CN109535270A - 一种安吉白茶多糖的制备方法及其抗人巨细胞病毒的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种安吉白茶多糖的制备及其在抗人巨细胞病毒(HCMV)中的应用。本发明通过超临界CO₂萃取方法制备获得的安吉白茶多糖，具有明显的抗HCMV作用，表现为显著抑制HCMV在其体外宿主细胞——人胚肺成纤维细胞中的HCMV特征性基因IE1/2、UL44的表达，有效抑制HCMV的DNA复制，显著改善HCMV侵染后引起的细胞病变，并且自身毒性较低，从而具有制备抗HCMV药物的应用前景。

Description

一种安吉白茶多糖的制备方法及其抗人巨细胞病毒的新用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种安吉白茶多糖的制备方法及其抗人巨细胞病毒的新用途。

背景技术

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)属疱疹病毒β亚科，HCMV是世界范围内引发先天性感染最常见的病毒，在活产儿中的感染率为0.2％～2％。我国也是HCMV感染的高发地区。HCMV感染临床发病及转归受机体免疫力影响，大多数HCMV感染者无明显症状，但在孕妇、婴儿、免疫力低下的老年人及有免疫抑制的个体，可引起严重疾病，如胎儿畸形、婴幼儿CMV肝炎、CMV肺炎、多器官功能损害等。HCMV感染也是器官移植失败的重要原因之一。然而，迄今为止，HCMV感染尚无特效治疗药物，临床主要采取对症支持治疗及加强护理。临床常用抗病毒药物有膦甲酸(PFA)、更昔洛韦、西多福韦等。膦甲酸是一种广谱抗病毒药物，可有效治疗巨细胞病毒、单纯疱疹病毒感染等。研究表明，应用膦甲酸治疗期间可发生电解质紊乱、酸中毒、贫血、发热、呕吐，其他抗HCMV西药亦具有相似的不良反应，如骨髓抑制、肾毒性和引起电解质紊乱等，且连续用药往往会诱导耐药株的出现。因此目前仍缺少理想的治疗HCMV感染的药物。

安吉白茶是全国地方名茶之一，茶叶资源十分丰富。每年在生产大量高、中档茶的同时，产生大量的低档茶、粗老茶等副产物。利用好这些茶资源，将具有很高的经济价值和社会价值。近年来发现茶多糖是茶叶中继茶多酚之后发现的又一种重要的生理活性物质，具有降血糖、降血脂、抗凝血、抗血栓、降血压、耐缺氧、增加冠状动脉血流量、防辐射、增强机体免疫力、抗炎、抗癌等多种功效。同时，茶多糖无毒副作用，生物相容性好，开发前景相当广泛。开辟安吉白茶多糖新用途成为安吉白茶夏秋老叶高值化利用的重要方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种安吉白茶多糖的制备方法，以及获得的安吉白茶多糖在防治HCMV感染方面的新用途，具体而言，是提供安吉白茶多糖在制备抗HCMV药物中的应用，从而为安吉白茶的高值化利用提供新途径。

本发明采用如下的技术方案：

取安吉白茶夏秋老叶于70℃烘箱中烘干，适度粉碎后，加入无水乙醇浸没，90℃回流提取2h以脱脂。抽滤后收集残渣，于真空干燥箱中烘干后过40目筛。称取过筛后的安吉白茶粉末放入萃取釜中，设定工艺条件为：夹带剂流速：0.5mL·min^-1；CO₂流速：2L·min^-1；CO₂存储罐出口压力为5～6MPa，温度为室温25～30℃；出口阀温度：70℃。萃取时间80～100min，萃取压力20.0～35.0MPa，萃取温度65～85℃，夹带剂乙醇浓度85％～95％。提取液透析脱盐后加入3倍量无水乙醇，充分搅拌放置过夜。取沉淀加无水乙醇洗涤两次后离心烘干即得安吉白茶多糖。

本发明的生物学实验表明：

1.用HCMV侵染体外宿主细胞——人胚肺成纤维细胞WI-38，其诱导的细胞病变现象可被安吉白茶多糖显著抑制，在较高剂量下，安吉白茶多糖的效果与阳性药物膦甲酸(PFA)效果相似。

2.用HCMV侵染WI-38细胞，其特征性病毒基因包括IE1/2和UL44的蛋白表达可被安吉白茶多糖抑制，其抑制效应呈现剂量依赖性，在较高浓度下与PFA相似。

3.用HCMV侵染WI-38细胞，HCMV DNA扩增可被安吉白茶多糖显著抑制，安吉白茶多糖抑制HCMV DNA扩增的半数有效浓度(EC₅₀)为68.7μg/ml。而安吉白茶多糖本身对WI-38的毒性较低，在400μg/ml仍未观察到明显的抑制WI-38增殖的作用。

本发明采用超临界CO₂萃取方法制备获得的安吉白茶多糖，通过系统生物学研究证明，该多糖能显著抑制HCMV侵染引起的细胞病变、特征性HCMV蛋白IE1/2和UL44的表达以及HCMV的DNA扩增，并且其自身毒性较低，有望将其开发成为防治HCMV感染的药物或相关产品。

