CN104353058A - 商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂及其制备方法和应用，特别是在治疗和预防HPV病毒感染及其相关疾病中的应用。商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂包括商陆抗病毒蛋白冻干粉和溶解液；其中商陆抗病毒蛋白冻干粉组分包括商陆抗病毒蛋白、商陆皂甙、多糖、虫草素；溶解液组分包括水、乙醇、磷酸盐、甘油、薄荷醇和防腐剂。本发明使用商陆抗病毒蛋白作为主要成份制成的复合剂，能有效治疗HPV病毒感染，预防宫颈癌和阴茎癌，对由HPV病毒感染引发的宫颈上皮细胞瘤变(CIN)、宫颈糜烂、宫颈息肉和宫颈肥大等疾病具有显著疗效，具有良好的临床应用前景。

Description

商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，更具体地说，涉及商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂及其制备方法，以及在治疗和预防HPV感染及其相关疾病中的应用。 

背景技术

1、HPV病毒形态、基因图谱与功能 

人乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)1949年由Strauss在电镜下发现。病毒粒子呈球形，20面体对称，直径45-55nm，属双链闭环的小DNA病毒，无病毒包膜，约8000个碱基对，是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性。绝大多数HPV病毒基因组含有8个开放阅读框架，依其功能分为3个区域： 

(1)非编码调控区(约400-1000bp)，其功能为调控病毒的复制和基因转录； 

(2)早期表达基因编码区，编码6个早期表达病毒蛋白((E1,E2,E4,E5,E6,和E7),其功能与病毒复制和肿瘤发生有关； 

(3)晚期表达基因编码区，其编码病毒衣壳主要结构蛋白(L1)及次要蛋白(L2) 

2、HPV病毒分型的方法和依据 

HPV病毒是一组DNA肿瘤病毒(Papillomaviridea)，人乳头瘤病毒是该组病毒家族中一个成员。依据基因组DNA序列的各异，将人乳头瘤病毒(HPV)分为多种型别。随着人类对HPV病毒感染相关疾病认识的不断深入，其中HPV 病毒DNA序列分析技术已是HPV病毒分型的主要方法和依据。目前已经确定的HPV型别大约有100余种，大约35种型别可感染女性生殖道，约20种与肿瘤相关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低，HPV被分为低危型别和高危型别。其中15种型别被鉴定为高危型HPV病毒，其与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CIN II/III)的发生相关，尤以HPV16和18型为甚；3种被鉴定为疑似高危型HPV病毒；12种被鉴定为低危型HPV病毒，包括HPV6、11、42、43、44等型别，这些型别的HPV常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CIN I)；3种HPV病毒致病危险程度未定。HPV病毒新型别的确定，其L1基因DNA序列与目前已知各型别HPV L1基因DNA序列的同源性不会超过90％。如果新发现的HPV病毒DNA序列与已知的HPV某一型别的DNA序列同源性介于90-98％之间，可将其再细分亚型。 

3、HPV病毒感染的宿主特异性 

HPV病毒感染对宿主细胞的选择特异，目前发现HPV病毒的感染宿主范围主要限制在复层鳞状上皮的基底膜细胞，并也仅在复层鳞状上皮组织进行病毒复制。 

宫颈上皮是由宫颈阴道部复层鳞状上皮与宫颈管柱状上皮共同组成，两者交接部位在宫颈外口，称原始鳞-柱交接部或鳞柱交界。复层鳞状上皮组织分别由角质层、透明层、颗粒层、棘细胞层和基底层构成，基底模细胞是HPV病毒的宿主细胞，病毒在此细胞内复制、表达、包装、释放。 

4、HPV病毒感染及进入宿主细胞的机制 

HPV病毒是经黏膜、皮肤的擦伤或微小伤口感染进入鳞状上皮基底细胞层的。HPV病毒粒子衣壳L1蛋白首先与细胞外基质和基底膜表面的HSPG受体结合。结合之后，HPV病毒粒子衣壳L2蛋白的N端前蛋白转化酶酶切位点裸露，并被弗林蛋白酶或PC5/6水解，致使L1蛋白构象发生变化，其与宿主细胞 表面的未知的第二受体结合后，通过胞吞作用进入基底细胞，2-4小时进入早期内涵体，8-12小时进入晚期内涵体并脱掉病毒衣壳，病毒基因组DNA需在L2蛋白的参与下从晚期内涵体释放，24小时后病毒DNA-L2蛋白进入宿主细胞核开始复制。然后随着基底细胞的分化成熟向表层移动，细胞内病毒衣壳蛋白表达并包装病毒DNA形成完整的病毒颗粒，修饰后可释放到上皮表面，经密切接触可传与他人或从角化层表面脱落播散到周围环境中。 

