CN117942350A - 桑叶多糖在制备治疗或预防hcmv药物中的应用 - Google Patents
桑叶多糖在制备治疗或预防hcmv药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117942350A CN117942350A CN202410110518.4A CN202410110518A CN117942350A CN 117942350 A CN117942350 A CN 117942350A CN 202410110518 A CN202410110518 A CN 202410110518A CN 117942350 A CN117942350 A CN 117942350A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hcmv
- mulberry leaf
- polysaccharide
- use according
- leaf polysaccharide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 title claims abstract description 66
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 title claims abstract description 65
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 title claims abstract description 65
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 61
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 61
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 61
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 17
- 101710110377 Immediate early protein IE1 Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101710205425 Immediate-early protein 2 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101150104684 UL44 gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101150002378 gC gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 claims description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 24
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 abstract description 19
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 101150081727 UL32 gene Proteins 0.000 abstract description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001909 effect on DNA Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- ZJAOAACCNHFJAH-UHFFFAOYSA-N phosphonoformic acid Chemical compound OC(=O)P(O)(O)=O ZJAOAACCNHFJAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710205424 Immediate-early protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 229960005102 foscarnet Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- VWFCHDSQECPREK-LURJTMIESA-N Cidofovir Chemical compound NC=1C=CN(C[C@@H](CO)OCP(O)(O)=O)C(=O)N=1 VWFCHDSQECPREK-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229940127399 DNA Polymerase Inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 206010011891 Deafness neurosensory Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 241000218231 Moraceae Species 0.000 description 1
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 208000009966 Sensorineural Hearing Loss Diseases 0.000 description 1
