CN109517042A - 一种新型抗人乳头瘤病毒蛋白的制备方法 - Google Patents

一种新型抗人乳头瘤病毒蛋白的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型抗人乳头瘤病毒蛋白的制备方法，包括以下步骤：1）从各大生物学数据库中查找N端突变的PAP基因的已知序列，依据密码子的简并原则，使用毕赤酵母Pichia pastoris高频使用密码子替换PAP基因序列中毕赤酵母的低频使用密码子；依据密码子修改后的基因序列，人工合成基因序列，所述的N端突变PAP基因是去除了N端22个氨基酸序列的PAP基因，其序列如SEQ NO.1所示：2）将人工合成的基因序列连接到分泌型表达载体pPICk9上；3）将重组表达载体pPICk9‑PAP电转入毕赤酵母中，使用甲醇诱导重组PAP蛋白的表达。本发明的方法可以利用毕赤酵母的高密度发酵可以在体外大量生产重组型的PAP蛋白，有利于PAP蛋白的大规模生产。

Description

一种新型抗人乳头瘤病毒蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及一种医药技术领域的抗人乳头瘤病毒蛋白，具体是涉及一种新型抗人乳头瘤病毒蛋白的制备方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一种最小的DNA(脱氧核糖核酸)病毒。HPV呈球形，直径约为45～55nm(纳米)，具有嗜上皮性。HPV是一组病毒的总称，到目前为止，已鉴定出HPV达70多个亚型，有资料报道为100种以上HPV亚型。不同的亚型可以导致不同的疾病。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低，可将HPV分为低危险型和高危险型。造成宫颈癌及其癌前病变的高风险HPV亚型有14种，分别是：HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58，HPV59，HPV66，HPV68。其中HPV16和HPV18这两种病毒株的危险最高，可导致70％－85％的宫颈癌病例。美国最大型的宫颈癌普查ATHENA研究发现，感染HPV16或18的女性，发展为宫颈癌前病变的风险比不携带这类病毒的女性高35倍，表明人宫颈感染HPV的亚型中以HPV16/18两型与宫颈癌关系最为密切。有研究采用生物素标记的HPV16/18探针作原位PCR杂交，结果显示，HPV16/18在宫颈原位癌和宫颈浸润癌的阳性感染率分别为40％和74.42％，并且鳞癌主要以HPV16型感染为主，腺癌主要以HPV18型感染为主。因此，HPV16/18感染是宫颈癌的高危因素，能客观反映宫颈癌的恶性程度，并且HPV型别也可作为评估宫颈癌患者预后的新指标。
目前，在国际上能有效预防和治疗HPV病毒感染的药物较为缺乏，公认疗效显著的主要还是预防型的疫苗，临床证实HPV疫苗几乎能100％地预防一些HPV病毒株的感染，但它并不能预防所有类型病毒株的感染和治疗已经感染HPV病毒的病人，并且价格高昂。而在治疗上由于没有特效药因而采用的免疫调节药物由于普遍存在无法有效地预防HPV感染、疗效不明确、价格昂贵等方面的缺陷而大大限制了其在临床上的使用，特别是在低收入的发展中国家。
美洲商陆抗病毒蛋白(Pokeweed Antiviral Proteins，PAP)是一类天然的广谱抗病毒蛋白，能抗多种植物和动物病毒，对真菌和细菌也有一定的抑制作用。PAP蛋白是核糖体失活蛋白的一种，它能够攻击真核细胞28S和原核细胞23S核糖体RNA，并且从核糖体RNA保守的S/R区移去特异的一个腺嘌呤而使EF2延伸因子无法正常形式功能，蛋白合成受到抑制。有研究表明，PAP蛋白对HPV病毒的复制有一定的抑制作用，因此，该蛋白可以作为潜在的治疗HPV感染的药物。
现有技术的主要存在如下技术问题：天然PAP蛋白表达量很少，不能满足市场需求。缺少一种可以在体外大量生产PAP蛋白的方法，且需要生产的PAP蛋白具有与天然PAP蛋白同样的生物学活性。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种新型抗人乳头瘤病毒蛋白的制备方法。
