WO2014173059A1 - 一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

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WO2014173059A1
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polysaccharide protein
preparation
polysaccharide
volume
sophora
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徐无为
陆正鑫
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启东盖天力药业有限公司
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a polysaccharide protein of cockroach and a preparation method and use thereof. Background technique
  • the industrial production of mycelium was realized, and the extracts of the ear fungus (the fermented material of the ear fungus) were used as raw materials to develop medicines such as the ear granules and the glutinous granules, which satisfied the clinical drug demand.
  • the present invention provides a polysaccharide protein of the ear and a preparation method and use thereof.
  • the present invention provides a polysaccharide protein (also referred to as “the ear polysaccharide protein of the present invention”), wherein the monosaccharide composition of the polysaccharide protein is arabinose, galactose, glucose, xylose and nectar Sugar, the mass ratio is 8.9: 1.6: 3.4: 7.4: 1.3.
  • the weight average molecular weight proteoglycans 7.0xl0 5 -2.0xl0 6 Da, preferably 1.41xl0 6 Da.
  • the method for preparing the polysaccharide protein comprises the following steps:
  • step (2) adding the saccharide moiety obtained in the step (1) to anhydrous ethanol to form a sugar solution having an alcohol concentration of 75% to 80% by volume, preferably 80% by volume, and centrifuging to obtain a precipitate.
  • step (3) dissolving the precipitate obtained in the step (2) with water, filtering, concentrating, and dialysis to collect the inner portion of the bag;
  • the extract of the ear fungus includes an aqueous extract of the ear fungus, especially hot water.
  • the aqueous extract of the ear fungus can be used as it is or after concentration.
  • the concentrated aqueous extract of the ear fungus (i.e., the ear cream) or the water extract of the unconcentrated ear fungus can be prepared or purchased by a conventional method.
  • the method for preparing the polysaccharide protein further comprises the step of dialysis and desalting of the product eluted with the aqueous solution of NaCl.
  • the method for preparing the polysaccharide protein further comprises the step of separating and purifying the product after dialysis and desalting using a Sepharose CL-6B agarose gel column.
  • the present invention provides a method for preparing the above polysaccharide protein, which comprises the following steps:
  • step (2) adding the saccharide moiety obtained in the step (1) to anhydrous ethanol to form a sugar solution having an alcohol concentration of 75% to 80% by volume, preferably 80% by volume, and centrifuging to obtain a precipitate.
  • step (3) dissolving the precipitate obtained in the step (2) with water, filtering, concentrating, and dialysis to collect the inner portion of the bag;
  • the eluent used is an aqueous solution of 0.85 Mol/L to 1.5 Mol/L of NaCl, preferably 1.0 Mol/L of NaCl.
  • Aqueous solution that is.
  • the preparation method further comprises: permeating the product eluted by the aqueous solution of NaCl The step of removing salt.
  • the preparation method further comprises the step of separating and purifying the dialysis and desalted product using a Sepharose CL-6B agarose gel column.
  • the preparation method comprises the following steps:
  • step (3) The inner part of the bag collected in step (3) was separated by DEAE-52 ion exchange column chromatography, eluted with l.OM NaCl aqueous solution, and the eluted part was concentrated and dialyzed to remove salt.
  • the dialysis process was Dialysis dialysis for three days, dialysis for two days; and
  • step (4) The product obtained in the step (4) was separated and purified using a Sepharose CL-6B agarose gel column until it was detected as a pure product by high performance liquid chromatography.
  • the present invention provides the use of the above polysaccharide protein for the preparation of a medicament for treating a tumor.
  • the polysaccharide protein of the present invention has remarkable antitumor activity and is expected to be an active ingredient of a novel antitumor drug.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an agaric acid protein and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the composition comprises 0.01% to 99.5% by weight of a polysaccharide protein as an active ingredient, and
  • the auricular polysaccharide protein contains 90% by weight to 100% by weight of the polysaccharide protein of the first aspect of the present invention, based on the total weight of the polysaccharide protein of the ear.
  • the pharmaceutical composition preferably contains 0.1% to 99.9% by weight of the polysaccharide protein as an active ingredient, preferably 0.1% to 99.5% by weight of the polysaccharide protein as an active ingredient, more preferably a weight ratio. It is 0.5%-95% active ingredient.
  • the pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the polysaccharide protein of the present invention, has significant antitumor efficacy.
  • the mixture of the polysaccharide protein of the ear and the pharmaceutically acceptable carrier, diluent and the like can be orally administered in the form of a tablet, a capsule, a granule, a powder or a syrup or in the form of an injection. Oral administration.
  • the above formulations can be prepared by conventional pharmaceutical methods.
  • useful pharmaceutically acceptable carriers include excipients (e.g., saccharide derivatives such as lactose, sucrose, glucose, mannitol, and sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, dextrin, and carboxymethyl Starch; cellulose derivatives such as crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose; gum arabic; dextran; silicate derivatives Such as magnesium aluminum metasilicate; phosphate derivatives such as calcium phosphate; carbonate derivatives such as calcium carbonate; sulfate derivatives such as calcium sulfate, etc., binders (such as gelatin, polyvinylpyrrolidone and polyethylene glycol) , disintegrating agents (such as cellulose derivatives such as sodium carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone), lubricants (such as talc, calcium stearate, magnesium stearate, cetyl
  • a safe and effective amount of the polysaccharide protein of the invention is administered to a mammal, wherein the safe and effective amount is usually at least about 1 microgram per day, and in most cases no more than about 10 milligrams per kilogram of body weight. .
  • the dosage is from about 1 microgram per day to about 3 milligrams per kilogram of body weight.
  • specific doses should also take into account factors such as the route of administration, the health of the patient, etc., which are within the skill of the skilled physician.
  • polysaccharide protein of the present invention can be used as a single drug or in combination with other drugs.
  • Preferred combinations include: in combination with surgery, in combination with one or more western medicines, in combination with Chinese herbal medicines, in combination with radiation therapy.
  • the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and includes, but is not limited to, oral administration, injection administration, intratumoral administration, implantation administration, intraluminal administration, anal administration, transdermal administration.
  • Administration, internal and external application; preferred injection administration includes: intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intraluminal injection, intratumoral administration.
  • the present invention has at least the following beneficial effects:
  • the present invention uses a system of water extraction, alcohol precipitation, deproteinization, dialysis small molecule, ion exchange chromatography and gel molecular size exclusion chromatography to obtain a uniform polysaccharide protein component from the fungus of the fungus, and Comprehensive application of molecular weight analysis, monosaccharide composition and amino acid composition analysis, infrared spectrum analysis and methylation analysis, etc., confirmed the chemical structure characteristics, and defined its weight average molecular weight, monosaccharide composition and ratio, amino acid composition and The ratio, and the way in which the sugar residues are attached.
  • Such a polysaccharide component with clear structure and uniform molecular weight is an ideal molecular model for studying the active constituents and biological activities of polysaccharides from Auricularia auricula, in order to elucidate the immunomodulatory and antitumor active components of Auricularia auricula polysaccharides and their effects.
  • the mechanism lays a foundation, and the present invention will provide a scientific basis for the further development and utilization of the fungus and the quality control of related preparations.
