CN113480674A - 一种黑茶多糖-ⅰ活性成分及其制备方法和在抗癌中应用 - Google Patents

一种黑茶多糖-ⅰ活性成分及其制备方法和在抗癌中应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗癌活性成分技术领域，具体公开了一种黑茶多糖‑Ⅰ及其结构式、制备方法和在特异性调控肝癌细胞凋亡药物中的应用。本发明研究发现所述的黑茶多糖‑Ⅰ作为抗癌药物活性成分，能够特异性地调节癌症细胞例如肝癌细胞的凋亡，且不影响正常细胞如正常肝细胞L02的增殖，具有生物相容性好、特异性强、毒副作用低等特点，能够弥补传统癌症治疗手段的不足，具有广阔的应用前景。

Description

一种黑茶多糖-Ⅰ活性成分及其制备方法和在抗癌中应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种抗癌活性成分。
背景技术
肝癌是由肝细胞或肝内胆管细胞癌变导致的，是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率高，且发病率呈逐年上升趋势。目前，癌症常见的治疗方法有放疗、化疗、手术切除以及中西医联合治疗等。至今，原发性肝癌的发病原理仍不完全明确，研究表明可能与肝硬化、病毒性肝炎、化学致癌物质有关。因此，肝癌目前最有效的治疗手段为早期手术切除。但由于原发性肝癌早期无特异性症状，早期发现较为困难，且病情发展迅速，患者发现时多在中晚期，癌组织大多扩散或转移，手术切除的效果大打折扣。而放疗和化疗作为肝癌晚期的主要治疗手段，由于特异性差，无法分辨正常细胞与肿瘤细胞，对正常组织损伤较大，对人体造成严重危害。因此，研究一种能特异性杀伤肝癌细胞，而不损伤正常肝细胞的药物成为肝癌治疗的当务之急。
茶叶在中国、印度、泰国和日本等亚洲国家的医疗和饮食领域有着悠久历史。研究表明，茶叶具有抗氧化、抗炎、抗癌、免疫调节等生理活性。茶多糖就是茶叶中重要的一种生理活性物质，现代科学研究表明，茶多糖在诸多疾病的预防与治疗中发挥着重要的作用，具有广泛的抗氧化、抗病毒、保肝、免疫刺激、抗肿瘤、抗肥胖和抗糖尿病等功能。而黑茶由于发酵工艺的特殊性，导致其多糖在结构和生理活性上均与其它茶叶有所区别，值得深入探究。另外，与化疗、放疗相比，天然提取的多糖，作为抗肿瘤药物，具有生物相容性好、作用平缓、毒副作用低、不容易产生抗药性等优点。
发明内容
本发明第一目的在于提供一种全新的黑茶多糖-Ⅰ活性成分。
本发明第二目的在于提供一种所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分的制备方法。
本发明第三目的在于提供所述黑茶多糖-Ⅰ活性在用于制备抗癌药物中的应用。
本发明第四目的在于提供一种包含所述的黑茶多糖-Ⅰ抗癌活性成分的抗癌药物。
一种黑茶多糖-Ⅰ活性成分，为具有式1所示的结构的多糖：
Figure BDA0003220236540000021
式1。
本发明提供了一种全新的多糖化合物，且发现该全新的多糖化合物能够具有良好的特异性抗癌活性，例如，其对癌细胞具有优异的抑杀作用，并能够降低癌细胞的迁移能力，此外，所述结构的多糖对正常细胞基本没有抑制活性，甚至还具有一定程度地促进正常细胞活性的作用。
本发明所述的黑茶多糖-Ⅰ为一种新的多糖类化合物，其是通过特定含量的葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸中的单糖单元按所述特殊糖苷键连接得到；
水解后的多糖化合物中，葡萄糖含量为34～36％，半乳糖含量为29～31％，阿拉伯糖含量为24～26％，鼠李糖含量为4～6％以及半乳糖醛酸含量为3～5％。
