CN116617250A - 茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用 - Google Patents

茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116617250A
CN116617250A CN202310785092.8A CN202310785092A CN116617250A CN 116617250 A CN116617250 A CN 116617250A CN 202310785092 A CN202310785092 A CN 202310785092A CN 116617250 A CN116617250 A CN 116617250A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
atractylis lancea
gastric cancer
fermentation
rhizoma atractylodis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202310785092.8A
Other languages
English (en)
Inventor
李启照
陆松侠
李心雨
卫强
陶阿丽
冯学花
裴文清
常金贵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Xinhua University
Original Assignee
Anhui Xinhua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Xinhua University filed Critical Anhui Xinhua University
Priority to CN202310785092.8A priority Critical patent/CN116617250A/zh
Publication of CN116617250A publication Critical patent/CN116617250A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A61K36/284—Atractylodes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明属于茅苍术多糖应用技术领域，具体涉及茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用。所述茅苍术多糖的制备包括如下步骤：S1、将茅苍术洗净，烘干，粉碎过筛，得茅苍术粉末；S2、称取茅苍术粉末，于30℃恒温震荡下添加茅苍术多糖发酵菌进行发酵处理，发酵结束后，取浸提液和发酵液进行分离与纯化得到茅苍术多糖。所述茅苍术多糖被证实能够抑制PLGC细胞增殖，具有促进胃黏膜上皮细胞异常增殖凋亡，抑制胃黏膜癌变，因此，在制备预防和治疗胃癌的药品或者保健食品方面具有良好的应用前景。

Description

茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用
技术领域
本发明属于茅苍术多糖应用技术领域，具体涉及茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用。
背景技术
胃癌(GC)为常见消化系统疾病，在我国其发病率居各类肿瘤首位。检出与早期治疗及早发现预防是防止胃癌发展关键。胃癌前期多为各型胃炎如慢性萎缩性胃炎(CAG)、异性增生(Dys)、肠上皮化生(IM)等发生胃黏膜组织病理学改变。它是经过几个阶段漫长癌前过程。研究表明在癌前病变阶段有效控制疾病发展可大大降低胃癌发病率。
胃癌前病变(PLGC)阶段研究可以早识别、早诊断防治癌前病变降低死亡率，提高生存率的关键。目前，针对胃癌前病变(PLGC)阶段的治疗方法包括：手术、免疫治疗、放射治疗、化学治疗、细胞毒性治疗等方法。但这些方法在治疗中主要存在手术治疗胃癌前病变手术切除对患者身体及术后生活质量影响较大。
发明内容
为解决现有技术中现有的针对胃癌前病变(PLGC)阶段的治疗方法在治疗中存在的手术治疗胃癌前病变手术切除对患者身体及术后生活质量影响较大的问题，本发明制备了苍术多糖，研究其对胃癌Wnt/β-catenin信号通路的影响，提供了一种茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用，所述茅苍术多糖的制备包括如下步骤：
S1、将茅苍术洗净，烘干，粉碎过筛，得茅苍术粉末；
S2、称取茅苍术粉末，于28-32℃下添加茅苍术多糖发酵菌进行发酵处理，发酵结束后，将发酵液浸提，取浸提液进行离心分离、浓缩、乙醇沉淀纯化得到茅苍术多糖。
优选地，所述胃癌为胃癌前病变阶段。
优选地，所述治疗胃癌是抑制胃癌前病变阶段的细胞增殖，抑制炎症因子分泌，促进胃粘膜细胞恢复、增加胃黏膜保护因子，促进胃黏膜上皮细胞异常增殖凋亡，抑制胃黏膜癌变。
