CN117442626A - 隐丹参酮在防治人巨细胞病毒感染中的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了隐丹参酮在制备防治人巨细胞病毒(HCMV)感染的药物中的新用途。实验表明，隐丹参酮具有显著的抗HCMV的活性。隐丹参酮(1‑10μM)单独处理HCMV的体外宿主细胞‑人胚肺二倍体成纤维细胞WI‑38没有表现出显著的细胞毒性，改善HCMV感染形成的细胞病变效应，抑制HCMV特征性基因包括立即早期基因IE1/2和早期基因UL44的蛋白表达，有效抑制HCMV的DNA复制，具有制备抗HCMV药物的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体是隐丹参酮在防治人巨细胞病毒感染中的新用途。
背景技术
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)属疱疹病毒β亚科，人群普遍易感，且感染后终身带毒，感染缓解后，病毒长期潜伏在体内，形成潜伏感染，在身体免疫力低下或者器官移植病人中，容易发生继发感染，容易导致神经系统、肝脏、呼吸系统及血液系统等损伤，严重时甚至危及生命；同时，在孕妇中，HCMV的继发感染是造成新生儿先天性疾病的主要病原体，引起黄疸性肝炎、智力低下、失明、耳聋等多器官、多系统病变。因此，对人巨细胞病毒感染进行积极有效治疗，是提高出生人口素质以及提高免疫力低下老年人生活质量的重要手段。目前还没有获批的疫苗上市，临床上对症用药主要是膦甲酸钠、西多福韦、福米韦生等抗病毒药物，但是这些药物具有骨髓抑制、肾毒性和引起电解质紊乱等明显的副作用，而且还会出现耐药性，限制了其在临床上的应用。
隐丹参酮是一种从丹参的根中提取的天然化合物，但是到目前为止，还未有关于隐丹参酮在制备预防和/或治疗HCMV药物中的应用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了隐丹参酮在防治人巨细胞病毒感染中的新用途。
本发明提供了隐丹参酮在制备防治人巨细胞病毒感染药物中的新用途。
所述的隐丹参酮可显著缓解HCMV感染形成的细胞病变效应。
所述的隐丹参酮可抑制包括立即早期基因IE1/2和早期基因UL44在内的HCMV特征性基因的蛋白表达。
所述的隐丹参酮可有效抑制HCMV的DNA复制。
所述的隐丹参酮的形式包括其盐的形式以及药学上可接受的载体结合的形式。
所述的防治人巨细胞病毒感染的药物的制剂形式为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶囊、缓释剂、滴丸剂或注射剂。
本发明采用商品化的隐丹参酮，进行了系列的生物学实验，为隐丹参酮防治人巨细胞病毒感染的新用途提供了理论依据。
生物学实验研究的结果表明：
1、隐丹参酮单独处理HCMV宿主细胞-人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38在0-10μM没有表现出明显的细胞毒性。
2、隐丹参酮具有良好的抗HCMV的作用，具体表现为，在0-10μM可以显著缓解HCMV感染形成的细胞病变效应，显著抑制立即早期蛋白IE1/2和早期蛋白UL44的表达；同时抑制HCMV的核酸复制。
本发明的有益效果如下：本发明通过系列的生物学实验发现并证明，隐丹参酮在没有明显细胞毒性的剂量下具有显著的抗HCMV的作用，安全有效，有望将其开发为防治HCMV的药物。
附图说明
图1：MTT法测定隐丹参酮对WI-38细胞活力的影响。
其中：纵坐标-细胞活力(设置对照组为1)
横坐标：1-DMSO单独处理2天(Control)
2-隐丹参酮(1μM)单独处理2天
3-隐丹参酮(2μM)单独处理2天
4-隐丹参酮(5μM)单独处理2天
5-隐丹参酮(10μM)单独处理2天
图2：不同浓度隐丹参酮处理对人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38的影响以及HCMV感染对细胞病变的影响。
其中：1-隐丹参酮(1μM)单独处理5天
2-隐丹参酮(5μM)单独处理5天
3-隐丹参酮(10μM)单独处理5天
4-DMSO单独处理5天(Control)
5-隐丹参酮(1μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
6-隐丹参酮(5μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
7-隐丹参酮(10μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
8-DMSO+HCMV(MOI 0.01)接种5天(Control)
图3：Western-blot法检测隐丹参酮对HCMV立即早期蛋白IE1/2和早期蛋白UL44的影响(GAPDH为内参)。
其中：1-膦甲酸钠(200μg/ml)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
2-DMSO+HCMV(MOI 0.01)接种5天
3-隐丹参酮(1μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
4-隐丹参酮(2μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
5-隐丹参酮(5μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
6-隐丹参酮(10μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
7-无隐丹参酮和无HCMV接种5天
图4：IFA法检测隐丹参酮对HCMV立即早期蛋白IE1/2表达的影响。
其中：1-DMSO+HCMV(MOI 0.01)接种5天
2-隐丹参酮(1μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
3-隐丹参酮(5μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
4-隐丹参酮(10μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
5-膦甲酸钠(200μg/ml)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
图5：qPCR法检测隐丹参酮对HCMV DNA扩增的影响。
其中：1-DMSO+HCMV(MOI 0.01)接种5天