甲基化后的多糖化合物包括→2)-Araf-(1→、Rhap-(1→、→5)-Araf-(1→、Glcp-(1→、→3)Galp-(1→、→4)-Galp-(1→、→4)-Glcp-(1→、→6)-Galp-(1→、→4,6)-Galp-(1→等9种单糖残基，其含量分别为20～21％、2～3％、12～14％、7～8％、9～10％、4～5％、29～31％、6～7％、5～6％。
优选地，本发明所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分为无臭无味、易溶于水白色絮状物。
作为优选，所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分，分子量为8000～10000。
优选地，所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分，微粒粒径为50～150nm。
本发明所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分的抑瘤率可达31％～34％；且给药浓度在达到600μg/mL下仍具有良好的正常细胞安全性，甚至在200～400μg/mL的浓度下还具有一定程度的促进正常细胞活性的效果。
本发明还提供了所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将黑茶进行脱脂、水提取、醇沉、脱蛋白，得到黑茶粗多糖；
步骤(2)：将黑茶粗多糖先用纤维素柱进行分离，分离过程包括依次进行的第一段洗脱和第二段洗脱；收集第二段洗脱液，经脱盐、浓缩处理后再经葡聚糖凝胶柱纯化处理即得黑茶多糖-Ⅰ活性成分；
第一段洗脱的洗脱剂为浓度小于或等于0.1M的盐溶液；第二段洗脱的洗脱剂为0.25～0.35mol/L的盐溶液。
本发明研究发现，通过所述的方法、配合所述的洗脱工艺，可以获得所述的全新的黑茶多糖-Ⅰ活性成分。
本发明中，所述的黑茶可以选自黑茶的茶砖。所述的黑茶可以预先进行粉碎和过筛处理。
本发明中，脱脂过程中，所采用的溶剂为70％～90％的乙醇水溶液；脱脂过程的溶剂用量例如为1～20mL/g(以黑茶重量为基准)；脱脂过程的温度为回流，优选为65℃～75℃。
脱脂处理后进行固液分离，获得的脱脂物进行后续的水提取。
优选地，水提取过程的水和黑茶按1～15倍重量投加(以黑茶重量为基准，水的用量为1～15mL/g，优选为5～10mL/g)。
优选地，水提取过程的温度为80℃～90℃。
优选地，水提取处理后进行固液分离，获得水提取液。
本发明中，水提取液经浓缩或者未浓缩后加入醇溶剂，进行醇沉处理。
优选地，醇沉过程中，添加的醇为水提取溶液(例如可以是浓缩后的水提取液)体积的3～5倍。所述的醇例如为乙醇。
优选地，将醇沉产物用水溶解，并采用中性蛋白酶和Sevage试剂进行脱蛋白处理，获得黑茶粗多糖。
本发明中，将获得的黑茶粗多糖进行纤维素离子交换柱进行分离；本发明中，所述的纤维素柱采用DEAE-50纤维素离子交换柱。
优选地，所述的盐溶液中的溶质为氯化钠、氯化钾中的至少一种；
优选地，第一段洗脱的盐溶液的浓度为0.05～0.15M；优选为0.1～0.12M；
优选地，第二段洗脱的盐溶液的浓度为0.3～0.32M。
本发明中：所述的葡聚糖凝胶柱为G-100葡聚糖凝胶柱。
本发明一种优选的黑茶多糖-Ⅰ活性成分的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将黑茶茶砖粉碎、过筛，用70％～90％的乙醇水溶液脱脂后，过滤，将滤饼用80～90℃热水浸提，得到水提液；水提液浓缩后添加乙醇，固液分离得到醇沉淀物；
步骤(2)：步骤1得到的醇沉淀物用水溶解后加入蛋白酶与Sevage试剂，通过两种试剂的联用，提高脱蛋白的效率；经过分子截流量为2000～4000的透析袋除去小分子，真空冻干得到黑茶粗多糖；
