CN102286097A - 人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白（pap）抗原、抗体及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)抗原、抗体及其制备方法、应用”，属于生物技术领域。人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白抗原，包括具有免疫原性的载体蛋白和与其偶联的人工合成的多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO1或/和SEQ ID NO2。本发明应用该人工合成多肽与匙孔嘁血蓝蛋白的偶联物作为抗原，制备得到了三种PAP抗血清，可应用于PAP制剂、PAP基因原核表达和真核表达产物、转基因再生植株等检测，能够采用免疫学手段检测PAP及其基因的表达情况，为PAP的检测提供物质基础。

Description

人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)抗原、抗体及其制备方法、应用

技术领域

本发明专利属于生物学和生物技术领域，特别是涉及利用人工合成的多肽作为抗原，制备得到美洲商陆抗病毒蛋白多克隆抗体的技术。 

背景技术

美洲商陆抗病毒蛋白(Pokeweed antiviral protein，PAP)是从美洲商陆(Phytolaccaamericana L.)植株春天叶片中分离出的单链(I型)核糖体失活蛋白(Ribosome InactivatingProteins，RIPs)，分子量约为30kD。RIPs具有独特的rRNA-N糖苷酶活性，能够水解真核生物核糖体28S大亚基RNA GAGA茎环(stemloop)结构上特定位点的腺嘌呤残基，从而使核糖体失活，干扰核糖体与延伸因子的结合，继而抑制蛋白质的生物合成(Irvin，J.D.&Uckun，F.M.Pokeweed antiviral protein：ribosome inactivation and therapeutic applications.Pharmacol.Ther.1992，55：279-302)。 

自Duggar等1925年发现商陆中存在着一种潜在的能阻碍植物病毒传播的因子，Kassanis等从美洲商陆叶片中分离、纯化了该阻碍因子，并初步描述了其特性后，人们开始了一系列研究。研究发现PAP是目前所有RIPs中最为有效的抗病毒蛋白，低浓度就具有很强的抗性。其不仅对7个病毒组的7种植物病毒有抑制作用，还对包括艾滋病毒(human immunodeficiencyvirus 1，HIV 1)在内的多种动物病毒、真菌、细菌的侵染有一定的抑制作用，在体外，该蛋白可以阻碍脊髓灰质炎病毒和流感病毒的复制，在体外无细胞蛋白质合成系统(兔网织红细胞)中，可以阻碍真核生物蛋白质的合成(Kassanis，B.，&A.Kleczkowski.The isolationand some properties of a virus-inhibiting protein from Phytolacca esculents.J.Gen.Microbiol.Academic Press，N.Y.1948；Tomlinson.J.A.et al.，The inhibition ofinfection by cucumber mosaic virus and influenza virus by extract of Phytolaccaamericana，J.Gen.Virol 1974，22，225-232；Aron G M，Irvin J D，Antimicrob.AgentsChemother.1980，17：1032-1033；Zarling J M，Moran P A，Haffar O et al.Inhibitionof HIV replication by pokeweed antiviral protein targeted to CD4 cells by monoclonalantibodies.Nature，1990，347：92-95；Chen Z C，White R F，Antoniw J F，et al.Effectof pokeweed antiviral protein(PAP)on the infection of plant viruses.Plant Pathology，1991，40：610-612；Oalson，M.S.Ramakrishnan，T.Anand，Ribosomal inhibitory proteins from plants inhibits HIV-1replication in acutely infected peripheral bloodmononuclear cells，AIDS Res.Hum.Retrovir.1991，7，1025-1030)。 

正是由于PAP有着这种广谱性的抑制危害动、植物及人体的病原真菌、细菌和病毒的作用，因此其越来越引起人们的好奇和重视，不断的促使人们对其进行深入研究，并希望在不久的将来在农业和医学领域发挥其特殊的作用和实用价值。 