- 101710183015 Trans-activating transcriptional regulatory protein Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010047601 Vitamin B1 deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010047924 Wheezing Diseases 0.000 description 1
- IWSWDOUXSCRCKW-UHFFFAOYSA-N [6,7-dimethoxy-2-[4-(oxolane-2-carbonyl)piperazin-1-yl]quinazolin-4-yl]azanium;chloride Chemical compound Cl.N=1C(N)=C2C=C(OC)C(OC)=CC2=NC=1N(CC1)CCN1C(=O)C1CCCO1 IWSWDOUXSCRCKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000002894 beriberi Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960000724 cidofovir Drugs 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000035619 diuresis Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 206010013990 dysuria Diseases 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011344 liquid material Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 231100000879 sensorineural hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 208000023573 sensorineural hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明提供了桑叶多糖在制备治疗和/或预防HCMV药物中的应用。桑叶多糖（polysaccharide from Morus alba L.MP）可以缓解人巨细胞病毒（HCMV）感染宿主细胞引起的细胞病变效应，对HCMV立即早期蛋白IE1/2，早期蛋白p52以及立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数都有显著的抑制作用，对HCMV感染具有显著的预防和治疗作用，毒副作用小，具有良好的用于开发针对HCMV感染的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体是桑叶多糖在制备治疗或预防HCMV药物中的应用。
背景技术
人巨细胞病毒(HCMV)属于β疱疹病毒家族，是一种含有包膜的双链DNA病毒，基因组大小为235kb，编码至少165种蛋白质。HCMV保持在潜伏期或低水平状态，在临床上是无法检测到，所以HCMV感染呈现无症状形式。但是HCMV感染在一些特定的高危人群中具有严重危险性，特别是在免疫功能低下的患者中，包括HIV感染者和器官移植受体患者以及老年人。同时，HCMV感染是导致新生儿缺陷的主要因素之一，也是引起感音神经性听力损失和神经功能障碍的主要原因。另外，HCMV感染也是动脉粥样硬化、冠状动脉再狭窄和炎症性肠病等疾病的重要因素。
目前，尽管在HCMV疫苗方面取得了一些进展，但是临床上还没有上市的疫苗可用。更昔洛韦，膦甲酸和西多福韦等是临床上常用的抗HCMV药物，它们都是作为病毒DNA聚合酶抑制剂用于抗HCMV的感染。但是随着耐药毒株的出现，严重降低了这些药物使用的有效性，而且这些药物还会产生明显的不良反应，如骨髓抑制、肾毒性、中性粒细胞减少、血小板减少、电解质紊乱等。因此，对人巨细胞病毒感染者进行积极有效的治疗，是提高出生人口素质和提高免疫功能低下个体生活质量的重要手段。
桑(Morus alba L.)是桑科桑属落叶乔木植物，原产我国中部，现东北至西南各省均有栽培。《本草纲目》记载“桑可以祛风湿，治风寒湿痹、脚气、浮肿，肌体风痒；根皮可以泻肺平喘、利水消肿，治肺热咳嗽、水肿喘息、小便不利”。但是到目前为止，桑叶包括其来源的活性物质多糖暂未见在制备预防和/或治疗HCMV药物中的应用。
发明内容
为了解决上述现有技术中的不足，本发明的目的是进行系列生物学实验，提供一种毒副作用小，安全有效的抑制HCMV的药物。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
本发明提供了桑叶多糖在制备治疗和/或预防HCMV药物中的应用。
所述桑叶多糖的制备方法包括如下步骤：
1)取桑叶细粉加入到三颈烧瓶中，加入石油醚，在水浴锅中加热，在70℃下回流脱脂1-2次，每次回流一小时，然后过滤干燥；回流完毕后，用布氏漏斗抽滤，将滤饼抽干，并在低温下，放入烘干箱中烘干；
2)取经过前处理后的桑叶细粉，加入蒸馏水进行提取，在90℃下提取两次；第一次提取一个半小时，第二次提取一小时，在90℃的恒温提取过程中需要用搅拌器不断搅拌，并用保鲜膜封住烧杯口；待提取液体冷却后，过滤；将过滤后的液体用旋转蒸发仪加热蒸发浓缩，浓缩至原体积的十分之一左右；将浓缩液装入500Da的透析袋中浓缩样品，将透析袋中的浓缩液进行过滤、浓缩、醇沉，将滤饼放入研钵中用红外灯烘干并称重。
所述的应用，步骤1)中桑叶细粉与石油醚的重量体积比为1:5。
所述的应用，步骤1)中烘干箱的温度为45℃。
所述的应用，步骤2)中桑叶细粉与蒸馏水的重量体积比为1:30。
所述的应用，步骤2)中醇沉时使用乙醇，浓缩液与乙醇的体积比为1:4。
桑叶多糖通过抑制HCMV立即早期蛋白IE1/2，早期蛋白p52的表达以及立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数的方式抑制HCMV复制。
本发明生物学实验的研究结果表明：