步骤(3)：将步骤2得到的黑茶粗多糖通过纤维素柱层析(优选为DEAE-50纤维素离子交换柱)进行分离，依次用0.05～0.15mol/L的氯化钠溶液、0.25～0.35mol/L的氯化钠溶液以及0.45～0.55mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集0.25～0.35mol/L的氯化钠溶液的洗脱液(目标洗脱液)；
步骤(4)：将得到的洗脱液(目标洗脱液)，浓缩，并通过葡聚糖凝胶柱(G-100葡聚糖凝胶柱)纯化，用蒸馏水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，冻干，得到黑茶多糖-Ⅰ。
本发明所述的黑茶多糖-Ⅰ制备方法，通过蛋白酶与Sevage试剂联用的方法，大大提高了蛋白的脱除率，提高了黑茶多糖的产率；通过上述洗脱方法，可以获得能特异调控肝癌细胞凋亡，而不影响正常细胞代谢增殖的黑茶多糖-Ⅰ。
本发明还提供了一种黑茶多糖-Ⅰ活性成分在制备抗癌药物中的应用。
本发明研究发现，所述的全新的黑茶多糖-I活性成分具有良好的抗癌选择性，其能够特异性地抑杀癌细胞，且对正常的细胞基本不具备抑杀作用，甚至还具有一定地改善正常细胞活性的效果。
本发明优选的应用，将所述的黑茶多糖-I活性成分用于制备抗肝癌药物中的应用。
本发明通过肝癌细胞模型(例如SMMC-7721肝癌细胞)以及正常细胞模型(人源正常肝细胞L02)证实了所述的多糖活性成分的抗癌选择性。
进一步优选，本发明制备的黑茶多糖-Ⅰ能够特异性有效抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖的同时，不对正常细胞L02的正常生理活动产生显著影响，甚至可以促进正常细胞的增殖。
本发明所述的黑茶多糖-Ⅰ的特异性抑制肝癌细胞的生理活性可以通过细胞增殖毒性实验进行证明。实验结果表明，黑茶多糖-Ⅰ可以大大降低肝癌细胞的存活率，而对正常细胞的增殖无明显影响。
本发明还将黑茶多糖-Ⅰ孵育后的肝癌细胞细胞经过AO/EB染色试剂处理，通过高内涵细胞成像仪定性反应细胞状态。结果证明，黑茶多糖-Ⅰ特异性促进肝癌细胞的凋亡，而不影响正常细胞的细胞状态
同时，本发明还通过细胞划痕实验证明，经黑茶多糖-Ⅰ孵育后，肝癌细胞的迁移能力大大下降，而正常肝细胞的迁移能力无显著变化。
本发明还提供了包含所述的抗癌药物，其包含药学有效量的所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分。
本发明所述的抗癌药物，还允许含有其他抗癌活性成分。
优选地，还包含其他药学上可接受的辅料；
优选地，具有药学上可接受的药学有效的任意剂型。
有益效果：
1、本发明提供了全新的黑茶多糖-Ⅰ活性成分，本发明通过粒径分析、原子力显微镜、扫描电镜等表征方法，探明了黑茶多糖-Ⅰ的颜色、气味、粒径、溶解度、酸碱度等物化特性，可以证实其为全新的多糖活性成分。此外，本发明通过单糖组成分析、甲基化、核磁共振谱图等手段，解析了黑茶多糖-Ⅰ的化学结构，为探明黑茶多糖-Ⅰ抗肝癌活性的构效机制奠定结构基础，为多糖作为抗癌药物的应用起到推动作用；
另外，本发明所述的全新的多糖物质不仅可以特异性抑制癌细胞如肝癌细胞的增殖和迁移，还能避免对正常细胞增殖能力和细胞状态的损害，甚至意外地能够促进正常细胞的新陈代谢和增殖，弥补了现有化学抗癌药物特异性不强，对人体副作用大的缺点。
2、本发明的制备方法中采用蛋白酶和Sevage试剂联用的方法除去黑茶粗多糖中的蛋白质，不仅大大提高了去除蛋白质的速度和效率，而且一定程度上提高了黑茶多糖-Ⅰ的得率。
附图说明
图1为黑茶粗多糖的纤维柱洗脱曲线(两个组分分别为0.3mol/L，0.5mol/L的氯化钠水溶液洗脱液，分别命名黑茶多糖-Ⅰ，黑茶多糖-Ⅱ)；
图2为黑茶多糖-Ⅰ的葡聚糖柱洗脱曲线；
