CN112321736B - 一种平菇多糖硒苷-ⅲ抗癌活性成分及其制备和在制备抗肝癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高抗肝癌药效、低毒副作用的平菇多糖硒苷‑Ⅲ组分。其特征在于：该平菇多糖硒苷‑Ⅲ组分能够对肝癌细胞有强杀伤作用，但是对正常肝细胞具有促进增殖作用。这说明其不仅有用于抗癌药物的能力，还可能有用于增强新陈代谢，促进细胞增殖的潜力。该平菇多糖硒苷‑Ⅲ作为抗癌药物具有良好的社会效益与经济效益，具有广阔的应用前景。

Description

一种平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分及其制备和在制备抗肝 癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种高抗癌药效、低毒副作用的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分。

技术背景

肝癌即肝脏恶性肿瘤，主要分为原发性与继发性两类肿瘤。原发性肿瘤在我国发病率很高。如今，原发性肝癌的病因及确切分子机制尚不完全清楚，可能与乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染、饮水污染、酒精、黄曲霉素、肝硬化、性激素、亚硝酸类物质等因素有关。目前肝癌患病率居高不下，研究对肝癌有特异性杀伤能力的抗癌药物刻不容缓。

目前，肝癌的治疗方法在不断发展，总的来说，肝癌的治疗主要分成化疗、放疗、手术、中药治疗或者联合治疗。手术可以快速切除病灶，控制病情。但是大多数肝癌患者起病隐匿，病情发展较快，多数患者在发现的时候都是晚期。在肝癌晚期，癌细胞往往已经出现了扩散和转移，手术切除难度大，而放疗效、化疗对正常细胞、组织损伤很大，具有严重的毒副作用，治疗效果收效甚微。所以，研究对肝癌有特异性杀伤能力的抗癌药物刻不容缓。

此外，化疗是治疗肝癌的另一重要手段，但现有化疗药物的特异性识别作用还有待提高，难于避免在杀伤癌细胞的前提下不误杀正常细胞，故行业内需要一种可特异杀灭癌细胞的前提下，还不影响正常细胞，甚至还有助于提升正常细胞活性的药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种高抗癌药效、低毒副作用的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分(本发明还称为多糖硒苷-Ⅲ)。

本发明第二目的在于，提供一种所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分的制备方法。

本发明第三目的在于，提供一种所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分在制备抗肝癌药物中的应用。

本发明第四目的在于，提供一种包含所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分的抗肝癌的药物。

现有技术披露了一些平菇多糖硒苷的提取方式以及在抗氧化方面的作用，但现有技术中很少涉及平菇多糖硒苷在抗肝癌方面的作用。事实上，本发明研究发现，从平菇中提取的平菇粗多糖(多种活性成分的混合物)基本不具备抗癌活性。然而，在获知平菇粗多糖不具备抗癌活性的研究背景下，行业内没有动机从其中筛查出抗癌成分，然而，本发明人仍通过深入研究，意外地发现，从所述的平菇粗多糖分离得到的平菇多糖硒苷-Ⅲ出人意料地具有良好的抗肝癌活性，还对正常细胞具有良好的促代谢，促增殖功效，故提供以下技术方案：

本发明所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ为一种新的修饰有有机硒的多糖化合物，所述的多糖化合物为包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖中的单糖单元通过糖苷键连接得到；

水解后的多糖化合物中，葡萄糖含量为80％以上，半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸含量为1％以上；半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖各自含量不高于1％；

优选地，水解后的杂多糖化合物中，葡萄糖含量为82～84％，半乳糖含量为3～5％、甘露糖含量为2.5～3.5％、葡萄糖醛酸含量为1～2％；半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖各自含量不高于1％。

本发明研究发现，所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ具有优异的抗癌活性，不仅如此，平菇多糖硒苷-Ⅲ不但不会损伤正常细胞，还能够促进正常细胞的新陈代谢，改善正常细胞的修复和增殖。

对于抗癌药物而言，其在抑杀癌细胞的同时，免不了对正常细胞造成伤害。然而，本发明人进一步对平菇多糖硒苷-Ⅲ深入研究发现，发现其不仅具有良好的抗癌活性，还能够解决现有抗癌活性成分对正常细胞的伤害现象，不仅不会对正常细胞带来伤害，甚至还能够出人意料地在一定浓度范围内有助于促进正常细胞的新陈代谢，有助于促进正常细胞的修复和增殖。