5、高危HPV病毒感染宫颈组织的主要方式 

高危HPV病毒感染宫颈组织主要有以下几种方式： 

(1)活动性感染(Active Infection)，病毒感染宿主细胞后，在宿主细胞核内完成病毒的复制、表达、包装、释放等全部遗传过程。 

一般基底层细胞和副基底层细胞均保持着低水平病毒DNA拷贝数。在细胞周期中需要最低水平的病毒早期蛋白的表达。研究证实，由E7蛋白诱导产生的PCDNA是可靠的HPV病毒感染指示器。临床上，免疫抑制的病人会出现HPV病毒高度活跃的现象，这是因为患者丧失了通过细胞免疫清除被病毒感染细胞的功能。 

(2)潜伏性感染(Latent Infection)：病毒不形成病毒颗粒，而是以其DNA整合到宿主细胞基因组DNA的方式完成病毒的遗传过程。由于其不断刺激、干扰细胞基因组的正常性质和功能，又不受细胞基因组调控系统的调控，最终导致宿主细胞基因组发生癌变，导致癌症的发生。 

HPV的潜伏性感染可不表现任何临床症状，细胞形态也正常，不能通过细胞学或组织学方式进行诊断，但可以通过DNA检查得到证实。HPV感染生殖道是一个长期的过程，可潜伏在细胞内若干年，一旦机体免疫力降低，潜伏的病毒可恢复活动(Re-active),转变为活动性感染。 

HPV病毒潜伏性感染，病毒DNA和RNA的量均非常少。通过PCR检测病毒DNA和RT-PCR分析检测病毒RNA发现，HPV病毒能够完全在细胞或组织中呈亚临床状态。潜伏性感染大多情况下是建立在个别细胞感染的基础之上，当宿主基底细胞分裂时，HPV病毒必须进行复制，以保持在这些细胞中病毒基因组的拷贝数最低。病毒DNA复制，需要E1和E2蛋白，同时也需要E6和E7蛋白参与。当基底细胞脱离，细胞周期恢复静止状态后，就不需要早期病毒基因的表达了。这种极低水平的病毒基因表达，可能是HPV病毒自身，为了尽量减少其存在的证据，以便逃脱宿主免疫系统监视的方法和策略。 

(3)肿瘤发生 

在HPV病毒复制过程中，其病毒致癌基因蛋白破坏了宿主细胞周期调控蛋白，导致肿瘤的发生。HPV病毒为了存活与扩增，其致癌基因在基底层细胞持续高度表达，导致细胞生长周期过度和宿主有害基因突变。任何型别的高危型HPV持续性感染均能增加不良增生发生的风险。病毒DNA片段整合到宿主染色体上，经常导致早期肿瘤病变的发生，而此种病变发生的速度要比完整的HPV病毒DNA导致病变的速度快。 

(4)与HPV感染相关的生殖器癌症 

肿瘤的发生进一步发展能导致侵润性和转移性癌症。这一时期，HPV病毒基因组通常整合宿主细胞染色体中。研究证实，HPV18DNA能优先整合到c-myc附近区域。病毒整合位点一般在E1或E2基因序列中，整合之后，该基因即被破坏，病毒下游部分基因序列被切除，包含E5基因和早期poly-A位点。HPVE2基因DNA结合区域的持续性切除，导致P1启动子负调控反馈丧失和E6和E7RNA转录过度表达。将病毒基因组下游早期poly-A位点的切除后，病毒mRNA就成为了杂合子，转录扩展到宿主DNA侧端的poly-A序列。生长最快的肿瘤细胞，E6和E7转录保持非常高的水平。令人惊奇的是，体外分析宫颈癌细胞株，感染永生化的角质细胞的HPV16或HPV18病毒，只发现一个 HPV病毒基因组拷贝，或从缺失杂合一侧的HPV病毒同基因拷贝被转录。也就是说，无论有多少病毒基因组拷贝整合在多少个宿主染色体位点上，整合的HPV病毒基因组，只有其下游区域拷贝，因其E2基因被镶嵌破坏，致使缺失功能的E2或E2相关蛋白表达，而余下整个上游病毒DNA拷贝则被甲基化，致使基因沉默。此外，HPV病毒早期基因的表达被损伤或系统免疫抑制所正调控。通过细胞周期过度表达和干扰P53功能，导致细胞突变的积累或染色体变异。实际上，宫颈癌细胞株连续表达病毒致癌蛋白E6和E7，能关闭P1启动子，导致细胞衰老或细胞凋亡。 

6、高危HPV病毒感染是引发宫颈癌的必要条件 

宫颈癌是女性生殖道系统常见的恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第二位，近年来呈现高发病率、低龄化等特点，已严重危害妇女的健康与生命。世界卫生组织(WHO)统计资料表明，每年全球大约有50万例新发宫颈癌病例，20多万人死于宫颈癌，其中，80％的死亡发生在发展中国家。高危型HPV病毒感染是宫颈癌发生的主要因素,90％以上宫颈癌是由HPV感染引起。国际癌症研究中心明确提出高危HPV感染是宫颈癌致病的必要条件。因此，对高危HPV筛查，对预防和治疗宫颈癌有着十分重要的意义。在发达国家已将此项检查列为常规普查项目，建议三年以上性生活的女性均应进行该项检测。尽管目前妇科医生已经了解HPV分型检测对诊断和预防宫颈癌的意义，发达国家还建立了完善的宫颈癌筛查制度，但临床上缺乏有效的预防治疗药物。在我国市场上目前还没有直接清除杀灭HPV病毒的理想药物。 

