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Abstract

本发明属于非洲猪瘟治疗技术领域，具体涉及亚硒酸钠(Na2SeO3)或含有亚硒酸钠的组合物用于预防或治疗非洲猪瘟的新用途。本发明首先发现，亚硒酸钠能够抑制非洲猪瘟病毒蛋白p72的表达，抑制非洲猪瘟病毒基因拷贝数和病毒滴度，能够抑制ASFV的复制和感染，用于预防或治疗非洲猪瘟；同时，本发明发现，亚硒酸钠和EGTA的组合物能够显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白p72的表达，抑制ASFV的复制和感染；并且所述组合物对ASFV的抑制效果显著优于单独使用亚硒酸钠和EGTA，可用于预防或治疗非洲猪瘟。

Description

含有亚硒酸钠的组合物在制备用于治疗非洲猪瘟的药物中的 新用途
技术领域
本发明属于非洲猪瘟治疗技术领域，具体涉及亚硒酸钠或含有亚硒酸钠的组合物用于预防或治疗非洲猪瘟的新用途。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。2019年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，继续对养猪业构成威胁。由于至今仍无有效疫苗和特效治疗药物，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过扑杀手段进行控制，但是这种方式不仅导致经济损失，无法满足我国规模化养猪的需要。因此，如何有效控制ASF疫情是目前世界养猪业面临的巨大挑战之一，也是我国ASF防控急需解决的重大战略课题。
p30和p72是ASFV中的关键结构蛋白，能够在病毒攻击易感细胞后中和病毒，抑制病毒的依附、复制及内化的过程。其中p72是一种衣壳蛋白，是非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白，能保护病毒核酸免受环境中核酸酶或其他理化因素破坏，同时参与病毒的感染过程且具有良好的免疫原性，该蛋白产生于病毒感染晚期，p72作为ASFV的重要抗原蛋白，是病毒二十面体的主要成分，对于病毒衣壳的形成至关重要，参与病毒结合细胞。
亚硒酸钠(Na2SeO3)是一种有机金属类化合物，为白色四方形棱柱体结晶或结晶性粉末。在空气中稳定，易溶于水，不溶于乙醇，不燃，受高热分解放出有毒的气体。
EGTA是一种化学物质，即乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，分子式是C14H24N2O10，是一种钙鳌合剂。其中有文献(Yang,et al.Gammaherpesvirus BoHV-4infects bovinerespiratory epithelial cells mainly at the basolateral side.)公开了在鼻腔上皮细胞顶端接种EGTA后，能够促进牛疱疹病毒4型(BoHV-4)的产生，即EGTA能够促进BoHV-4的复制。
本发明意外发现，亚硒酸钠能够抑制非洲猪瘟病毒p72的表达，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的早期感染；并且亚硒酸钠能够抑制非洲猪瘟病毒的复制，降低非洲猪瘟病毒感染后病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂，用于预防或治疗非洲猪瘟；同时，将亚硒酸钠与EGTA联合，能够显著抑制非洲猪瘟病毒p72的表达，抑制非洲猪瘟病毒的复制和感染，且其效果显著优于单独使用亚硒酸钠与EGTA。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种亚硒酸钠或含有亚硒酸钠的组合物用于抑制非洲猪瘟病毒的新用途。具体包括以下方案：
第一方面，本发明提供了一种亚硒酸钠在制备预防非洲猪瘟药物中的应用。
优选地，所述亚硒酸钠加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂的任一种剂型。
第二方面，本发明提供了一种亚硒酸钠在制备治疗非洲猪瘟药物中的应用。
优选地，所述亚硒酸钠加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂的任一种剂型。
第三方面，本发明提供了一种用于预防或治疗非洲猪瘟的药物组合物，所述药物组合物包括亚硒酸钠和EGTA或其药学上可接受的盐，所述EGTA的结构式如下式(Ⅰ)所示，
Figure GDA0003469146900000021
优选地，所述亚硒酸钠和EGTA或其药学上可接受的盐的摩尔比为6.25-400nM:0.75-48mM。
优选地，所述亚硒酸钠和EGTA或其药学上可接受的盐的摩尔比为6.25-100nM:0.75-12mM。
优选地，所述亚硒酸钠和EGTA或其药学上可接受的盐的摩尔比为20nM:6mM。
第四方面，本发明提供了一种上述第三方面所述的药物组合物在制备预防非洲猪瘟药物中的应用。
第五方面，本发明提供了一种上述第三方面所述的药物组合物在制备治疗非洲猪瘟药物中的应用。