成熟的PAP全长262个氨基酸，其中N端22个氨基酸组成信号肽，负责将PAP从核糖体向细胞膜运输，C端25个氨基酸为毒性区(Nonzingo，A.F.E.J.Collons，The 2.5Astructure of plokeweed antiviral protein，J.Mol.Biol.1993，233，705-715)。缺失C端毒性区的PAP突变体对细胞的毒性很低，仍具有较强的抗病毒活性(Jennifer K.Lodge，Nilgun E.Tumer.Broad-spectrum virus resistance in transgenic plants expressingpokeweed antiviral protein.1993，90：7089-7093.)。Lodge等将PAP基因导入烟草和马铃薯，获得的转基因植株及其后代具有广谱的抗病毒特性，包括对机械和蚜虫传播的病毒如马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、马铃薯卷叶病(Potato leaf roll virus，PLRV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus，AMV)等均有抗性(Jennifer K.Lodge，Nilgun E.Tumer.Broad-spectrum virus resistance in transgenicplants expressing pokeweed antiviral protein.1993，90：7089-7093)。国内学者在油菜、番茄等作物上也获得了对芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)、TMV、CMV、PVX有抗性的转基因植株(张海燕，党本元，周奕华等用微束激光穿刺技术将PAP导入油菜获得抗病毒转基因植株中国激光，1999，26(1)：1053-1056.；傅道林，王兰岚，张海燕等用微束激光穿刺技术将商陆抗病病毒蛋白(PAP)cDNA导入马铃薯的研究光子学报，2000，29(11)：970-974.)。本实验室也克隆到了缺失C、N端的PAP基因，并构建原核生物、真核生物表达载体，通过室内摇瓶发酵制备了PAP，并分别将缺失型PAP基因导入小麦、玉米、棉花和矮牵牛，获得了抗病植株(陈定虎，王锡锋，李莉等，美洲商陆抗病毒蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗病毒活性的测定[J]。农业生物技术，2003，11(2)：183-186；周倩，王锡锋，李莉，周广和，高必达.2003毕赤酵母Mut+和Muts重组子表达美洲商陆抗病毒蛋白基因的比较，植物病理学报，33(5)：425-428。)。 

在PAP基因及制剂的研究应用过程中，经常需要明确PAP基因是否表达，以及表达的情况。比如在转基因植株的检测、PAP原核和真核表达产物的检测、PAP与寄主植物的互作因子等研究中，都需要高效价、特异性的PAP抗血清。Schlick等从美洲商陆植株中分离、纯化了PAP，制备PAP的多克隆抗血清，能有效的检测PAP，但由于PAP在美洲商陆(Phytolacca americana)植株内的含量有限，纯化步骤繁琐、费时，使得PAP的提取非常困难(Jean-LucSchlick，Philippe Dulieu，Development of a double sandwich ELISA able to discriminatebetween free PAP and complexed PAP in leaf extracts.Plant Science 1999，140：1-8.)。本实验室曾利用原核表达产物制备了多克隆抗血清，但特异性差，不能满足转基因植株和PAP表达产物检测的需要。 

发明内容

本发明应用人工合成多肽与具有免疫原性的载体蛋白(马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白)的偶联产物作为抗原，制备得到了兔多克隆抗体，该抗体可应用于PAP制剂、PAP基因原核和真核表达产物、转基因再生植株、PAP与寄主植物的互作因子等研究中，能够采用免疫学手段检测PAP及其基因的表达情况，为PAP的检测提供物质基础。 

人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)抗原，包括具有免疫原性的载体蛋白和与其偶联的人工合成的多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO1或/和SEQ ID NO2。 

所述具有免疫原性的载体蛋白为马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白(Keyhole LimpetHemocyanin，KLH)。 

所述的抗原制备得到的美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)抗体。 

其中抗体为兔多克隆抗体。 

所述的抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求1或2所述的抗原免疫兔子，然后取其静脉血或全血，分离抗血清纯化即可。 

所述抗原采用下述方法制得：人工合成SEQ ID NO1或/和SEQ ID NO2所示的多肽，将其与马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白偶联得到。 

所述免疫的程序为：1)首免：600ug/只，将权利要求1或2所述的抗原溶液加等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下6点注射，2)二免、三免、四免分别在第21、35和49天注射，每次400ug/只，权利要求1或2所述的抗原溶液加等体积弗氏不完全佐剂乳化后皮下4点注射。 

所述兔子为新西兰大白兔。 

所述的美洲商陆抗病毒蛋白抗体在天然的美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)或缺失型PAP基因的表达产物或转基因美洲商陆抗病毒蛋白基因的植株检测中的应用。 

本发明根据本实验室改造的缺失了N端信号肽及C端毒性区的美洲商陆抗病毒蛋白(缺失型PAP)基因片段推测的氨基酸的序列(Genbank No.AF338910)，序列如SEQ ID NO3所示，通过在GenBank的BLAST比对，选择免疫原性和亲水性均较好、线性表位可能性大、 且预测无二级结构的多肽序列(SEQ.ID NO.1：DISGTERQDVETTLC和SEQ.IDNO.2：CRYPTLESKAGVKSR)。人工合成多肽片段，并与具有免疫原性的载体蛋白匙孔嘁血蓝蛋白偶联，免疫新西兰大白兔，制备得到了抗体，该抗体可特异性的检测美洲商陆植株内的天然PAP、缺失型PAP基因在原核和真核生物内的表达产物、以及其在转基因植物的表达情况。 