HPV病毒感染主要通过性生活传播，可在性伴侣之间通过性生活交叉感染，年轻性活跃妇女的感染率最高，约80％的女性在自己的一生当中会感染一种或者多种HPV病毒，早婚早育、有流产史、性病史、拥有多名性伴侣的女性，都是HPV病毒易感人群。有资料表明，有多个性伴侣的妇女患宫颈癌的危险性比只有一个性伴侣者高2～3倍以上。统计资料表明，18岁以前结婚的女性宫颈癌 发病率比25岁以后结婚者高20多倍。初产年龄在20岁以下的女性发病率比25岁以上初产者高7倍。部分女性HPV感染期较短，但部分女性可持续感染，正是这些持续感染的女性具有很高的患宫颈癌风险。 

在我国，根据权威部门统计子宫颈癌新增发病率占女性生殖系统恶性肿瘤发病率的73-93％，子宫颈癌是威胁妇女健康的主要疾病之一，现已被认为是全球性公共卫生问题。各个年龄阶层的女性都有可能发生子宫颈癌，但以25岁到45岁的妇女最为常见。子宫颈癌一旦发生，转移速度快，致死率高，是威胁妇女生命安全的大敌，为此，国家卫生部于2004年6月将“子宫颈癌的预防及癌前期病变规范化诊断与治疗的推广”(简称PCC，Prevention of Cervial Cancer)及新柏氏TCT防癌检查技术纳入其十年百项计划项目，以期在全国范围内得到更广泛的实施。防治子宫颈癌，重在预防,关键在有效的预防和清除HPV病毒感染。 

宫颈糜烂是妇科常见病，调查显示我国已婚妇女90％以上患有程度不同的宫颈糜烂。宫颈糜烂与人乳头瘤病毒(HPV)，单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(HCMV)等感染密切相关，有合并HPV感染的宫颈糜烂有发展为宫颈癌的可能。因此，对合并HPV感染的宫颈糜烂应进行早期有效的治疗。 

商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins,PAPs)是从商陆(Phytolacca acinosa)植株中分离得到的一类核糖体单链失活蛋白(ribosome inactivating proteins,RIP)。PAP对巨细胞病毒(CMV)、流感病毒、脊髓灰质炎病毒(PV)、疱疹病毒(HSV),人体免疫缺损病毒(HIV)和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)等病毒都有抑制作用，但是商陆抗病毒蛋白(PAP)治疗HPV病毒感染的作用未见报道。国家发明专利《用于治疗女性生殖道病毒感染的药物及其缓释制剂的制备方法200910190118.4》和《治疗上皮糜烂的复合制剂及其制备方法200610063142.8》文中将美州商陆抗病毒蛋白(PAP)作为其药物组合物的组成成分之一。虽然商陆抗病毒蛋白具有抗病毒的功能，但是在常温下很容易变性 失活，影响药物抗病毒的功能。 

发明内容

本发明的目的是提供了一种商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂及其制备方法，以及在治疗和预防HPV相关疾病中的应用。 

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂，其中，包括商陆抗病毒蛋白冻干粉和溶解液；其中所述商陆抗病毒蛋白冻干粉组分包括商陆抗病毒蛋白、商陆皂甙、多糖和虫草素；所述溶解液组分包括水、乙醇、磷酸盐、甘油、薄荷醇和防腐剂。 

优选的，所述商陆抗病毒蛋白为天然提取商陆抗病毒蛋白或重组商陆抗病毒蛋白，分子量为29-30KD，等电点为8.0-8.5。 

优选的，所述天然提取商陆抗病毒蛋白从以下的一种或两种商陆中提取：商陆Phytolacca acinosa Roxb和美洲商陆Phytolacca americana L.。 

优选的，所述天然提取商陆抗病毒蛋白按照下述方法制备获得： 

(1)预处理:商陆植株和蛋白提取液按1：2-5重量比例研磨匀浆，过滤，上清调PH3-6，4℃过夜； 

(2)粗提取:离心取上清液，加入硫酸铵固体至终浓度40-60％，室温放置过夜，进行第一次盐析；离心收集上清，加入硫酸铵固体至终浓度70-85％，室温放置过夜，进行第二次盐析；离心取沉淀，即为PAP粗蛋白，放置-20℃，备用； 