优选地，上述第三方面所述的药物组合物加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂的任一种剂型。
本发明的有益效果是：本发明首先发现，亚硒酸钠能够抑制非洲猪瘟病毒蛋白p72的表达，抑制非洲猪瘟病毒基因拷贝数和病毒滴度，能够抑制ASFV的复制和感染，用于预防或治疗非洲猪瘟；同时，本发明发现，亚硒酸钠和EGTA的组合物能够显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白p72的表达，抑制ASFV的复制和感染；并且所述组合物对ASFV的抑制效果显著优于单独使用亚硒酸钠和EGTA，可用于预防或治疗非洲猪瘟。
附图说明
图1非洲猪瘟病毒感染基因拷贝数；
图2非洲猪瘟病毒感染后的病毒滴度；
图3非洲猪瘟病毒感染后p72蛋白表达结果图；
图4Na2SeO3和EGTA组合物的细胞毒性结果图；
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
以下实施例中所述的实验细胞、病毒来源：
原代猪骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2-4月龄健康SPF巴马小型猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自索莱宝公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自Hyclone公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS/2018来自国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)，属于基因Ⅱ型，病毒效价为5×107TCID50/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，于2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V202096；保藏地址：中国武汉，武汉大学；联系电话：027-68752319。
亚硒酸钠(Na2SeO3)购买于赛默飞公司，EGTA购买于Sigma公司。
实验中其他试剂如果没有特别说明均为常见的市售试剂；实验中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。
实施例1 Na2SeO3和EGTA对非洲猪瘟病毒感染复制和基因转录表达的影响
1.基因拷贝数
用培养基RPMI 1640(含10％FBS培养+1％双抗)将BMDM细胞铺于12孔板，过夜培养。实验组分别加入Na2SeO3(50nM)、EGTA(6mM)以及Na2SeO3(50nM)和EGTA(6mM)的组合物，对照组用DMSO(1％)处理细胞2h；然后弃掉上清，采用ASFV CN/GS/2018毒株(MOI＝0.1)同时感染两组细胞。在37℃，5％CO2条件下继续培养24h。收取细胞，在-80℃反复冻融后收集细胞培养物，离心，取上清。用Q-PCR方法检测Na2SeO3、EGTA及对Na2SeO3和EGTA的组合物对ASFV病毒复制的影响，计算ASFV病毒基因拷贝数。
Q-PCR反应体系总体积为25μL，包括2×Pro Taq HS Probe Premix12.5μL，上下游引物各1μL，ASFV探针引物1μL，模板3μL，补充无菌去离子水至总体积为25μL。
反应程序为：95℃，2min；95℃，7s，60℃，12s，3cycles；95℃，6s，58℃，11s，40cycles。
上游引物5’-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3’；下游引物5’-GATACCACAAGATCAGCCGT-3’。
基因拷贝数检测结果如图1所示，ASFV感染24h发现病毒复制能力较高；而在分别加入Na2SeO3(50nM)、EGTA(6mM)以及Na2SeO3(50nM)和EGTA(6mM)的组合物后，与Mock对照组相比，Na2SeO3和EGTA分别单独能够抑制ASFV病毒基因拷贝数；而Na2SeO3联合EGTA的抑制效果比Na2SeO3和EGTA的单独抑制效果更显著。上述结果表明Na2SeO3和EGTA联合能够显著抑制非洲猪瘟病毒基因拷贝数，抑制ASFV病毒复制。
2.非洲猪瘟病毒感染后病毒滴度检测
用培养基RPMI 1640(含10％FBS培养+1％双抗)将BMDM细胞铺于12孔板，过夜培养。实验组分别加入Na2SeO3(50nM)、EGTA(6mM)以及Na2SeO3(50nM)和EGTA(6mM)的组合物，对照组用DMSO(1％)处理细胞2h；然后弃掉上清，采用ASFV CN/GS/2018毒株(MOI＝0.1)同时感染两组细胞。在37℃，5％CO2条件下继续培养24h。按照以上不同感染时间点收取细胞，在-80℃反复冻融后收集细胞培养物，离心，取上清。然后实验组和对照组各取100μL上清，用无抗无血清的RPMI 1640培养基做连续10倍梯度稀释，共7个稀释度，接种到含有BMDM细胞的96孔板中进行培养，每个稀释度重复8个孔，独立重复实验3次。将细胞培养板置于37℃，5％CO2条件继续培养5天，每天观察各细胞培养孔中细胞病变情况，最后计算TCID50值。