附图说明

图1：安吉白茶多糖的鉴定结果图(红外光谱)；

图2：安吉白茶多糖对HCMV侵染人胚肺成纤维细胞WI-38后细胞病变的影响

其中：1-对照组(control)，不加HCMV

2-HCMV(MOI 0.01)接种6天后(6dpi)

3-PFA(200μg/ml)+HCMV接种6天后

4-安吉白茶多糖(10μg/ml)+HCMV接种6天后

5-安吉白茶多糖(20μg/ml)+HCMV接种6天后

6-安吉白茶多糖(50μg/ml)+HCMV接种6天后

7-安吉白茶多糖(100μg/ml)+HCMV接种6天后

8-安吉白茶多糖(200μg/ml)+HCMV接种6天后

9-安吉白茶多糖(400μg/ml)+HCMV接种6天后；

图3：WesternBlot法测定安吉白茶多糖对HCMV特征性蛋白IE1/2和UL44的影响(GAPDH为内参)

其中：1-对照组(control)，不加HCMV

2-HCMV(MOI 0.01)接种3天后(3dpi)

3-PFA(200μg/ml)+HCMV接种3天后

4-安吉白茶多糖(10μg/ml)+HCMV接种3天后

5-安吉白茶多糖(20μg/ml)+HCMV接种3天后

6-安吉白茶多糖(50μg/ml)+HCMV接种3天后

7-安吉白茶多糖(100μg/ml)+HCMV接种3天后

8-安吉白茶多糖(200μg/ml)+HCMV接种3天后

9-安吉白茶多糖(400μg/ml)+HCMV接种3天后；

图4：Q-PCR法测定安吉白茶多糖对HCMV DNA扩增的影响

其中：纵坐标—HCMV DNA拷贝数相对值(2^-△△Ct法计算相对值)

横坐标：

1-对照组(control)，不加HCMV

2-HCMV(MOI 0.01)接种6天后(6dpi)

3-PFA(200μg/ml)+HCMV接种6天后

4-安吉白茶多糖(10μg/ml)+HCMV接种6天后

5-安吉白茶多糖(20μg/ml)+HCMV接种6天后

6-安吉白茶多糖(50μg/ml)+HCMV接种6天后

7-安吉白茶多糖(100μg/ml)+HCMV接种6天后

8-安吉白茶多糖(200μg/ml)+HCMV接种6天后

9-安吉白茶多糖(400μg/ml)+HCMV接种6天后；

与HCMV组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.0001

图5：安吉白茶多糖对HCMV DNA扩增的抑制率

其中：纵坐标—抑制率

横坐标—安吉白茶多糖浓度(μg/ml)；

图6：MTT法测定安吉白茶多糖对WI-38细胞增殖的影响

其中：纵坐标—细胞增殖活力(设定control为100％)

横坐标：

1-对照组(control)

2-安吉白茶多糖(10μg/ml)处理3天

3-安吉白茶多糖(20μg/ml)处理3天

4-安吉白茶多糖(50μg/ml)处理3天

5-安吉白茶多糖(100μg/ml)处理3天

6-安吉白茶多糖(200μg/ml)处理3天

7-安吉白茶多糖(400μg/ml)处理3天。

具体实施方式

本发明所涉及的人胚肺成纤维细胞株WI-38和人巨细胞病毒(HCMV)Towne株均来自于美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)。

实施例1：安吉白茶多糖的制备

取安吉白茶夏秋老叶于70度烘箱中烘干，适度粉碎后，加入无水乙醇浸没，90℃回流提取2h以脱脂。抽滤后收集残渣，于真空干燥箱中烘干后过40目筛。称取过筛后的安吉白茶粉末放入萃取釜中，设定工艺条件为：夹带剂流速：0.5mL·min^-1；CO₂流速：2L·min^-1(CO₂存储罐出口压力为5～6MPa，温度为室温25～30℃)；出口阀温度：70℃。萃取时间90min，萃取压力25.0MPa，萃取温度70℃，夹带剂乙醇浓度90％。提取液透析脱盐后加入3倍量无水乙醇，充分搅拌放置过夜。取沉淀加无水乙醇洗涤两次后离心烘干即得安吉白茶多糖。

实施例2：HCMV接种及药物处理

采用30PD的人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38，用10％FBS的培养基按2×10⁴/cm²接种至培养皿中，24小时后更换0.2％FBS的培养基继续培养48小时，通过此种血清饥饿的方法，细胞此时G0/G1同步化，更有利于HCMV的侵染。之后进行HCMV病毒(Towne病毒株)的接种，接种量为0.01MOI(感染复数)，继续培养至指定时间进行相关检测。进行抗HCMV药物活性检测时，提前2小时将一定浓度的药物加至培养基中，而后接种HCMV，进而在不同时间观察细胞形态学变化以及病毒基因和DNA扩增的变化。