  • Figure 1 is a flow chart of the alcohol precipitation of the ear extract of the ear fungus
  • Fig. 2 is a flow chart of TCP-80 column chromatography purification of 80% ethanol precipitation site of the ear fungus extract of the ear fungus;
  • Figure 3 is a standard curve for determining the molecular weight (Mw) of polysaccharide protein TP-4;
  • Figure 4 is an ion chromatogram of the reference solution in the analysis of the monosaccharide component of the polysaccharide protein TP-4;
  • Figure 5 is an ultra-high performance liquid chromatography-gel chromatography (UPLC-GPC) spectrum of the polysaccharide protein TP-4;
  • UPLC-GPC ultra-high performance liquid chromatography-gel chromatography
  • Figure 6 is an ion chromatogram of the composition analysis of the sugar polysaccharide protein TP-4 monosaccharide
  • Fig. 7 shows the proliferation of mouse spleen cells by 3 H-TdR incorporation method, wherein: TCP: crude polysaccharide; TP-1: polysaccharide protein-1; TP-2: polysaccharide protein-2; TP-3: Polysaccharide protein-3; TP-4: polysaccharide protein-4; To-1: low molecular weight component-1; ⁇ -2: low molecular weight component-2; ⁇ -3: ⁇ ears Low molecular weight component-3; ⁇ -4: ⁇ ear low molecular weight component-4; TFP: ⁇ ear coarse total protein fraction;
  • Figure 8 shows the proliferation of T and sputum lymphocytes in mice by 3 H-TdR incorporation, wherein Figure ⁇ is CD19+ cells; Figure B is CD3+ cells; Figure C is mouse T lymphocytes; Figure D is mouse B lymphocytes Cell; Dex: dextran; TCP: crude polysaccharide; TP-1: polysaccharide protein-1; TP-2: polysaccharide protein-2; TP-3: polysaccharide protein-3; TP-4: Polysaccharide protein-4; LPS: lipopolysaccharide;
  • Fig. 9 shows changes in the proportion of T and sputum lymphocytes in mice and humans after stimulation with polysaccharides from the ear, wherein Fig. B is mouse lymphocytes; Fig. B is mouse B lymphocytes; Fig. C is human T lymphocytes; For human B lymphocytes; Dex: Dextran; TCP: crude polysaccharide; TP-1: Polysaccharide protein-1; TP-2: Polysaccharide protein-2; TP-3: Polysaccharide protein -3; TP-4: polysaccharide protein-4; LPS: lipopolysaccharide;
  • Figure 10 shows the expression of CD69 on the surface of T and sputum lymphocytes after stimulation with polysaccharides from Auricularia auricula.
  • Fig. B shows the expression of CD69 on the surface of T lymphocytes stimulated by polysaccharides from Auricularia auricula
  • Figure B shows the expression of CD69 on the surface of B lymphocytes after stimulation with Auricularia auricula.
  • Dex Dextran
  • TCP crude polysaccharide
  • TP-1 Polysaccharide protein-1
  • TP-2 Polysaccharide protein-2
  • TP-3 Polysaccharide protein-3
  • TP- 4 polysaccharide protein-4
  • LPS lipopolysaccharide
  • Figure 11 shows changes in NO release in mouse peritoneal macrophages after stimulation with polysaccharides from Lycium barbarum L., Dex: Dextran; TCP: crude polysaccharide; TP-1: Polysaccharide protein-1; TP-2: Polysaccharide protein-2; TP-3: polysaccharide protein-3; TP-4: polysaccharide protein-4; To-1: low molecular weight component-1; To-2: low molecular weight component -2; ⁇ -3: ⁇ ear low molecular weight component-3; ⁇ -4: ⁇ ear low molecular weight component-4; TFP: ⁇ ear coarse total protein fraction; LPS: lipopolysaccharide; Figure 12 ⁇ ear polysaccharide protein Inhibition of tumor angiogenesis by endothelial cell proliferation, wherein TP-4: auricular polysaccharide protein-4. detailed description
  • Example 1 Method for separating and purifying polysaccharide protein (TP-4)
  • the dialysis process was dialysis dialysis for three days, and the distilled water was dialyzed for two days. Then, each section was separated and purified by Sepharose CL-6B agarose gel column until it was pure by high performance liquid chromatography. After the above column chromatography, it was separated from TCP-40 ion exchange column by 0.1 Mol/L. Purification of the eluted fraction of NaCl obtained UPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) as a homogeneous component of the polysaccharide protein TP-1 (397 mg) and a homogeneous polysaccharide protein TP-2 (1212 mg) from the 0.5 Mol/L NaCl elution site. ), the separation flow chart is shown in Figure 2.
  • UPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography
  • the dialysis process was dialysis dialysis for three days, and the dialysis water was dialyzed for two days. Then, each section was separated and purified by Sepharose CL-6B agarose gel column until it was pure by high performance liquid chromatography. After the above column chromatography, it was separated from TCP-60 ion exchange column by 1.0 Mol/L. Purification of the eluted fraction of NaCl resulted in a UPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) verification of the homogeneous component of the polysaccharide protein TP-3 (1. 21 g).
  • UPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography
  • the dialysis process was dialysis dialysis for three days, and the distilled water was dialyzed for two days. Then, each section was separated and purified by Sepharose CL-6B agarose gel column until it was pure by high performance liquid chromatography. After the above column chromatography, it was separated from TCP-80 ion exchange column by 1.0 Mol/L NaCl. The eluted site was purified by UPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) to verify the homogenous component of the polysaccharide protein TP-4 (10.0g), and the 80% (volume) ethanol precipitate supernatant of the ear cream was collected. Molecular weight component -4 (TO-4) ( Figure 2).
  • TO-4 Molecular weight component -4
  • UPLC-GPC-ELSD instrument configuration and chromatographic conditions US Waters UPLC, TSK-3000 GPC column, autosampler, Millipore ultrapure water ion exchanger Preparation of high purity water (0.45 ⁇ cellulose acetate membrane filtration); flow rate 0.3 ml / min.
  • Sample solution preparation Weigh a certain amount of the polysaccharide protein TP-4 prepared in Example 1, add appropriate amount of deionized water, prepare it into a solution with a concentration of lmg/ml, Millipore 0.22 ⁇ water filter to filter, injection detection .
  • Instrument configuration and chromatographic conditions Dionex ICS 3000 ion color language, CarboPac PA20 analytical column, 150 x 3mm, S/N 002823, CarboPac PA20 guard column, 50*3mm, S/N 002652, eluent composition and flow rate l- 25 min, Im Mol/L KOH; 25.1-32 min, 30 m Mol/L KOH,; 32.1-35 min, Im Mol/L KOH; 0.45 mL/min, 10 L injection.
  • Preparation of reference solution Take appropriate amount of arabinose, galactose, glucose, xylose and mannose, dissolve into 10.0 mg/L of reference solution with deionized water, shake well, and obtain.
  • Standard curve preparation Accurately draw the appropriate amount of reference stock solution, and dilute it with deionized water to 0.5 mg/L, lmg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L standard solution, 0.45 After filtration through ⁇ microporous membrane, the chromatographic conditions were determined by ion chromatography.
  • the peak area integral value is plotted on the ordinate (Y) and each standard concentration is plotted on the abscissa (X).
  • the standard curve of each reference is plotted and the regression equation is calculated. The results are shown in Table 1 and Figure 4.
  • test solution The polysaccharide peptone-4 completely acid hydrolyzate prepared in Example 1 was placed in 50 ml of deionized water, sonicated for 10 minutes to dissolve, and the solution was taken in an appropriate amount.
  • Partially methylated Aldiol acetyl ester preparation The sample which has been completely methylated is dissolved in 3 mL of 90% by volume of formic acid solution, sealed, depolymerized at 100 °C for 6 h, and added to the reaction flask 2 ⁇ 3 mL of methanol, concentrated and evaporated to dryness under reduced pressure at 40 ° C. The above operation was repeated three times to remove excess formic acid, and then 4 mL of 2 Mol/L TFA solution was added to the depolymerized sample, and after sealing, it was hydrolyzed at 110 ° C for 2 h.
  • Temperament conditions are: starting temperature 50 ° C, temperature program 40 ° C / min, to 215 ° C, hold 40 min, detector temperature 250 ° C, DB-5 capillary GC-MS column detection.
  • TP-4 is a dark brown powdery substance, soluble in water, DMSO, insoluble in high concentrations of organic solvents such as methanol and ethanol.
  • the UPLC-GPC-ESLD pattern of the polysaccharide protein presents a A symmetrical narrow chromatographic peak, suggesting that it is a pure polysaccharide protein material.
  • the molecular weight of the polysaccharide protein is 1.41 x l0 6 Da (see Figure 3)
  • the Lowry reaction is positive
  • the UV scan is at 280 nm. There is a weak absorption indicating that the substance contains protein.
  • TP-4 8.9 1.6 3.4 7.4 1.3 It can be seen from the analysis of monosaccharide composition that the polysaccharide protein TP-4 contains five kinds of monosaccharides, among which the highest content of arabinose and xylose, followed by glucose, galactose and mannose. Less in content.
