CN108076931A - 一种提高植物对烟草花叶病毒系统性抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高植物对烟草花叶病毒系统性抗性的方法。本发明首先公开了美洲商陆抗病毒蛋白PAP在提高植物对烟草花叶病毒系统性抗性中的应用，并提供了该应用的具体方法，是采用美洲商陆抗病毒蛋白对本生烟幼苗进行喷洒。本发明与用PBS喷洒烟草作为对照，然后分别接种含有绿色荧光蛋白标记的烟草花叶病毒，观察和检测病毒在烟草中的复制情况和相关生理参数的变化情况。结果表明：采用本发明的方法，TMV的复制量显著降低，植物的系统性抗性显著增强；实现了提高植物对TMV的系统性抗性。有望将美洲商陆抗病毒蛋白开发成新型低毒生物农药防治农业生产上的病毒性疾病，具有广阔的应用价值、市场前景和和经济效益。

Description

一种提高植物对烟草花叶病毒系统性抗性的方法
技术领域
本发明涉及改变植物系统性抗性防御病毒入侵的技术。特别是涉及利用美洲商陆抗病毒蛋白Pokeweed antiviral protein(PAP)改变植物系统性抗性防御病毒入侵的方法。
背景技术
植物在生长发育的过程中经常会遭受病原菌的入侵，植物在长期与病原菌相互斗争的过程也进化了一系列的防御机制来应答病原菌的入侵。当植物遭受病原菌的入侵时，植物可以识别相应的病原菌，植物通过自身的抗性基因编码的蛋白质通过间接或直接的方式与病原菌无毒性的基因相互作用来实现的。然后激活植物的局部和系统性抗性反应，从而增强植物对病原菌的抗性。
一些植物拥有特殊的代谢途径来合成大量的有价值的蛋白，这些蛋白可以用来防治病原菌。例如，某些植物基因可以编码核糖体失活蛋白Ribosome inactivatingproteins(RIPs)，并且近年来该类蛋白也被证明了具有抗病活性。RIPs广泛分布于植物界，在一些真菌、细菌还有水藻中也相继发现。不同的RIPs相继被报道具有着包括抗肿瘤、广谱抗病毒、核糖核酸酶活性和脱氧核糖核酸酶等活性。美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)是I型RIP的成员，它从美洲商陆植物的树叶，浆果和根等不同部位的提取物中分离出来。PAP在植物中的抗病毒活性及其在植物系统性抗性中的潜在作用还很少报道。全世界许多蔬菜和观赏性作物在生长发育的过程中经常遭受病毒和真菌的感染，由病毒和真菌引起的疾病对它们的产量和品质造成了巨大的损失。因此寻找有效途径来控制病毒和真菌的入侵是非常必要的。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种提高植物对烟草花叶病毒系统性抗性的方法。
本发明公开了美洲商陆抗病毒蛋白PAP在提高植物对烟草花叶病毒系统性抗性中的应用。
本发明还公开了一种提高植物对烟草花叶病毒系统性抗性的方法，是用美洲商陆抗病毒蛋白对本生烟幼苗进行喷洒。
具体的，美洲商陆抗病毒蛋白的使用浓度推荐0.1mg/mL。施用方式为：对生长6-7周的本生烟幼苗的2片下位叶片连续喷洒3次，每次间隔24小时。
本发明用PAP预处理烟草，用0.02M PBS(pH7.0)喷洒烟草植物下位叶片作为本发明的对照，然后分别接种含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的烟草花叶病毒(TMV-GFP)，观察和检测病毒在烟草中的复制情况和相关生理参数的变化情况：(1)TMV-GFP侵染7天后，通过台盼蓝试剂对感染TMV-GFP的植物叶片进行染色，检测植物细胞死亡的积累情况。结果表明病毒感染植物后，细胞死亡严重，然而经过PAP预处理的本生烟在感染病毒后，细胞死亡减轻。说明了PAP预处理植物可以增强植物的系统性抗性。
(2)TMV-GFP侵染7天后，通过硝基蓝四唑(NBT)和二氨基联苯胺(DAB)对感染TMV-GFP的植物叶片进行染色，检测活性氧的积累情况。结果表明病毒感染植物后，活性氧的积累显著增多，然而经过PAP预处理的本生烟在感染病毒后，活性氧的积累明显减轻。说明了PAP预处理植物可以增强植物的系统性抗性。
(3)收集感染TMV-GFP 7天和15天的本生烟，检测电导率和丙二醛的含量。结果表明，病毒感染植物后，电导率和丙二醛的含量显著上升，植物细胞受损程度严重，然而经过PAP预处理的本生烟在感染病毒后，电导率和丙二醛的含量显著下降，植物细胞受损程度下降，说明了PAP预处理植物可以增强植物的系统性抗性。
(4)TMV-GFP侵染本生烟7天后，在长波紫外灯的照射下，进行GFP荧光拍照，可以直观可视化跟踪TMV在PAP或者PBS喷洒的本生烟中的复制情况。结果表明PAP处理的本生烟中GFP荧光显著减弱，可以直观的证明了PAP处理的本生烟中病毒复制量显著下降，植物的系统性抗性显著增强。