实施例3：安吉白茶多糖对HCMV接种后WI-38细胞形态的影响

WI-38接种HCMV后，于第3天开始出现空斑，而后逐渐增多，在接种后第6天，细胞出现显著的病变，而安吉白茶多糖处理的细胞，随着安吉白茶多糖的浓度增加，其病变效应逐渐减弱，在较高剂量下与阳性药物膦甲酸(PFA)处理的细胞相似，没有出现显著的病变(图2)。

实施例4：安吉白茶多糖显著抑制HCMV相关蛋白表达

为进一步确认安吉白茶多糖的抗HCMV作用，我们检测了安吉白茶多糖对HCMV特征性蛋白包括立即早期蛋白1/2(IE1/2)和早期蛋白UL44的表达。细胞培养和HCMV接种方法同实施例2所述，设立不加HCMV的对照组(control)，只加HCMV组(HCMV)和多个试验组(HCMV+药物)，药物于HCMV接种前2小时加入到培养基中，于HCMV接种后3天收集细胞，进行WesternBlot检测HCMV的蛋白表达。细胞经细胞刮刀收集，采用RIPA裂解液裂解细胞后，收集蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，制备分析样品。应用相应抗体，采用Western Blot法测定HCMV立即早期蛋白IE1/2和早期蛋白UL44。结果如图3所示，HCMV的IE1/2蛋白表达(86kd，72kd)以及UL44蛋白可以被安吉白茶多糖显著抑制，其抑制作用呈现剂量依赖性，在较高剂量(200μg/ml和400μg/ml)下，其对HCMV蛋白表达的抑制作用接近于抗HCMV的阳性药物膦甲酸(PFA，200μg/ml)。

实施例5：安吉白茶多糖显著抑制HCMV在其体外宿主细胞WI-38中的DNA扩增

HCMV的接种及药物处理同实施例2。采用qPCR法测定HCMV DNA拷贝数，步骤如下：细胞培养至6天，采用Qiagen Mini-DNA Kit提取基因组DNA。取10ng总DNA，按照iQ SYBRGreen Supermix kit(Bio-Rad)试剂盒说明书进行，所用引物为：上游5′-TCTGCCAGGACATCTTTCTC-3′和下游5′GTGACCAAGGCCACGACGTT-3′。扩增条件：95℃5min，(95℃5sec+60℃30sec)×40循环。经2^-△△Ct法计算，结果如图4所示，HCMV的DNA扩增可以被安吉白茶多糖显著抑制，其抑制作用呈现剂量依赖性，在较高剂量下，其对HCMV的DNA扩增的抑制作用接近于抗HCMV的阳性药物膦甲酸(PFA，200μg/ml)。通过绘制抑制率曲线(图5)，计算获得安吉白茶多糖抑制HCMV DNA扩增的半数有效浓度(EC₅₀)为68.7μg/ml。本结果进一步确认了安吉白茶多糖的抗HCMV活性。

实施例6：MTT法测定单独安吉白茶多糖处理对WI-38细胞增殖活力的影响

WI-38细胞以每孔3000个细胞接种于96孔培养板中，培养24小时后加入不同浓度的安吉白茶多糖，每一浓度设6个平行孔，并设有不加药物的对照组。培养48小时后，每孔加入20μl 5mg/ml MTT(噻唑蓝，用无血清的DMEM培养液配制)，37℃、5％CO₂条件下培养4小时，小心吸尽孔内液体，每孔加150μl DMSO(二甲基亚砜)，在摇床上轻轻振荡10分钟，使结晶物充分溶解，而后于570nm处测定光吸收度OD₅₇₀，计算相对细胞增殖活力，以不加药物的对照组细胞的测定值为100％。结果如图6所示，安吉白茶多糖本身对WI-38的毒性较低，在400μg/ml仍未观察到明显的抑制WI-38增殖的作用(与对照组比较，P>0.05)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种安吉白茶多糖的制备方法，其特征在于使用CO₂超临界提取法，萃取时间80～100min，萃取压力20.0～35.0MPa，萃取温度65～85℃，夹带剂乙醇浓度85％～95％。

2.如权利要求1所述的一种安吉白茶多糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)取安吉白茶夏秋老叶于70℃烘箱中烘干，适度粉碎后，加入无水乙醇浸没，90℃回流提取2h以脱脂；

2)抽滤后收集残渣，于真空干燥箱中烘干后过40目筛；

3)称取过筛后的安吉白茶粉末放入萃取釜中，设定工艺条件为：夹带剂流速：0.5mL·min^-1；CO₂流速：2L·min^-1；出口阀温度：70℃；萃取时间80～100min，萃取压力20.0～35.0MPa，萃取温度65～85℃，夹带剂乙醇浓度85％～95％；

4)提取液透析脱盐后加入3倍量无水乙醇，充分搅拌放置过夜，取沉淀加无水乙醇洗涤两次后离心烘干即得安吉白茶多糖。

3.如权利要求2所述的一种安吉白茶多糖的制备方法，其特征在于步骤3)中CO₂存储罐出口压力为5～6MPa，温度为室温25～30℃。

4.如权利要求1至3中任意一项所述的安吉白茶多糖在制备抗人巨细胞病毒(HCMV)感染药物中的应用。