  • TP-4 was methylated by Needs method, and after three methylation, it was depolymerized with 90% formic acid to 2 Mol/LTFA complete acid. Hydrolysis, reduction of NaBH 4 and acetylation of acetic anhydride to prepare an alcohol derivative of alditol, and GC-MS analysis was carried out, and the results are shown in Table 3.
  • Methylation analysis showed that the structure of polysaccharide 4 was very complicated. Containing 8 different linked sugar residues, wherein the arabinose is linked to the other sugar residue by a hydroxyl group at the 1, 1, 2 and 1, 5 hydroxyl groups, and the xylose is at the 1-, 1, 3-hydroxyl group. It forms a glycosidic bond with other sugar residues, and glucose is linked to other sugar residues by a 1,4-position hydroxyl group, and galactose is 1,6. The hydroxyl group is linked to other sugar residues to form a glycosidic bond, and the mannose is linked to the other sugar residue by a hydroxyl group at the 1, 3, 6 hydroxyl group.
  • TP-4 chain In order to further confirm the structure of the TP-4 chain, it was partially subjected to acid hydrolysis (0.3 Mol/LTFA, 8 hours), and the hydrolyzate was dialyzed. After lyophilization, a degradation product of TP-4 was obtained, which was named TP- 4-in, TP-4-like, monosaccharide composition analysis and methylation analysis of TP-4-in, the results are shown in Table 4.
  • a significant decrease in the arabinose and xylose signals of TP-4-in compared to TP-4 suggests that the two sugars may be distributed in the side chain of TP-4, while the 1,4 linked glucose residues are opposite to other sugar residues.
  • the ratio increases, suggesting that the 1,4 linked glucose residues are the sugar residues that make up the TP-4 backbone, the 1,3,6 linked mannose residues almost disappear, and the appearance of 1,6 linked mannose residues also suggests 1.
  • the 6-linked mannose residue is a sugar residue constituting the TP-4 main chain, and the main chain of TP-4 forms a branch at the 0-3 position of the 1,3,6-linked mannose residue. Note: A large number of non-reducing terminal sugar residues are associated with the detachment of sugar residues in the methylation analysis reaction scheme.
  • the polysaccharide protein TP-4 is a very complex chemical protein, mainly composed of arabinose, xylose and galactose. , glucose, mannose composition, wherein arabinose is mainly present in the form of 1, 1, 2, 1, 5 - linkage, xylose is mainly present in the form of 1, 1,3-linked, galactose is 1,6-
  • glucose exists in a 1,4 - linkage
  • mannose exists in a 1,3,6-linked manner.
  • the components of the ear cream (the crude polysaccharide TCP; the ear polysaccharide TP-1 ⁇ -2 ⁇ -3 TP-4; the low molecular weight component ⁇ -1 ⁇ -2 ⁇ -3 ⁇ -4; Total free protein fraction (TFP) and negative control drug dextran (Dextran) were co-cultured with mouse spleen cells. After 42 h, 3 H-TdR was spiked. After 48 h, the proliferation index was detected by cell harvester Filtermate harvester. Results are shown in Figure 7.
  • the polysaccharide components extracted from the ear cream can stimulate mice. Splenocyte proliferation; low molecular weight components can not stimulate spleen cell proliferation except TO-3.
  • Auricular polysaccharide can stimulate mouse B cell proliferation, but not T cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • RESULTS Mouse peritoneal macrophages were cultured in vitro, adding crude polysaccharide TCP, polysaccharides TP-1, TP-2, TP-3, TP-4, low molecular weight components TO-l, TO-2, TO-3. , TO-4, the total free protein fraction of TGF was co-cultured with the control polysaccharides dextran (Dextran) and lipopolysaccharide (LPS). After 48 hours, the cell culture supernatant was detected by Griess Reagent kit. The content of NO is shown in Figure 11.