(5)分别提取感染TMV-GFP 7天和15天的总RNA。通过荧光定量PCR的方法进一步在分子水平上检测TMV在PAP或者PBS喷洒的本生烟中的复制情况。结果表明PAP处理的本生烟中病毒复制量显著下降，植物的系统性抗性显著增强。
采用本发明PAP预处理的烟草，TMV的复制量显著降低，植物的系统性抗性显著增强。实现了提高植物对TMV的系统性抗性。有望将美洲商陆抗病毒蛋白开发成新型低毒生物农药防治农业生产上的病毒性疾病。因此具有广阔的应用价值、市场前景和和经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例通过台盼蓝、硝基蓝四唑(NBT)和二氨基联苯胺(DAB)对经过PAP预处理然后感染TMV-GFP的本生烟植物叶片进行染色，检测植物细胞死亡和活性氧的积累情况。
图2为本发明实施例检测经过PAP预处理然后感染TMV-GFP的本生烟植物中的电导率和丙二醛的含量。
图3为本发明实施例观察经过PAP预处理然后感染TMV-GFP的本生烟植物中TMV的积累情况和通过荧光定量PCR的方法在分子水平上检测TMV在经过PAP预处理然后感染TMV-GFP的本生烟植物中的复制情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清晰，以下结合实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
烟草花叶病毒(TMV-GFP)由David Baulcombe(the University of Cambridge)惠赠(Zhu et al.,2016,Eur J Plant Pathol,146:541–549)。
实施例一：1.从春季的美洲商陆叶片中纯化出美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)，纯化方法可参考Baldwin等人的方法(Biochimica et BiophysicaActa,2009,1789,109–116)。用0.1mg/mL的PAP水溶液对生长6-7周、长势大小一致的本生烟幼苗的2片下位叶片连续喷洒3次，液体全部覆盖到叶片上为止，每次间隔24小时。用0.02M PBS(pH7.0)喷洒本生烟植物下位叶片作为对照，处理方法和PAP一致。然后将幼苗放置在人工气候室中进行培养，其中温室中的培养条件进行适当的控制：温度控制在25℃，光照时间为16小时，黑暗时间为8小时，光照强度为100μmolm-2s-1。
2.用含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的烟草花叶病毒(TMV-GFP)通过机械摩擦接种的方法对PAP或者PBS喷洒的本生烟进行接种侵染。首先将少量的无菌石英砂洒在本生烟叶片上，然后在叶片上接种5μlTMV-GFP接种物，用手指轻轻摩擦叶片造成微伤口，使得病毒接种液均匀分布在叶片上。
3.在TMV-GFP侵染本生烟7天后，通过台盼蓝试剂对感染TMV-GFP的植物叶片进行染色，检测植物细胞死亡的积累情况。具体方法：将新鲜的本生烟植物叶片放入1.25mg/mL的台盼蓝溶液中，沸水浴加热3min，立即将叶片放入95％的乙醇溶液中，加热至90℃脱色10min，重复脱色2-3次。染色的叶片用扫描仪进行扫描分析。如图1a结果表明，病毒感染植物后，细胞死亡严重，然而经过PAP预处理的本生烟在感染病毒后，细胞死亡减轻。说明了PAP预处理植物可以增强植物的系统性抗性。
4.在TMV-GFP侵染本生烟7天后，通过0.5mg/mL硝基蓝四唑(NBT)对感染TMV-GFP的本生烟植物叶片进行染色，检测活性氧超氧离子的积累情况。具体方法为：将新鲜的本生烟植物叶片放入到0.5mg/mL NBT溶液中，抽真空2-3h。然后将叶片放入95％的乙醇溶液中，加热至90℃脱色15min左右，重复脱色2-3次。染色的叶片用扫描仪进行扫描分析。如图1b结果表明，病毒感染植物后，活性氧超氧离子的积累显著增多，然而经过PAP预处理的本生烟在感染病毒后，活性氧超氧离子的积累明显减轻。说明了PAP预处理植物可以增强植物的系统性抗性。
5.在TMV-GFP侵染本生烟7天后，通过2mg/mL二氨基联苯胺(DAB)对感染TMV-GFP的本生烟植物叶片进行染色，检测活性氧过氧化氢的积累情况。具体方法为：将新鲜的本生烟植物叶片放入到2mg/mL DAB溶液中，抽真空8-9h。然后将叶片放入95％的乙醇溶液中，加热至90℃脱色15min左右，重复脱色2-3次。染色的叶片用扫描仪进行扫描分析。如图1b结果表明，病毒感染植物后，活性氧过氧化氢的积累显著增多，然而经过PAP预处理的本生烟在感染病毒后，活性氧过氧化氢的积累明显减轻。说明了PAP预处理植物可以增强植物的系统性抗性。