(3)纯化：PAP粗蛋白溶解于磷酸缓冲液中，采用凝胶过滤、离子交换柱层析技术和超滤技术，纯化商陆抗病毒蛋白，浓缩后，经真空冷冻干燥制成。 

优选的，所述商陆抗病毒蛋白冻干粉具体包括以下重量百分比的组分： 

商陆抗病毒蛋白：：0.001-2％ 

多糖：60-85％ 

商陆皂甙：5-20％ 

虫草素：1-9％。 

优选的，所述溶解液具体包括以下重量百分比的组分： 

水：50-100％ 

乙醇：0-30％ 

磷酸盐：0-3％ 

甘油：0-10％ 

薄荷醇：0-5％ 

防腐剂：0-0.5％。 

优选的，所述多糖为商陆多糖、虫草多糖、甘露聚糖、葡聚糖和硫酸多糖的一种或几种。 

商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂的制备方法，其中，包括以下步骤： 

(1)提取商陆抗病毒蛋白； 

(2)将步骤(1)提取的商陆抗病毒蛋白或重组商陆抗病毒蛋白在溶剂介质中溶解，加入多糖、商陆皂甙和虫草素，均匀搅拌后，低温真空干燥，制得含主药的固态物； 

(3)将步骤(2)制得的固态物，根据等量递增原则，添加增稠剂、助流剂，混合均匀，制备成冻干粉剂或散剂，分装后包装； 

(4)将水、乙醇、磷酸盐、甘油、薄荷醇和防腐剂按比例配成溶解液，分装后包装； 

(5)使用前将步骤(4)制备的溶解液加入步骤(3)得到的冻干粉剂或散剂中调成复合剂。 

本发明中，所述商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂，在治疗和预防HPV相关疾病中的应用。 

本发明所述HPV感染及其相关疾病为低危型HPV感染、高危型HPV感染，单一型HPV感染、混合型HPV感染及其引发的相关疾病。 

本发明所述HPV感染模式为活动性感染、潜伏性感染、一过性和持续性感染。 

本发明所述HPV感染相关疾病为宫颈癌、阴茎癌、宫颈上皮细胞瘤变、尖锐湿疣、宫颈糜烂、宫颈息肉。 

本发明所述的商陆抗病毒蛋白能有效地杀灭和清除女性生殖器HPV病毒(含低危和高危HPV病毒)感染，含活动性感染和潜伏性感染，一过性感染与持续性感染，预防宫颈癌。 

本发明所述的商陆抗病毒蛋白能有效地在体外细胞细胞水平抑制高危HPV病毒在体外细胞致癌基因E6/E7基因的表达；有效地抑制高危HPV病毒E6/E7致癌基因引发的肿瘤的生长。 

本发明所述的商陆抗病毒蛋白能有效地治疗由HPV病毒感染引发的宫颈上皮细胞瘤变(CIN)、宫颈糜烂、宫颈息肉和宫颈肥大等女性生殖道疾病。 

本发明中，所述的商陆抗病毒蛋白冻干粉，可加入药用辅料后制成冻干粉剂、泡腾剂、散剂、片剂、凝胶、胶囊、涂抹剂、栓剂、膏剂、喷剂、滴丸剂、乳液、溶液和悬浮液剂。 

本发明的商陆抗病毒蛋白冻干粉以多糖、虫草素和商陆皂甙作为商陆抗病毒蛋白冻干保护剂和辅助剂，避免商陆抗病毒蛋白在冻干过程中失活，在常温下保持商陆抗病毒蛋白活性。本发明的商陆抗病毒蛋白冻干粉采用独立包装，在常温下更稳定，更易于保存。使用前加入溶解液将冻干粉调成复合剂，能有 效治疗HPV病毒感染，预防宫颈癌和阴茎癌，对由HPV病毒感染引发的宫颈上皮细胞瘤变(CIN)、宫颈糜烂、宫颈息肉和宫颈肥大等疾病具有显著疗效，具有良好的临床应用前景。 

附图说明

图1为商陆抗病毒蛋白对人乳头病毒(HPV)E6/E7基因表达的抑制效果； 

图2为商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗宫颈高危型HPV病毒持续性感染的临床疗效观察(上海)； 

图3为商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗宫颈高危型HPV病毒一过性感染的临床疗效(上海)； 

图4为商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂LEEP术后联合使用，清除高危HPV感染临床观察(山西)。 

具体实施方式

实施例1 

1、提取天然商陆抗病毒蛋白的制备 

(1)预处理:商陆植株和蛋白提取液按比例1：4(w/v)研磨匀浆研磨匀浆，过滤，上清调PH3-6，4℃过夜； 

(2)粗提取:离心取上清液，加入硫酸铵固体至终浓度40％，室温放置过夜，进行第一次盐析；离心收集上清，加入硫酸铵固体至终浓度70％，室温放置过夜，进行第二次盐析；离心取沉淀，即为PAP粗蛋白，放置-20℃，备用； 