  • Reagents M199 medium, double antibody, fetal bovine serum (FBS), basic fibroblast growth factor (bFGF), gelatin (gelatin).
  • FBS fetal bovine serum
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • gelatin gelatin
  • TP-4 Ear polysaccharide protein-4, obtained by Example 1.
  • Polysaccharide protein-4 (TP-4) has a significant inhibitory effect on the proliferation of tumor vascular endothelial cells. The results are shown in Figure 12. Each drug-administered group was compared with the control group, and analyzed by analysis of variance and post hoc T test. *** P ⁇ 0.001, indicating a significant difference between the two groups.

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Abstract

本发明涉及一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途，本发明的槐耳多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其质量比为8.9:1.6:3.4:7.4:1.3，该多糖蛋白的重均分子量为7.0×105-2.0×106Da，优选为1.41x106Da。本发明的多糖蛋白可以用于制备治疗肿瘤的药物。

Description

一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途 技术领域
本发明涉及一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途。 背景技术
槐耳为多孔菌科真菌槐栓菌 Trametes robiniophila Murr. ) 的子实体， 是一种重要的民间药用真菌， 在中国具有 1600余年的用药历史。 Ainsworth 真菌分类系统将其归属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、 多孔菌科、栓菌属。 槐耳子实体中等至较大， 木栓质， 无菌柄， 生于槐、刺槐等阔叶树的树干上， 分布于河北、 陕西、 辽宁、 湖南、 广西、 福建等地， 是一种可以导致树木心 材腐朽的木腐菌。本品味苦、辛，性平无毒， 有 "治风"、 "破血"、 "益力，， 的 功效， 临床上用于治疗多种疾病。 由于老龄中国槐日益稀少， 槐耳药材资源 濒于枯竭， 难以满足临床用药需求， 更无法满足工业化生产需求。 为了解决 槐耳的资源问题， 启东盖天力药业有限公司经过长期的研究和实践， 攻克了 槐耳菌丝体大规模发酵难题，实现了菌丝体的工业化生产，并以槐耳菌质（槐 耳菌丝体发酵物 )提取物为原料开发了槐耳颗粒和槐杞黄颗粒等药品， 满足 了临床用药需求。
近年来大量的化学成分及药理活性研究资料证实槐耳菌质提取物的有 效成分为槐耳多糖蛋白， 其主要功效是治疗或辅助治疗肿瘤性疾病。 然而， 目前对于槐耳多糖蛋白的组成、 结构及其制备方法研究很少， 在化学成分研 究方面仅有粗多糖的单糖组成及比例分析的文献报道，缺乏对其均一多糖的 分离纯化和结构研究， 如均一多糖蛋白所含的糖残基种类、 比例、 在主链中 的排列次序等信息， 而这些信息对于阐明槐耳菌质真正的药效成分、 槐耳多 糖蛋白的作用机制及构效关系等至关重要。 同样在槐耳多糖蛋白的生物活性 研究方面， 多以粗多糖作为研究对象， 缺乏应用均一多糖组分获得的体内、 体外药理学研究数据，从而无法深入了解槐耳多糖蛋白与人体免疫细胞或肿 瘤细胞表面相关多糖受体的作用过程， 因而无法深入的阐明其作用原理。 发明内容
为了克服现有技术的缺陷， 本发明提供一种槐耳多糖蛋白及其制备方 法和用途。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的。
第一方面， 本发明提供一种槐耳多糖蛋白（又称为 "本发明槐耳多糖蛋 白" ）， 该多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 木糖及甘露 糖， 其质量比为 8.9: 1.6: 3.4: 7.4: 1.3。
优选地， 所述多糖蛋白的重均分子量为 7.0xl05-2.0xl06 Da, 优选为 1.41xl06Da。
优选地， 该多糖蛋白的制备方法包括如下步骤：
( 1 )将浓度为 2%-20% (质量 /体积 ), 优选为 8% (质量 /体积 ) 的槐 耳菌质提取物 （例如槐耳清膏） 水溶液采用 Sevage 法去除游离蛋白， 收 集糖类部分；
(2 )将步骤（ 1 )得到的糖类部分加入无水乙醇中， 使其形成醇浓度 为 75%-80% (体积）， 优选为 80% (体积）的糖溶液， 离心， 得到沉淀物； ( 3 )将步骤（2 )得到的沉淀物加水溶解， 过滤， 浓缩、 透析收集袋 内部分； 以及
(4)使用离子交换柱色谱对步骤（3 ) 收集到的袋内部分进行分离， 其中使用的洗脱液为 0.85Mol/L-1.5Mol/L的 NaCl水溶液，优选为 1.0 Mol/L 的 NaCl水溶液。
在本发明中， 槐耳菌质提取物包括槐耳菌质的水提取物， 尤其是热水
( 60-100 °C )提取物。所述槐耳菌质的水提取物可直接使用或浓缩后使用。 浓缩的槐耳菌质的水提取物（即槐耳清膏）或未浓缩的槐耳菌质的水提取 物可用常规方法制备或购买得到。
优选地， 所述多糖蛋白的制备方法还包括对 NaCl水溶液洗脱得到的 产品进行透析除盐的步骤。
优选地， 所述多糖蛋白的制备方法还包括采用 Sepharose CL-6B琼脂 糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。
第二方面， 本发明提供一种上述多糖蛋白的制备方法， 该制备方法包 括如下步骤：
( 1 )将浓度为 2%-20% (质量 /体积 ), 优选为 8% (质量 /体积 ) 的槐 耳菌质提取物 （例如槐耳清膏） 水溶液采用 Sevage 法去除游离蛋白， 收 集糖类部分；
(2 )将步骤（ 1 )得到的糖类部分加入无水乙醇中， 使其形成醇浓度 为 75%-80% (体积）， 优选为 80% (体积）的糖溶液， 离心， 得到沉淀物； ( 3 )将步骤（2 )得到的沉淀物加水溶解， 过滤， 浓缩、 透析收集袋 内部分； 以及
(4)使用离子交换柱色谱对步骤（3 ) 收集到的袋内部分进行分离， 其中使用的洗脱液为 0.85Mol/L-1.5Mol/L的 NaCl水溶液，优选为 1.0 Mol/L 的 NaCl水溶液， 即得。
优选地， 所述制备方法还包括对 NaCl水溶液洗脱得到的产品进行透 析除盐的步骤。
优选地， 所述制备方法还包括采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对 透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。
在一个具体实施方案中， 所述制备方法包括如下步骤：
( 1 ) 准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏 300g, 加入适量蒸镏水将其 稀释为浓度约为 8% (质量 /体积） 的稀溶液， 之后采用 Sevage 法去除游 离蛋白， 重复操作 5次， 收集糖类部分；
( 2 ) 向步骤（ 1 )得到的槐耳菌质糖类部分中緩緩加入无水乙醇使其 成为醇浓度为 80% (体积 ) 的糖溶液， 4°C静置 24小时后， 以 3000转 /分 钟的速度离心 10分钟， 沉淀， 得到沉淀物；
( 3 )称取适量步骤（ 2 )得到的沉淀物， 将其溶解于 150ml蒸镏水中， 过滤， 减压浓缩至体积 50ml; 透析收集袋内部分， 以及
( 4 )使用 DEAE-52 离子交换柱色谱对步骤（3 ) 收集到的袋内部分 进行分离，采用 l .OM NaCl水溶液进行洗脱，洗脱部分在浓缩后进行透析除 盐， 透析过程为对流水透析三天， 蒸镏水透析两天； 以及
( 5 ) 采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对步骤（4 )得到的产品进 行分离纯化， 直至高效液相色谱法检测为纯品为止。