现有公开的论文中，大部分采用的技术方案是运用大肠杆菌体外原核表达美洲商陆抗病毒蛋白，该方案最大的缺陷是体外表达的美洲商陆抗病毒蛋白是以无活性的包涵体形式表达，导致后续要对该重组蛋白进行复性处理，而包涵体的复性是业界公认的难题，制约着该重组蛋白的大规模应用。本发明采用真核分泌型表达方法，在此基础上对密码子进行优化，不但使重组蛋白以有活性的可溶性形式表达，而且提高了重组蛋白的产量，减少了后续的操作步骤，提高了重组蛋白的大规模应用前景。
本发明的技术方案如下：
一种新型抗人乳头瘤病毒蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)从各大生物学数据库中查找N端突变的PAP基因的已知序列，依据密码子的简并原则，使用毕赤酵母Pichia pastoris高频使用密码子替换PAP基因序列中毕赤酵母的低频使用密码子；依据密码子修改后的基因序列，人工合成基因序列；其序列如SEQ NO.1所示：所述的N端突变PAP基因是去除了N端22个氨基酸序列的PAP基因；
2)将人工合成的基因序列连接到分泌型表达载体pPICk9上；
3)将重组表达载体pPICk9-PAP电转入毕赤酵母中，使用甲醇诱导重组PAP蛋白的表达。
所述的PAP基因是根据Genbank上公布的PAP基因序列合成的。
所述方法制备的制备的新型抗人乳头瘤病毒蛋白在制备阻断HPV病毒入侵细胞和阻止病毒扩大感染药物中的应用。
本发明药物具有阻断HPV病毒入侵细胞、阻止病毒扩大感染、稳定性高等显著优势，可用于开发成为以其为主要活性成分的预防和控制HPV感染的各种剂型，制备方法简单，易于推广。
本发明的方法可以利用毕赤酵母的高密度发酵可以在体外大量生产重组型的PAP蛋白，有利于PAP蛋白的大规模生产。
附图说明
图1为pPICk9-PAP质粒双酶切的结果图。
图2为Marker Ladder。
图3为SDS-PAGE电泳图。
图4为定量标准曲线图。
图5为天然PAP蛋白和重组PAP蛋白的WB显影结果图。
图6天然PAP蛋白和重组PAP蛋白对HPV16E7的抑制结果。
图7天然PAP蛋白和重组PAP蛋白对HPV18E7的抑制结果。
具体实施方式
实验例1
本发明的新型抗人乳头瘤病毒蛋白的制备方法，包括以下步骤：
一、根据Genbank上公布的PAP基因的序列，PAP基因编码区全长942bp，编码313个氨基酸，N末端有一个由22个氨基酸组成的信号肽，C末端有一个由29个氨基酸组成的稳定区。基因的扩增用于后期真核表达载体的构建，所以去除N端的66个碱基编码的22个氨基酸后，全长共876bp。合成N端突变PAP基因序列，用Prime 5.0软件设计引物，以N端突变PAP基因作为模板进行PCR扩增，将PCR产物回收后与分泌型表达载体pPICk9载体连接，得到重组质粒pPICk9-PAP，并电转化毕赤酵母GS115菌株，筛选阳性重组子，将阳性重组子培养后提取质粒进行双酶切验证，将重组质粒进行测序。测序结果如SEQ NO.2所示，测序结果与预期一致。
图1为pPICk9-PAP质粒双酶切的结果图。图2为Marker Ladder。
从图1可以看出，双酶切的结果是产生了两个DNA片段，对图1和图2的分析可以得出，图1中的2个DNA片段大小分别是9000bp与900bp左右，与线性pPICk9和PAP的理论大小相符，说明成功构建了表达载体pPICk9-PAP。
二、重组蛋白的诱导表达
选取阳性重组子划YPD平板，30℃培养48h；挑取单菌落接入BMGY培养基中，30℃培养36h；4℃、1500rpm离心10min收集菌体，用离心水重悬菌体后，4℃、1500rpm离心10min收集菌体(重复两次)；将收集的菌体加入BMMY培养基中，28℃培养96h，每隔24h加入100％的甲醇至终浓度为1％；4℃、1500rpm离心10min，收集上清液，4℃保存。
用SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达情况。图3为SDS-PAGE电泳图。从图中可以看出：重组蛋白的大小约38kDa，最高表达量达100mg/L。表明该重组PAP蛋白得到正确表达。
实验例2测定实施例1制备的重组蛋白浓度
BCA微孔定量检测法：
(1)稀释BSA标准品：用与待测蛋白样品相一致的稀释液按下表稀释BSA标准品。
(2)配置BCA工作液：
①计算BCA工作液总量：
BCA工作液总量＝(BSA标准品样本个数+未知样本个数)×复孔数×每个样本BCA工作液体积