图3为黑茶多糖-Ⅰ的凝胶渗透色谱图(GPC)；
图4为黑茶多糖-Ⅰ的粒径分布图(DLS)；
图5为黑茶多糖-Ⅰ的原子力显微镜图(AFM)；
图6为黑茶多糖-Ⅰ的扫描电镜图(SEM)；
图7为黑茶多糖-Ⅰ的红外光谱图(IR)；
图8为黑茶多糖-Ⅰ水解物及标准单糖的离子色谱图(IC)；
图9为黑茶多糖-Ⅰ甲基化产物的气质联用谱图(GC-MS)；
图10为黑茶多糖-Ⅰ的一维核磁共振谱图(图a为1H-NMR，图b为13C-NMR)；
图11为黑茶多糖-Ⅰ的二维核磁共振1H-1H-COSY谱图；
图12为黑茶多糖-Ⅰ的二维核磁共振HMBC谱图
图13为黑茶多糖-Ⅰ的二维核磁共振HSQC谱图
图14为黑茶多糖-Ⅰ经解析得到的结构式；
图15为肝癌细胞SMMC-7721经黑茶多糖-Ⅰ孵育后的细胞存活率；
图16为SMMC-7721细胞经黑茶多糖-Ⅰ孵育后的高内涵细胞荧光成像图；
图17为SMMC-7721细胞经黑茶多糖-Ⅰ孵育后的细胞划痕实验图；
图18为SMMC-7721细胞经黑茶粗多糖和黑茶多糖-Ⅱ孵育后的细胞存活率；
图19为人正常肝细胞L02经黑茶多糖-Ⅰ孵育后的细胞存活率；
图20为L02细胞经黑茶多糖-Ⅰ孵育后的高内涵细胞荧光成像图；
图21为L02细胞经黑茶多糖-Ⅰ孵育后的细胞划痕实验图；
具体实施方式
以下实施例旨在对本发明的具体实施方式进行详细描述，但本发明的实施方法不限于具体实施例。另外，在未特殊说明的情况下，本发明各实施例所述的实验方法均属常规方法。
实施例1
实施例1提供了一种黑茶多糖-Ⅰ的制备方法，具体实施方法如下：
一、粗黑茶多糖的制备
粉碎：取黑茶茶砖(湖南省白沙溪茶厂股份有限公司提供)粉碎，过100目筛，烘干，得到黑茶茶粉。
脱脂：取50g于500mL的圆底烧瓶中，加入75％(体积)的乙醇-水溶液250mL，70℃下搅拌回流2h，将混合液抽滤，收集滤饼，真空干燥。
水提：取滤饼20g于500mL烧瓶中，添加250mL的去离子水，85℃浸提3h，将混合液离心，收集上清液，减压浓缩，得到粘稠液体。
醇沉：将水提浓缩液搅拌加入4倍体积的无水乙醇进行沉淀，于4℃下静置24h，离心，得沉淀物。
脱蛋白：将沉淀物加热溶于40mL的去离子水中，加入沉淀物质量1％的中性蛋白酶，于45℃搅拌2h；加入溶液1/4体积的sevage试剂，离心取上清液，重复4-5次，收集上清液，用分子量为3500透析袋透析，减压浓缩，冻干得到粗多糖。
二、黑茶多糖-Ⅰ的制备
离子交换柱纯化：取500mg粗多糖溶于15mL去离子水中，将溶液加入DEAE-50纤维素离子交换柱中，依次用0.1、0.3和0.5mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱。取奇数管，选用苯酚-硫酸法，用紫外分光光度计检测多糖含量，绘制纤维素柱洗脱曲线图，如图1。收集0.3mol/L、0.5mol/L洗脱液两个组分。取0.3mol/L的洗脱液，减压浓缩，透析，浓缩，得到组分浓缩液。
葡聚糖柱纯化：取5mL组分浓缩液加入G-100葡聚糖柱进行纯化，用去离子水洗脱，取奇数管用苯酚-硫酸法检测糖含量，绘制葡聚糖柱洗脱曲线，如图2。将洗脱液浓缩，冻干，得到精制黑茶多糖-Ⅰ(总提取率为2.51％)。
和黑茶多糖-Ⅰ的制备类似，将0.5mol/L洗脱液减压浓缩，透析，浓缩后按葡聚糖柱纯化，获得黑茶多糖-II。
实施例2
实施例2说明了黑茶多糖-Ⅰ(由实施例1获得)的物化性质和结构表征方法和所述黑茶多糖-Ⅰ的明确化学结构式，具体表征方法如下：
分子量分析：将5mg的黑茶多糖-Ⅰ与标准品，置于样品瓶中，加入流动相，室温放置12h，采用凝胶色谱仪进行分析对黑茶多糖-Ⅰ的分子量进行测试。实验结果如图3，黑茶多糖-Ⅰ的平均分子量为8837。