第三方面， 本发明提供上述多糖蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的用 途。 本发明槐耳多糖蛋白， 具有显著抗肿瘤活性， 有望成为一种新型抗肿 瘤药物的活性成分。
第四方面， 本发明提供包含槐耳多糖蛋白和药学上可接受的载体的药 物组合物， 其中， 所述组合物中含有重量比为 0.01%-99.95%的槐耳多糖蛋 白作为活性成分， 并且以槐耳多糖蛋白的总重量计， 所述槐耳多糖蛋白中 含有 90wt% - 100wt%的本发明第一方面所述的槐耳多糖蛋白。
该药物组合物优选含有重量比为 0.1%-99.9%的槐耳多糖蛋白作为活 性成分，较佳地，含有重量比为 0.1%-99.5%的槐耳多糖蛋白作为活性成分， 更优选含有重量比为 0.5%-95%的活性成分。
该药物组合物， 含有治疗有效量的本发明槐耳多糖蛋白， 具有显著的 抗肿瘤功效。 可将槐耳多糖蛋白与可药用赋形剂、 稀释剂等药学上可接受 的载体的混合物以片剂、 胶嚢、 颗粒剂、 散剂或糖浆剂的形式口服给药或 以注射剂的形式非口服给药。 上述制剂可通过常规制药方法制备。 可用的 药学上可接受的载体的例子包括赋形剂（例如糖类衍生物如乳糖、蔗糖、 葡 萄糖、 甘露糖醇和山梨糖醇； 淀粉衍生物如玉米淀粉、 土豆淀粉、 糊精和 羧甲基淀粉； 纤维素衍生物如结晶纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、 羧甲基纤维素钙、 羧甲基纤维素钠； 阿拉伯胶； 右旋糖酐； 硅酸盐衍生物 如偏硅酸镁铝； 磷酸盐衍生物如磷酸钙； 碳酸盐衍生物如碳酸钙； 硫酸盐 衍生物如硫酸钙等）、 粘合剂（例如明胶、 聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇）、 崩 解剂（例如纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、 聚乙烯吡咯烷酮）、 润滑剂（例 如滑石、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 鲸蜡、 硼酸、 苯甲酸钠、 亮氨酸)、 稳定剂 (对羟基苯甲酸甲酯、 对羟基苯甲酸丙酯等）、 矫味剂（例如常用的甜味剂、 酸味剂和香料等）、 稀释剂和注射液用溶剂（例如水、 乙醇和甘油等）。
使用药物组合物时， 是将安全有效量的本发明槐耳多糖蛋白施用于哺 乳动物， 其中该安全有效量通常至少约 1微克 /天， 而且在大多数情况下不 超过约 10毫克 /千克体重。 较佳地， 该剂量是约 1微克 /天-约 3毫克 /千克 体重。 当然， 具体剂量还应考虑给药途径、 病人健康状况等因素， 这些都 是在熟练医师技能范围之内的。
此外， 本发明槐耳多糖蛋白可以单药使用， 也可以与其它药物联合使 用。 优选的联合使用包括： 与外科手术联合使用， 与一种或多种西药联合 使用， 与中草药联合使用， 与放射性治疗联合使用。
本发明的药物组合物的给药途径没有特别限制， 其中包括但并不限 于： 口服给药， 注射给药， 瘤内给药， 植入给药， 腔内给药， 肛门给药， 透皮给药， 内外敷； 优选的注射给药包括： 静脉注射， 肌肉注射， 皮下注 射， 腔内注射、 瘤内给药。
与现有技术相比， 本发明至少具有以下有益效果：
本发明首次采用系统的水提取、 醇沉淀、 去蛋白、 透析小分子、 离子 交换色谱及凝胶分子量排阻色谱分离的手段从槐耳菌质中分离获得了一 个均一的多糖蛋白组分， 并综合应用分子量分析、 单糖组成及氨基酸组成 分析、 红外光谱分析及甲基化分析等手段， 对其进行了化学结构特点的确 认， 明确了其重均分子量、 单糖组成及比例、 氨基酸组成及比例， 以及 所含糖残基的连接方式。 这样一个结构特点明晰、 分子量均一的槐耳菌质 多糖组分， 是研究槐耳多糖有效成分及其生物活性的理想分子模型， 为阐 明槐耳多糖的免疫调节及抗肿瘤的有效成分及其作用机制奠定了基础， 本 发明将为槐耳菌质进一步开发利用和相关制剂的质量控制提供科学依据。 附图说明
以下， 结合附图来详细说明本发明的实施方案， 其中：
图 1为槐耳菌质提取物槐耳清膏分级醇沉淀流程图；
图 2为槐耳菌质提取物槐耳清膏 80%乙醇沉淀部位 TCP-80柱色谱纯 化流程图；
图 3为槐耳多糖蛋白 TP-4分子量 （Mw ) 测定标准曲线； 图 4为槐耳多糖蛋白 TP-4单糖组分分析中对照品溶液的离子色谱图； 图 5为槐耳多糖蛋白 TP-4的超高效液相-凝胶色谱（UPLC-GPC) 图 谱；
图 6为槐耳多糖蛋白 TP-4单糖组成分析离子色谱图；
图 7为 3H-TdR掺入法检测小鼠脾细胞增殖， 其中， TCP: 粗多糖； TP-1: 槐耳多糖蛋白 -1; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3: 槐耳多糖蛋白 -3; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; To-1: 槐耳低分子量组分 -1; Το-2: 槐耳低分子 量组分 -2; Το-3: 槐耳低分子量组分 -3; Το-4: 槐耳低分子量组分 -4; TFP: 槐耳粗总游离蛋白部分；
图 8为 3H-TdR掺入法检测小鼠 T、 Β淋巴细胞增殖， 其中， 图 Α为 CD19+细胞； 图 B为 CD3+细胞； 图 C为小鼠 T淋巴细胞； 图 D为小鼠 B 淋巴细胞； Dex: 葡聚糖； TCP: 粗多糖； TP-1: 槐耳多糖蛋白 -1; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3: 槐耳多糖蛋白 -3; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; LPS: 脂多糖；
图 9为槐耳多糖刺激后小鼠及人 T、 Β淋巴细胞比例变化， 其中， 图 Α为小鼠 Τ淋巴细胞； 图 B为小鼠 B淋巴细胞； 图 C为人类 T淋巴细胞； 图 D为人类 B淋巴细胞； Dex: 葡聚糖（Dextran); TCP: 粗多糖； TP-1: 槐耳多糖蛋白 -1; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3: 槐耳多糖蛋白 -3; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; LPS: 脂多糖；
图 10为槐耳多糖刺激后 T、 Β淋巴细胞表面 CD69的表达， 图 Α为槐 耳多糖刺激后 T淋巴细胞表面 CD69的表达，图 B为槐耳多糖刺激后 B淋 巴细胞表面 CD69的表达， 其中 Dex: 葡聚糖（Dextran); TCP: 粗多糖； TP-1: 槐耳多糖蛋白 -1; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3: 槐耳多糖蛋白 -3; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; LPS: 脂多糖；
图 11 为槐耳多糖刺激后小鼠腹腔巨噬细胞 NO释放变化， 其中 Dex: 葡聚糖（Dextran); TCP: 粗多糖； TP-1: 槐耳多糖蛋白 -1; TP-2: 槐耳多 糖蛋白 -2; TP-3: 槐耳多糖蛋白 -3; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; To-1: 槐耳低 分子量组分 -1; To-2: 槐耳低分子量组分 -2; Το-3: 槐耳低分子量组分 -3; Το-4: 槐耳低分子量组分 -4; TFP: 槐耳粗总游离蛋白部分； LPS: 脂多糖； 图 12槐耳多糖蛋白对肿瘤血管形成内皮细胞增殖的抑制作用， 其中 TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4。 具体实施方式
下面通过实施例详细说明本发明， 应当理解， 下述实施例仅用于说明 本发明， 而不以任何方式限制本发明的范围。 实施例 1: 槐耳多糖蛋白 （TP-4 ) 的分离纯化方法
准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏 （由启东盖天力药业有限公司提 供） 300g, 加入适量蒸镏水将其稀释为浓度约为 8% (质量 /体积） 的稀溶 液， 之后采用 Sevage 法去游离蛋白， 重复操作 5次， 分别收集糖类部分 ( TCP )及槐耳粗总游离蛋白部分（TFP ), 槐耳粗总游离蛋白部分真空干 燥备用， 槐耳菌质糖类物质部分（TCP )在减压浓缩去除残存的氯仿及正 丁醇后， 进行分级醇沉淀。 首先向 TCP中緩緩加入无水乙醇使其成为醇体 积浓度为 40% (体积） 的糖溶液， 4°C静置 24小时后， 3000转 /分钟 离心 10分钟， 沉淀编号为 TCP-40, 减压干燥以备进一步分离纯化， 之后向上 清液中继续加入适量无水乙醇使其成为含醇 60% (体积） 的糖溶液， 4°C 静置 24小时后， 3000转 /分钟,离心 10分钟， 沉淀编号为 TCP-60, 减压干 燥以备进一步分离纯化， 在此之后继续向上清液中加入适量无水乙醇至乙 醇浓度达到 80% (体积 ) , 4°C静置 24小时后， 3000转 /分钟 离心 10分 钟， 沉淀编号为 TCP-80, 减压干燥以备进一步分离纯化， 具体分级醇沉 淀流程图见图 1。