微孔检测法一般使用3个复孔，每个样本BCA工作液体积是200μL
②根据计算出的BCA工作液需要总量，将BCA-A和BCA-B按照50:1的体积比，配制BCA工作液，充分混匀。
(3)定量检测：
①按上表，将稀释好的A-G BSA标准品和待测蛋白样品(原液或稀释液)各25μL，分别加到作好标记的96孔板微孔中。推荐每个测定的样本做2-3个平行反应。
②每孔加入200μL BCA工作液，充分混匀，盖上96孔板盖，37℃孵育30分钟，冷却至室温，须在3-5分钟内完成检测。
③用酶标仪在540-590nm范围内，测定每个样品及BSA标准品的吸光值，同时做好记录。
④绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
结果如图4所示。
从图4可以看出，对重组蛋白使用BCA定量法绘制的标准曲线精确度高(相关系数大于0.999)，表明对蛋白的定量结果准确。
实验例3天然PAP蛋白和重组PAP蛋白的western blot分析
将天然和实施例1制备重组PAP蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将凝胶放在转移缓冲液中漂洗，将蛋白从胶上转移至硝酸纤维素薄膜(NC)上；用丽春红将NC膜染色，再使用PBST将颜色洗掉；将膜转入封闭液中封闭；将上步的NC膜置于用PBST稀释的一抗中37℃孵育1h，再用PBST洗三次；将上步的NC膜放入经PBST稀释的二抗中，室温孵育1h，再用PBST洗三次；在避光条件下，将NC膜置于含有NBT和BCIP的碱性磷酸脂酶显色，之后用水冲洗终止显色反应，取出晾干、拍照。
结果如图5所示，天然PAP蛋白和重组PAP蛋白的WB显影结果一致。表明利用毕赤酵母异源表达获得的重组PAP蛋白具有与天然PAP蛋白同样的生物学活性。
实施例4天然PAP蛋白和重组PAP蛋白的抗HPV病毒活性比较分析
将培养好的Hela细胞均匀的铺在60mm的细胞培养皿中；天然PAP蛋白和实施例1制备的重组PAP蛋白药物分别加入细胞培养基中；培养一定时间后，收集细胞，并提取细胞总蛋白；将提取好的总蛋白做WB检测，使用的抗体分别是HPV16E7和HPV18E7抗体，最后分析显影结果。
结果如图6和图7所示，天然PAP蛋白和重组PAP蛋白的WB显影结果一致。
表明利用毕赤酵母异源表达获得的重组PAP蛋白具有与天然PAP蛋白同样的生物学抗病毒活性。
序列表
<110> 江苏正大天创生物工程有限公司
<120> 一种新型抗人乳头瘤病毒蛋白的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgaatacaa tcatctacaa tgttggaagt accaccatta gcaaatacgc cacttttctg 60
aatgatcttc gtaatgaagc gaaagatcca agtttaaaat gctatggaat accaatgctg 120
cccaatacaa atacaaatcc aaagtacgtg ttggttgagc tccaaggttc aaataaaaaa 180
accatcacac taatgctgag acgaaacaat ttgtatgtga tgggttattc tgatcccttt 240
gaaaccaata aatgtcgtta ccatatcttt aatgatatct caggtactga acgccaagat 300
gtagagacta ctctttgccc aaatgccaat tctcgtgtta gtaaaaacat aaactttgat 360
agtcgatatc caacattgga atcaaaagcg ggagtaaaat caagaagtca agtccaactg 420
ggaattcaaa tactcgacag taatattgga aagatttctg gagtgatgtc attcactgag 480
aaaaccgaag ccgaattcct attggtagcc atacaaatgg tatcagaggc agcaagattc 540
aagtacatag agaatcaggt gaaaactaat tttaacagag cattcaaccc taatcccaaa 600
gtacttaatt tgcaagagac atggggtaag atttcaacag caattcatga tgccaagaat 660