粒径分析：取1mg的黑茶多糖-Ⅰ配成1mg/mL的样品溶液，采用粒度分析仪对样品的粒度大小和分布进行分析。实验结果如图4，黑茶多糖-Ⅰ的平均粒径为150nm。
原子力显微镜成像：同上，将黑茶多糖-Ⅰ配成1mg/mL的样品溶液，将溶液喷涂于1×1cm的云母片上，晾干后，采用原子力显微镜对样品进行成像。实验结果如图5，可以看出黑茶多糖-Ⅰ粒径大小分布比较均匀，粒径在120nm左右。
扫描电镜成像：同上将黑茶多糖-Ⅰ制成溶液，将溶液滴落于硅片上，置于真空干燥箱干燥后，喷金处理，然后采用场发射扫描高分辨率电镜分别在不同高度进行对焦成像。图像如图6所示，可以看出黑茶多糖-Ⅰ的微观结构为层状。
红外光谱：取5mg黑茶多糖-Ⅰ冻干样品，以与0.75g KBr固体混合均匀，研磨成粉末，然后将粉末压入1mm厚的圆盘中进行压片，使用红外光谱仪在4000-400cm-1的频率范围内进行红外光谱分析。红外光谱如图7所示，3442cm-1处的宽峰是由氢键O-H的伸缩振动形成的，2924cm-1处的较弱吸收峰是由C-H键的不对称伸缩振动形成的，1026cm-1和1079cm-1处的谱带是由吡喃糖环中C-O基团的拉伸振动形成的，说明了单糖组成中存在半乳糖，800-900cm-1处的弱吸收峰则与多糖中的α-糖苷键和β-糖苷键有关，结果与黑茶多糖-Ⅰ的单糖组成分析结果以及甲基化分析结果一致。
黑茶多糖-Ⅰ的水解及单糖组分分析：取10mg样品至5mL安培瓶中，加入2mL(2mol/L)三氟乙酸封管，110℃酸解8h。挥干三氟乙酸，加2mL水复溶，完成水解。后吸取250μL水解液，加入250μL(0.6mol/L)氢氧化钠，500μL(0.4mol/L)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，在70℃反应1h。冷却，加入500μL(0.3mol/L)盐酸中和，再加入1mL氯仿漩涡1min，离心，取上清，萃取。取上清液，完成衍生化。最后采用经过高效液相设备洗脱，得到的洗脱曲线如图8所示，实验分析结果见表1。
表1黑茶多糖-Ⅰ单糖组成及含量
Figure BDA0003220236540000091
黑茶多糖-Ⅰ甲基化分析：取20mg干燥后的黑茶多糖-Ⅰ溶于4mL干燥的DMSO中，超声使样品完全溶解，然后快速加入20mg预先干燥的NaOH粉末，继续超声，使完全溶解，冰浴至反应完全冻结。用氮气保护反应体系，用移液管缓慢加入0.6mL干燥的碘甲烷，再超声处理1h.然后加入1mL蒸馏水终止反应。再加入1mol/L的乙酸中和。透析，冷冻干燥。
将完全甲基化的黑茶多糖-Ⅰ溶于4ml90％的甲酸溶液，于110℃反应6h。减压蒸干，甲醇重复洗涤。然后加入4mL 2mol/L三氟乙酸的安培管中，110℃水解密封反应2h，减压蒸干，重复加甲酸多次洗涤。再加水溶解。30mg NaBH4还原乙酰化，萃取后进行GC-MS分析。测试参数为：毛细管柱HP-5,程序升温50～250℃,10℃/min,进样口温度260℃；离子源：El；氦气流速1ml/min。实验得到的总离子流色谱图(TIC)如图9所示，黑茶多糖-Ⅰ甲基化分析数据如表2所示，与单糖组成一致。
表2黑茶多糖-Ⅰ甲基化数据分析
Figure BDA0003220236540000092
核磁共振分析：取50mg黑茶多糖-Ⅰ溶于2mL重水中，将溶液移入核磁管，采用脉冲傅里叶变换谱仪，对样品进行扫描。得到的1H-NMR和13C-NMR一维谱图如图10所示，二维谱图1H-1H-COSY谱图见图11，HMBC谱图见图12，HSQC谱图见图13。由图可知，黑茶多糖-Ⅰ的各个糖残基的13C、1H的化学位移如表3所示，与甲基化结构基本符合。
表3黑茶多糖-Ⅰ糖残基的13C、1H的化学位移
Figure BDA0003220236540000101
经过以上对黑茶多糖-Ⅰ的结构表征，可以得出本发明所述的黑茶多糖-Ⅰ的化学结构式如图14。