称取适量的槐耳清膏 40 % (体积） 乙醇沉淀部位 TCP-40, 将其溶解 于 150ml蒸镏水中， 过滤， 减压浓缩至体积 50ml, 透析收集袋内部分及袋 外部分，袋外部分为槐耳低分子量组分 -1 ( ΤΟ-1 ),袋内部分通过 DEAE-52 离子交换柱色谱分离， 分别采用蒸镏水及 0.1M NaCl溶液、 0.5M NaCl洗 脱， 每个部位收集 3.0L, 水洗脱部分直接浓缩至干， 氯化钠洗脱部分均在 浓缩后进行透析除盐， 透析过程为对流水透析三天， 蒸镏水透析两天。 然 后各段分别采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化， 直至高效 液相色谱法检测为纯品为止，经过上述柱色谱分离过程，分别从 TCP-40 离 子交换柱色谱 0.1 Mol/L NaCl 洗脱部位纯化获得了 UPLC (超高效液相色 谱 )验证为均一组分的多糖蛋白 TP-1 ( 397mg ) 以及从 0.5 Mol/L NaCl洗 脱部位获得了均一多糖蛋白 TP-2 ( 1212 mg ) , 分离流程图见图 2。
称取适量的槐耳清膏 60 % (体积） 乙醇沉淀部位 TCP-60, 将其溶解 于 150ml蒸镏水中， 过滤， 经减压浓缩至体积 50ml, 透析收集袋内部分及 袋外部分， 袋外部分为槐耳低分子量组分 -2 ( TO-2 ), 袋内部分通过 DEAE -52 离子交换柱色谱分离， 分别采用蒸镏水及 1.0 Mol/LNaCl溶液洗脱， 每个部位收集 3.0L, 水洗脱部分直接浓缩至干， 氯化钠洗脱部分均在浓缩 后进行透析除盐， 透析过程为对流水透析三天， 蒸镏水透析两天。 然后各 段分别采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化， 直至高效液相 色谱法检测为纯品为止， 经过上述柱色谱分离过程， 分别从 TCP-60 离子 交换柱色谱 1.0 Mol/L NaCl 洗脱部位纯化获得了 UPLC(超高效液相色谱 ) 验证为均一组分的多糖蛋白 TP-3 ( 12.1g )。
称取适量的槐耳清膏 80 % (体积） 乙醇沉淀部位 TCP-80, 将其溶解 于 150ml蒸镏水中， 过滤， 减压浓缩至体积 50ml, 透析收集袋内部分及袋 外部分，袋外部分为槐耳低分子量组分 -3 ( TO-3 ),袋内部分通过 DEAE -52 离子交换柱色谱分离， 分别采用蒸镏水及 l .O Mol/L NaCl水洗脱， 每个部 位收集 3.0L, 水洗脱部分直接浓缩至干， 氯化钠洗脱部分均在浓缩后进行 透析除盐， 透析过程为对流水透析三天， 蒸镏水透析两天。 然后各段分别 采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化， 直至高效液相色谱法 检测为纯品为止， 经过上述柱色谱分离过程， 分别从 TCP-80 离子交换柱 色谱 1.0 Mol/LNaCl 洗脱部位纯化获得了 UPLC (超高效液相色谱）验证 为均一组分的多糖蛋白 TP-4 ( 10.0g ), 收集 槐耳清膏 80 % (体积） 乙醇 沉淀上清液部分得 槐耳低分子量组分 -4 ( TO-4 ) (图 2)。 实施例 2: 槐耳多糖蛋白 （TP-4 )化学结构的研究
本实施例研究了实施例 1制备的槐耳多糖蛋白 TP-4的化学结构。
一、 槐耳多糖蛋白 （TP-4 )化学结构研究方法
1、 纯度及分子量的测定
超高效液相-凝胶色谱 -蒸发光散射检测器（ UPLC-GPC-ELSD )仪器配 置及色谱条件： 美国 Waters UPLC , TSK-3000 GPC色谱柱， 自动进样器， Millipore超纯水离子交换器制备高纯水（ 0.45μιη醋酸纤维素膜过滤）； 流 速 0.3 ml/min。
标准曲线的制备： 分别称取适量的右旋糖苷标准品， 加入去离子水， 将其配置成浓度 0.5mg/ml 的对照品溶液， 之后逐一进行 UPLC检测， 结 果见图 3。
样品溶液制备： 分别称取一定量的实施例 1制备的多糖蛋白 TP-4, 加 入适量去离子水， 将其配制成浓度为 lmg/ml 的溶液， Millipore 0.22μιη水 系滤膜过滤， 进样检测。
2、 单糖组成分析
完全酸水解：精密称取实施例 1制备的多糖蛋白 TP-4 (10 mg) 放入厚 壁耐压瓶中，加入 4ml的 2 Mol/L三氟乙酸（TFA ),充氮气，封管后， 100 °C 水解 2小时， 减压蒸干。 样品的离子色谱分析
仪器配置及色谱条件： Dionex ICS 3000型离子色语， CarboPac PA20 分析柱， 150 x 3mm, S/N 002823 , CarboPac PA20保护柱， 50*3mm, S/N 002652 , 淋洗液组成及流速 l-25min, Im Mol/L KOH; 25.1-32 min, 30m Mol/L KOH,; 32.1-35 min, Im Mol/L KOH; 0.45mL/min, 进样 10 L。
对照品溶液的制备： 取阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 木糖、 甘露糖对 照品适量， 用去离子水溶解成各含 10.0 mg/L的对照品溶液， 摇匀， 即得。
标准曲线制备： 精密吸取对照品混合贮备液适量， 分别用去离子水将 其稀释成 0.5 mg/L 、 lmg/L、 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L 的标准溶液， 0.45 μιη微孔滤膜过滤后，依次进行离子色谱测定，离子色谱条件为： Dionex ICS 3000型离子色谱， CarboPac PA20分析柱， 150 x 3mm, S/N 002823 , CarboPac PA20保护柱， 50*3mm, S/N 002652 ,淋洗液组成及流速 l-25min, lm Mol/L KOH; 25.1-32 min, 30m Mol/L KOH, ; 32.1-35 min, lm Mol/L KOH; 0.45mL/min, 进样 10 L。 以峰面积积分值为纵坐标 （Y )、 以各标准品浓 度为横坐标（X ), 绘制各对照品标准曲线并计算回归方程， 结果见表 1和 图 4。
表 1 线性关系考察结果 对照品名称 相对保留时间 回归方程 相关系数 (R) 阿拉伯糖 0.67 Υ=1.848χ-0.100 99.9973 半乳糖 0.85 Υ=2.138χ-0.170 99.9765 葡萄糖 1.00 Υ=2.297χ-0.164 99.9630 木糖 1.20 Υ=2.629χ-0.176 99.9620 甘露糖 1.30 Υ=1.911χ-0.147 99.9826
供试品溶液制备： 将实施例 1制备的多糖蛋白 ΤΡ-4完全酸水解产物 容于 50ml去离子水， 超声 10分钟使溶解， 取溶液适量， 过孔径 0.22μιη 水系滤膜及 DIONEX RP II固相萃取小柱。
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 ΙΟμ , 注入离子色谱仪， 即得。
3、 甲基化分析
多糖蛋白完全甲基化： 称取适量实施例 1制备的多糖蛋白 ΤΡ-4于反 应瓶中， 放入真空干燥箱中干燥 5h ( 50 °C ), 加入经过分子筛处理过的 DMSO 2ml, 超声振荡 5分钟，待样品完全溶解后，加入研磨成粉状 NaOH 20mg, 同时用氮气赶尽瓶中空气， 室温下超声 10分钟， 静置 90分钟， 待 反应瓶中的 DMSO完全冰冻后， 逐滴加入 0.1ml碘甲烷（此过程大约需要 15~20分钟）， 同时反应物会慢慢解冻， 并逐渐澄清， 直至成为亮黄色。 然 后超声 10分钟， 静置 30分钟。 室温减压蒸镏， 去尽过量的碘甲烷， 用水 透析一天， 减压蒸至 2ml左右。 冷冻干燥后再于干燥器中干燥 5小时， 重 复上述操作 2次后，取少量样品进行红外检测，如果红外光谱中原 3300cm-1 处强而宽的羟基峰消失， 而 2900cm-1处甲基峰显著增强， 表明样品的全甲 基化反应已经完成。