经过单糖组分分析显示，所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ水解后的葡萄糖含量超过80％，半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸含量超过1％，而该单糖组成与现有的平菇来源的多糖或多糖衍生物均有明显差别，表明所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ是新获取的物质。

作为优选，所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分，分子量为13000～18000。

作为优选，所述的有机硒通过Se＝O和Se-C-O修饰在所述的多糖化合物中。

优选地，所述的其含硒量为24～26μg/g。

本发明所述的多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分的浓度在0-600μg/mL时，癌细胞存活率为100％-45％。在多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分浓度为600μg/mL时，癌细胞存活率为43％-47％，抑瘤率为53％-57％。

本发明还提供了所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分的制备方法，将富硒平菇粉经醇水溶液脱脂、水提、醇沉、脱蛋白得粗多糖(本发明也称为平菇粗多糖)；

将粗多糖经纤维素交换柱进行分离处理，分离过程包括依次进行的蒸馏水洗脱、0.05～0.15mol/L的氯化钠溶液洗脱、0.25～0.35mol/L的氯化钠溶液洗脱和0.45～0.55mol/L的氯化钠溶液洗脱过程；

收集0.25～0.35mol/L的氯化钠溶液的洗脱液为目标洗脱液，并进行脱盐、浓缩处理后再经葡聚糖凝胶柱纯化，即得平菇多糖硒苷-Ⅲ。

本发明所述的制备方法，通过所述的特殊的洗脱机制，可以出人意料地获得具有优异抗癌活性，且利于正常细胞新陈代谢繁殖的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分。

所述的醇水溶液脱脂过程的条件为：醇-水溶液为乙醇水溶液，且乙醇的体积分数为75～85％；回流脱脂；

醇水溶液脱脂后进行固液分离，将沉淀在水中分散提取；所述的水提的温度为80～90℃；

水提获得提取液，经浓缩后再加入乙醇，进行醇沉，固液分离得到醇沉物；

将醇沉物进行脱蛋白处理，即得粗多糖。

作为优选，所述的纤维素交换柱为DEAE-52纤维素离子交换柱。

优选地，采用透析手段对目标洗脱液进行脱盐处理。

作为优选，所述的葡聚糖凝胶柱为G-100葡聚糖凝胶柱。

本发明还提供了一种所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分的应用，用于制备抗肝癌的药物。

作为优选，所述的应用，用于制备特异性地使HepG2细胞凋亡的抗肝癌的药物。

进一步优选，所述的应用，其特征在于：用于制备特异性地使HepG2细胞凋亡，且利于正常肝细胞生长、增殖的抗肝癌的药物。

本发明制备的平菇多糖硒苷-III能够在有效杀伤癌细胞的同时不损伤正常细胞的功能，甚至还能促进正常细胞的增殖和新陈代谢，对该平菇多糖作为抗癌活性成分的研究对抗癌领域的发展具有重要意义。

所述的正常细胞优选为人源正常肝细胞L02。

本发明还提供了一种特异性促使HepG2细胞凋亡且有利于正常肝细胞生长、增殖的抗肝癌的药物，其包含所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分。

作为优选，所述的特异性促使HepG2细胞凋亡且有利于正常肝细胞生长、增殖的抗肝癌的药物，还包含将所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分制成药学上可接受的任意剂型的辅料。

所述的药学上可接受的任意剂型例如为粉针剂、胶囊、滴丸、冲剂等。

所述的多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分的抗癌活性可以通过cck-8方法进行定量分析，还可以通过AO/EB荧光染色的方法进行可视化分析。吖啶橙(AO)是一种选择性荧光阳离子染料，它能透过细胞膜，活细胞与死细胞均能被其染色。在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过完整细胞膜，将活细胞的细胞核染成均匀的绿色荧光；而凋亡细胞由于其染色质固缩或断裂为大小不等的片段，吖啶橙将细胞核染成黄绿色亮绿色荧光；死亡细胞呈橙色荧光，但荧光很弱甚至会消失。溴化乙锭(EB)只能将具有不完整细胞膜的细胞染色，AO与EB联合使用，将坏死细胞染成橙色或橙红色，但这也包括与活细胞核形态相似的且无染色质固缩的细胞。因此，AO/EB染色试剂盒可以将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。本发明通过AO/EB染色的方法，可以观测出多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分可以特异性地使HepG2细胞凋亡，而对正常细胞无明显损伤。