本发明的抗原有三个，其中的一个是采用SEQ ID NO1所编码的多肽与马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白偶联得到，另一个是采用SEQ ID NO2所编码的多肽与马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白偶联得到，还有一个是采用上述两个抗原的混合体作为抗原。 

上述抗原分别制备得到了三种兔多克隆抗体antiPAP1、antiPAP2和antiPAP3，其中antiPAP1效价最高，说明SEQ ID NO1所示的多肽偶联得到的抗原，其免疫原性最好。应用该抗体检测美洲商陆植株、缺失型PAP基因在酵母中的表达产物、及转基因矮牵牛中的PAP表达情况，均获得了成功。 

附图说明

图1.SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化后的抗体 

其中泳道1：中分子量蛋白非预染MarkerIV 

泳道2：抗原亲和纯化抗SEQ ID NO1多肽的兔多克隆抗体(antiPAP1) 

图2抗体的特异性检测 

其中泳道1：预染SDS-PAGE低分子量标准蛋白质；泳道2：阴性对照(非转基因矮牵牛植株)；泳道3：转缺失型PAP基因矮牵牛植株；泳道4：缺失型PAP基因在酵母中的表达产物 

图3转缺失型PAP基因矮牵牛植株的检测 

其中泳道1：预染SDS-PAGE低分子量标准蛋白质；泳道2：阴性对照(非转基因矮牵牛植株)；泳道3：美洲商陆春天植株；泳道4-9：转缺失型PAP基因矮牵牛植株；泳道10：缺失型PAP基因在酵母中的表达产物 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。 

下述实施例中所用的方法如无特殊说明均为常规方法。 

试剂和仪器 

用于多肽偶联的载体蛋白马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白试剂盒(ImjectR MaleimideActivated mcKLH Kit)、免疫动物的完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂为Pierce公司(PierceBiotechnology，USA)产品。用于抗血清纯化的CNBr-activated Sepharose 4B购自GE Healthcare Life Science，Protein A凝胶为北京康为世纪生物科技有限公司(CWBIO)产品。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(H+L)购自Promega公司。TMB底物显色试剂盒(20x)、中分子量蛋白非预染Marker IV为北京康为世纪生物科技有限公司(CWBIO)产品。HD-4层析工作站出自上海沪西仪器厂，层析柱为Phamacia产品，DEM-3型自动洗板机为北京拓普分析仪器有限责任公司产品，酶标仪为BIO-RAD(680型)产品。免疫用新西兰大白兔，体重约2kg，来自北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂。PAP在酵母中的表达产物和转基因矮牵牛植株保存在本实验室，可以向公众提供。其它生化试剂均为进口或国产分析纯。 

实施例1 

1.1多肽序列的设计和合成 

根据本实验室改造的缺失型PAP基因片段(缺失了N端信号肽及C端致毒区)推测的氨基酸的序列(Genbank No.AF338910)(SEQ ID NO3)，通过BLAST与Genbank检索的序列进行同源比对分析，利用DNAStar和Biosum等分析软件进行蛋白的二级结构和抗原表位预测，选择了2个免疫原性和亲水性均较好、线性表位可能性大、且预测无二级结构的多肽序列，SEQ ID NO1：DISGTERQDVETTLC和SEQ ID NO2：CRYPTLESKAGVKSR。多肽由上海吉尔多肽有限公司(Shanghai GL peptide Ltd.)合成。 

1.2多肽偶联制得抗原 

由于小分子多肽没有免疫原性，需要偶联到一个具有免疫原性的载体蛋白上，将偶联物作为抗原，用于免疫动物。本发明用于多肽偶联的载体蛋白为匙孔嘁血蓝蛋白(Keyhole LimpetHemocyanin，KLH)，偶联步骤按照试剂盒(ImjectR Maleimide Activated mcKLH Kit)的说明进行，偶联结束后通过电泳检测偶联效率。 

