以下结合实施例和附图作进一步详细描述：
实施例1：一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽的制备方法，包括以下步骤：
1)鮸鱼鱼肉预处理：鮸鱼去鱼皮和鱼骨，鱼肉匀浆至糊状后，按料液比1g:4mL加入乙酸乙酯溶液，搅拌脱脂20h，过滤，干燥，得脱脂鮸鱼鱼肉；
2)鮸鱼鱼肉的酶解：取脱脂鮸鱼鱼肉，按料液比1g:5mL加入蒸馏水，调节pH值至6.5，加入鱼肉重量1.0%木瓜蛋白酶，45℃酶解3h，在90℃持续10min灭酶活，样品降温至50℃，调节pH值至8.5，加入碱性蛋白酶1.0%，反应3，在90℃下持续10min灭酶活，冷却至常温，12000rmp离心20min，收集上清液，得鮸鱼鱼肉酶解液，该条件下，酶活力高，酶解反应速度快，且使鮸鱼鱼肉得到了充分利用；
3)鮸鱼鱼肉抗氧化寡肽的制备：将鮸鱼鱼肉酶解液经截留分子量为1kDa、3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于1kDa组分，得到超滤酶解液，将超滤酶解液按照体积比加入到装有8倍D101大孔树脂的层析柱中，用3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液在50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鮸鱼鱼肉抗氧化寡肽。
离子交换树脂层析的具体过程为：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45mg/mL的溶液，加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1 mol/L的NaCl溶液洗脱，收集最高自由基清除活性组分，即为离子交换层析酶解物，结果如图1所示。
凝胶柱层析的具体过程为：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为15mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物，结果如图2所示。
反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化的具体过程为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对羟基自由基的清除活性得五肽，其中，RP-HPLC条件为：进样量10μL；色谱柱Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：40%乙腈；洗脱速度0.8mL/min；紫外检测波长280nm，该过程利用反向高效液相色谱制备出超高纯度的抗氧化五肽，酶解物的RP-HPLC图如图3所示，五肽的质谱图如图4所示。
五肽的抗氧化活性实验，图5是五肽对DPPH自由基的清除作用；图6是五肽对羟基自由基的清除作用；利用双氧水（H2O2）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）氧化损伤模型，研究鮸鱼鱼鳔与鱼肉多肽对氧化损伤细胞的保护作用，图7是五肽对HUVEC细胞的增殖活性的影响；图8是五肽对氧化损伤HUVEC细胞的保护作用；图9是不同浓度五肽对氧化损伤HUVEC细胞的保护作用；图10是五肽对氧化损伤HUVEC细胞的保护作用的Hoechst 33342染色实验结果；图11是五肽对氧化损伤HUVEC细胞内GSH-Px含量的影响；图12是五肽对氧化损伤HUVEC细胞内SOD含量的影响；图13是五肽对氧化损伤HUVEC细胞内MDA含量的影响；图14是五肽对氧化损伤HUVEC细胞内NO含量的影响。可知，在100μM浓度处理24h，五肽较模型组表现出对HUVEC细胞更强的保护能力；五肽能显著提高细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活力，并显著降低胞内一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）的含量。因此，五肽对双氧水诱导HUVEC细胞氧化损伤起到保护作用。
实施例2：一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽的制备方法，包括以下步骤：
1)鮸鱼鱼肉预处理：鮸鱼去鱼皮和鱼骨，鱼肉匀浆至糊状后，按料液比1g:6mL加入乙酸乙酯溶液，搅拌脱脂24h，过滤，干燥，得脱脂鮸鱼鱼肉；
2)鮸鱼鱼肉的酶解：取脱脂鮸鱼鱼肉，按料液比1g:7mL加入蒸馏水，调节pH值至7.5，加入鱼肉重量1.5%木瓜蛋白酶，55℃酶解5h，在100℃持续10min灭酶活，样品降温至50℃，调节pH值至10.0，加入碱性蛋白酶2.0%，反应5h，在100℃下持续10min灭酶活，冷却至常温，12000rmp离心20min，收集上清液，得鮸鱼鱼肉酶解液，该条件下，酶活力高，酶解反应速度快，且使鮸鱼鱼肉得到了充分利用；
3)鮸鱼鱼肉抗氧化寡肽的制备：将鮸鱼鱼肉酶解液经截留分子量为1kDa、3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于1kDa组分，得到超滤酶解液，将超滤酶解液按照体积比加入到装有10倍D101大孔树脂的层析柱中，用5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用8倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液在50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鮸鱼鱼肉抗氧化寡肽。