优选地，所述治疗胃癌是通过抑制MAPK/ERK信号通路中关键蛋白MLK、ERK、ElK-1、ERK-1、Raf-1的表达。
优选地，所述治疗胃癌是通过促进PLGC胃黏膜组织中c-Fos、c-Jun表达、抑制RAS蛋白激活、调控MAPK级联反应。
优选地，S2中，发酵处理时，20mL发酵液中加入茅苍术粉末0.5-1.0g。
优选地，S2中，所述茅苍术多糖发酵菌为酵母菌。
优选地，S2中，发酵处理时是将茅苍术粉末置于发酵液中进行发酵；
所述发酵液的制备包括如下步骤：
将保存的茅苍术多糖发酵菌菌种活化，于36-38℃下厌氧培养24h以上，再将其置于36-38℃厌氧发酵培养48h以上，得到发酵液。
优选地，所述产品为以茅苍术多糖作为有效成分的药品或者保健食品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供了一种茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用，是以茅苍术多糖作为有效成分制备为药品或者保健食品来用于胃癌的治疗。本发明将茅苍术多糖应用于胃癌前病变(PLGC)阶段的治疗，代替了传统的手术治疗，可以有效解决现有的针对胃癌前病变(PLGC)阶段的治疗方法在治疗中存在的手术治疗胃癌前病变手术切除对患者身体及术后生活质量影响较大的问题。在对胃癌前病变(PLGC)阶段的治疗时不需要对患者身体造成较大的影响，通过服用药品来实现治疗效果，使用方便。
2、本发明在制备茅苍术多糖的基础上，进一步探索茅苍术多糖对胃癌细胞的抑制作用。本申请具有如下优点：
(1)基于发酵对多糖成分的影响，进一步检测茅苍术多糖对胃癌细胞的抑制作用及其机制；
(2)基于发酵技术，提升茅苍术的利用效率，解决茅苍术的资源短缺难题。本实验利用发酵技术研究可提高中药茅苍术多糖提取率15-20％。
3、本发明在制备的茅苍术多糖的基础上，基于Wnt/β-catenin信号通路，对茅苍术多糖的抗胃癌机制进行了研究，证明了茅苍术多糖呈剂量相关显著抑制胃癌前病变(PLGC)阶段的细胞增殖，具有促进胃黏膜上皮细胞异常增殖凋亡，抑制胃黏膜癌变，对慢性萎缩性胃炎治疗有一定疗效，以茅苍术多糖作为有效成分在制备预防和治疗胃癌的药品或者保健食品方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为不同处理组大鼠体质量的变化。
图2为不同处理组形态学改变HE染色100，A-F份别为空白对照组、模型组、茅苍术多糖高剂量组、茅苍术多糖中剂量组、茅苍术多糖低剂量组和药物对照组。
图3为葡萄糖标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面实施例中所用材料如下：
茅苍术购自亳州中药材市场。
实验动物经安徽新华学院药学院实验动物伦理委员会审批，购于合肥长临河实验动物有限公司SPF级Wistar，6周龄，体重为180-220g，雄性，合格证号：SCXK(皖)2020-0006，购回适应饲养7d。
茅苍术多糖经安徽新华学院卫强教授鉴定，科大检测中心检测。
下面实施例中所用试剂如下：
造模剂(MNNG)甲基硝基亚硝基胍购自日本TCI、二甲苯、封闭山羊血清(上海细胞生物学研究所)；
5-氟尿嘧啶(5-FU)、苏木素染液；RPMI-1640干粉、0.25％胰蛋白酶(Sigma)；
6-SDS(solarbio)；
7-RIPA组织细胞快速崩解液(solarbio)；
8-BCA蛋白测定试剂盒(solarbio)；
9-DAB试剂盒(solarbio)；
10-注射用生理盐水(安徽丰原药业)。
下面实施例中所用仪器如下：
二氧化碳培养箱、酶标仪(ThermoForma)；
超净工作台(上海三发)；
图像定量分析仪(MIQAS)；
细胞培养瓶(BIOFIL)；
96孔板(Sunub)；
倒置显微镜(Olympus)；
微量移液器(Pipetman)；
电子天平(赛多利斯)。组织脱水机(TP1020)、切片机(德国Leica)、组织包埋机(泰维科技)；
荧光定量PCR仪(美国生物应用系统公司)；
BX51生物光学显微镜(日本OLYMPUS)。
实施例1
茅苍术多糖的制备包括如下步骤：
S1、称取502g的茅苍术，将其洗净，烘干，粉碎过40目筛，得茅苍术粉末；
S2、称取10g茅苍术粉末，于30℃恒温震荡下添加1.2g的茅苍术多糖发酵菌进行发酵处理。
其中，茅苍术多糖发酵菌为酵母菌，酵母菌购自购自上海涵乐生物科技有限公司；
发酵处理是利用茅苍术多糖发酵菌，进行发酵。发酵培养基中茅苍术的添加量为：每200mL发酵液中加入10g茅苍术粉末。详细操作如下：
(1)细菌生长曲线绘制与菌悬液制备
快速复苏上述茅苍术多糖发酵菌(酵母菌)冻存菌株，接种于25mL的MRS肉汤中，37℃厌氧培养24h。将复壮的细菌按体积比为1％接种到新的MRS肉汤中，37℃厌氧培养，每间隔2h于波长600nm处测定细菌OD值，绘制菌体生长线，确定细菌的对数生长期。离心收集培养至对数生长期的菌体，并用无菌生理盐水洗涤2-3次；重悬于生理盐水中，用血细胞计数器对细菌计数；灭菌生理盐水稀释细菌至细菌数为108个/mL，倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡10min，使菌体均匀分散成单细胞，制成茅苍术多糖发酵菌菌悬液，备用。