1、桑叶多糖MP单独处理HCMV宿主细胞WI-38，在1.5625μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml浓度梯度对WI-38没有表现出明显的细胞毒性，当桑叶多糖MP的浓度达到25μg/ml和50μg/ml时具有细胞毒性，100μg/ml时细胞毒性极大。
2、桑叶多糖MP在5μg/ml、10μg/ml的浓度都能明显缓解HCMV引起的WI-38细胞病变效应，浓度为2.5μg/ml时，对HCMV感染引起的细胞病变效应缓解不明显，其中10μg/ml桑叶多糖MP处理的效果与200μg/ml的阳性药物PFA效果相当。
3、桑叶多糖MP在5μg/ml、10μg/ml的浓度都能够显著抑制HCMV立即早期蛋白IE1/2以及早期蛋白p52在WI-38中的表达。显示桑叶多糖具有明显的抗HCMV作用。
4、桑叶多糖MP在5μg/ml、10μg/ml的浓度可以显著降低HCMV立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数。显示桑叶多糖具有明显的抗HCMV作用。
本发明所述的药物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂。
本发明所述的药物的制剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂，例如，片剂、粉末剂、胶囊、溶液、分散液、混悬剂、糖浆、喷雾、凝胶、乳状液、凝胶、贴片等。
本发明的有益效果如下：本发明通过系列生物学实验发现并证明，桑叶多糖MP对HCMV立即早期蛋白IE1/2，早期蛋白p52以及立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数都有显著的抑制作用，对HCMV感染具有显著的预防和治疗作用，毒副作用小，安全有效，可以用于HCMV的感染，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是CCK8法测定桑叶多糖MP对HCMV宿主细胞-人胚肺成纤维细胞(WI-38)细胞毒性的影响。其中，横坐标为桑叶多糖不同浓度梯度，设置没有桑叶多糖MP处理的Control组为1，纵坐标为各个实验组别与Control对照组相比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图2是桑叶多糖MP处理与否对HCMV感染人胚肺成纤维细胞WI-38后引起的细胞病变影响，其中，
对照组细胞(control)，不添加桑叶多糖MP处理，不感染HCMV；
HCMV组细胞是HCMV单独感染，不添加桑叶多糖MP处理；
PFA组细胞是阳性药物膦甲酸(PFA，200μg/ml)单独处理，不感染HCMV，做为阳性药物对照；
所有感染HCMV的组别都是按照MOI＝0.5的剂量进行接种，感染后五天(5dpi)进行观察并拍照，选取代表性图片。
图3是Western-blot法测定不同浓度桑叶多糖MP(2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)处理WI-38细胞对HCMV立即早期蛋白IE1/2和早期蛋白p52的影响(GAPDH为内参)；
其中图3(A)是桑叶多糖MP处理的细胞中HCMV蛋白IE1/2和p52表达水平；图3(B)是对图3(A)中结果的定量分析统计。**表示P<0.01，***表示P<0.001。
其中HCMV alone组是HCMV单独感染，不添加任何多糖或者药物处理，该组做为药物处理前后样品组的对照；
所有感染HCMV的组别都是按照MOI＝0.5的剂量进行接种，感染五天(5dpi)进行收样，提蛋白进行检测。设置HCMV alone单独感染细胞组的病毒蛋白为1，不同浓度桑叶多糖MP或药物PFA处理组与HCMV alone组相比较，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图4是qPCR法测定不同浓度桑叶多糖MP对HCMV立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数的影响。与HCMV alone单独感染细胞组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所涉及的人胚肺成纤维细胞株WI-38和人巨细胞病毒(HCMV)Towne株均来自于美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)。
实施例1桑叶多糖MP的制备
1)取90g桑叶细粉加入到三颈烧瓶中，以1：5(kg/L)的比例加入石油醚，在水浴锅中加热，在70℃下回流脱脂1-2次，每次回流一小时，然后过滤干燥。回流完毕后，用布氏漏斗抽滤，将滤饼抽干，并在低温(45℃)下，放入烘干箱中烘干。
2)取75g经过前处理后的桑叶细粉，加入蒸馏水进行提取，按照液料比为1：30(g/mL),在90℃下提取两次(加入的蒸馏水量为2250mL)。第一次提取一个半小时，第二次提取一小时，在90℃的恒温提取过程中需要用搅拌器不断搅拌，并用保鲜膜封住烧杯口；待提取液体冷却后，过滤；将过滤后的液体用旋转蒸发仪加热蒸发浓缩，浓缩至原体积的十分之一左右，浓缩液的体积约为200mL；将浓缩液装入500Da的透析袋中浓缩样品。将透析袋中的浓缩液进行过滤、浓缩、醇沉(醇沉时加入1：4比例的乙醇)，将滤饼放入研钵中用红外灯烘干并称重。
实施例2桑叶多糖MP单独处理对WI-38细胞毒性的影响
通过CCK-8法检测桑叶多糖MP对细胞毒性的影响。