有益效果

1、本发明意外地发现，平菇多糖硒苷-Ⅲ不仅具有良好的抗癌活性，还能够解决现有抗癌活性成分对正常细胞的伤害现象，不仅不会对正常细胞带来伤害，相反，还能够出人意料地有助于促进正常细胞的新陈代谢，有助于促进正常细胞的修复和增殖。

2、本发明通过所述的制备方法，可以获得具有良好抗癌活性，且能够出人意料地有助于促进正常细胞的新陈代谢，有助于促进正常细胞的修复和增殖生长的平菇多糖硒苷-Ⅲ。

附图说明

图1为平菇多糖硒苷-Ⅲ组分红外光谱图(758cm^-1处的峰为Se＝O特征峰,660cm^-1的峰为Se-C-O键)

图2为平菇多糖硒苷-Ⅲ组分凝胶渗透色谱(GPC)图

图3为平菇粗硒多糖的纤维柱洗脱曲线(三个组分分别由浓度为0，0.1，0.3mol/L的氯化钠水溶液洗脱下来，分别命名为糖硒苷Ⅰ，组分Ⅱ，组分Ⅲ)

图4为平菇多糖硒苷-Ⅲ组分硒含量(ICP)

图5平菇多糖硒苷-Ⅲ水解物及参照单糖的洗脱曲线(HPLC)

图6多糖硒苷-Ⅲ的透射电镜图(TEM)

图7为平菇多糖硒苷-Ⅲ组分孵育后肝癌细胞(HepG2)的存活率

图8为平菇多糖硒苷-Ⅲ组分孵育后，经AO/EB染色后，肝癌细胞(HepG2)的荧光图片。(图片经高内涵拍摄，40×)

图9为多糖硒苷-Ⅲ孵育后，经过膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒染色之后HepG2的细胞流式图

图10为多糖硒苷-Ⅲ孵育后，HepG2细胞的划痕实验

图11平菇粗多糖孵育后肝癌细胞(HepG2)的存活率

图12平菇多糖硒苷-Ⅲ组分孵育后正常肝细胞(L02)的存活率

图13为平菇多糖硒苷-Ⅲ组分孵育后，经AO/EB染色后，肝细胞(L02)的荧光图片。(图片经高内涵拍摄，40×)

图14为多糖硒苷-Ⅲ孵育后，经过膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒染色之后L02的细胞流式图

图15为多糖硒苷-Ⅲ孵育后，L02细胞的划痕实验

图16平菇粗多糖孵育后正常肝细胞(L02)的存活率

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

(一)粗硒多糖的制备

取富硒平菇粉(湖南万臻生物科技有限公司提供)15g于圆底烧瓶中，加入80％的乙醇-水溶液120mL，65℃下搅拌回流3h，抽滤，得滤饼，干燥。

水提：取滤饼10g于烧瓶中，添加300mL超纯水，85℃下搅拌3h，离心，取上清液浓缩，得到粘稠液体。

醇沉：将粘稠液体中滴入4倍量无水乙醇，置于4℃下24h，离心，得沉淀物。

脱蛋白：将沉淀物溶于100mL的水中，加入四分之一体积的sevage试剂，离心取上清液，重复6次后用透析袋透析，冻干得到粗多糖。

(二)精制硒多糖

(2.1)离子交换柱纯化过程：选用DEAE-52纤维素离子交换柱纯化多糖，将300mg的样品溶于10mL水中，湿法上样。之后依次用蒸馏水、0.1、0.3、0.5mol/L的氯化钠溶液梯度洗脱。用苯酚-硫酸法，在490nm下隔管检测多糖含量，绘制洗脱曲线图，收集主要组分。共分离出三个组分，本发明取自0.3mol/L的氯化钠水溶液洗脱下来的组分，即组分3。