(2)将上述茅苍术多糖发酵菌菌悬液接入MRS肉汤，200r/min、37℃厌氧摇床培养；传3代后，按φ＝3％(菌量约4.5×108/mL)的接菌量接入100mL发酵培养基(调pH至7.4)中，200r/min、37℃厌氧发酵培养48h，得到发酵液。
(3)将上述茅苍术粉末置于发酵液中进行发酵(发酵培养基中茅苍术的添加量为：每200mL发酵液中加入10g茅苍术粉末)，于37℃厌氧发酵培养48h。
S3、发酵结束后，将发酵液过滤，所得滤液离心，取上清液真空浓缩，向浓缩液中加入乙醇浸提，取浸提液进行离心分离、浓缩、乙醇沉淀纯化得到茅苍术多糖，对发酵产物茅苍术多糖进行提取测定，测定过程包括如下步骤：
(1)Φ＝5％苯酚的制备：准确取2.5mL重蒸苯酚，加纯水定容至50mL，即稀释为φ＝5％苯酚溶液，4℃避光保存。
(2)葡萄糖标准溶液的制备：精密称取干燥至恒质量的葡萄糖10mg，用5mL蒸馏水溶解，定容至50mL，配制成0.1g/L的葡萄糖标准品溶液。
(3)标准曲线的绘制：分别取上述葡萄糖标准品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，蒸馏水定容至25mL后，各吸取1.0mL置于具塞试管中，加入φ＝5％的苯酚溶液0.5mL，摇匀，再立即加入浓硫酸2.5mL，摇匀，室温静置10min，沸水浴15min，冷却至室温后在490nm波长处测OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，制得回归标准曲线，如图3所示。
(4)茅苍术粗多糖的提取与测定：待上述所得的茅苍术多糖发酵菌菌株发酵结束后，5000r/min离心8min进行固液分离，上清液转入另一洁净器皿保存；沉淀加入200mL的蒸馏水煮沸2.0h，冷却到室温后，离心取上清液。合并两次的上清液，沸水浴中浓缩至40mL，加入3倍体积的φ＝95％乙醇，边加边搅拌，4℃静置24h，收集沉淀；将醇沉淀过夜后(时间≥12h)的上清液，于5000r/min离心10min，将两次沉淀合并。沉淀干燥后用200mL蒸馏水溶解，稀释后，取2.0mL稀释液置于具塞试管中，用苯酚-硫酸法测定茅苍术多糖的提取率。每个样品3个重复，每重复测定3次OD值，根据标准曲线计算茅苍术多糖提取率为21.26％；
(5)茅苍术多糖的分离、鉴定研究
分离条件：待待上述所得的茅苍术多糖发酵菌(酵母菌)菌株发酵结束后，5000r/min离心8min进行固液分离，上清液转入另一洁净器皿保存；沉淀加入200mL的蒸馏水煮沸2.0h，冷却到室温后，离心取上清液。合并滤液，减压浓缩，滤液4℃过夜，弃去容器底部少许沉淀物。溶液置分子量为截留分子量3500透析袋内，逆水法透析3d，透析后的溶液继续减压浓缩至40mL，用Sevag法脱蛋白，加入4倍体积的无水乙醇，置4℃下沉淀24h，离心5min，收集沉淀，-50℃，真空度5-10pa冷冻干燥得茅苍术粗多糖。
经计算，所得茅苍术粗多糖的得率可达23.25％。
茅苍术粗多糖的纯化：称取50mg上述茅苍术粗多糖溶于10mL去离子水中，加样于DEAE-52层析柱(30cm×2.5cm)中，以NaCl溶液依次梯度洗脱，分步收集。用硫酸-苯酚法检测各管多糖的含量(A490)，以收集的管数为横坐标、A490为纵坐标绘制DEAE-52色谱洗脱曲线。合并所收集的不同洗脱梯度、各洗脱峰的各管溶液、浓缩、透析、冷冻干燥，依次得到各级初步纯化组分。分别称取15mg经DEAE-52初步纯化的各级多糖组分，溶于10mL去离子水中，加样于Sephadex G-l00层析柱(60cm×2.5cm)中，用去离子水洗脱，分步收集。用硫酸-苯酚法检测各管多糖的含量(A490)，绘制Sephadex G-100色谱洗脱曲线。分别收集洗脱峰、浓缩、透析、冷冻干燥，得纯化的茅苍术多糖。
经计算，纯化后所得茅苍术多糖的纯度可达86.66％，产品纯度较高。
下面对纯化得到的茅苍术多糖进行理化性质及结构的分析，具体分析如下：
理化性质及结构的分析：用苯酚-硫酸法测定茅苍术粗多糖及其纯化，茅苍术多糖组分总糖的含量、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，初步研究粗多糖及其纯化组分的理化性质。高效液相色谱法测得的莼菜多糖中单糖组成分为鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖，按照其相对峰面积比可得单糖组分的摩尔比约为1.0∶1.0∶6.8∶2.0∶0.3∶3.0。该糖的中心链主要为葡萄糖醛酸和半乳糖，支链的边缘结构或末端残基结构为鼠李糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖，木糖则靠近主链的位置。原子力显微镜和扫描电镜可观察到莼菜多糖分子以聚合体状态呈环形网链状结构并形成凝胶，所以莼菜多糖作为富含半乳糖的酸性杂多糖具有独特的理化性质和凝胶特性。