测定细胞毒性方法简述如下：选择处于对数生长期的代次为30代的(PD30)人胚肺成纤维细胞WI-38细胞，经胰酶消化后进行细胞计数，然后以5000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，置于37℃，5％ CO2的培养箱中培养，待细胞长满单层后，更换为含不同浓度(0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的桑叶多糖MP的新鲜培养基，每一浓度设置3个重复孔，同时设不加多糖处理的阴性对照组和无细胞的空白对照组。继续培养5天后，每孔加入10μl CCK-8溶液，以上各种操作不要向孔中引入气泡，以免干扰后续OD值测定。置于37℃、5％ CO2条件下继续培养1-2h，而后取出来在450nm处测定光吸收度，计算细胞相对细胞活力，以不加桑叶多糖的空白组细胞活力设定为1，实验结果分析如下：细胞活力＝[OD(加多糖)-OD(空白)]/[OD(0加多糖)-OD(空白)]。桑叶多糖MP对细胞毒性影响结果见图1。
实施例3 HCMV的接种以及桑叶多糖MP处理
采用PD30的WI-38细胞，用含10％ FBS的DMEM培养基按照2×104/cm2的细胞密度铺板六孔细胞培养板，置于37℃，5％ CO2的培养箱中培养，待孔中细胞长满单层后，更换成含0.2％ FBS的DMEM培养基，继续培养48小时，通过血清饥饿的方法使细胞G0/G1期同步化，有利于后续HCMV的感染。然后按照MOI＝0.5(感染复数)的剂量进行HCMV病毒(Towne病毒株)感染，继续培养至指定时间进行相关检测。在进行桑叶多糖MP以及阳性药物磷甲酸PFA处理时，在进行HCMV感染前2小时，将不同浓度的(2.5、5、10μg/ml)桑叶多糖MP提前加至培养基中，而后再按照MOI＝0.5的剂量进行HCMV感染，最后观察桑叶多糖MP处理与否的各个组别，不同时间细胞形态学变化以及各个病毒蛋白表达和DNA拷贝数等的变化。
实施例4桑叶多糖MP预处理WI-38细胞对HCMV感染后细胞形态的影响
WI-38细胞单独HCMV(MOI＝0.5)后，三天后可以观察到HCMV单独感染组中由HCMV感染引起的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，CPE的主要特征是细胞变大变圆，细胞间的间隙增大；到第五天，这种细胞病变现象更加显著和严重，HCMV单独感染组细胞出现明显的拉网状。2.5μg/ml桑叶多糖MP预处理细胞对于缓解CPE效果不是很明显，而5、10μg/ml的桑叶多糖MP预处理细胞则能够明显减少由HCMV感染引起的CPE，特别是当桑叶多糖MP的浓度达到10μg/ml时，其对感染细胞形态保护作用的效果与阳性药物膦甲酸(PFA，200μg/ml)处理的组别类似，没有出现严重的CPE(图2)。
实施例5桑叶多糖MP预处理对HCMV病毒蛋白表达的影响
为了进一步确认桑叶多糖MP抗HCMV作用，我们在观察桑叶多糖MP预处理细胞对HCMV感染后细胞病变情况的同时，选择HCMV立即早期蛋白1/2(IE1/2)和早期蛋白p52做为检测指标，检测不同浓度(2.5、5、10μg/ml)的桑叶多糖MP预处理细胞对IE1/2和p52的表达影响。细胞培养、桑叶多糖MP处理以及HCMV接种处理同上述实施例3所述。设立不接种HCMV和无桑叶多糖MP处理的空白对照组；单独接种HCMV的HCMV alone对照组，以及不同浓度(2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)的桑叶多糖MP预处理和接种HCMV的三个实验组；同时设置阳性药物磷甲酸PFA预处理和接种HCMV的阳性药物对照组。HCMV接种的剂量为0.5MOI(感染复数)，HCMV接种后5天收集细胞样品进行病毒相关蛋白的检测。首先弃去细胞培养上清，用PBS洗细胞三次，用中等强度的RIPA裂解液(碧云天公司)裂解细胞后收集和离心样品，用BCA试剂盒测定蛋白浓度后采用相应的IE1/2和p52抗体进行Western-blot检测，结果显示桑叶多糖MP可以显著抑制HCMV病毒蛋白IE1/2和p52的表达(图3A、3B)。
实施例6桑叶多糖MP预处理对HCMV在宿主细胞中的DNA拷贝数的影响
细胞培养、多糖处理以及HCMV接种处理同上述实施例3所述。样品收集时间为HCMV感染后3天(3dpi)。采用qPCR法测定HCMV DNA的拷贝数，采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取病毒DNA，取10ng总DNA，使用2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix进行qPCR实验，所用引物如下表所示：
表1：实验所用引物名称和序列
扩增条件：95℃5min，(95℃5sec，60℃30sec)×40循环，经2-△△Ct法计算，以单独HCMV感染的样品(HCMV alone)的DNA拷贝数设置为1，结果如图4所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.桑叶多糖在制备治疗或预防HCMV药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于桑叶多糖通过对HCMV立即早期蛋白IE1/2，早期蛋白p52以及立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数的抑制来抑制HCMV。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物的制剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述桑叶多糖的制备方法包括如下步骤：
1）取桑叶细粉加入到三颈烧瓶中，加入石油醚，在水浴锅中加热，在70℃下回流脱脂1-2次，每次回流一小时，然后过滤干燥；回流完毕后，用布氏漏斗抽滤，将滤饼抽干，并在低温下，放入烘干箱中烘干；