Figure BDA0003220236540000102
实施例3
实施例3提供了黑茶多糖-Ⅰ(由实施例1获得)在制备特异性调控肝癌细胞凋亡的药物中的应用，具体实施过程如下：
一、黑茶多糖-Ⅰ对肝癌SMMC-7721细胞的药效实验过程
细胞增殖实验：将肝癌细胞SMMC-7721细胞复苏后，置于含有10％FBS的DMEM培养基中培养，并置于37℃、5％CO2条件的培养箱中。当7721细胞长满细胞瓶底部时，使用胰酶将细胞消化，离心，弃去上清，向沉淀中加入2mL培基后，吹打，使用血球计数板计数，并按比例稀释细胞，向96孔板接种细胞(每孔100μL细胞悬液，即5000个细胞)，于培养箱中培养24h。向96孔板中分别加入含黑茶多糖-Ⅰ浓度为0、50、100、200、400、600μg/mL的DMEM培养基，37℃孵育24h。再向各孔加入10μL稀释十倍的CCK-8试剂，孵育1h。使用酶标仪测450nm处的吸光度。计算细胞存活率，结果如图15所示，7721细胞在用黑茶多糖-Ⅰ孵育后，细胞存活率明显下降；当黑茶多糖-Ⅰ浓度为600μg/mL时，细胞存活率不足70％，证明黑茶多糖-Ⅰ能在一定程度上抑制肝癌细胞的增殖。同时，用上述方法向SMMC-7721细胞中加入黑茶粗多糖(实施例1制备)和黑茶多糖-Ⅱ(实施例1制备)进行孵育，并计算其存活率，结果如图18所示，黑茶粗多糖和黑茶多糖-Ⅱ对SMMC-7721细胞的增殖有一定抑制作用，但抑制率远小于黑茶多糖-Ⅰ。
高内涵细胞成像实验：同上，将7721细胞接种于96孔板中，并用不同浓度的黑茶多糖-Ⅰ溶液孵育24h。然后向96孔板中加入双色染液染色(AO染料、EB染料和1×BB以1:1:20的比例混合)，黑暗中孵育5min后，用PBS清洗。采用高内涵细胞成像仪检测黑茶多糖-Ⅰ孵育后的7721细胞状态。成像如图16所示，随着黑茶多糖-Ⅰ溶液浓度的增加，孵育后的7721细胞活细胞明显减少，凋亡细胞明显增多。
细胞划痕实验：将7721细胞以每孔1x106的细胞密度接种于6孔板中，培育24h使之贴壁生长，后用200μL的枪头在每孔中央垂直均匀划痕，再用含0,300,600μg/mL的黑茶多糖-Ⅰ的无血清培养基培养。在0h，12h，24h，48h后，分别在荧光倒置显微镜下观察划痕的变化情况，以判断7721细胞迁移能力的变化。实验结果图见图17，可以看出划痕的变化不大，在黑茶多糖--Ⅰ孵育后，7721细胞的迁移能力大大下降。
二、黑茶多糖-对人源正常肝细胞L02的药效实验过程
细胞增殖实验：将人源正常肝细胞L02细胞复苏后，置于含有10％FBS的1640培养基中培养，并置于37℃、5％CO2条件的培养箱中。当L02细胞长满细胞瓶底部时，使用胰酶将细胞消化，离心，弃去上清，向沉淀中加入2mL培基后，吹打，使用血球计数板计数，并按比例稀释细胞，向96孔板接种细胞(每孔100μL细胞悬液，即5000个细胞)，于培养箱中培养24h。向96孔板中分别加入含黑茶多糖-Ⅰ浓度为0、50、100、200、400、600μg/mL的1640培养基，37℃孵育24h。再向各孔加入10μL稀释十倍的CCK-8试剂，孵育1h。使用酶标仪测450nm处的吸光度。计算细胞存活率，结果如图19所示，L02细胞在用黑茶多糖-Ⅰ孵育后，细胞存活率无明显下降趋势；甚至当黑茶多糖-Ⅰ浓度为300μg/mL时，细胞存活率略微上升，证明低浓度的黑茶多糖-Ⅰ有促进正常细胞增殖的作用。
高内涵细胞成像实验：同上，将L02细胞接种于96孔板中，并用不同浓度的黑茶多糖-Ⅰ溶液孵育24h。然后向96孔板中加入双色染液染色(AO染料、EB染料和1×BB以1:1:20的比例混合)，黑暗中孵育5min后，用PBS清洗。采用高内涵细胞成像仪检测黑茶多糖-Ⅰ孵育后的L02细胞状态。成像如图20所示，随着黑茶多糖-Ⅰ溶液浓度的增加，孵育后的L02细胞的细胞状态无明显变化。