单糖组成的分析：称取约20mg茅苍术粗多糖于20mL安瓿瓶中，加入4mol/L三氟乙酸(TFA)16mL，封管，于120℃水解2h。水解液于50℃下减压蒸干，加入4mL甲醇溶解，减压蒸干，重复3次，末次蒸干后得水解糖样。依次向水解糖样中加入20mg盐酸羟胺、10mg肌醇(内标物)、1.2mL吡啶，封口，于90℃水浴中振荡反应30min。取出冷却至室温后，加入2.0mL醋酸酐，置90℃水浴中继续反应30min，冷却，用0.45μm微孔滤膜过滤后，得茅苍术多糖样品的糖腈乙酸酯衍生物。
各单糖对照品(鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)除不水解外，在相同条件下进行糖腈乙酸酯衍生化处理，得各标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物。以HP-1(30m*0.3mm)、毛细管柱，程序升温，180-250℃；升温速度8℃/min。250℃延长8min,进样口240℃，FID检测280℃，进样体积0.4微升进行分析，计算鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖摩尔比为1.0∶1.0∶6.8∶2.0∶0.3∶3.0。
纯度及分子量测定：将已知分子量的，茅苍术粗多糖对照品用流动相配成2.0mg/mL标准溶液，用分子排阻HPLC法测定。色谱条件：TSK G PWXL柱，柱温35℃，进样量20μL流动相：0.7％硫酸钠溶液，按照0.5mL/min。对照品溶液：取右旋糖酐分子量适量，加流动相适量制成10mg/mL溶液，室温放置过夜。供试品溶液：取供试品适量加适量流动相制成10mg/mL溶液，室温放置过夜。以多糖对照品分子量的对数值为纵坐标、保留时间为横坐标作图，得多糖分子量的标准曲线。称取适量多糖样品，配制1.0mg/mL溶液，用0.45μm滤膜过滤，在相同条件下进行HPLC分析。将各样品tR代入线性方程，计算茅苍术多糖平均分子量为87000。
IR分析：测定纯化组分的IR特征。判断O-H伸缩振动吸收峰，C-H伸缩振动吸收峰，C＝O非对称伸缩振动，β-吡喃糖C-H的变角振动特征吸收峰及α,β-糖苷键。
相邻单糖基的连接方式：采用高碘酸氧化和Smith降解纯化多糖的方法纯化组分。经高碘酸氧化均有甲酸生成，计算甲酸生成量/己糖量，推断其结构中是否存在1→6键合的糖基或非还原末端糖基。红外光谱图在3378cm-1为糖OH伸缩震动的强吸收峰，且存在分子间氢键。2928cm-1为C-H伸缩振动，1645cm-1的吸收为少量羰基的吸收峰，1460～1350cm-1处的吸收峰为-OH的变形振动，表明该组分为多聚糖，1644.5、1141.5、1194.8、1337.2、1031cm-1处的吸收峰说明该多糖含糖醛酸这些吸收均为糖的特征吸收位置。
上述结果表明，利用茅苍术多糖发酵菌(酵母菌)菌株发酵得到的苍术粗多糖的得率可达23.25％，后续经过纯化后其纯度可达86.66％。凝胶渗透色谱测得分子量2.44×106。部分酸水解后单糖组成表明茅苍术多糖的中心链主要为葡萄糖醛酸和半乳糖，支链的边缘结构或末端残基结构为鼠李糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖和木糖。通过原子力显微镜和扫描电镜观察可知茅苍术多糖是呈网状交联的凝胶结构。本方法充分利用发酵工艺提高茅苍术多糖提取率，可以减少耗能，需要仪器设备简单，需要有机溶剂少，安全毒性小，适合于工业生产。
下面以实施例1制备的茅苍术多糖为例，说明其抑制PLGC细胞增殖，具有促进胃黏膜上皮细胞异常增殖凋亡，抑制胃黏膜癌变的作用。
1、实验方法
1.1动物模型建立
将80只实验鼠随机分为造模组和空白组，造模组60只、每组20只，空白组20只为一组；造模组MNNG灌胃采用0.02mol/L复制PLGC模型。于第12周、第16周观察实验鼠的胃组织病理，随机抽取模型组2只、空白组1只进行HE染色切片观察。
第16周末实验鼠出现胃黏膜上皮细胞萎缩伴肠化生病变，制模成功。将第16周末造模组实验鼠随机分为茅苍术多糖高剂量组、茅苍术多糖低剂量组及模型组。茅苍术多糖高剂量组和茅苍术多糖低剂量组分别按照22.4g/kg.d、11.2g/kg.d茅苍术多糖的标准灌胃。2次/d.空白组和模型组实验给同等剂量生理盐水，连续饲喂7周。
1.2实验标本制备
第24周末实验鼠禁水禁食24h，按照40mg/kg的2％戊巴比妥钠溶液麻醉后取血，分离血浆。取血静置2h，3000rpm离心15min，冷冻保存，酶联免疫吸附测定。制备病理切片取胃窦组织用多聚甲醛固定，制备切片。用HE染色进行免疫组化检测实验。另用无酶管取胃组织2片进行组织蛋白含量检测。
1.3实验指标检测
参照中国慢性胃炎共识中的标准量化要求，按照常规HE染色步骤染色，进行PLGC实验鼠胃黏膜组织病理学检查；按照试剂盒使用要求对实验鼠血清蛋白表达进行测定；按照蛋白提取配置和蛋白定量制备要求，利用酶标仪进行标准曲线绘制。检测实验鼠胃粘膜组织蛋白表达。