(3)纯化：PAP粗蛋白溶解于磷酸缓冲液中，采用凝胶过滤、离子交换柱层析技术和超滤技术，纯化商陆抗病毒蛋白，浓缩后，经真空冷冻干燥制成。 

2、商陆抗病毒蛋白冻干粉的制备： 

加入商陆抗病毒蛋白0.01份、商陆皂甙12份、商陆多糖42份，虫草多糖42份，虫草素4份，加水溶解后，均匀搅拌，低温真空干燥制得。 

3、溶解液的制备： 

加入防腐剂洗必泰0.2份、甘油5份，乙醇20份、薄荷醇5份、水69.8 份，所有原料混合均匀制成。 

4、商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂的制备方法，包括以下步骤： 

(1)提取天然商陆抗病毒蛋白； 

(2)将步骤(1)提取的商陆抗病毒蛋白或重组商陆抗病毒蛋白在溶剂介质中溶解，加入多糖、商陆皂甙和虫草素，均匀搅拌后，低温真空干燥，制得含主药的固态物； 

(3)将步骤(2)制得的固态物，根据等量递增原则，添加增稠剂、助流剂，混合均匀，制备成冻干粉剂或散剂，分装后包装； 

(4)将水、乙醇、磷酸盐、甘油、薄荷醇和防腐剂配成溶解液，分装后包装； 

(5)使用前将步骤(4)制备的溶解液加入步骤(3)得到的冻干粉剂或散剂中调成复合剂。 

实施例2 

1、提取天然商陆抗病毒蛋白的制备 

(1)预处理:商陆植株和蛋白提取液按比例1：5(w/v)研磨匀浆研磨匀浆，过滤，上清调PH3-6，4℃过夜； 

(2)粗提取:离心取上清液，加入硫酸铵固体至终浓度45％，室温放置过夜，进行第一次盐析；离心收集上清，加入硫酸铵固体至终浓度75％，室温放置过夜，进行第二次盐析；离心取沉淀，即为PAP粗蛋白，放置-20℃，备用； 

(3)纯化：PAP粗蛋白溶解于磷酸缓冲液中，采用凝胶过滤、离子交换柱层析技术和超滤技术，纯化商陆抗病毒蛋白，浓缩后，经真空冷冻干燥制成。 

2、商陆抗病毒蛋白冻干粉的制备： 

加入商陆抗病毒蛋白0.01份、商陆皂甙17份、甘露聚糖40份，葡聚糖38份，虫草素5份，加水溶解后，均匀搅拌，低温真空干燥制得。 

3、溶解液的制备： 

加入磷酸二氢钾0.5份，水99.5份，所有原料混合均匀制成。 

4、商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂的制备方法，包括以下步骤： 

(1)提取天然商陆抗病毒蛋白； 

(2)将步骤(1)提取的商陆抗病毒蛋白或重组商陆抗病毒蛋白在溶剂介质中溶解，加入多糖、商陆皂甙和虫草素，均匀搅拌后，低温真空干燥，制得含主药的固态物； 

(3)将步骤(2)制得的固态物，根据等量递增原则，添加增稠剂、助流剂，混合均匀，制备成冻干粉剂或散剂，分装后包装； 

(4)将水、乙醇、磷酸盐、甘油、薄荷醇和防腐剂配成溶解液，分装后包装； 

(5)使用前将步骤(4)制备的溶解液加入步骤(3)得到的冻干粉剂或散剂中调成复合剂。 

实施例3 

1、提取天然商陆抗病毒蛋白的制备 

(1)预处理:商陆植株和蛋白提取液按比例1：3(w/v)研磨匀浆研磨匀浆，过滤，上清调PH3-6，4℃过夜； 

(2)粗提取:离心取上清液，加入硫酸铵固体至终浓度55％，室温放置过夜，进行第一次盐析；离心收集上清，加入硫酸铵固体至终浓度85％，室温放置过夜，进行第二次盐析；离心取沉淀，即为PAP粗蛋白，放置-20℃，备用； 

(3)纯化：PAP粗蛋白溶解于磷酸缓冲液中，采用凝胶过滤、离子交换柱层析技术和超滤技术，纯化商陆抗病毒蛋白，浓缩后，经真空冷冻干燥制成。 

2、商陆抗病毒蛋白冻干粉的制备： 

加入商陆抗病毒蛋白0.01份、商陆皂甙9份、商陆多糖20份、硫酸多 糖65份，虫草素6份，加水溶解后，均匀搅拌，低温真空干燥制得。 

3、溶解液的制备： 

加入防腐剂洗必泰0.15份、乙醇19份、薄荷醇2份、水78.85份，所有原料混合均匀制成。 

4、商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂的制备方法，包括以下步骤： 

(1)提取天然商陆抗病毒蛋白； 

(2)将步骤(1)提取的商陆抗病毒蛋白或重组商陆抗病毒蛋白在溶剂介质中溶解，加入多糖、商陆皂甙和虫草素，均匀搅拌后，低温真空干燥，制得含主药的固态物； 

(3)将步骤(2)制得的固态物，根据等量递增原则，添加增稠剂、助流剂，混合均匀，制备成冻干粉剂或散剂，分装后包装； 

(4)将水、乙醇、磷酸盐、甘油、薄荷醇和防腐剂配成溶解液，分装后包装； 

(5)使用前将步骤(4)制备的溶解液加入步骤(3)得到的冻干粉剂或散剂中调成复合剂。 

上述三个实施例制备的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂的批号为110610001、110610002、110610003。 