2-膦甲酸钠(200μg/ml)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
3-隐丹参酮(1μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
4-隐丹参酮(5μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
5-隐丹参酮(10μM)+HCMV(MOI 0.01)接种5天
**P<0.01，与阳性对照组比较
具体实施方式
本发明所涉及的人胚肺二倍体成纤维细胞株WI-38和人巨细胞病毒(HCMV)Towne株均来自于美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)。
实施例1隐丹参酮单独处理对WI-38细胞增殖活力的影响
通过MTT法检测细胞活力，方法如下：PD30的人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38以每孔3000个的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，培养24h后加入不同浓度的隐丹参酮，每一浓度设3个平行孔，并设不加药物的空白对照组和无细胞的溶剂对照组。在培养箱培养48小时后，每孔加入20μlMTT(5mg/ml，用无血清的DMEM培养液配制)，37℃、5％CO2条件下继续培养4h，然后吸净细胞培养孔内的液体，每孔加150μl DMSO，在摇床上轻轻振荡10min，使结晶物充分溶解，而后于570nm处测定光吸收度，计算相对细胞活力，以不加药物的空白对照组细胞活力为100％。实验结果见图1。
实施例2隐丹参酮处理以及HCMV的接种
采用PD30的人胚肺成纤维细胞WI-38细胞，用含10％FBS的培养基按照2×104/cm2的细胞量铺板六孔细胞培养板，24小时后更换0.2％FBS的培养基继续培养48小时，通过血清饥饿的方法，使其细胞周期G0/G1同步化，利于HCMV的感染。之后进行HCMV病毒(Towne病毒株)的接种，接种剂量为0.01MOI(感染复数)，继续培养至指定时间进行相关检测。进行隐丹参酮抗HCMV活性检测时，提前2小时将一定浓度的隐丹参酮加至培养基中，而后接种HCMV(MOI 0.01)，进而观察不同时间细胞形态学变化以及病毒蛋白表达和DNA扩增等的变化。
实施例3隐丹参酮单独处理以及接种HCMV后对WI-38细胞形态的影响
WI-38细胞以每孔2ⅹ104的细胞密度接种于6孔板中，处理方式按照实施例2进行，以DMSO为对照组，观察不同浓度隐丹参酮(1μM、5μM、10μM)对细胞形态的影响；同时，设置添加药物并且接种HCMV(MOI 0.01)的组别，观察隐丹参酮对HCMV感染后细胞病变的改善作用。接种HCMV(MOI 0.01)后，三天后可以看到细胞的病变效应，到第五天，病变现象显著；而不同浓度的隐丹参酮能够显著降低由HCMV引起的细胞病变效应，而且具有明显的剂量依赖性，特别是10μM的隐丹参酮处理后再接种HCMV，几乎没有表现出细胞病变效应(图2)。
实施例4Western-blot检测隐丹参酮对HCMV病毒蛋白表达的影响
为了确认隐丹参酮的抗HCMV作用，我们检测了隐丹参酮对HCMV立即早期蛋白IE1/2和早期蛋白UL44的表达影响，细胞培养和隐丹参酮处理以及HCMV接种如上述实施例2。设立不接种HCMV和没有隐丹参酮处理的空白对照组(Blank Control)，只接种HCMV和没有隐丹参酮处理的阳性对照(Positive Control)，接种HCMV和临床用膦甲酸钠(200μg/ml)处理的药物对照组，以及不同浓度隐丹参酮(1μM、2μM、5μM、10μM)处理和接种HCMV的实验组。接种HCMV后5天，弃去上清，用PBS洗细胞三次，用中等强度的RIPA裂解液裂解细胞后收集细胞样品，用BCA试剂盒测定蛋白浓度后采用相应的IE1/2和UL44抗体进行Western-blot检测，结果显示隐丹参酮可以显著抑制HCMV病毒蛋白IE1/2和UL44的表达，特别是浓度达到5μM和10μM时，并且具有剂量依赖性(图3)。
实施例5间接免疫荧光法(IFA)检测隐丹参酮对HCMV病毒蛋白表达的影响
具体实施方法如上述实施例4，在药物处理和HCMV接种后5天，弃去上清，用PBS洗细胞三次，用预冷的甲醇丙酮(1:1)在-20℃固定20分钟，然后弃去固定液，放置通风橱中自然晾干。用针对IE1/2蛋白的抗体进行常规IFA操作，然后在倒置荧光显微镜下观察拍照，结果显示，隐丹参酮能够显著降低HCMV立即早期蛋白IE1/2的表达，并且具有剂量依赖性(图4)。
实施例6qPCR测定隐丹参酮对HCMV DNA拷贝数的影响
细胞培养、药物处理以及HCMV接种处理同上述实施例2所述。采用qPCR法测定HCMVDNA的拷贝数，取10ng总DNA，按照iQ SYBR Green Supermix kit(Bio-Rad)试剂盒说明进行，所用引物为：上游5′-TCTGCCAGGACATCTTTCTC-3′和下游5′-GTGACCAAGGCCACGACGTT-3′。扩增条件：95℃5min，(95℃5sec，60℃30sec)×40循环，经2-△△Ct法计算，结果显示，隐丹参酮能够显著抑制病毒DNA的拷贝数，特别是10μM浓度，其抑制效果与临床用药膦甲酸钠相当(图5)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.隐丹参酮在制备防治人巨细胞病毒感染药物中的新用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于隐丹参酮可显著缓解HCMV感染形成的细胞病变效应。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于隐丹参酮可抑制包括立即早期基因IE1/2和早期基因UL44在内的HCMV特征性基因的蛋白表达。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于隐丹参酮可有效抑制HCMV的DNA复制。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的隐丹参酮的形式包括其盐的形式以及药学上可接受的载体结合的形式。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的防治人巨细胞病毒感染的药物的制剂形式为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶囊、缓释剂、滴丸剂或注射剂。
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