部分甲基化阿尔迪醇乙酰酯制备： 将已经完全甲基化的样品溶于 3mL 90% (体积 )的甲酸溶液中，封管， 100 °C下解聚 6h,向反应瓶中加入 2~3mL 甲醇， 40°C下减压浓缩蒸干， 重复以上操作三次以除尽过量甲酸， 然后向 解聚后的样品中加入 2 Mol/L TFA溶液 4mL, 密封后于 110°C下水解 2h, 反应瓶中的溶液于 40°C下减压蒸干， 再加入 2~3mL甲醇， 蒸干， 重复以 上操作多次以除尽过量的 TFA。 水解后的样品用 3~4mL蒸镏水溶解后， 加入约 20mg NaBH4于室温下还原 3h, 然后用冰醋酸调 pH值到 5左右， 加入 l~2mL 甲醇及一滴冰醋酸后， 再减压蒸干， 重复上述操作多次以除 尽过量的乙酸。 经上述处理的样品置于 P205真空干燥器中减压干燥一天， 再于 110°C干燥 10~15min后， 加入 3mL醋酐， 110°C反应 lh, 向反应液 中加入 2mL甲苯， 振荡后 40°C下减压蒸去未反应的醋酐， 如此重复多次 以除尽醋酐。 然后将乙酰化后的样品溶于氯仿中， 再加入等体积的蒸镏水 洗涤氯仿层 3 次， 除尽水层， 氯仿层加入无水硫酸钠干燥 lOmin, 过滤， 将氯仿溶液室温减压浓缩至 O. lmL 左右后，进行气质联用分析（GC-MS )。 气质的条件为： 起始温度 50°C , 升温程序为 40°C/min, 至 215 °C , 保持 40min, 检测器温度 250°C , DB-5 毛细管 GC-MS色谱柱检测。
4、 氨基酸分析：
称取适量实施例 1制备的多糖蛋白 TP-4放入试管中， 加入 4ml的 6 Mol/L HCl在 100°C下水解 6小时， 蒸去 HC1, 离心， 过滤， 滤液用氨基酸 分析仪进行分析。
5、 IR光谱分析：
称取 lmg实施例 1制备的多糖蛋白 TP-4, 真空干燥过夜， 次日用溴 化钾压片法进行 IR检测。
二、 槐耳多糖蛋白 （TP-4 )化学结构研究结果
根据第一部分的研究方法对实施例 1制备的槐耳多糖蛋白 （TP-4 )的 化学结构进行了研究， 研究结果如下：
1、 纯度及分子量
TP-4为深褐色粉末状物质， 易溶于水、 DMSO , 不溶于高浓度的甲醇、 乙醇等有机溶剂， 该多糖蛋白的 UPLC-GPC-ESLD图谱（见图 5 ) 呈现一 个对称的窄的色谱峰， 提示其为一个纯的多糖蛋白物质， 与分子量标准品 对比， 该多糖蛋白的分子量为 1.41 x l06 Da (见图 3 ) , Lowry反应呈阳性， 紫外扫描 280nm处有弱的吸收， 表明该物质含有蛋白。
2、 单糖组成分析
TP-4完全酸水解之后， 水解产物一部分直接进行了离子色谱分析， 与 标准单糖对照， 分析结果表明该多糖由阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 木糖 及甘露糖组成， 在检测过程中没有发现与糖醛酸及氮乙酰氨基糖相关的色 谱峰显示出来， 提示其为一中性多糖 （表 2 , 见图 6 )。
表 2 槐耳多糖蛋白 TP-4单糖组成及比例 （质量比） 离子色谱分析结果 样品名 阿拉伯糖 半乳糖 葡萄糖 木糖 甘露糖
TP-4 8.9 1.6 3.4 7.4 1.3 通过单糖组成分析可以看出， 槐耳多糖蛋白 TP-4含有 5种单糖， 其 中以阿拉伯糖、 木糖的含量最高， 其次为葡萄糖， 半乳糖及甘露糖含量较 少。
3、 甲基化分析
为了确认 TP-4中的糖残基连接方式， 采用 Needs法对 TP-4进行了甲 基化， 在三次甲基化之后， 将其用 90%的甲酸解聚， 以 2 Mol/LTFA完全 酸水解， NaBH4还原和醋酐乙酰化制备成阿尔迪醇乙酸酯衍生物， 进行 GC-MS分析， 结果见表 3。
表 3 TP-4甲基化分析结果
连接方式 峰面积百分比
非还原末端连接阿拉伯糖 21%
非还原末端连接木糖 13%
1,2位连接阿拉伯糖 9%
1,5位连接阿拉伯糖 9%
1,3位连接木糖 18%
1,4位连接葡萄糖 14%
1,6位连接半乳糖 5%
1,3,6位连接甘露糖 10%
甲基化分析表明， 槐耳多糖 -4的结构非常复杂。 含有 8种不同连接的 糖残基， 其中， 阿拉伯糖以 1位， 1,2位和 1,5位羟基与其他糖残基形成糖 苷键互相连接， 木糖以 1位， 1,3位羟基与其他糖残基形成糖苷键互相连 接， 葡萄糖以 1,4-位羟基与其他糖残基形成糖苷键互相连接，半乳糖以 1,6 位羟基与其他糖残基形成糖苷键互相连接， 甘露糖以 1,3,6位羟基与其他 糖残基形成糖苷键互相连接。
为了进一步确认 TP-4链结构，对其进行了部分酸水解（ 0.3Mol/LTFA, 8小时）， 将水解产物进行了透析， 冷冻干燥之后， 获得了 TP-4的降解产 物， 命名为 TP-4-in, 同 TP-4—样， 对 TP-4-in 进行了单糖组成分析及甲 基化分析， 结果如表 4。
表 4 TP-4-in甲基化分析结果
连接方式 峰面积百分比
非还原末端连接阿拉伯糖 18%
非还原末端连接木糖 12%
1,5位连接阿拉伯糖 2%
非还原末端连接甘露糖 24%
非还原末端连接葡萄糖 26%
1,4位连接葡萄糖 12%
1,6位连接半乳糖 1%
1,6位连接甘露糖 5%
1,3,6位连接甘露糖 文里
TP-4-in与 TP-4相比阿拉伯糖和木糖信号的明显下降提示这两种糖可 能分布于 TP-4的侧链，而 1,4连接葡萄糖残基与其它糖残基的相对比例上 升， 提示 1,4连接葡萄糖残基为构成 TP-4主链的糖残基， 1,3,6连接甘露 糖残基几乎消失、 1,6连接甘露糖残基的出现也提示 1,6连接甘露糖残基为 构成 TP-4主链的糖残基， TP-4 的主链在 1,3,6连接甘露糖残基的 0-3 位 形成分支。 注： 大量的非还原末端糖残基与甲基化分析反应流程糖残基脱 落有关。
综合分析 TP-4 及 TP-4-in的甲基化分析结果可以发现，可以确定槐耳 多糖蛋白 TP-4 是一个化学结构非常复杂的多糖蛋白，其主要由阿拉伯糖、 木糖、 半乳糖、 葡萄糖、 甘露糖组成， 其中阿拉伯糖主要以 1 , 1,2-, 1,5- 连接的方式存在， 木糖主要以 1 , 1,3- 连接的方式存在， 半乳糖以 1,6- 连 接的方式存在， 葡萄糖以 1,4 - 连接的方式存在， 甘露糖以 1,3,6-连接的方 式存在。
4、 氨基酸分析：
为了分析槐耳多糖蛋白 TP-4中的氨基酸组成及比例， 采用盐酸水解结 合日立自动氨基酸分析仪， 对其进行了氨基酸组成及比例分析， 结果见表 表 5 槐耳多糖蛋白 TP-4氨基酸组成分析结果
氨基酸名称 含量 μ g/mg
天冬氨酸 26. 71
苏氨酸 11. 92
丝氨酸 10. 03
谷氨酸 33. 27
甘氨酸 19. 25
丙氨酸 13. 26
缬氨酸 14. 00
蛋氨酸 2. 29
异亮氨酸 6. 44
亮氨酸 11. 51
酪氨酸 4. 86
苯丙氨酸 6. 45
赖氨酸 11. 40
组氨酸 4. 52
精氨酸 12. 11
脯氨酸
5 IR光谱分析：
TP-4的红外光谱在 1735cm-1 无吸收， 提示 TP-4不含糖醛酸。 实施例 3槐耳清膏及所含化学成分体内免疫活性研究
1、 样品来源
槐耳清膏 由启东盖天力药业有限公司提供。 粗多糖 TCP, 均一多糖 TP-1 TP-2 TP-3 TP-4, 低分子量组分 ΤΟ-1 ΤΟ-2 ΤΟ-3 ΤΟ-4由实 施例 1制备。
2、 促进小鼠脾细胞增殖
1 )检测槐耳多糖是否能刺激小鼠脾细胞增殖
方法： 槐耳清膏各组分（粗多糖 TCP; 槐耳多糖 TP-1 ΤΡ-2 ΤΡ-3 TP-4; 低分子量组分 ΤΟ-1 ΤΟ-2 ΤΟ-3 ΤΟ-4; 槐耳粗总游离蛋白部分 TFP )及阴性对照药品葡聚糖 （Dextran ) 与小鼠脾细胞共培养， 42h后， 掺入 3H-TdR, 48h后采用细胞收集器 Filtermate harvester检测其增殖指数。 结果如图 7 结论： 从 3H-TdR结果看， 由槐耳清膏中提取的多糖成分（包括粗多 糖 TCP, 多糖组分 TP-1 , TP-2 , TP-3 , TP-4 ) 均能刺激小鼠脾细胞增殖； 低分子量组分除 TO-3外均不能刺激脾细胞增殖。
2 )槐耳多糖能刺激小鼠 B细胞增殖， 而非 T细胞
方法： 粗多糖 TCP、 槐耳多糖 TP-1、 TP-2 , TP-3 , TP-4与阴性对照 品葡聚糖 （ Dextran ) (浓度梯度为 100 μ g/ml, 30 μ g/ml, 10 μ g/ml ), 阳 性对照脂多糖（LPS )与纯化的 T、 Β淋巴细胞共培养， 42h掺入 3H-TdR, 48h后采用细胞收集器 Filtermate harvester检测其增殖指数。 结果见图 8。
结论： 磁珠分选获得高纯度的 1\ B细胞， 与槐耳多糖共孵育 48h后， 3H-TdR结果显示， 槐耳多糖组分 TP-1、 TP-2 , TP-3 , TP-4, TCP刺激的 是 B细胞， 而非 T细胞。 且这种刺激作用呈剂量相关性。
3 )槐耳多糖刺激小鼠脾细胞及人外周血单个核细胞（PBMC )后， Τ、 Β细 比例变 4匕
方法： 粗多糖 TCP、 槐耳多糖 TP-1、 TP-2 , TP-3 , TP-4 与葡聚糖 ( Dextran ) (浓度为 50 μ g/ml )、 脂多糖（ LPS )与小鼠脾细胞及人外周血 PBMC共培养， 24小时后， 流式检测 T、 Β细包比例。 结果见图 9。