1、商陆抗病毒蛋白冻干粉稳定性考察 

利用麦胚体外蛋白质生物合成体系来测定蛋白活性。 

将商陆抗病毒蛋白冻干粉样品(110610001、110610002、110610003)处理后加入1ml含荧光素蛋白DNA的麦胚体外蛋白质生物合成体系中，于30度反应2小时后终止反应，分别取出5ul，采用荧光酶标仪检测荧光吸收值。IU定义为抑制1ml麦胚体外蛋白质生物合成的50％所需要的商陆抗病毒蛋白量。如下表(1)为商陆抗病毒蛋白冻干粉样品室温留样考察结果。 

表(1)商陆抗病毒蛋白冻干粉样品室温留样考察结果 

2、商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂对细胞毒性的测定 

在TC-1细胞培养内，采用MTT染色法，测定三批商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂(110610001、110610002、110610003)对细胞的毒性，实验结果表明：110610001、110610002和110610003三批商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂：最大无毒浓度(TD50)为1250μg/ml±0，半数中毒浓度(TD50)为2500μg/ml±0。 

3、商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂对人乳头病毒(HPV)E6/E7基因表达的抑制效果 

三个批次的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂(110610001、110610002、110610003)分别作用TC-1细胞和Hela细胞。采用RT-PCR检测法，检测其对细胞中HPV16和HPV18病毒癌基因E6、E7基因表达的抑制。从图1中可看出， 三个批次的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂均能抑制HPV16和HPV18病毒E6、E7基因的表达。(见说明书附图1) 

4、商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂对HPV16型细胞所致肿瘤生长的抑制效果 

三批不同剂量的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂作用TC-1细胞(含HPV16型肿瘤)72小时后，分别注射SCID小鼠右侧腋下2次，四周后解剖小鼠，剥离瘤块称瘤重，实验结果如下：如下表1商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂(110610001)不同剂量下肿瘤其抑制率分别为：91.84％、79.88％、69.97％、51.02％；如下表2商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂(110610002)不同剂量下肿瘤其抑制率分别为：89.34％、80.39％、58.47％、42.86％；如下表3商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂(110610003)不同剂量下肿瘤其抑制率分别为：91.09％、81.60％、67.36％、54.30％；经统计学处理P值<0.05，有显著性差异。上述实验结果表明商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂，对HPV16型细胞所致肿瘤生长有明显的抑制作用。 

表1 商陆抗病毒蛋白冻干答复合剂(110610001)对小鼠肿瘤的抑制作用 

表2 商陆抗病毒蛋白冻干答复合剂(110610002)对小鼠肿瘤的抑制作用 

表3 商陆抗病毒蛋白冻干答复合剂(110610003)对小鼠肿瘤的抑制作用 

5、试用效果 

对本发明的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂散剂治疗不同地区高危HPV病毒(含低危和高危HPV病毒)感染阳性患者及相关疾病做了初步试用观察，结果表明，该制剂能有效治疗HPV病毒对女性生殖器感染，并对由HPV病毒感染引发的宫颈上皮细胞瘤变(CIN)、宫颈糜烂、宫颈息肉、尖锐湿疣等均有确切的治疗效果，无任何刺激和不良反应，方便患者自行给药治疗。 

(1)商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗宫颈高危型HPV病毒持续性感染的临床疗效观察(上海地区) 

目的:观察高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染女性使用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗宫颈HPV感染的临床效果。 

方法：对临床上经LCT或宫颈刮片检查正常，同时经HC2方法检测高危型HPV-DNA(+)的500名妇女，随机分为五组，试验组300例采用阴道推注商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂的方法给药(其中试验组1采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610001，试验组2采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610002，试验组3采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610003)，阳性对照组100例采用阴道放置干扰素栓方法给药，空白对照组100例，不使用任何药物。停药后第3个月和第6个月观察高危型HPV DNA的转阴率，以HPV转阴为有效；停药后一周，根据患者自觉症状、妇科检查及阴道分泌物镜检结果，分析药物对阴道炎症的临床疗效，以阴道炎治愈为治疗有效。如图2所示试验结果：商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610001、110610002、110610003对治疗宫颈高危型HPV感染患者转阴率分别为62％、65％、60％；阳性对照组治疗宫颈高危型HPV感染患者转阴率为24％；空白对照组自愈率为18％。商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂组与干扰素组疗效比较差异显著(P<0.01)；结论：商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂对妇女宫颈高危型HPV感染具有明显的临床疗效(见说明书附图2)。 

(2)商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗宫颈高危型HPV病毒一过性感染的临床疗效观察(上海地区) 

目的：探讨商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂阴道用药治疗高危型人乳头瘤病毒(HPV)宫颈感染的临床效果。 