ggagttttac ccaaacctct cgagctagtg gatgccagtg gtgccaagtg gatagtgttg 720
agagtggatg aaatcaagcc tgatgtagca ttcttaaact acgttggtgg gagctgtcag 780
acaacttata accaaaatgc catgtttcct caacttataa tgtctactta ttataattac 840
atggttaatc ttggtgatct atttgaagga ttctga 876
<210> 2
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgaatacaa tcatctacaa tgttggaagt accaccatta gcaaatacgc cacttttctg 60
aatgatcttc gtaatgaagc gaaagatcca agtttaaaat gctatggaat accaatgctg 120
cccaatacaa atacaaatcc aaagtacgtg ttggttgagc tccaaggttc aaataaaaaa 180
accatcacac taatgctgag acgaaacaat ttgtatgtga tgggttattc tgatcccttt 240
gaaaccaata aatgtcgtta ccatatcttt aatgatatct caggtactga acgccaagat 300
gtagagacta ctctttgccc aaatgccaat tctcgtgtta gtaaaaacat aaactttgat 360
agtcgatatc caacattgga atcaaaagcg ggagtaaaat caagaagtca agtccaactg 420
ggaattcaaa tactcgacag taatattgga aagatttctg gagtgatgtc attcactgag 480
aaaaccgaag ccgaattcct attggtagcc atacaaatgg tatcagaggc agcaagattc 540
aagtacatag agaatcaggt gaaaactaat tttaacagag cattcaaccc taatcccaaa 600
gtacttaatt tgcaagagac atggggtaag atttcaacag caattcatga tgccaagaat 660
ggagttttac ccaaacctct cgagctagtg gatgccagtg gtgccaagtg gatagtgttg 720
agagtggatg aaatcaagcc tgatgtagca ttcttaaact acgttggtgg gagctgtcag 780
acaacttata accaaaatgc catgtttcct caacttataa tgtctactta ttataattac 840
atggttaatc ttggtgatct atttgaagga ttctga 876

Claims (3)

1.一种新型抗人乳头瘤病毒蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）从各大生物学数据库中查找N端突变的PAP基因的已知序列，依据密码子的简并原则，使用毕赤酵母Pichia pastoris高频使用密码子替换PAP基因序列中毕赤酵母的低频使用密码子；依据密码子修改后的基因序列，人工合成基因序列，所述的N端突变PAP基因是去除了N端22个氨基酸序列的PAP基因，其序列如SEQ NO.1所示：
2）将人工合成的基因序列连接到分泌型表达载体pPICk9上；
3）将重组表达载体pPICk9-PAP电转入毕赤酵母中，使用甲醇诱导重组PAP蛋白的表达。
2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述的PAP基因是根据 Genbank 上公布的 PAP基因序列合成的。
3.如权利要求1或2所述的方法制备的新型抗人乳头瘤病毒蛋白在制备阻断 HPV 病毒入侵细胞和阻止病毒扩大感染药物中的应用。
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