1.3抗血清的制备 

1.3.1动物免疫 

免疫前，每只兔子耳缘静脉取血0.5-1ml，分离抗血清，4℃保存，备用。 

用1XPBS缓冲液将偶联物稀释到1mg/ml，用于免疫新西兰大白兔。分别以序列为SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO1/SEQ ID NO2的多肽偶联物为抗原免疫三只动物，动物编号分别为R01、R02和R03，获得的血清分别编号为antiPAP1、antiPAP2、antiPAP3。 

每只兔子总共免疫4次。1)首免：600ug/只，抗原溶液加等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下6点注射。2)二免、三免、四免分别在第21、35和49天注射，每次400ug/只，抗原溶液加等体积弗氏不完全佐剂乳化后皮下4点注射。 

1.3.2抗血清的效价测定和收集 

4次免疫结束后10天，每只兔子耳缘静脉取血0.5-1ml，分离抗血清，间接ELISA检测 免疫后血清效价。抗原为人工合成的多肽，一抗为免疫后的抗血清。抗血清分别稀释200倍、1000倍、5000倍、25000倍、125000倍、625000倍、3125000倍。空白对照为PBS缓冲液，阴性对照为免疫前血清，稀释10000倍。二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG，稀释10000倍使用。当效价达到要求后，以心脏穿刺的方式采取兔子的全血，分离PAP抗血清。 

1.3.3抗血清的效价测定 

间接ELISA检测步骤：1)以2ug/ml的人工合成的PAP多肽包被酶标板，100ul/孔，4℃冰箱过夜；2)PBST洗涤3次，每次振板5秒；3)5％脱脂奶封闭，300ul/孔，37℃孵育2h；4)PBST洗涤3次；5)将稀释后的待检测抗血清(一抗)或免疫前血清加入酶标板中，100ul/孔，37℃，孵育1h；6)PBST洗涤3次；7)加入二抗，即HRP标记的山羊抗兔IgG稀释10000倍，100ul/孔，37℃，孵育40min；8)PBST洗涤3次；9)加入现配的TMB底物显色工作液，100ul/孔，显色10min；10)加入2M H₂SO₄终止显色反应，50ul/孔；11)酶标仪测450nm波长的OD值。 

1.3.4PAP特异性抗体IgG的纯化和纯度测定 

采用抗原亲和纯化方法从PAP抗血清中纯化特异性抗体IgG。抗体纯化采用ProteinA凝胶和CnBr-activated Sepharose 4B，以人工合成的PAP多肽为抗原，使其与亲和层析填料偶联制备亲和柱，层析纯化与抗原特异性结合的抗体，并进行洗脱、回收。纯化后的PAP抗体保存在0.01M PBS，pH7.2中，用蛋白定量检测仪测定特异抗体浓度。抗体纯化由北京康为世纪生物科技有限公司(CWBIO)完成。 

采用SDS-PAGE电泳检测纯化后抗体的纯度。SDS-PAGE电泳的上样量是8ug，分离胶12％、浓缩胶4％，浓缩胶电泳电压60V，分离胶电泳电压80V，电泳结束后，采用0.05％的考马斯亮蓝R250染色，甲醇、冰醋酸溶液脱色后，凝胶成像系统照相。 

1.3.5Western bolt检测 

首先从美洲商陆植株、转基因矮牵牛再生植株和缺失型PAP基因在酵母中的表达产物、以及非转基因矮牵牛植株中提取总蛋白，通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，其中分离胶12％、浓缩胶4％，浓缩胶电泳电压60V，分离胶电泳电压80V。随后，在37V恒压情况下，4。C过夜，将蛋白电转移到蛋白杂交膜上。将膜在5％脱脂奶粉37℃封闭2h，PBST洗涤3次，加入一抗(PAP抗体，稀释3000倍)，室温孵育2h，PBST洗涤3次，每次10min，加入二抗(HRP标记的山羊抗兔IgG，稀释5000倍)，室温孵育1h，PBST洗涤3次，每次10min，采用DAB显色液显色，待到信号清晰后，终止反应。 