方法.研究对象为排除宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的240例高危型HPV宫颈感染的患者，其中120例高危型HPV宫颈感染的患者使用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗作为试验组(其中试验组1采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610001，试验组2采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610002，试验组3采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610003)，阴道内隔日用药，10次为一个疗程，共6疗程；另60例高危型HPV宫颈感染的未行任何治疗患者作为对照组。两组患者均知情同意参见该研究。观察研究组用药结束后6个月及9个月后的宫颈高危HPV检测结果，及对照组在相同时间的检测结果。如图3结果商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610001、110610002、110610003治疗高危型HPV宫颈感染6月后高危型HPV转阴性率分别为95.0％、96.6％、93.3％，9月后转阴性率分别为98.3％、98.3％、96.6％，显著高于对照组(61.0％，69.l5％)。 

结论：商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗高危型HPV宫颈感染临床效果满意，有必要进一步研究和临床推广应用(见说明书附图3)。 

(3)商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗CIN伴高危型HPV感染的临床研究(山西) 

目的：观察高频电波刀宫颈电圈环切术(LEEP)联合应用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗宫颈上皮内瘤变(CIN)伴人乳头瘤病毒(HPV)感染的临床效果。 

方法：对199例宫颈上皮内瘤变(CIN)CINI-III伴HPV阳性患者进行随机分组，其中对照组49例选择单独予电圈切除术治疗，试验组150例在电圈切除术后，给予商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂(其中试验组1采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610001，试验组2采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610002，试验组3采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610003)治疗3个月，术后随访2年，检测其宫颈HPV-DNA的负荷量，同时行阴道镜检查及宫颈活检。比较试验组与对照组两组的治愈率、残留率。如图4结果：试验组1、试验组2和试验组3治愈率分别为96.0％、92.0％、96.0％，残留率分别为2.0％、3.0％、2.0％.对照组治愈率73.5％，残留率20.4％。试验组治愈率明显高于对照组，残留率明显 低于对照组，差异有统计学意义。 

结论：LEEP联合商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗可以有效控制CIN的进一步发展，同时可明显降低宫颈HPV表达(见说明书附图4)。 

(4)、商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗单一型高危HPV感染(仅一种类型的病毒感染)和混合型高危HPV感染(两种以上类型的病毒感染)的临床观察(太原)： 

观察商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂(110610001、110610002、110610003)治疗单纯型和混合型HPV感染的临床效果。试用组1采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610001，试用组2采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610002，试用组3采用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂110610003，如下表4结果显示：单一高危HPV感染使用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂(110610001、110610002、110610003)3个月后转阴率分别是75.0％、65.0％、65.0％，对照组是15.0％；6个月后试用组全部转阴，对照是50.0％。混合型高危HPV感染使用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂(110610001、110610002、110610003)3个月后转阴率分别是53.0％、40.0％、46.7％，对照是0，6个月后试用组转阴率分别为80.0％、93.3％、86.7％，对照为0。 

表4 商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗单纯型和混合型HPV感染的临床效果 

(5)商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗尖锐湿疣及低危型HPV感染临床疗效观察 

目的：观察商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗尖锐湿疣的临床效果。 

临床资料：30例患者中年龄最大的53岁，最小的18岁，平均年龄33岁，单纯生殖器尖锐湿疣、低危型HPV患者60例。 

临床治疗方法：生殖器尖锐湿疣患者，采用物理治疗去除赘物后，阴道后穹窿内置及外阴部，分3组，每组20例，分别涂抹商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂(110610001、110610002、11061003)隔日一次，连用一个疗程，停药1-3周复查。 

疗效判定： 

痊愈：宫颈HPV-DNA转阴，生殖器尖锐湿疣无复发。 

有效：宫颈HPV-DNA复查结果下降。 

无效：宫颈HPV-DNA复查未下降或上升，生殖器疣反复发作。 

副作用：个别患者使用后出现外阴阴道瘙痒，可能与患者原有念珠菌感染有关，给予局部冲洗即可，无需停药。 

结果：60例患者中，单纯生殖器尖锐湿疣，低危性HPV患者，使用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂一个疗程后，全部转阴，无复发。 

(6)商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗宫颈糜烂的临床观察(太原) 

临床资料：选取2011年1月至2011年12月在我院门诊就诊的不同程度的宫颈糜烂患者165例，患者年龄28-59岁，平均年龄42岁。3月内未接受其他方法治疗，并能来复查。 

方法： 

(1)诊断标准：按照《妇产科学》第6版宫颈糜烂的分类标准，根据糜烂面积分为：①轻度糜烂(Ⅰ度)：糜烂面积小于整个子宫颈面积的1/3；②中度糜烂(Ⅱ度)：糜烂面积占整个子宫颈面积的1/3-2/3；③重度糜烂(Ⅲ度)：糜烂面积占整个子宫颈面积的2/3以上。 

(2)治疗方法和疗效标准 

患者随机分成3个试用组，分别给予商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗(试用组1采用110610001、试用组2采用110610002、试用组3采用110610003) 