2、实验结果
2.1胃黏膜组织病理形态学改变
2.1.1实验鼠体质变化
造模组实验鼠发育延迟体重增长缓慢，皮毛无光泽，饮食减退，精神疲倦，活动性减少，便溏，脾虚。停止造模后各组食欲增加，活动性增强，体重增加。高剂量组实验鼠毛皮光亮、活动性正常，饮食状况、体重增加情况等各项指标均好与模型组。
实验结果表明：茅苍术多糖具有增强免疫、健脾和胃、散瘀消积对PLGC有较好的疗效。经统计学分析空白对照组和模型组实验差异显著具有统计学意义，实验结果见如图1。
2.1.2HE染色实验结果
观察空白组实验鼠胃黏膜无炎症反应、表面光滑、色泽红润、粘液丰富，厚薄均匀；镜下观察黏膜结构形态特征正常，保存完整，形态规则，腺体固有结构完整，无浸润及水肿，上皮细胞无异常情况出现。
造模组肉眼观察胃黏膜胃壁较薄呈现灰白色，不完整粘液较多水肿有锯齿状突起，炎症反应明显；镜下观察胃黏膜实验结果有少数颗粒状结节萎缩出现，腺体排列发生紊乱，黏膜基底发生增厚，上皮细胞结构异性改变，黏膜肌发生炎性水肿，间质发生充血水肿，胃黏膜明显萎缩伴肠上皮化出现，以上现象均表明造模基本成功。
给药组实验鼠肉眼观察各项指标均优于模型组，胃黏膜淡红，与空白组比较光泽度较差，皱襞不完整，有炎性浸润粘液多；镜下观察茅苍术多糖低剂量组胃黏膜粘膜层较模型组厚，上皮可见少量空泡细胞，高剂量组较模型组黏膜腺体组织排列紧密，萎缩情况有所减少，炎性细胞浸润萎缩减少与茅苍术多糖低剂量组比较空泡减少，优于模型组，实验结果见图2。
2.2验鼠增殖凋亡蛋白表达差异
2.2.1茅苍术多糖对实验鼠EGFR、c-Fos、Kras表达影响
经实验茅苍术多糖对实验鼠进行检验分析结果显示，实验组与空白对照组比较，模型组EGFR、c-Fos、Kras在血清含量增加明显，统计学分析差异显著(P<0.01)实验给药组与模型组EGFR、c-Fos、Kras差异显著，茅苍术多糖高低剂量组之间(P>0.05)不存在统计学意义。
表1实验鼠血清中EGFR、c-Fos、Kras含量(±s)
组别 N EGFR(ng·ml-1) c-Fos(ng·ml-1) Kras(pg·ml-1)
空白对照 20 3.58±0.36 24.25±2.49 131.66±4.58
模型组 20 8.26±0.24** 40.33±2.68** 269.38±12.47**
低剂量组 20 5.66±0.46## 32.02±2.66## 186.46±8.57##
高剂量组 20 4.96±0.48## 28.26±3.32## 168.28±13.89##
与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比#P<0.05，##P<0.01
2.2.2茅苍术多糖对实验鼠胃黏膜组织c-Jun、c-Fos、JNK的mRNA表达影响
实验经单因素方差分析，茅苍术多糖高剂量组c-Jun、c-Fos(P<0.05)基因表达下降；模型组实验鼠胃黏膜组织c-Jun、c-Fos与空白组比较(P<0.05)表达升高。茅苍术多糖低剂量组实验鼠胃黏膜组织c-Jun、c-Fos与模型组比(P>0.05)差异不显著；茅苍术多糖高剂量组JNK基因表达与模型组(P>0.05)差异不显著；模型组胃黏膜JNK基因表达与空白组表达降低(P<0.05)。
表2实验鼠胃黏膜中c-Jun、c-Fos、JNK的mRNA含量
组别 N c-Jun(ng·ml-1) c-Fos(ng·ml-1) JNK(ng·ml-1)
空白对照 20 1.24±0.86 0.95±0.59 3.66±1.58
模型组 20 9.42±7.26* 16.33±14.36* 0.88±0.47*
低剂量组 20 4.16±1.26 5.02±2.36 0.96±1.57
高剂量组 20 1.96±0.78# 2.26±1.36# 2.78±1.89#
与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比#P<0.05，##P<0.01
2.2.3 Western Blot检测茅苍术多糖对实验鼠胃黏膜组织c-Fos蛋白表达影响
实验结果表明，茅苍术多糖模型组与空白组实验鼠胃黏膜组织c-Fos蛋白表达差异水平显著(P<0.01)，茅苍术多糖高剂量组与茅苍术多糖低剂量组之间存在统计学意义。
表3实验鼠胃黏膜中c-Fos蛋白含量
组别 N c-Fos(ng·ml-1)
空白对照 20 0.28±0.08
模型组 20 0.63±0.26*
低剂量组 20 0.62±0.28
高剂量组 20 0.46±0.36#
与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比#P<0.05，##P<0.01
2.2.4免疫组化分析茅苍术多糖实验鼠胃黏膜组织Kras、c-Fos蛋白表达影响
实验通过免疫组化分析各组实验鼠胃黏膜组织c-Fos、Kras蛋白表达，经实验单因素方差分析结果显示，空白对照组与模型组比较胃黏膜c-Fos、Kras在镜下观察蛋白表达(P<0.01)差异显著上升，具有一定统计学意义。