2、结果与分析 

2、1抗血清的效价检测 

以人工合成的多肽，SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)制备抗原，采用间接酶联免疫吸附法(间接EILSA)分别对三只相应动物免疫获得的PAP抗血清进行检测，血清的稀释倍数分别为200倍、1000倍、5000倍、25000倍、125000倍、625000倍、3125000倍；以免疫前同只动物的血清稀释10000倍，作为阴性对照，以PBS缓冲液为空白对照，在450nm波长下的读取OD值，实验重复2次。当同一被测样品2次重复的读数均为阴性对照2.0倍以上时(且OD值＞0.1)，该样品的稀释倍数即为抗血清的效价。检测结果表明：当antiPAP1稀释125000倍时2次重复的OD450值分别是0.613和0.541，是对照的7.1和6.0倍；当antiPAP2稀释25000倍时2次重复的OD450值分别是0.223和0.208，是对照的2.3和2.1倍；antiPAP3稀释25000倍时2次重复的OD450值分别是0.183和0.178，是对照的22和2.0倍。因此，antiPAP1效价最高，是1∶125000，说明该段多肽偶联物抗原性较好，免疫动物后，产生了较强的应答，适于准备抗血清；antiPAP2和antiPAP3的效价稍差，均为1∶25000，说明多肽SEQ ID NO2的偶联物不仅免疫原性稍差，当与SEQ ID NO1的多肽偶联物同时注射动物时，不能起到增强免疫原性的作用，还干扰了动物对SEQ ID NO1的多肽偶联物的应答(表1)。 

表1间接ELISA检测免疫后血清效价(OD值)结果 

2、2PAP抗体的纯化和纯度检测 

在效价检测的基础上，采用CNBr-activated SepharoseTM 4B对效价好的抗体antiPAP1进行了亲和纯化，并采用蛋白定量检测仪(Amersham Biosciences)测定了抗体的浓度，结果表明：antiPAP1的浓度为0.9mg/ml。 

进一步采用SDS-PAGE电泳检测了其纯度，上样量为8μg，电泳结果显示重链和轻链两条带，重链约为50kD，轻链约为25kD，重链的浓度明显大于轻链，其他杂带不明显(图1)，说明得到了纯度较高的抗体。 

2、3抗体的特异性检测及应用 

采用Western blot技术，以本发明制备的抗体antiPAP1为一抗(稀释3000倍)，对缺失型PAP基因在酵母中的表达产物和经PCR和RT-PCR检测为阳性的转缺失型PAP基因的再生矮牵牛植株(CF37②)叶组织进行了检测，以非转基因的矮牵牛为对照，目的是验证抗体的特异性，了解缺失型PAP基因是否表达，以及表达情况，检测结果表明：阴性对照与抗体无反应，酵母表达产物和PCR和RT-PCR检测的阳性转基因植株CF37②均有一条约26kD的条带与PAP抗体有强烈的反应，说明本发明制备的PAP抗体特异性较好。 

进一步采用Western blot检测技术，以antiPAP1为一抗(稀释3000倍)，对美洲商陆春天的植株中表达的天然PAP和转缺失型PAP基因的矮牵牛进行检测，以非转基因的矮牵牛为对照，结果表明：阴性对照与PAP抗体无反应，酵母表达产物和PCR和RT-PCR检测的阳性转基因植株均有一条约26kD的条带与PAP抗体有强烈的反应，美洲商陆春天植株有一条约29KD的条带与抗体有明显的杂交反应，该条带略大于缺失型PAP基因的表达产物，说明其是未缺失的天然PAP。试验结果说明本发明制备的PAP抗体可以用于美洲商陆植株中天然PAP和转基因矮牵牛植株中的缺失型PAP检测。 

Claims (9)

1.人工合成的美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)抗原，包括具有免疫原性的载体蛋白和与其偶联的人工合成的多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO1或/和SEQ ID NO2。

2.根据权利要求1所述的抗原，所述具有免疫原性的载体蛋白为马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)。

3.权利要求1或2所述的抗原制备得到的美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)抗体。

4.权利要求3所述的抗体，其中抗体为兔多克隆抗体。

5.权利要求4所述的抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求1或2所述的抗原免疫兔子，然后取其静脉血或全血，分离抗血清纯化即可。

6.权利要求5所述的制备方法，所述抗原采用下述方法制得：人工合成SEQ ID NO1或/和SEQ ID NO2所示的多肽，将其与马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白偶联得到。

7.权利要求5所述的制备方法，所述免疫的程序为：1)首免：600ug/只，将权利要求1或2所述的抗原溶液加等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下6点注射，2)二免、三免、四免分别在第21、35和49天注射，每次400ug/只，权利要求1或2所述的抗原溶液加等体积弗氏不完全佐剂乳化后皮下4点注射。

8.权利要求5所述的制备方法，所述兔子为新西兰大白兔。

9.权利要求3或4所述的美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)抗体在天然的美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)或缺失型PAP基因的表达产物或转基因美洲商陆抗病毒蛋白基因的植株检测中的应用。

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