给药方法:商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂1支,患者睡前推入阴道深部,隔 日一次,10次为一疗程,共三个疗程后,复诊进行疗效观察。 

疗效标准:①痊愈：子宫颈光滑，糜烂面消失；②显效：糜烂面积缩小>50％或Ⅱ度转为Ⅰ度，Ⅲ度转为Ⅱ度；③有效：糜烂面积缩小<50％，糜烂面积明显缩小但好转不足Ⅰ度或糜烂面积无明显缩小而颗粒型变为单纯型，乳头型变为颗粒型；④无效：治疗前后糜烂面无变化或有发展。 

(3)统计学处理：采用SPSS 13.0统计软件，以P＜0.05为差异有统计学意义。 

如下表5商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂对宫颈糜烂的疗效结果： 

表5 商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂对宫颈糜烂的疗效 

副作用：除2例患者出现瘙痒，使用产品自备的清洗液消除外，其他均无明显不适。 

结论：商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂对宫颈糜烂的有效率为90％，商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗宫颈糜烂使用方便、安全、不良反应小、疗效高，患者易于接受，值得临床应用。为增强和巩固疗效以用药3个疗程以上为好。 

(7)商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗宫颈息肉患者的临床观察 

目的：观察商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂(试用组1采用110610001、试用组2采用110610002、试用组3采用110610003)治疗宫颈息肉的临床效果。 

方法：宫颈息肉患者120例，采用物理治疗去除赘物或微创后给药，隔日一支，10次为一个疗程。观察用药一个月、两个月及三个月后的疗效。 

如下表6商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂对宫颈息肉的疗效结果：商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗宫颈息肉的有效率达到了90％以上。结论：商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂治疗宫颈息肉临床效果满意，宫颈息肉不复发，值得临床推 广应用。 

表6 商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂对宫颈息肉的疗效 

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。 

Claims (9)

1.商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂，其特征在于：包括商陆抗病毒蛋白冻干粉和溶解液；其中所述商陆抗病毒蛋白冻干粉组分包括商陆抗病毒蛋白、商陆皂甙、多糖和虫草素；所述溶解液组分包括水、乙醇、磷酸盐、甘油、薄荷醇和防腐剂。

2.如权利要求1所述的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂，其特征在于：所述商陆抗病毒蛋白为提取天然商陆抗病毒蛋白或重组商陆抗病毒蛋白，分子量为29-30KD，等电点为8.0-8.5。

3.如权利要求2所述的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂，其特征在于：所述提取天然商陆抗病毒蛋白从以下的一种或两种商陆中提取：商陆Phytolaccaacinosa Roxb和美洲商陆Phytolacca americana L.。

4.如权利要求3所述的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂，其特征在于：所述提取天然商陆抗病毒蛋白按照下述方法制备获得：

(1)预处理:商陆植株和蛋白提取液按1：2-5重量比例研磨匀浆，过滤，上清调PH3-6，4℃过夜；

(2)粗提取:离心取上清液，加入硫酸铵固体至终浓度40-60％，室温放置过夜，进行第一次盐析；离心收集上清，加入硫酸铵固体至终浓度70-85％，室温放置过夜，进行第二次盐析；离心取沉淀，即为PAP粗蛋白，放置-20℃，备用；

(3)纯化：PAP粗蛋白溶解于磷酸缓冲液中，采用凝胶过滤、离子交换柱层析技术和超滤技术，纯化商陆抗病毒蛋白，浓缩后，经真空冷冻干燥制成。

5.如权利要求1所述的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂，其特征在于：所述商陆抗病毒蛋白冻干粉具体包括以下重量百分比的组分：

商陆抗病毒蛋白：：0.001-2％

多糖：60-85％

商陆皂甙：5-20％

虫草素：1-9％。

6.如权利要求1所述的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂，其特征在于：所述溶解液具体包括以下重量百分比的组分：

水：50-100％

乙醇：0-30％

磷酸盐：0-3％

甘油：0-10％

薄荷醇：0-5％

防腐剂：0-0.5％。

7.如权利要求1所述的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂，其特征在于：所述多糖为商陆多糖、虫草多糖、甘露聚糖、葡聚糖和硫酸多糖的一种或几种。

8.如权利要求1所述的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)提取商陆抗病毒蛋白；

(2)将步骤(1)提取的商陆抗病毒蛋白或重组商陆抗病毒蛋白在溶剂介质中溶解，加入多糖、商陆皂甙和虫草素，均匀搅拌后，低温真空干燥，制得含主药的固态物；

(3)将步骤(2)制得的固态物，根据等量递增原则，添加增稠剂、助流剂，混合均匀，制备成冻干粉剂或散剂，分装后包装；

(4)将水、乙醇、磷酸盐、甘油、薄荷醇和防腐剂按比例配成溶解液，分装后包装；

(5)使用前将步骤(4)制备的溶解液加入步骤(3)得到的冻干粉剂或散剂中调成复合剂。

9.一种如权利要求8所述制备的商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂在治疗和预防HPV相关疾病中的应用。