c-Fos、Kras在茅苍术多糖给药组(包括茅苍术多糖高剂量组和茅苍术多糖低剂量组)与模型组表达下降；茅苍术多糖低剂量组c-Fos在100倍镜下((P<0.01)差异显著、在200倍镜下(P<0.05)有差异。
c-Fos茅苍术多糖高剂量组各实验鼠组与模型组在100、200倍镜下(P<0.01)均差异显著中表达呈现下降趋势，茅苍术多糖高剂量组和茅苍术多糖低剂量组均有显著统计意义，茅苍术多糖高剂量组优于茅苍术多糖低剂量组表达。
Kras给药组与实验模型组相比，表达下降，模型组、发酵茅苍术多糖低剂量组在100、200倍镜下(P>0.05)均无显著差异，模型组与发酵茅苍术多糖高剂量组在100倍镜下比(P>0.05)均无显著差异，在200倍镜下(P<0.05)有差异表达呈现下降趋势。
表4实验鼠胃黏膜中c-Fos含量测定
组别 N c-Fos(×100) c-Fos(×200)
空白对照 20 1.24±0.002 1.45±0.004
模型组 20 1.42±0.001** 1.44±0.006*
低剂量组 20 1.56±0.001## 1.52±0.002#
高剂量组 20 1.96±0.002## 1.26±0.006##
与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比#P<0.05，##P<0.01
表5实验鼠胃黏膜中Kras含量测定(x±s)
组别 N c-Fos(×100) c-Fos(×200)
空白对照 20 1.14±0.011 1.25±0.024
模型组 20 1.56±0.008** 1.74±0.016**
低剂量组 20 1.46±0.002 1.52±0.006
高剂量组 20 1.50±0.012 1.46±0.016#
与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比#P<0.05，##P<0.01
2.3实验鼠MAPK/ERK信号通路影响
2.3.1发酵茅苍术多糖对实验鼠血清MAPK/ERK信号通路MEK、p-ERK、ELK-1影响
发酵茅苍术多糖对实验鼠各组PLGC血清检测，检验后通过单因素方差分析显示，与空白对照组比较模型组实验鼠p-ERK、MEK、ELK-1血清含量明显增加，统计学(P<0.01)差异明显，发酵茅苍术多糖给药组(包括发酵茅苍术多糖高剂量组和发酵茅苍术多糖低剂量组)与模型组比较((P<0.01)差异显著，血清中p-ERK、MEK、ELK-1含量下降明显。发酵茅苍术多糖高剂量组和发酵茅苍术多糖低剂量组统计学差异(P<0.05)表现不明显。
表6实验鼠血清中MEK、p-ERK、ELK-1含量
组别 N MEK(ng·ml-1) p-ERK(pg·ml-1) ELK-1(ng·ml-1)
空白对照 20 2.74±1.86 1361.95±78.54 36.58±1.28
模型组 20 47.42±2.26** 2658.33±74.36* 58.82±3.47*
低剂量组 20 24.36±3.46## 2124.22±113.48## 50.36±2.53##
高剂量组 20 22.96±3.78## 1672.28±201.46## 52.38±4.89##
与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比#P<0.05，##P<0.01
2.3.2茅苍术多糖对实验鼠血清MAPK/ERK信号通路MEK、ElK-1、ERK、Raf-1的mRNA表达检测
茅苍术多糖对实验鼠各组PLGC胃黏膜组织MEK、ElK-1、ERK、Raf-1基因影响。检测后经单因素方差分析显示，模型组与空白对照组比较MEK、ElK-1、ERK、Raf-1表达升高(P<0.05)，茅苍术多糖高剂量组与模型组比较MEK、ElK-1、ERK、Raf-1表达下降(P<0.01)差异显著；茅苍术多糖低剂量组与模型组比较统计学(P>0.05)差异表现不明显。
表7实验鼠胃黏膜中MEK、ElK-1、ERK、Raf-1含量
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组相比#P＜0.05，##P＜0.01
2.3.3茅苍术多糖对实验鼠血清MAPK/ERK信号通路ELK-1、p-ERK的WesternBlot表达检测
茅苍术多糖对实验鼠各组PLGC胃黏膜组织MEK、ElK-1、ERK-1、Raf-1基因影响。检测后经单因素方差分析显示，模型组与空白对照组比较胃黏膜MEK、Raf-1、ERK、p-ERK蛋白表达(P<0.01)有差异，茅苍术多糖高剂量组与模型组比较ElK-1、ERK-1、Raf-1表达下降(P<0.01)差异显著；茅苍术多糖低剂量组与模型组ERK-1比较统计学(P>0.05)差异表现不明显；茅苍术多糖低剂量组与模型组ElK-1比较统计学(P<0.05)有差异。在100倍镜下空白组与模型组比较ElK-1表达(P<0.01)差异显著；茅苍术多糖高剂量组和茅苍术多糖低剂量组与模型组均显著(P<0.01)。在200倍镜下空白组与模型组比较、茅苍术多糖高剂量组和茅苍术多糖低剂量组与模型组ElK-1表达(P<0.01)均显著。