6.在TMV-GFP侵染本生烟7天和15天后，分别收集病毒侵染7天和15天的本生烟植物叶片，通过检测电导率的积累来反映细胞死亡的程度。具体方法为：称量0.2g左右的新鲜本生烟植物叶片，用剪刀将本生烟植物叶片剪碎，放入试管中，加入5mL的蒸馏水，并盖上塞子，抽真空渗透25min左右，然后定容至5mL，静置1小时，然后用电导率仪器测试电导率(Ri)。然后将叶片放入沸水浴中煮5min，冷却到室温后再测定电导率(Rt)的大小，相对电导率Ro＝Ri/Rt用来表示质膜的通透性。如图2a所示，结果表明，病毒感染植物后，电导率的含量显著上升，植物细胞受损程度严重，细胞死亡加重，然而经过PAP预处理的本生烟在感染病毒后，电导率的含量显著下降，植物细胞受损程度下降，细胞死亡减轻。说明了PAP预处理植物可以增强植物的系统性抗性。
7.在TMV-GFP侵染本生烟7天和15天后，分别收集病毒侵染7天和15天的植物叶片，通过检测丙二醛的积累来反映细胞膜系统受损的程度。具体方法为：取0.5g本生烟植物叶片用5mL 5％三氯乙酸(TCA)研磨匀浆，匀浆液在2500×g的离心力作用下离心10min后取上清液2mL，再加入含0.67％硫代巴比妥酸(TBA)的2mL 5％TCA溶液，混匀。混合液置于沸水浴中加热30min后迅速冷却，在2500×g的离心力作用下离心10min，取上清液，用分光光度计分别测定OD450、OD532和OD600值，以公式：C(μM)＝6.45(OD532-OD600)-0.56OD450，计算本生烟植物叶片中MDA的含量。如图2b所示，结果表明，病毒感染植物后，丙二醛的含量显著上升，细胞膜系统受损严重，然而经过PAP预处理的本生烟在感染病毒后，丙二醛的含量显著下降，细胞膜系统受损程度下降。说明了PAP预处理植物可以增强植物的系统性抗性。
8.TMV-GFP侵染本生烟7天后，在B-100AP长波紫外灯的照射下，使Canon G15数码相机进行GFP荧光拍照，可以直观可视化跟踪TMV在PAP或者PBS喷洒的本生烟中的复制情况。如图3a结果表明PAP处理的本生烟中GFP荧光显著减弱，可以直观的证明了PAP处理的本生烟中病毒复制量显著下降，植物的系统性抗性显著增强。
9.在TMV-GFP侵染本生烟7天和15天后，分别收集TMV侵染7天和15天的本生烟植物叶片，提取本生烟植物总RNA。利用软件设计特异性引物扩增烟草花叶病毒的部分移动蛋白序列，TMV-MP-F：5′-GACCTGACAAAAATGGAGAAGATCT-3′(SEQ ID NO.1)和TMV-MP-R：5′-GAAAGCGGACAGAAACCCGCTG-3′(SEQ ID NO.2)，通过荧光定量PCR的方法进一步在分子水平上检测TMV在PAP或者PBS喷洒的本生烟中的复制情况。如图3b所示，结果表明PAP处理的本生烟中病毒复制量显著下降，植物的系统性抗性显著增强。有望将美洲商陆抗病毒蛋白开发成新型低毒生物农药防治农业生产上的病毒性疾病。因此具有广阔的应用价值、市场前景和和经济效益。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 一种提高植物对烟草花叶病毒系统性抗性的方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gacctgacaa aaatggagaa gatct 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacctgacaa aaatggagaa gatct 25

Claims (4)

1.美洲商陆抗病毒蛋白PAP在提高植物对烟草花叶病毒系统性抗性中的应用。
2.一种提高植物对烟草花叶病毒系统性抗性的方法，其特征在于，是用美洲商陆抗病毒蛋白对本生烟幼苗进行喷洒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述美洲商陆抗病毒蛋白的使用浓度为0.1mg/mL。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述喷洒的具体操作为：对生长6-7周的本生烟幼苗的2片下位叶片连续喷洒3次，每次间隔24小时。
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