(2.2)透析：将样品-水溶液用旋转蒸发仪浓缩至10-15mL，之后用盐酸溶液调节pH至7，用去离子水透析36h，之后浓缩至5mL。

(2.3)葡聚糖柱纯化过程：选用G-100葡聚糖纯化组分3(2.2成分)，将5mL的样品湿法上样，之后用去离子水洗脱，用苯酚-硫酸法隔管检测，浓缩，冻干，得到精制平菇多糖硒苷-Ⅲ。

平菇多糖硒苷的水解及单糖组分分析：精密称取样品至5ml安培瓶中，加入2.0mL(2mol/L)三氟乙酸于5.0mL安瓿中，封管，110℃酸解8h。取出挥干三氟乙酸，加2.0ml水复溶，完成水解。后精确吸取250μL水解后溶液到5mL EP管中，加入250μL(0.6mol/L)氢氧化钠，500μL(0.4mol/L)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，在70℃反应1h。冷水中冷却10min；加入500μL(0.3mol/L)盐酸中和，再加入1mL氯仿漩涡1min，3000r/min离心10min,小心取上清，萃取3次。取上清液，完成衍生化。参照试样为含50μg/mL各对比糖的糖混合溶液，以同样条件进行衍生化。最后样品和参照品经过Xtimate C18高效液相设备在洗脱，记录洗脱曲线，通过样品与参照品的峰面积比即可计算得单糖组分(洗脱液为：0.05M pH＝6.7磷酸二氢钾溶液-乙腈＝83-17)。其单糖组分分析结果见表1和图5。

表1平菇多糖硒苷-Ⅲ组成单糖含量

采用实施例1获得的平菇多糖硒苷-Ⅲ进行以下抗癌和正常细胞毒性的研究，具体为：

实施例2

多糖硒苷-Ⅲ(实施例1获得)对人源肝癌细胞的药效实验

当HepG2细胞密度达到80-90％的时候，用胰酶消化至细胞变圆，之后加入细胞培养液终止消化。将细胞悬浮液适当稀释，并且以血球计数板计数，以每孔8000细胞的密度种板(96孔板)，将96孔板置于细胞培养箱中孵育24h。

之后将96孔板中的培养液用无血清的细胞培养液替换，在细胞培养箱中孵育24h。

用含有不同浓度的多糖硒苷-Ⅲ的细胞培养液(0μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL，600μg/mL)替代之前的无血清培基，孵育24h。并且以无细胞，单纯的细胞培养液为阴性对照组。

每孔中加入10μL的cck-8试剂，并且在共同孵育2小时后，以酶标仪在450nm处测定吸光度OD，计算细胞存活率。

细胞存活率＝(OD_实验组-OD_{阴性对照组})/(OD_空白组-OD_{阴性对照组})。

以每孔5000细胞的密度种板(96孔板)，将96孔板置于细胞培养箱中孵育24h。之后将96孔板中的培养液用无血清的细胞培养液替换，在细胞培养箱中孵育24h。用含有不同浓度的多糖硒苷-Ⅲ的细胞培养液(0μg/mL，300μg/mL，600μg/mL)替代之前的无血清培基，孵育24h。用PBS洗，并加入90μL的PBS，5μL OA溶液与5μL EB溶液，染色5min，之后用PBS洗，在高内涵下观测(AO激发488nm，发射515nm，EB激发518nm,发射605nm)。

之后通过流式细胞术来量化细胞凋亡的情况，以每孔5x10⁵的密度种板(6孔板)，孵育24h。用含有不同浓度多糖硒苷-Ⅲ药物的细胞培养液(0μg/mL，300μg/mL，600μg/mL)更新培基，孵育24h。之后以膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒染色，消化收集细胞，并且在流式细胞仪上进行检测。

划痕实验用来验证药物对细胞迁移能力的影响，以每孔1x10⁶的细胞密度接种细胞，培育24h以贴壁，之后用200μL的枪头划痕，之后以含药物的无血清培养基培养0，12h，24h，48h后，在荧光倒置显微镜下观察。

在用多糖硒苷-Ⅲ孵育HepG2细胞24h后，给药浓度为400μg/mL时，细胞存活率不足60％，即抑瘤率可以达到40％以上(如图7所示)，在给药浓度为600μg/mL时，细胞的存活率为50％左右，抑瘤率可以达到50％，这可以从正面说明多糖硒苷-Ⅲ可以有效抑制肝癌细胞。如图8所示，从AO/EB染色结果来看，未加入药物孵育的HepG2细胞未见明显凋亡信号，随着给药浓度增加，凋亡细胞明显增多，这更直观地表现了多糖硒苷-Ⅲ可以有效诱导肝癌细胞凋亡。如图9所示，当给药浓度为600μg/mL时，凋亡细胞所占比例为39.53％。如图10所示，随着给药浓度增大，划痕恢复的能力逐渐减弱，结果证明多糖硒苷-Ⅲ在一定程度上可以抑制肿瘤细胞的迁移能力。

对比例1：

平菇粗多糖(未进行过柱纯化，实施例1步骤(一)产物)对人源肝癌细胞的药效实验

当HepG2细胞密度达到80-90％的时候，用胰酶消化至细胞变圆，之后加入细胞培养液终止消化。将细胞悬浮液适当稀释，并且以血球计数板计数，以每孔8000细胞的密度种板(96孔板)，将96孔板置于细胞培养箱中孵育24h。

之后将96孔板中的培养液用无血清的细胞培养液替换，在细胞培养箱中孵育24h。

用含有不同浓度的平菇粗多糖的细胞培养液(0μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL，600μg/mL)替代之前的无血清培基，孵育24h。并且以无细胞，单纯的细胞培养液为阴性对照组。

每孔中加入10μL的cck-8试剂，并且在共同孵育2小时后，以酶标仪在450nm处测定吸光度OD，计算细胞存活率。

细胞存活率＝(OD_实验组-OD_{阴性对照组})/(OD_空白组-OD_{阴性对照组})。

如图11所示，在用平菇粗多糖孵育HepG2细胞24h后，随着给药浓度的增大，细胞存活率无明显变化，这在一定程度上证明该平菇粗多糖对肝癌细胞无明显抑制作用。

实施例3

多糖硒苷-Ⅲ(实施例1)对正常细胞的药效实验

当人正常肝细胞密度达到80-90％的时候，用胰酶消化至细胞变圆，之后加入细胞培养液终止消化。将细胞悬浮液适当稀释，并且以血球计数板计数，以每孔8000细胞的密度种板(96孔板)，将96孔板置于细胞培养箱中孵育24h。

之后将96孔板中的培养液用无血清的细胞培养液替换，在细胞培养箱中孵育24h。

用含有不同浓度的多糖硒苷-Ⅲ的细胞培养液(0μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL，600μg/mL)替代之前的无血清培基，孵育24h。并且以无细胞，单纯的细胞培养液为阴性对照组。

每孔中加入10μL的cck-8试剂，并且在共同孵育2小时后，以酶标仪在450nm处测定吸光度OD，计算细胞存活率。

细胞存活率＝(OD_实验组-OD_{阴性对照组})/(OD_空白组-OD_{阴性对照组})。

以每孔5000细胞的密度种板(96孔板)，将96孔板置于细胞培养箱中孵育24h。之后将96孔板中的培养液用无血清的细胞培养液替换，在细胞培养箱中孵育24h。用含有不同浓度的多糖硒苷-Ⅲ的细胞培养液(0μg/mL，300μg/mL，600μg/mL)替代之前的无血清培基，孵育24h。用PBS洗，并加入90μL的PBS，5μL OA溶液与5μL EB溶液，染色5min，之后用PBS洗，在高内涵下观测(AO激发488nm，发射515nm，EB激发518nm,发射605nm)。

之后通过流式细胞术来量化细胞凋亡的情况，以每孔5x10⁵的密度种板(6孔板)，孵育24h。用含有不同浓度多糖硒苷-Ⅲ药物的细胞培养液(0μg/mL，300μg/mL，600μg/mL)更新培基，孵育24h。之后以膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒染色，消化收集细胞，并且在流式细胞仪上进行检测。

划痕实验用来验证药物对细胞迁移能力的影响，以每孔1x10⁶的细胞密度接种细胞，培育24h以贴壁，之后用200μL的枪头划痕，之后以含药物的无血清培养基培养0，12h，24h，48h后，在荧光倒置显微镜下观察。

如图12所示，当用多糖硒苷-Ⅲ孵育L02正常细胞时，在给药浓度为400μg/mL时，细胞存活率可以达到150％，相对于未给药的正常细胞，细胞增殖速率大大提高。如图13所示，经过AO/EB染色后，给药浓度加大时，未见明显凋亡或死亡细胞。如图14所示，流式细胞术结果表明，在加药浓度为600μg/mL时，凋亡细胞所占比例不足4％，故证明多糖硒苷-Ⅲ对正常细胞无明显毒副作用。如图15所示，经过多糖硒苷-Ⅲ孵育的正常细胞迁移能力并未有明显改变，故该组分对正常细胞的迁移能力并未有明显影响。以上数据说明，该多糖硒苷-Ⅲ对正常肝细胞无明显损伤作用。

对比例2：

平菇粗多糖(未进行过柱纯化)对正常细胞的药效实验

当人源正常肝细胞密度达到80-90％的时候，用胰酶消化至细胞变圆，之后加入细胞培养液终止消化。将细胞悬浮液适当稀释，并且以血球计数板计数，以每孔8000细胞的密度种板(96孔板)，将96孔板置于细胞培养箱中孵育24h。

之后将96孔板中的培养液用无血清的细胞培养液替换，在细胞培养箱中孵育24h。

用含有不同浓度的平菇粗多糖的细胞培养液(0μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL，600μg/mL)替代之前的无血清培基，孵育24h。并且以无细胞，单纯的细胞培养液为阴性对照组。

每孔中加入10μL的cck-8试剂，并且在共同孵育2小时后，以酶标仪在450nm处测定吸光度OD，计算细胞存活率。

细胞存活率＝(OD_实验组-OD_{阴性对照组})/(OD_空白组-OD_{阴性对照组})。

如图16所示，在用平菇粗多糖孵育L02-正常细胞24h后，给药共同孵育后，细胞存活率无明显变化，这在一定程度上证明该平菇粗多糖对正常细胞既无抑制作用也无促进增殖的作用。

Claims (7)

1.一种平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分在制备特异性地使HepG2细胞凋亡的抗肝癌的药物中的应用，其特征在于：平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分为修饰有有机硒的杂多糖化合物；该杂多糖化合物为包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖中的单糖通过糖苷键连接得到；

水解后的杂多糖化合物中，葡萄糖含量为82~84%，半乳糖含量为3~5%、甘露糖含量为2.5~3.5%、葡萄糖醛酸含量为1~2%；半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖各自含量不高于1%；

所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分分子量为13000~18000；

所述的有机硒通过Se=O和Se-C-O修饰在所述的多糖化合物中；含硒量为24~26 μg/g；

所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分的制备步骤包括：将富硒平菇粉经醇水溶液脱脂、水提、醇沉、脱蛋白得粗多糖；所述的醇水溶液脱脂过程的条件为：醇-水溶液为乙醇水溶液，且乙醇的体积分数为75~85%；回流脱脂；醇水溶液脱脂后进行固液分离，将沉淀在水中分散提取；所述的水提的温度为80~90℃；水提获得提取液，经浓缩后再加入乙醇，进行醇沉，固液分离得到醇沉物；将醇沉物进行脱蛋白处理，即得粗多糖；

将粗多糖经纤维素交换柱进行分离处理，分离过程包括依次进行的蒸馏水洗脱、0.1mol/L的氯化钠溶液洗脱、0.3 mol/L的氯化钠溶液洗脱和0.5mol/L的氯化钠溶液洗脱过程；

收集0.3 mol/L的氯化钠溶液的洗脱液为目标洗脱液，并进行脱盐、浓缩处理后再经葡聚糖凝胶柱纯化处理即得平菇多糖硒苷-Ⅲ。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的纤维素交换柱为DEAE-52纤维素离子交换柱。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：采用透析手段对目标洗脱液进行脱盐处理。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的葡聚糖凝胶柱为G-100葡聚糖凝胶柱。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：用于制备特异性地使HepG2细胞凋亡，且不损伤正常肝细胞，甚至有利于正常肝细胞生长、增殖的抗肝癌的药物。

6.一种特异抗HepG2细胞凋亡且不损伤正常肝细胞，甚至利于正常肝细胞生长、增殖的抗肝癌的药物，其特征在于：包含权利要求1~5任一项应用所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分。

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，还包含将所述的平菇多糖硒苷-Ⅲ抗癌活性成分制成药学上可接受的任意剂型的辅料。