CN112791084B - Ml-60218在制备用于治疗非洲猪瘟的药物中的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于非洲猪瘟治疗技术领域，具体涉及ML‑60218用于预防或治疗非洲猪瘟的新用途。本发明意外发现，ML‑60218能够显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白p30的表达，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的早期感染；并且ML‑60218能够显著抑制非洲猪瘟病毒的复制，降低非洲猪瘟病毒感染后的病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟。

Description

ML-60218在制备用于治疗非洲猪瘟的药物中的新用途
技术领域
本发明属于非洲猪瘟治疗技术领域，具体涉及一种ML-60218用于预防或治疗非洲猪瘟的新用途。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。2019年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，继续对养猪业构成威胁。由于至今仍无有效疫苗和特效治疗药物，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过扑杀手段进行控制，但是这种方式不仅导致经济损失，无法满足我国规模化养猪的需要。因此，如何有效控制ASF疫情是目前世界养猪业面临的巨大挑战之一，也是我国ASF防控急需解决的重大战略课题。
p30是ASFV中的关键结构蛋白，是构成病毒颗粒的主要结构蛋白，也是重要的表面抗原，与宿主细胞嗜性、致病性与免疫原性密切相关；p30表达于ASF的感染早期，通常在感染后2-4h产生，并持续表达于整个感染期间，参与病毒内化，与病毒入侵宿主细胞有关。
ML-60218，即2-氯-N-[3-(5-氯-3-甲基苯并[b]噻吩-2-基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基]-苯磺酰胺，是酿酒酵母和人RNA聚合酶Ⅲ的小分子抑制剂。在200μM时对酿酒酵母、白色念珠菌和人RNA聚合酶III的体外转录活性分别有88％、94％和90％的抑制作用。其中文献(Melchjorsen J,et al.Early Innate Recognition of Herpes Simplex Virus inHuman Primary Macrophages Is Mediated via the MDA5/MAVS-Dependent and MDA5/MAVS/RNA Polymerase III-Independent Pathways.)公开了RNA聚合酶Ⅲ抑制剂ML60218对HSV-1感染后干扰素IFN-β和TNF-α水平无抑制，即ML60218不能抑制HSV-1病毒的复制。
而本发明意外发现，ML-60218能够显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白p30的表达，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的早期感染；并且ML-60218能够显著抑制非洲猪瘟病毒的复制，降低非洲猪瘟病毒感染后病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种ML-60218用于抑制非洲猪瘟病毒感染的新用途，具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种ML-60218或其药学上可接受的盐在制备非洲猪瘟病毒p30蛋白表达抑制剂中的应用，所述ML-60218的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure GDA0003219516280000021
优选地，所述ML-60218或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
第二方面，本发明提供了一种ML-60218或其药学上可接受的盐在制备治疗非洲猪瘟药物中的应用，所述ML-60218的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure GDA0003219516280000022
优选地，所述ML-60218或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
第三方面，本发明提供了一种ML-60218或其药学上可接受的盐在制备预防非洲猪瘟药物中的应用，所述ML-60218的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure GDA0003219516280000023
优选地，所述ML-60218或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
第四方面，本发明提供了一种ML-60218或其药学上可接受的盐在制备治疗非洲猪瘟病毒早期感染药物中的应用，所述ML-60218的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure GDA0003219516280000031
优选地，所述ML-60218或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
本发明的有益效果是：本发明意外发现，ML-60218能够显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白p30的表达，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的早期感染；并且ML-60218能够显著抑制非洲猪瘟病毒的复制，降低非洲猪瘟病毒感染后病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟。
附图说明
图1非洲猪瘟病毒感染后的病毒滴度；
图2非洲猪瘟病毒感染基因拷贝数；
图3 p30蛋白表达水平结果图；
图4 ML-60218的细胞毒性结果图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
以下实施例中所述的实验细胞、病毒来源：
原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2-4月龄健康SPF巴马小型猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自PAN公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
ASFV CN/GS/2018分离株来自国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)，属于基因Ⅱ型，病毒效价为5×107TCID50/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，于2020年12月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V202096；保藏地址：中国武汉，武汉大学；联系电话：027-68752319。
ML-60218(C19H15Cl2N3O2S2)，购买于MedChemExpress公司。
实验中其他试剂如果没有特别说明均为常见的市售试剂；实验中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。
本发明中所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白表达抑制剂是指科学研究用的实验试剂。本发明所述化合物ML-60218能够抑制非洲猪瘟病毒p30蛋白的表达，可作为科学研究用的实验试剂用于研究非洲猪瘟病毒p30蛋白的相关机理。
实施例1 ML-60218对非洲猪瘟病毒感染复制和基因转录表达的影响
1.非洲猪瘟病毒感染和复制的变化
在12孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基培养猪肺泡巨噬细胞(PAM，1×106/孔)，实验组用ML-60218(50μM)处理2h后，感染ASFV CN/GS/2018毒株(0.1MOI)6h、12h、24h；对照组用DMSO(1％)处理2h后，感染ASFV CN/GS/2018毒株(0.1MOI)6h、12h、24h。收取不同处理、不同时间点的细胞及上清，-80℃反复冻融3次后作为样品，分别用无血清RPMI 1640连续10倍稀释，做7个稀释度，每个稀释度重复8个孔，接种到PAM细胞进行培养，同时加入猪红细胞；将细胞板置于37℃，5％CO2条件培养7天，每天观察各细胞培养孔中红细胞吸附反应(HAD)。计算HAD50，其计算方法参照TCID50的计算方法。
红细胞吸附反应(HAD)是基于猪源红细胞会吸附在感染非洲猪瘟病毒的单核巨噬细胞周围从而产生红细胞吸附的现象。实验结果如图1所示，感染对照组(DMSO)中HAD50值较高，而用ML-60218处理后HAD50值降低。上述结果表明，化合物ML-60218能够显著抑制ASFV的病毒滴度。
2.基因拷贝数
在12孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基培养猪肺泡巨噬细胞(PAM，1×106/孔)，实验组用ML-60218(50μM)处理2h后，感染ASFV CN/GS/2018毒株(0.1MOI)6h、12h、24h；对照组用DMSO(1％)处理2h后，感染ASFV CN/GS/2018毒株(0.1MOI)6h、12h、24h。收取不同处理、不同时间点的细胞及上清，-80℃反复冻融3次后作为样品。使用Pro Taq HS预混型探针法qPCR试剂盒(ACCURATE BIOLOGY)直接检测不同处理样品Ct值，根据标准曲线，得出基因拷贝数变化。
Q-PCR反应体系总体积25μL，包括：12.5μL的2x pro taq HS probe premix，2.5μL的上下游引物，1μL探针，2.5ul灭活毒液作为模板，补充无菌去离子水到25μL；
反应条件为：95℃，2min；95℃，7s，60℃，12s，3cycles；95℃，6s,58℃,11s,40cycles；
正向引物5’-GATACCACAAGATCAGCCGT-3’；反向引物5’-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3’；探针FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA。
基因拷贝数检测结果如图2所示，加入ML-60218的PAM细胞中的ASFV的基因拷贝数显著低于加入DMSO的细胞，说明化合物ML-60218能够抑制非洲猪瘟病毒表达和复制。
3.p30蛋白表达水平
在12孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基过夜培养猪肺泡巨噬细胞(PAM，10×106)；实验组用ML-60218(50μM)处理细胞2h后感染ASFV CN/GS/2018毒株(MOI＝0.1)；未感染对照组用DMSO(1％)处理细胞2h后感染ASFV CN/GS/2018毒株(MOI＝0.1)；将处理后的细胞继续分别培养6h、12h、24h后，收集细胞培养物，将细胞用PBS洗一遍，离心，弃上清。提取总蛋白，用western-blotting方法检测p30蛋白表达差异。
p30蛋白表达水平实验结果如图3所示，与未感染对照组(control组)相比，感染对照组(DMSO+ASFV)和实验组(ML-60218+ASFV)中ASFV p30蛋白表达水平增加；但是，相对于感染对照组(DMSO+ASFV)，实验组(ML-60218+ASFV)中ASFV p30蛋白表达水平显著降低。结果表明，ML-60218能够显著抑制非洲猪瘟病毒基因中p30的蛋白表达水平，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的早期感染。
实施例2 ML-60218的细胞毒性
利用构建的稳定体外细胞筛选体系，用CCK-8法对小分子化合物ML-60218进行细胞毒性检测。在96孔板中用RPMI 1640+10％FBS培养基培养猪肺泡巨噬细胞(PAM，2×105/孔)，过夜培养，向孔中加入不同浓度的ML-60218(12.5μM 25μM 50μM 100μM 200μM)，同时设置空白孔(仅含有培养基)，对照孔(含有细胞和培养基)，将培养板在培养箱中孵育2h后，向板的每个孔中加入10μL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱中孵育1-4h，在读取平板之前，可以在摇床上温柔的混匀。然后读取酶标仪测量450nm处的吸光度，计算细胞存活率。
结果如图4所示，ML-60218对细胞的毒性较小，安全性较好。
综上所述，本发明所述ML-60218能够显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白p30的表达，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的早期感染；并且ML-60218能够显著抑制非洲猪瘟病毒的复制，降低非洲猪瘟病毒感染后病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟。
以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。