细胞划痕实验：将L02细胞以每孔1x106的细胞密度接种于6孔板中，培育24h使之贴壁生长，后用200μL的枪头在每孔中央垂直均匀划痕，再用含0,300,600μg/mL的黑茶多糖-Ⅰ的无血清培养基培养。在0h，12h，24h，48h后，分别在荧光倒置显微镜下观察划痕的变化情况，以判断L02细胞迁移能力的变化。实验结果图见图21，可以随着时间的延长，划痕逐渐合拢，证明黑茶多糖-Ⅰ并不会影响正常细胞的迁移能力。

Claims (10)

1.一种黑茶多糖-Ⅰ活性成分，其特征在于，为具有式1所示的结构的多糖：
Figure FDA0003220236530000011
2.如权利要求1所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分，其特征在于，
分子量为8000～10000；
粒径优选为50～150nm。
3.一种权利要求1或2所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将黑茶进行脱脂、水提取、醇沉、脱蛋白，得到黑茶粗多糖；
步骤(2)：将黑茶粗多糖先用纤维素柱进行分离，分离过程包括依次进行的第一段洗脱和第二段洗脱；收集第二段洗脱液，经脱盐、浓缩处理后再经葡聚糖凝胶柱纯化处理即得黑茶多糖-Ⅰ活性成分；
第一段洗脱的洗脱剂为浓度小于或等于0.1M的盐溶液；第二段洗脱的洗脱剂为0.25～0.35mol/L的盐溶液。
4.根据权利要求3所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分的制备方法，其特征在于：所述的黑茶为茶砖；
优选地，脱脂过程中，所采用的溶剂为70％～90％的乙醇水溶液；脱脂过程的温度为回流，优选为65℃～75℃；
脱脂处理后进行固液分离，获得的脱脂物进行后续的水提取；
优选地，水提取过程的水和黑茶按1～15倍重量投加；
优选地，水提取过程的温度为80℃～90℃；
优选地，水提取处理后进行固液分离，获得水提取液；
优选地，向水提取液中添加醇溶剂，进行醇沉处理；
优选地，醇沉过程中，添加的醇为水提取溶液体积的3～5倍；
优选地，将醇沉产物用水溶解，并采用中性蛋白酶和Sevage试剂进行脱蛋白处理，获得黑茶粗多糖。
5.根据权利要求3所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分的制备方法，其特征在于：
所述的纤维素柱采用DEAE-50纤维素离子交换柱；
优选地，所述的盐溶液中的溶质为氯化钠、氯化钾中的至少一种；
优选地，第一段洗脱的盐溶液的浓度为0.05～0.15M；优选为0.1～0.12M；
优选地，第二段洗脱的盐溶液的浓度为0.3～0.32M。
6.根据权利要求3所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分的制备方法，其特征在于：所述的葡聚糖凝胶柱为G-100葡聚糖凝胶柱。
7.一种权利要求1或2所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分或权利要求3～6任一项制备方法制得的黑茶多糖-Ⅰ活性成分在制备抗癌药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的抗癌药物为抗肝癌药物。
9.一种抗癌药物，其特征在于，包含药学有效量的权利要求1或2所述的黑茶多糖-Ⅰ活性成分。
10.如权利要求9所述的抗癌药物，其特征在于，还包含其他抗癌活性成分；
优选地，还包含其他药学上可接受的辅料；
优选地，具有药学上可接受的药学有效的任意剂型。
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