离子交换树脂层析的具体过程为：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为50mg/mL的溶液，加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1 mol/L的NaCl溶液洗脱，收集最高自由基清除活性组分，即为离子交换层析酶解物。
凝胶柱层析的具体过程为：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物。
反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化的具体过程为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对羟基自由基的清除活性得五肽，其中，RP-HPLC条件为：进样量15μL；色谱柱Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：40%乙腈；洗脱速度1.0mL/min；紫外检测波长280nm，该过程利用反向高效液相色谱制备出超高纯度的抗氧化五肽。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 鮸鱼(Miichthys miiuy)
<400> 1
Phe Met Pro Leu His
1 5
Claims (8)
1.一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽，其特征在于：所述五肽的氨基酸序列为：FMPLH，ESI-MS测定分子量为643.81Da。
2.根据权利要求1所述的一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽，其特征在于：所述五肽的制备方法包括以下步骤：
1)鮸鱼鱼肉预处理：去皮骨，匀浆，按料液比1g:4～6mL加入乙酸乙酯溶液，搅拌脱脂20～24h，经过滤干燥得脱脂鮸鱼鱼肉；
2)鮸鱼～鱼肉的酶解：取脱脂鮸鱼鱼肉，按料液比1g:5～7mL加入蒸馏水，调节pH值至6.5～7.5，加入鱼肉重量1.0%～1.5%木瓜蛋白酶，45～55℃酶解3～5h，在90～100℃持续10min灭酶活，样品降温至50℃，调节pH值至8.5～10.0，加入碱性蛋白酶，反应3～5h，在90～100℃下持续10min灭酶活，冷却至常温，12000rmp离心20min，收集上清液，得鮸鱼鱼肉酶解液；
3)鮸鱼鱼肉抗氧化寡肽的制备：将鮸鱼鱼肉酶解液经截留分子量为1kDa、3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于1kDa组分，得到超滤酶解液，将超滤酶解液按照体积比加入到装有8～10倍D101大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鮸鱼鱼肉抗氧化寡肽。
3.根据权利要求2所述的一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽，其特征在于：所述步骤3)中离子交换树脂层析的具体过程为：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45～50mg/mL的溶液，加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1mol/L、0.5mol/L和1mol/L的NaCl溶液洗脱，收集最高自由基清除活性组分，即为离子交换层析酶解物。
4. 根据权利要求2所述的一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽，其特征在于：所述步骤3)中凝胶柱层析的具体过程为：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为15～20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物。
5.根据权利要求2所述的一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽，其特征在于：所述步骤3)中反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化的具体过程为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80～100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对羟基自由基的清除活性得五肽。
6.根据权利要求2所述的一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽，其特征在于：所述步骤1)中碱性蛋白酶的加入量为鱼肉重量的1.0%～2.0%。
7. 根据权利要求5所述的一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽，其特征在于：所述RP-HPLC条件为：进样量10～15μL；色谱柱Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：40%乙腈；洗脱速度0.8～1.0mL/min；紫外检测波长280nm。
8.一种源于鮸鱼鱼肉的抗氧化五肽的应用，其特征在于将五肽用于制备抗氧化保健品中的用途。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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| CN114057837B (zh) * | 2021-12-07 | 2024-01-26 | 浙江海洋大学 | 一组从厚壳贻贝肉中分离的具有肝保护功能的抗氧化肽及其制备方法和应用 |
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