病毒感染细胞会产生细胞病变，通过细胞病变数计算TCID50值。结果如图2所示，ASFV病毒感染24h可以看出，ASFV感染细胞后TCID50值较高(Mock)，而Na2SeO3和EGTA分别处理后，ASFV病毒TCID50值降低，同时Na2SeO3和EGTA联合处理后ASFV病毒TCID50值显著降低，且相较于单独使用Na2SeO3和EGTA，Na2SeO3和EGTA联合处理后ASFV病毒TCID50值也显著降低。以上结果进一步表明，Na2SeO3和EGTA联合使用能够显著的抑制ASFV病毒滴度，抑制ASFV病毒复制。
3.非洲猪瘟病毒感染p72蛋白表达水平
用培养基RPMI 1640(含10％FBS培养+1％双抗)将BMDM细胞铺于12孔板，过夜培养。实验组分别加入Na2SeO3(50nM)、EGTA(6mM)以及Na2SeO3(50nM)和EGTA(6mM)的组合物，对照组用DMSO(1％)处理细胞2h；然后弃掉上清，采用ASFV CN/GS/2018毒株(MOI＝0.1)同时感染两组细胞。在37℃，5％CO2条件下继续培养24h。按照以上不同感染时间点收取细胞，在2000rpm，4℃离心10min，弃上清收取细胞。然后采用细胞裂解液裂解细胞，置于冰上裂解30min。12000rpm，4℃离心10min，收取上清，按比例加入4×loading buffer，100℃煮沸10min，12000rpm，4℃离心10min。进行蛋白电泳。转膜后，NC膜在室温封闭2h。加入一抗抗兔P72抗体(1:1000)，内参抗兔β-actin抗体(1:5000)，4℃过夜，TBST洗膜3次，每次10min。加入二抗抗兔-HRP(1:5000)，室温1h。TBST洗膜3次，每次10min。最后采用ECL显影液曝光。
P72蛋白表达水平实验结果如图3所示，与Mock组相比，ASFV病毒感染后p72蛋白表达水平较高；而用Na2SeO3和EGTA分别处理后，p72蛋白表达降低；并且Na2SeO3和EGTA联合使用后p72表达水平显著降低。说明，Na2SeO3和EGTA联合使用能显著抑制p72表达，抑制ASFV病毒复制。
实施例2 Na2SeO3和EGTA组合物的细胞毒性
为了判定小分子化合物Na2SeO3+EGTA对原代细胞是否产生毒性或者影响细胞存活，本实验采用CCK-8法检测Na2SeO3+EGTA对细胞活率的影响。首先用培养基RPMI 1640(含10％FBS培养+1％双抗)复苏猪源骨髓巨噬细胞(BMDM)，按2×105/孔铺于96孔板过夜培养。然后向孔中加入不同浓度的EGTA(0.75mM、1.5mM、3mM、6mM、12mM、24mM、48mM)以及Na2SeO3(6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、400nM)，同时设置空白孔(仅含有培养基)，对照孔(含有细胞和培养基)，将培养板在培养箱中孵育4h后，向板的每个孔中加入10μL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱中孵育4h。读取酶标仪测量450nm处的吸光度，计算细胞存活率。
结果如图4所示，6.25-400nM的Na2SeO3与0.75-48mM的EGTA的联合对细胞活率影响较低，并且6.25-100nM的Na2SeO3与0.75-12mM的EGTA的联合对细胞几乎没有产生毒性，具有较好的安全性。
综上所述，本发明所述Na2SeO3联合EGTA能够显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白p72的表达，阻止病毒入侵宿主细胞，可用于抑制ASFV的晚期感染。并且Na2SeO3联合EGTA能够显著抑制ASFV病毒基因的拷贝数，降低非洲猪瘟病毒感染后病毒滴度，可作为非洲猪瘟病毒的抑制剂。
以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。

Claims (3)

1.药物组合物在制备治疗非洲猪瘟药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括亚硒酸钠和EGTA或其药学上可接受的盐，所述亚硒酸钠和EGTA或其药学上可接受的盐的摩尔比为6.25-400nM:0.75-48mM；所述EGTA的结构式如下式（Ⅰ），
Figure 109188DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述亚硒酸钠和EGTA或其药学上可接受的盐的摩尔比为50nM:6mM。
3.如权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，所述药物组合物加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂的任一种剂型。
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