Claims (6)

1.ML-60218或其药学上可接受的盐在制备非洲猪瘟病毒p30蛋白表达抑制剂中的应用，所述ML-60218的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003219516270000011
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ML-60218或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
3.ML-60218或其药学上可接受的盐在制备治疗非洲猪瘟药物中的应用，所述ML-60218的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003219516270000012
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述ML-60218或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
5.ML-60218或其药学上可接受的盐在制备治疗非洲猪瘟病毒早期感染药物中的应用，所述ML-60218的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003219516270000013
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述ML-60218或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
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CN114469913B (zh) * 2022-02-17 2024-03-22 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） Tilorone用于预防/治疗非洲猪瘟病毒感染的应用
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Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Effect of inhibitors of the host cell RNA polymerase II on African swine fever virus multiplication;J Salas等;《Virology》;19880531;第164卷(第1期);第280-283页 *
Effect of rifamycin derivatives and coumermycin A1 on in vitro RNA synthesis by African swine fever virus. Brief report;M L Salas等;《Archives of virology》;19831231;第77卷(第1期);第77-80页 *
Identification of a Small Molecule That Compromises the Structural Integrity of Viroplasms and Rotavirus Double-Layered Particles;Catherine Eichwald等;《Journal of Virology》;20180117;第92卷(第3期);e01943-17 *
Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells;Saskia C Stein等;《Journal of virology》;20120215;第86卷(第8期);第4527-4537页，doi: 10.1128/JVI.07071-11. *

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