表8实验鼠胃黏膜中p-ERK蛋白含量
组别 N ELK-1(×100) ELK-1(×200)
空白对照 20 0.148±0.006 0.127±0.012
模型组 20 0.189±0.022** 0.174±0.016**
低剂量组 20 0.158±0.006## 0.156±0.008##
高剂量组 20 0.149±0.004## 0.149±0.006##
与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比#P<0.05，##P<0.01
本实验采用MNNG灌胃造模诱导胃黏膜发生炎症萎缩及肠化病变发生。模拟PLGC环境检测MAPK/ERK信号通路MLK、ERK、ElK-1、ERK-1、Raf-1关键蛋白癌基因抑制表达，探究茅苍术多糖对实验鼠各组PLGC胃黏膜组织MEK、ElK-1、ERK-1、Raf-1基因影响。
实验结果显示空白对照组胃黏膜组织结构、腺体排列结构完好，无浸润水肿现象出现，上皮细胞观察排列整齐，无萎缩变异情况发生。造模组肉眼观察胃黏膜胃壁较薄呈现灰白色，不完整粘液较多水肿有锯齿状突起，炎症反应明显；镜下观察胃黏膜出现少数颗粒状结节萎缩，腺体结构排列发生紊乱，黏膜基底增厚，上皮细胞结构异性改变，黏膜肌发生炎性水肿，间质发生淤血充血，水肿现象明显，胃黏膜出现萎缩并伴肠上皮化发生，表明实验造模基本成功。
茅苍术多糖给药组实验鼠肉眼观察各项指标均优于模型组，胃黏膜淡红，与空白组比较光泽度较差，皱襞不完整，有炎性浸润粘液多；镜下观察茅苍术多糖低剂量组胃黏膜粘膜层较模型组厚，上皮可见少量空泡细胞，茅苍术多糖高剂量组较模型组黏膜腺体组织排列紧密，萎缩情况有所减少，炎性细胞浸润萎缩减少与低剂量组比较空泡减少，优于模型组。
上述实验结果表明，茅苍术多糖通过对实验鼠各组PLGC胃黏膜组织中c-Fos、c-Jun表达、抑制RAS蛋白激活、调控MAPK级联反应，茅苍术多糖抑制胃癌细胞异常增殖，抑制炎症因子分泌，促进胃粘膜细胞恢复、增加黏膜保护因子，可抑制胃癌基因ElK-1、ERK-1蛋白激活，实验表明MAPK/ERK信号通路中关键蛋白MLK、ERK、ElK-1、ERK-1、Raf-1表达在给药组中均有明显降低。表明茅苍术多糖对PLGC细胞增殖可通过MAPK/ERK信号通路实现。从而减缓PLGC症状发生。为利用中药茅苍术发酵有效成分治疗胃癌肿瘤细胞抑制提供研究基础。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用，其特征在于，
所述茅苍术多糖的制备包括如下步骤：
S1、将茅苍术洗净，烘干，粉碎过筛，得茅苍术粉末；
S2、称取茅苍术粉末，于28-32℃下添加茅苍术多糖发酵菌进行发酵处理，发酵结束后，将发酵液浸提，取浸提液进行离心分离、浓缩、乙醇沉淀纯化得到茅苍术多糖。
2.根据权利要求1所述的茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用，其特征在于，所述胃癌为胃癌前病变阶段。
3.根据权利要求1所述的茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用，其特征在于，所述治疗胃癌是抑制胃癌前病变阶段的细胞增殖，抑制炎症因子分泌，促进胃粘膜细胞恢复、增加胃黏膜保护因子，促进胃黏膜上皮细胞异常增殖凋亡，抑制胃黏膜癌变。
4.根据权利要求1所述的茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用，其特征在于，所述治疗胃癌是通过抑制MAPK/ERK信号通路中关键蛋白MLK、ERK、ElK-1、ERK-1、Raf-1的表达。
5.根据权利要求1所述的茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用，其特征在于，所述治疗胃癌是通过促进PLGC胃黏膜组织中c-Fos、c-Jun表达、抑制RAS蛋白激活、调控MAPK级联反应。
6.根据权利要求1所述的茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用，其特征在于，S2中，发酵处理时，20mL发酵液中加入茅苍术粉末0.5-1.0g。
7.据权利要求1所述的茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用，其特征在于，S2中，所述茅苍术多糖发酵菌为酵母菌。
8.根据权利要求1所述的茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用，其特征在于，S2中，发酵处理时是将茅苍术粉末置于发酵液中进行发酵；
所述发酵液的制备包括如下步骤：
将保存的茅苍术多糖发酵菌菌种活化，于36-38℃下厌氧培养24h以上，再将其置于36-38℃厌氧发酵培养48h以上，得到发酵液。