结论： 槐耳多糖 TP-1、 TP-2 , TP-3 , TP-4刺激小鼠脾细胞或人外周 血 PBMC后， 与对照药物葡聚糖 ( Dextran )相比， B细胞比例明显上调， 而 T细胞比例无明显变化。
4 )槐耳多糖刺激小鼠脾细胞后， Τ, B细胞上 CD69的表达
方法： 粗多糖 TCP、 槐耳多糖 TP-1、 TP-2 , TP-3 , TP-4与对照多糖 葡聚糖（ Dextran ) (浓度为 50 μ g/ml )、 脂多糖（ LPS )与小鼠脾细胞共培 养， 6小时后， 流式检测 T、 Β细胞表面 CD69的表达。 结果见图 10。
结论： 槐耳多糖刺激小鼠脾细胞 6h后， B细胞开始高表达 CD69 , 而 T细胞无明显变化。
3、 促进巨噬细胞释放 NO
方法： 小鼠腹腔巨噬细胞体外培养，加入粗多糖 TCP、槐耳多糖 TP-1、 TP-2、 TP-3 , TP-4, 低分子量组分 TO-l、 TO-2、 TO-3 , TO-4、 槐耳粗总 游离蛋白部分 TFP与对照多糖葡聚糖（Dextran )、 脂多糖（LPS )共培养， 48小时后， 用格里斯试剂盒（ Griess Reagent kit )检测细胞培养上清中 NO 的含量， 结果见图 11。
结论： NO检测结果显示， 槐耳多糖能够刺激小鼠巨噬细胞分泌 NO , 且分泌量与多糖浓度呈剂量相关性。 低分子量组分刺激后 NO的分泌则没 有显著变化。 实施例 4槐耳多糖蛋白对肿瘤血管形成内皮细胞增值的抑制作用 一、 实验方法与步骤：
1、 实验材料
细胞： 人类肿瘤来源的血管内皮细胞
试剂： M199培养基， 双抗， 胎牛血清（FBS ), 碱性成纤维细胞生长 因子 （bFGF ), 明胶（ gelatin )。
待测样品： TP-4： 槐耳多糖蛋白 -4 , 由实施例 1制得。
2、 实验步骤：
( 1 ) 用排枪将 0.2%明胶加入 96孔板内， 每孔 40微升， 摇勾。 放入 培养箱孵育 30分钟以上。
( 2 )取出 96孔板， 用排枪吸出明胶， 用 PBS洗一遍， 放于超净台备 用。
( 3 ) 配制 20%FBS , 加双抗的 M199培养液。
( 4 )取复苏的人类肿瘤来源的血管内皮细胞， 吸出培养液， 用 PBS 洗一次， 离心后用 10%血清的 M199 重悬计数， 调整细胞浓度为 40000-50000/ml。
( 5 )用排枪将细胞加入 96孔板，每孔 100微升， 边缘孔加等量 PBS。 放入培养箱。
( 6 ) 12小时后， 配制含 1%-5% FBS , 10-100ng/ml bFGF的 M199培 养基。
( 7 )取出 96孔板，用排枪吸出培养基，加入含 1%-5%FBS以及 bFGF 的 M199与药物， 每孔 100微升， 设对照组与调零组。 并加入待测样品， 分别为 TCP、 TP-1、 ΤΡ-2、 ΤΡ-3与 ΤΡ-4。 每一样品设 4个浓度， 分别为 l(^g/L、 10(^g/L、 50(^g/L、 与 100(^g/L。 然后在 37。C , 5%的 C02下连 续孵育。
( 8 ) 72小时后， 吸去培养基， 加 MTT (浓度 0.5 mg/ml, 过滤除菌）， 孵育 4-6小时。
( 9 ) 吸去 MTT, 加 100微升 DMSO , 570 匪测 OD.
二、 实验结论：
槐耳多糖蛋白 -4 ( TP-4 )对肿瘤血管内皮细胞的增殖具有显著的抑制 作用。 结果见图 12。 各给药组与对照组相比较后， 并经方差分析及事后 T 检验。 *** P < 0.001 , 表示两组比较有极显著差异。

Claims

权利要求
1、 一种槐耳多糖蛋白， 该多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 木糖及甘露糖， 其质量比为 8.9: 1.6: 3.4: 7.4: 1.3。
2、 根据权利要求 1所述的多糖蛋白， 其特征在于， 所述多糖蛋白的重 均分子量为 7.0xl05-2.0xl06Da, 优选为 1.41xl06Da。
3、 根据权利要求 1或 2所述的多糖蛋白， 其特征在于， 该多糖蛋白的制 备方法包括如下步骤：
( 1 )将浓度为 2%-20% (质量 /体积 ), 优选为 8% (质量 /体积 ) 的槐 耳菌质提取物水溶液采用 Sevage法去除游离蛋白， 收集糖类部分；
( 2 )将步骤 （1 )得到的糖类部分加入无水乙醇中， 使其形成醇浓度 为 75%-80% (体积）， 优选为 80% (体积） 的糖溶液， 离心， 得到沉淀物；
(3 )将步骤 （2)得到的沉淀物加水溶解， 过滤， 浓缩、 透析收集袋 内部分； 以及
(4)使用离子交换柱色谱对步骤 （3) 收集到的袋内部分进行分离， 其中使用的洗脱液为 0.85mol/L-1.5mol/L 的 NaCl水溶液，优选为 1.0mol/L 的 NaCl水溶液。
4、 根据权利要求 3所述的多糖蛋白， 其特征在于， 所述多糖蛋白的制 备方法还包括对 NaCl水溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。
5、 根据权利要求 4所述的多糖蛋白， 其特征在于， 所述多糖蛋白的制 备方法还包括采用 Sepharose CL-6B 琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进 行分离纯化的步骤。
6、 一种权利要求 1至 5中任一项所述的多糖蛋白的制备方法， 该制备 方法包括如下步骤：
( 1 )将浓度为 2%-20% (质量 /体积 ), 优选为 8% (质量 /体积 ) 的槐 耳菌质提取物水溶液采用 Sevage法去除游离蛋白， 收集糖类部分；
( 2 )将步骤 （1 )得到的糖类部分加入无水乙醇中， 使其形成醇浓度 为 75%-80% (体积）， 优选为 80% (体积） 的溶液， 离心， 得到沉淀物；
(3 )将步骤 （2)得到的沉淀物加水溶解， 过滤， 浓缩、 透析收集袋 内部分； 以及
(4)使用离子交换柱色谱对步骤 （3) 收集到的袋内部分进行分离， 其中使用的洗脱液为 0.85mol/L-1.5mol/L的 NaCl水溶液， 优选为 1.0mol/L 的 NaCl水溶液， 即得。
7、 根据权利要求 6所述的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法还包 括对 NaCl水溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。
8、 根据权利要求 7所述的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法还包 括采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化 的步骤。
9、 根据权利要求 6至 8中任一项所述的制备方法， 其特征在于， 所述 制备方法包括如下步骤：
( 1 )准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏 300g, 加入适量蒸镏水将其稀 释为浓度约为 8% (质量 /体积）的稀溶液， 之后采用 Sevage 法去除游离蛋 白， 重复操作 5次， 收集糖类部分；
( 2 ) 向步骤 （1 )得到的槐耳菌质糖类部分中緩緩加入无水乙醇使其 成为醇浓度为 80% (体积） 的糖溶液， 4°C静置 24小时后， 以 3000转 /分 钟的速度离心 10分钟， 沉淀， 得到沉淀物；
( 3 )称取适量步骤（ 2 )得到的沉淀物， 将其溶解于 150ml蒸镏水中， 过滤， 减压浓缩至体积 50ml; 透析收集袋内部分， 以及
( 4 )使用 DEAE-52离子交换柱色谱对步骤（3 )收集到的袋内部分进行分 离，采用 1.0mol/L NaCl溶液进行洗脱， 洗脱部分在浓缩后进行透析除盐， 透析过程为对流水透析三天， 蒸镏水透析两天； 以及
( 5 )采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对步骤（ 4 )得到的产品进行 分离纯化， 直至高效液相色谱法检测为纯品为止。
10、 权利要求 1至 5中任一项所述的多糖蛋白在制备治疗肿瘤的药物 中的用途。
11、 一种药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物包含槐耳多糖蛋 白和药学上可接受的载体，其中，所述组合物中含有重量比为 0.01%-99.95% 的槐耳多糖蛋白作为活性成分， 并且以槐耳多糖蛋白的总重量计， 所述槐 耳多糖蛋白中含有 90wt%-100wt%的权利要求 1至 5中任一项所述的槐耳多 糖蛋白。
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