2）取经过前处理后的桑叶细粉，加入蒸馏水进行提取，在90℃下提取两次；第一次提取一个半小时，第二次提取一小时，在90℃的恒温提取过程中需要用搅拌器不断搅拌，并用保鲜膜封住烧杯口；待提取液体冷却后，过滤；将过滤后的液体用旋转蒸发仪加热蒸发浓缩，浓缩至原体积的十分之一左右；将浓缩液装入500Da的透析袋中浓缩样品，将透析袋中的浓缩液进行过滤、浓缩、醇沉，将滤饼放入研钵中用红外灯烘干并称重。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于步骤1）中桑叶细粉与石油醚的重量体积比为1:5。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于步骤1）中烘干箱的温度为45℃。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于步骤2）中桑叶细粉与蒸馏水的重量体积比为1:30。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于步骤2）中醇沉时使用乙醇，浓缩液与乙醇的体积比为1:4。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410110518.4A CN117942350A (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | 桑叶多糖在制备治疗或预防hcmv药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410110518.4A CN117942350A (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | 桑叶多糖在制备治疗或预防hcmv药物中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117942350A true CN117942350A (zh) | 2024-04-30 |
Family
ID=90799533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410110518.4A Pending CN117942350A (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | 桑叶多糖在制备治疗或预防hcmv药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117942350A (zh) |
-
2024
- 2024-01-26 CN CN202410110518.4A patent/CN117942350A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105031625B (zh) | 一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物及其制备方法 | |
| EP3424512B1 (en) | Uses of alginic acid sulfate in preparation of drugs and health care products for preventing and treating diseases caused by human papilloma viruses | |
| CN113795258B (zh) | 抑制病毒感染的方法及组合物 | |
| CN112791084B (zh) | Ml-60218在制备用于治疗非洲猪瘟的药物中的新用途 | |
| CN106474147B (zh) | 一种预防和控制人乳头状瘤病毒感染的敷料及其制备方法 | |
| CN113521156B (zh) | 一种中药组合物在制备抗宫颈癌前病变药物中的应用 | |
| CN112274541B (zh) | 半枫荷水提物在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| WO2021218422A1 (zh) | 一种中药组合物在制备治疗或预防冠状病毒感染的药物中的应用 | |
| CN117942350A (zh) | 桑叶多糖在制备治疗或预防hcmv药物中的应用 | |
| CN108159337B (zh) | 治疗乙型或丙型病毒性肝炎的药物组合物 | |
| CN109535270B (zh) | 一种安吉白茶多糖的制备方法及其抗人巨细胞病毒的新用途 | |
| CN115105502B (zh) | 一种含千金藤属植物生物碱的化合物在制备猫传染性腹膜炎药物中的应用 | |
| WO2022143710A1 (zh) | 吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐作为抗病毒新药的用途及其药物组合物 | |
| CN117899103A (zh) | 铁线莲多糖在制备治疗或预防hcmv药物中的应用 | |
| CN112402429B (zh) | 紫堇灵在防治人巨细胞病毒感染中的新用途 | |
| CN113599412A (zh) | 党参黄芪组合物在制备预防和治疗晚期肿瘤相关症状的药物中的用途 | |
| CN106957826B (zh) | 一种病毒灭活剂及其应用 | |
| CN117982526A (zh) | 银杏叶多糖在制备治疗或预防hcmv药物中的应用 | |
| CN115869335A (zh) | 血红栓菌多糖在制备抑制hcmv感染的药物中的应用 | |
| CN117442626A (zh) | 隐丹参酮在防治人巨细胞病毒感染中的新用途 | |
| CN115381846B (zh) | 一种抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂 | |
| CN116173064A (zh) | 羊栖菜多糖在制备抗hcmv感染的药物中的应用及其制备方法 | |
| CN115137762B (zh) | 一种青钱柳提取物及其在制备抗冠状病毒的药物中的用途 | |
| CN110840969B (zh) | 一种治疗丙型肝炎的中药组合物及其应用 | |
| CN117427065A (zh) | 土木香内酯抗人巨细胞病毒的新用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |