CN1904047A

CN1904047A - 人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAPs、表达载体及其重组工程菌

Info

Publication number: CN1904047A
Application number: CNA2006100117947A
Authority: CN
Inventors: 王锡锋; 李莉; 周广和; 刘艳; 杨宇
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2006-04-26
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2007-01-31
Anticipated expiration: 2026-04-26
Also published as: CN100432225C

Abstract

本发明涉及“人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAPs、表达载体及其重组工程菌”。人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAPs，其特征在于具有SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。构建重组表达载体pPIC9K－PAPs，通过电转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株，获得PAP重组工程菌，对表达产物进行SDS－PAGE及Western－blotting检测，结果表明通过密码子优化的PAPs基因的表达量可以达到180－200mg/L，明显高于改造前的缺失型PAP基因在毕赤酵母中的表达量(45mg/L)，使其应用于植物病毒病害的防治早日成为可能。

Description

人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAPs、表达载体及其重组工程菌

技术领域

本发明专利属于生物技术、生物遗传工程技术领域，特别是涉及一种人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAPs。

背景技术

病毒病害是农作物的一类重要病害，造成作物减产与品质下降，给农业生产带来巨大的经济损失。美洲商陆抗病毒蛋白(Pokeweed antiviral protein，PAP)是从美洲商陆(Phytolacca americana)体内分离出来的一种单链碱性蛋白，分子量为29kD(Irvin，J.D.1975)，成熟的PAP蛋白由262个氨基酸组成。该蛋白属于I型核糖体灭活蛋白(Ribosome-inactive Protein，RIP)，具有RNA N-糖苷酶的活性，能专一地从真核生物核糖体60S大亚基的28S rRNA特殊位点上切下一腺嘌呤，使其难与蛋白质合成的延伸因子EF-2结合，从而阻碍了蛋白质的合成(Endo，k.et al.，1988)。研究表明，PAP不但能够对7个植物病毒属的成员具有抑制作用(Tomlinson，V.M.et al.1974；Chen，Z.C.et al.1991)，而且对真菌、细菌及人类免疫缺陷型病毒(HIV)等都具有一定的抑制效果(Aron，G.M.1980；Olson，M.1991；Zarling，J.M.1990)，因此PAP是一种广谱性抗病菌蛋白，具有广阔的应用价值。但由于PAP在植物中含量有限，且提取困难，加之PAP在体外稳定性高，使得体外操作成为可能，因此，采用基因工程的方法，构建PAP表达载体，再通过真核微生物发酵来大量生产PAP，不失为一种可行的方法。

Antonio等发现改造了的信号肽提高了外源蛋白表达量。Hayasuke N等1996年修饰了人血清白蛋白(HAS)的信号肽序列，使HAS在毕赤酵母中的分泌提高几倍。了解毕赤酵母在密码子使用上的偏爱性可以为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。赵翔等研究发现毕赤酵母以GAG为高表达优越密码子(赵翔等，生物工程学报2000，16(3)：308-311)。重组蛋白的表达除了与上述因素有关外，还与特定宿主菌、培养条件和蛋白本身有关，即使同一种宿主菌的重组子，表达量也往往有所差别，因此筛选高表达量的菌株尤为重要。此外还可以通过优化组合培养条件来提高外源蛋白的表达量。毕赤酵母表达系统是近年来迅速发展的一种真核表达系统，它具有AOX1强启动子，能利用甲醇严格调控外源蛋白的表达，并且其自身分泌杂蛋白较少，有利于外源蛋白的纯化。

本实验室采用分子生物学方法对PAP基因进行改造，获得了去除了N端信号肽编码序列及C端毒性基因的对生物无毒的缺失型PAP基因(GeneBank AF338910)，构建了缺失型PAP基因的真核表达载体pPIC9K，通过电转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株，获得PAP重组工程菌。经PCR鉴定和双膜免疫杂交法筛选获得高效、快速表达的甲醇利用快速型重组子Mut⁺重组子(陈定虎等，农业生物技术学报2003 11(2)：183-186；周倩等，植物病理学报，2003，33(5)：425-428)，对重组工程菌的室内摇瓶发酵条件(如碳源、接种比例、生物素浓度、甲醇诱导浓度、培养基pH值、诱导时间、摇床转速等)进行了优化，建立了摇瓶发酵方案，使得PAP的发酵量达到45mg/L。

发明内容

为了进一步提高PAP的表达量，本发明对缺失型PAP基因做了进一步的改造，通过人工合成的方法获得了PAP片段，将编码PAP蛋白氨基酸的密码子转换成毕赤酵母(Pichia pastois)偏爱的形式，大幅度的提高了PAP基因在酵母中的表达量。

人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAPs，其特征在于具有SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。

一种重组质粒，其特征在于含有上述基因PAPs。

所述重组质粒为T-Easy-PAPs，其含有SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。

一种表达载体，其特征在于含有上述基因PAPs。

所述表达载体为pPIC9K-PAPs，其含有SEQ ID NO2所述的核苷酸序列。

一种重组工程菌，其特征在于含有上述表达载体和宿主细胞。

所述宿主细胞为毕赤酵母GS115菌株。

人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAPs在植物病毒病害防治中的应用。

所述应用是将上述基因表达的蛋白用于植物病毒病害防治。

所述植物病毒为烟草花叶病毒。

本发明在已有研究的基础上，采用分子生物学方法，根据毕赤酵母密码子的偏好性，将编码PAP蛋白氨基酸的密码子转换成毕赤酵母(Pichiapastois)偏爱的形式，对已经获得的缺失N端信号肽及C端毒性区域的缺失型PAP基因(714bp)进行了改造。本发明设计了12条70～85bp的寡聚核苷酸引物及一对两端引物，通过连续的PCR反应，获得了人工合成的PAP基因(PAPs)。本发明共对缺失型PAP基因序列的167个碱基(占23.4％)进行了修改，涉及56个密码子、12种不同的氨基酸。并将合成的PAPs基因克隆到毕赤酵母分泌性表达载体PIC9k上，构建重组表达载体pPIC9K--PAPs。通过电转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株，获得PAP重组工程菌(PAPs28)。对表达产物进行SDS-PAGE及Western-blotting检测，结果表明通过密码子优化的PAPs基因的表达量可以达到180-200mg/L，明显高于改造前的缺失型PAP基因在毕赤酵母中的表达量(45mg/L)。生物学实验结果表明表达产物在体外对烟草花叶病毒(TMV)的侵染有明显的抑制作用，亦可通过转基因的方式获得转PAPs基因抗病植物。

本发明通过对缺失型PAP基因的改造，使其在真核生物内得到高效表达，使其应用于植物病毒病害的防治早日成为可能。

附图说明

图1：基因PAPs合成示意图

图2：第一轮PCR反应结果

1.DNA Marker DL2000 2.片段I(133bp) 3.片段II(139bp) 4.片段III(139bp)

5.片段IV(139bp) 6.片段V(130bp)

图3：第二轮PCR反应结果

1.DNA Marker DL2000 2.片段VI(257bp)

图4：第三轮PCR反应结果

1.DNA Marker DL2000 2.片段VII(493b)

图5：第四轮PCR反应结果

1.DNA Marker DL2000 2.片段VIII(714bp)

图6：第五轮PCR反应结果

1.DNA Marker DL2000 2.目的基因PAPs(728bp)

图7：T-Easy-PAPs质粒的PCR和酶切鉴定

1.DNA Marker DL2000 2.PCR鉴定 3.未酶切的重组质粒 4.EcoR I酶切结果，

图8：pPIC9K-PAPs表达载体的构建策略

图9：质粒T-easy-PAPs双酶切结果

1.DNA Marker DL2000，2.质粒T-easy-PAPs

图10质粒PIC9k-PAPs的鉴定结果

1.DNA Marker DL2000，2.质粒PIC9k-PAPs，3.质粒pPIC9K-PAPs的双酶切结果(720bp)

4.以Y1/Y2为引物PCR扩增(714bp) 5.以5’和3’AOX1为引物PCR扩增(1203bp)

图11电转化毕赤酵母示意图

图12部分转化子在MD与MM培养基上的筛选结果

图13 pPIC9K-PAPs的PCR鉴定

1.DNA Marker DL2000-，2.GS115菌株对照，4、6、7、10、11、12、13.Mut⁺转化子，

8.Mut^s转化子，14.假阳性转化子

图14 Mut⁺阳性转化子的表达产物

1.低分子量蛋白Marker，2.空载体阴性对照，3、4、5、6、7、8、9.不同转化子的表达产物

图15表达产物的Western-blotting分析

1.标记过的低分子量蛋白Marker，2.空载体阴性对照，3.Mut⁺转化子杂交结果

图16改造前后的PAP基因的表达产物

1.低分子量蛋白Marker，2.PAP基因的表达量，3.PAPs基因的表达量

图17表达产物不同处理对病毒的抑制情况

A.左：PB缓冲液与等体积病毒液混和接种右：PAPs表达产物与等体积病毒液混合接种

B.左：PB缓冲液与等体积病毒液混和接种右：未改造的PAP基因表达产物与等体积病毒液

混和接种

C.左：PB缓冲液与等体积病毒液混和接种右：空载体诱导产物与等体积病毒液混和接种

D.左：喷施PB缓冲液10h后接种病毒右：喷施PAPs表达产物10h后接种病毒

E.左：接种病毒10h后喷施PB缓冲液右：接种病毒10h后喷施PAPs表达产物

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

下述实施例中所有方法如无特殊说明均为常规方法。

1.实验选用的材料：

1.1菌株与载体：大肠杆菌JM110菌株为本实验室保存；毕赤酵母GS115菌株及表达载体pPIC9K购自Invitogen公司；T-easy载体购自Promaga公司。

1.2主要试剂：Pyrobest Taq DNA聚合酶、DNA标准分子量购自Takara公司；T4连接酶购自Promaga公司；限制内切酶Not I、SnaB I、SaI I购自New England Biolabs(NEB)公司；平末端DNA片段添A试剂盒购自北京天为时代公司；5’AOX1与3’AOX1引物由北京奥科生物公司合成，PAP兔抗血清由本实验室保存，公众可以通过购买方式获得。其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3培养基：

MD平板培养基：(13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂粉)；

MM平板培养基：(13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5ml/L甲醇，15g/L琼脂粉)；

YPD液体培养基：(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)；

BMGY培养基：(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，0.1mol/L磷酸钾缓冲液pH 6.0，13.4g/LYNB，4×10^-4g/L生物素，10g/L甘油)。

BMMY培养基(10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，0.1mol/L磷酸钾缓冲液pH 6.0，13.4g/L YNB，44×10^-4g/L生物素，5mL/L甲醇)。

1.4本发明设计和引用的引物序列

根据本实验室改造的缺失型PAP基因序列，把编码氨基酸的密码子转换成毕赤酵母(Pichia pastois)偏好的形式(赵翔等，生物工程学报2000，16(3)：308-311)，并在序列的两端分别添加Not I、SnaB I酶切位点及保护碱基。共设计12条引物(正链6条F1～F6，反链6条R1～R6)，引物长度在70～85bp，相邻引物间存在25bp的重叠序列。根据修改后的基因序列再设计了1对含有酶切位点的P1和P2，扩增全长PAP基因。引物在基因中的位置见图1，引物由北京奥科公司合成，序列如下：

F1：5’-GTGAACACTATCATCTACAACGTTGGTTCCACTACTATCTCCAAGTACGCTACTTT

CTTGAACGACTTGAGAAA-3’

R1：5’-TGTTAGTGTTTGGCAACATTGGAATACCGTAACACTTCAAGGATGGGTCCTTAGC

CTCATTTCTCAAGTCGTTCAAGAAA-3’

F2：5’-CAATGTTGCCAAACACTAACACTAATCCAAAGTACGTTTTGGTTGAGTTGCAGG

GTTCCAACAAGAAGACCATCACTTTG-3’

R2：5’-TTGTTAGCTTCGAATGGGTCGGAGTAACCCATAACGTACAAATTATTTCTTCTCA

ACATCAAAGTGATGGTCTTCTTGTT-3’

F3：5’-CGACCCATTCGAAGCTAACAAGTGTAGATACCACATTTTCAACGACATTTCCGGT

ACTGAGAGACAGGACGTTGAGACTA-3’

R3：5’-GTATCTGGAGTCGAAGTTGATGTTCTTGGAAACTCTGGAATTAGCGTTTGGACA

CAAAGTAGTCTCAACGTCCTGTCTCT-3’

F4：5’-ATCAACTTCGACTCCAGATACCCAACTTTGGAGTCCAAGGCTGGAGTTAAGTCC

AGATCCCAGGTTCAGTTGGGTATCCA-3’

R4：5’-CAGTCTTCTCAGTGAAGGACATAACACCGGAAATCTTACCAATATTGGAGTCCA

AAATCTGGATACCCAACTGAACCTGG-3’

F5：5’-TGTCCTTCACTGAGAAGACTGAGGCTGAGTTCTTGTTGGTTGCTATTCAGATGGT

TTCCGAGGCTGCTAGATTCAAGTAC-3’

R5：5’-AAGACCTTTGGGTTTGGGTTGAAAGCTCTATTGAAATTAGTCTTAACCTGATTCT

CAATGTACTTGAATCTAGCAGCCTC-3’

F6：5’-CAACCCAAACCCAAAGGTCTTGAATTTGCAGGAGACTTGGGGTAAGATTTCCAC

TGCTATCCACGGTGCTAAGAACGGTG-3’

R6：5’-CTACCACTTAGCACCGGACGCGTCAACCAACTCCAATGGCTTTGGCAAAACACC

GTTCTTAGCACCGTGGA-3’

两端引物(P1、P2)：

P1：5’-AA TACGTAGTGAACACTATCATCTACAACGT-3’

SnaB I

P2：5’-AA GCGGCCGCCTACCACTTAGCACCGGACG-3’

Not I

Y1：5’-GTGAACACTATCATCTACAACGT-3’

Y2：5’-TACCACTTAGCACCGGACG-3’

5’AOX1引物：5’-GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC-3’(引用的引物)

3’AOX1引物：5’-GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC-3’(引用的引物)

2.基因PAPs的合成

按如图1所示的策略，采用连续延伸PCR法，通过5轮反应合成PAP基因，新基因命名为PAPs。

第一轮反应取引物F1和R1、F2和R2、F4和R3、F5和R5、F6和R6各25pmol互为模板与引物分别进行扩增，合成大小依次为133、139、139、139、130bp的目的基因片段，命名为片段I～V，电泳结果显示PCR产物符合预期片段大小(图2)。反应体系50μL，Pyrobest DNA polymerase 1.25U，反应条件94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共20个循环；72℃延伸5min。

第二轮PCR反应以F4和R3的反应产物(片段III)为模板，以F3和R4为引物进行PCR反应得到大小为257bp的片段VI，电泳结果显示产物大小与预期相一致(图3)。反应体系50μL，反应条件为94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃1min，共20个循环；72℃5min。

第三轮PCR反应以第二轮PCR反应的产物(片段VI)为模板，片段II和IV为引物扩增得到大小为493bp的片段VII。反应体系50μL，II、IV、VI各5μL，反应条件同第二轮反应，电泳结果显示产物大小与预期相一致(图4)。

第四轮PCR反应以第三轮PCR反应的产物(片段VII)为模板，片段I和V为引物扩增得到大小为714bp的片段VIII，反应体系50μL，片段VII、I和V各5μL，反应条件同第二轮反应，电泳结果显示产物大小与预期大小基本一致(图5)。

第五轮PCR反应以第四轮PCR反应的产物(VIII)为模板，P1/P2为引物扩增得到经改造的大小约为728bp的PAPs，反应体系50μL，P1、P2和VIII均5μL，反应条件同第二轮反应，电泳结果显示产物大小与预期相一致(图6)。

由于Pyrobest DNA聚合酶不仅具有5’～3’聚合酶活性，还具有3’～5’外切酶的活性，在PCR产物末端不具有普通TaqDNA聚合酶留下的polyA黏性末端，为了方便与克隆载体连接，本发明对PCR合成的基因PAPs末端进行了修饰，添加黏性末端polyA尾巴，反应体系50μL：Pyrobest DNA聚合酶产物(PAPs)40μL，添“A”反应混和液10μL，Taq DNA聚合酶5U；72℃延伸30min。

回收添“A”反应产物，并与T-Easy载体的连接，通过蓝、白斑筛选，挑取阳性转化子，PCR及Ecor I单酶切鉴定结果表明重组质粒含有PAPs(图7)，重组质粒命名为T-Easy-PAPs。

分别以T7与SP6启动子对阳性转化子的外源片段进行双向测序，用VectorNT8.0软件对基因序列进行分析比较，结果表明PAPs为728bp，基因序列与设计结果完全一致，说明基因改造成功。该序列由北京三博远志生物公司测定(SEQ ID NO1)。

3.酵母分泌型表达载体的构建

本发明按图8所示的策略构建酵母分泌型表达载体pPIC9K-PAPs。将重组质粒T-easy-PAPs经Not I与SnaB I双酶切后获得基因PAPs(图9)，在T₄ Ligase的作用下，正向插入与同样经Not I和SnaB I双酶切的pPIC9K载体，构建了分泌型酵母表达载体pPIC9K-PAPs，经Not I与SnaB I双酶切、及以引物Y1和Y2(不含酶切位点的引物P1与P2)的PCR扩增、5’AOX1与3’AOX1为引物PCR扩增均证明阳性质粒构建成功(图10)，并采用热激法转化大肠杆菌JM110。经PCR与双酶切鉴定为阳性的质粒分别以5’AOX1与3’AOX1为引物从两端进行序列测定，测序结果用VectorNT8.0软件进行分析，结果表明：外源基因片段PAPs已正确插入表达载体，并且重组表达载体阅读框正确。该序列由北京三博远志生物公司测定(SEQ ID NO2)。

4.毕赤酵母的电击转化和阳性重组子的筛选

转化方法参照刘飞鹏等(刘飞鹏等，生物工程进展1996，16(3)：6-9.54)，按照图11所示将PAPs转化毕赤酵母GS115。经Sal I酶切线形化的表达载体pPIC9K-PAPs，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，在MD平板上30℃培养直至转化子出现。

再挑取单菌落在MM和MD平板培养基30℃培养两天，对转化子进行了表现型鉴定，结果表明：3、10、13、16、19、20等菌落在两种培养基上均正常生长，为Mut⁺转化子(图12)；而6、7、8、9、14、15等菌落只可在MD培养基上正常生长，为Mut^s转化子。根据表现型鉴定，本发明共得到pPIC9K-PAPs的Mut⁺转化子31个。

本发明还以5’AOX1和3’AOX1引物，通过PCR扩增对转化子做了进一步的鉴定，本发明得到了27个pPIC9K-PAPs的阳性Mut⁺转化子(图13)。

5.重组酵母转化子的诱导表达及表达产物的分析

取重组酵母转化子在YPD平板上28℃培养48h，挑取单菌落接入BMGY培养液中，28℃培养36h，4℃、1500rpm离心10min收集菌体，经无菌水重新悬浮后接入BMMY培养液中，28℃诱导96h，每隔24h加入1％的甲醇，4℃、1500rpm离心10min，收集上清液。表达产物经12％SDS-PAGE电泳分析，结果表明得到了分子量约为28kD左右的蛋白条带，空载体诱导(阴性对照)表达产物则没有该蛋白条带(如图14)。初步推测该蛋白条带为PAPs在酵母菌中的表达产物。对表达产物的Western-blotting分析结果表明，该28kD左右的蛋白与PAP抗体有明显的杂交信号，说明表达产物为目的缺失型PAP蛋白(如图15)。

经SDS-PAGE电泳分析表明，PAPs基因在毕赤酵母中的表达量约为180-200mg/L，明显高于未改造的缺失型PAP基因(图16)。

7.PAPs表达产物的浓缩和抗病性测定

本发明采用硫酸铵盐析法对PAPs表达产物进行了沉淀。在100ml发酵产物上清液中缓缓加入55％硫酸铵，4℃沉淀5h，3000g离心30min，将沉淀溶于20mL蒸馏水中，装入透析袋于4℃下蒸馏水中透析24小时，中间更换3次蒸馏水，并用磁力搅拌器缓慢搅拌。

对烟草花叶病毒(TMV)的抗性测定采用半叶法进行，供试植物为TMV的枯斑寄主—心叶烟，病毒接种方法为人工机械摩擦方法。试验共设6个处理：

处理1：PAPs表达产物与病毒液1∶1混合接种

处理2：PAPs表达产物喷施10小时后，再接种病毒

处理3：接种病毒10小时后，喷施PAPs表达产物

处理4：空载体表达产物与病毒液1∶1混合接种

处理5：缺失型PAP基因的毕赤酵母表达产物与病毒液1∶1混和接种

处理6：磷酸盐缓冲液与病毒液1∶1混合接种(阳性对照)。

每个处理接种9片叶，26℃下观察烟叶发病情况，记载枯斑数量并计算对病毒的抑制率：抑制率＝(阳性对照病斑数-病斑数)÷阳性对照病斑数×100％

生物学测定结果表明：26℃下2～3天即可发现在PB缓冲液以及PIC9k空载体发酵产物与TMV病毒液等体积混合接种的心叶烟叶片上产生了很多褐色局部病斑；TMV病毒液与PAPs基因表达产物混合后再接种的叶片只产生零星的小病斑，或没有枯斑产生；先喷施PAPs诱导表达产物，后接种TMV的心叶烟叶片也有少许枯斑形成，但其症状明显轻于先接种病毒后喷施PAPs表达产物的处理(见表1)，图17。这说明该蛋白对TMV的侵然具有高毒的抑制作用，其保护作用远远大于治疗作用。可以预见，将PAPs基因用于转化植物，其抗病毒的作用将比蛋白的体外抑制效果更好。

表1 PAPs表达产物对TMV的抑制效果

处理	平均枯斑数	平均抑制效果
处理	平均枯斑数	平均抑制效果	处理1处理5处理2处理3处理4	3±26±212±629±343±13	94.1％88.2％76.4％-42.1％-
处理6	51±10	0％	处理1处理5处理2处理3处理4	3±26±212±629±343±13	94.1％88.2％76.4％-42.1％-

体外活性测定结果也表明，改造后的基因PAPs仍然具有活性，其表达产物具有对病毒侵然的抑制作用，说明PAPs基因在毕赤酵母GS115中也得到了正确表达。

附录：

SEQ ID NO1：(基因PAPs的核苷酸序列，共728bp)：

TACGTAGTGAACACTATCATCTACAACGTTGGTTCCACTACTATCTCCAAGTACGCTACTTTCTT

SnaBI

GAACGACTTGAGAAATGAGGCTAAGGACCCATCCTTGAAGTGTTACGGTATTCCAATGTTGCCAA

ACACTAACACTAATCCAAAGTACGTTTTGGTTGAGTTGCAGGGTTCCAACAAGAAGACCATCACT

TTGATGTTGCGCCGCAATAATTTGTACGTTATGGGTTACTCCGACCCATTCGAAGCTAACAAGTG

TCGCTACCACATTTTCAACGACATTTCCGGTACTGAGCGCCAGGACGTTGAGACTACTTTGTGTC

CAAACGCTAATTCCCGCGTTTCCAAGAACATCAACTTCGACTCCCGCTACCCAACTTTGGAGTCC

AAGGCTGGAGTTAAGTCCCGCTCCCAGGTTCAGTTGGGTATCCAGATTTTGGACTCCAATATTGG

TAAGATTTCCGGTGTTATGTCCTTCACTGAGAAGACTGAGGCTGAGTTCTTGTTGGTTGCTATTC

AGATGGTTTCCGAGGCTGCTCGCTTCAAGTACATTGAGAATCAGGTTAAGACTAATTTCAATCGC

GCTTTCAACCCAAACCCAAAGGTCTTGAATTTGCAGGAGACTTGGGGTAAGATTTCCACTGCTAT

CCACGGTGCTAAGAACGGTGTTTTGCCAAAGCCATTGGAGTTGGTTGACGCTTCCGGTGCTAAGT

GGTAG GCGGCCGC

*** NotI

SEQ ID NO2：(酵母分泌型表达载体pIC9K-PAPs)

1 GACAGCCTAATATCACGAGAGGAGCGTCGTGATTCACTTTTGATACCACA

51 TCATATAGCTAACTTCAAAATGCGAACTGTCCCAATGAAAGGCCTTGATT

101 GACGACCTTTACGACACTGAGAAGATCAAAAACAACTATATCGAGGATCA

151 ACG ATGAGATTTCCTCATTTTACTGCAGTTTATTCGCAGCATCTCGCATA

启动子

201 GCTGCTCCAGTCACAACTACAACAGAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCT

251 GAAGCTGTCATCGGTTACTCCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTG

a-Factor信号肽序列

301 TTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACT

351 ACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAG

401 AGAGGCTGAAGCTTACGTAGTGAACACTATCATCTACAACGTTGGTTCCA

SnaBI

451 CTACTATCTCCAAGTACGCTACTTTCTTGAACGACTTGAGAAATGAGGCT

501 AAGGACCCATCCTTGAAGTGTTACGGTATTCCAATGTTGCCAAACACTAA

551 CACTAATCCAAAGTACGTTTTGGTTGAGTTGCAGGGTTCCAACAAGAAGA

601 CCATCACTTTGATGTTGCGCCGCAATAATTTGTACGTTATGGGTTACTCC

651 GACCCATTCGAAGCTAACAAGTGTCGCTACCACATTTTCAACGACATTTC

701 CGGTACTGAGCGCCAGGACGTTGAGACTACTTTGTGTCCAAACGCTAATT

751 CCCGCGTTTCCAAGAACATCAACTTCGACTCCCGCTACCCAACTTTGGAG

801 TCCAAGGCTGGAGTTAAGTCCCGCTCCCAGGTTCAGTTGGGTATCCAGAT

851 TTTGGACTCCAATATTGGTAAGATTTCCGGTGTTATGTCCTTCACTGAGA

901 AGACTGAGGCTGAGTTCTTGTTGGTTGCTATTCAGATGGTTTCCGAGGCT

951 GCTCGCTTCAAGTACATTGAGAATCAGGTTAAGACTAATTTCAATCGCGC

1001 TTTCAACCCAAACCCAAAGGTCTTGAATTTGCAGGAGACTTGGGGTAAGA

1051 TTTCCACTGCTATCCACGGTGCTAAGAACGGTGTTTTGCCAAAGCCATTG

1101 GAGTTGGTTGACGCTTCCGGTGCTAAGTGGTAG GCGGCCGCGAATTAATT

*** NotI

1151 CGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGA

1201 CCGGTCTGCsss

Claims

1.人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAPs，其特征在于具有SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。

2.一种重组质粒，其特征在于含有权利要求1所述的基因PAPs。

3.根据权利要求2所述的重组质粒为T-Easy-PAPs，其含有SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的基因PAPs。

5.根据权利要求4所述表达载体为pPIC9K-PAPs，其含有SEQ ID NO2所述的核苷酸序列。

6.一种重组工程菌，其特征在于含有权利要求5所述的表达载体pPIC9K-PAPs和宿主细胞。

7.根据权利要求6所述的重组工程菌，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115菌株。

8.权利要求1所述的人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAPs在植物病毒病害防治中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，是将权利要求1所述的基因PAPs表达的蛋白用于植物病毒病害防治。

10.根据权利要求9所述的应用，所述植物病毒为烟草花叶病毒。