9.根据权利要求1所述的茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用，其特征在于，所述产品为以茅苍术多糖作为有效成分的药品或者保健食品。
CN202310785092.8A 2023-06-29 2023-06-29 茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用 Withdrawn CN116617250A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310785092.8A CN116617250A (zh) 2023-06-29 2023-06-29 茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310785092.8A CN116617250A (zh) 2023-06-29 2023-06-29 茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116617250A true CN116617250A (zh) 2023-08-22

Family

ID=87602724

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310785092.8A Withdrawn CN116617250A (zh) 2023-06-29 2023-06-29 茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116617250A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112457424B (zh) 一种甘草多糖有效部位的制备方法及其应用
WO2023066163A1 (zh) 一种从德氏乳杆菌和嗜热链球菌发酵酸奶中分离出的胞外多糖及其应用
CN112274529A (zh) 一种平菇多糖硒苷-ⅲ抗癌活性成分在用于制备抗胃癌的药物中的应用
CN108864316B (zh) 一种磺酸化牡丹籽多糖及其制备治疗肝癌辅助药物中的应用
CN116617250A (zh) 茅苍术多糖在制备治疗胃癌产品中的应用
CN116284468A (zh) 一种金耳酸性多糖及其制备方法和在改善溃疡性结肠炎中的应用
CN112237588B (zh) 一种平菇多糖硒苷-ⅲ抗癌活性成分在制备抗前列腺癌的药物中的应用
CN113121716B (zh) 一种促凝血紫荆花多糖及其提取分离方法和应用
Song et al. Gastrointestinal metabolism of Astragalus membranaceus polysaccharides and its related hypoglycemic mechanism based on gut microbial transformation
CN116178575B (zh) 一种鸡枞菌多糖及其制备方法和应用
CN115716883B (zh) 一种蛹虫草中性多糖及提取方法及其应用
CN116693716B (zh) 一种金果榄多糖及其制备方法和应用
CN112274530B (zh) 一种平菇多糖硒苷-ⅲ抗癌活性成分在用于制备抗乳腺癌的药物中的应用
CN115746157B (zh) 一种美味扇菇多糖及其制备方法和用途
CN113651896B (zh) 一种狄氏副拟杆菌胞外多糖及其提取方法与应用
CN112321736B (zh) 一种平菇多糖硒苷-ⅲ抗癌活性成分及其制备和在制备抗肝癌药物中的应用
CN112315973B (zh) 一种平菇多糖硒苷-ⅲ抗癌活性成分在制备抗结肠癌的药物中的应用
CN116655820B (zh) 一种藤茶酸性多糖AGP-3a及其提取分离方法和在制备抗炎化妆品中的用途
CN107281213B (zh) 一种狗肝菜多糖制备放射性口干症药物中的应用
CN105535013A (zh) 龙须菜多糖的应用
CN117088994A (zh) 一种甘草均一多糖及其制备方法和应用
CN118546266A (zh) 落叶松中阿拉伯半乳聚糖及其衍生物的制备方法与应用
CN117924533A (zh) 戴氏虫草多糖及其应用
Lu et al. Structural characterization and anti-obesity effect of a novel water-soluble galactomannan isolated from Eurotium cristatum
CN117551214A (zh) 一种纯化槐花多糖及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20230822

WW01 Invention patent application withdrawn after publication