CN103992404A

CN103992404A - 绿盲蝽超气门蛋白特异性多克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103992404A
Application number: CN201410229553.4A
Authority: CN
Inventors: 谭永安; 肖留斌; 柏立新; 孙洋; 赵静
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-05-27
Filing date: 2014-05-27
Publication date: 2014-08-20

Abstract

本发明公开了一种绿盲蝽超气门蛋白(ultraspiracle protein，ALUSP)的多克隆抗体及其制备方法和应用。本发明将经原核表达纯化的ALUSP重组蛋白应用于免疫家兔后制备了多克隆抗体，通过利用ELISA法确定了该多克隆抗体的效价后，发明人采用Western blot法确定该多克隆抗体能特异性识别ALUSP重组蛋白，并可产生特异性免疫反应。基于此，发明人还建立了一套高效、高灵敏度和准确的Western blot方法，可特异性地从绿盲蝽虫体内检测出超气门蛋白。应用本发明，可为超气门蛋白在绿盲蝽体内的组织分布以及该蛋白的快速检测和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑。

Description

绿盲蝽超气门蛋白特异性多克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体工程农业科学技术领域，具体涉及绿盲蝽超气门蛋白特异性多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

绿盲蝽Apolygus lucorum(Hemiptera:Miridae)属半翅目盲蝽科，是棉花、蔬菜、果树、牧草等多种农作物上的重要害虫。近年来，由于转Bt基因棉的大面积种植和农业产业结构的调整等原因，绿盲蝽种群数量急剧上升，加之长期依赖化学农药防治，致使绿盲蝽的抗药性日渐增强，目前农业生产上的绿盲蝽防控面临严峻挑战，急待开拓减少化学农药使用的新型无公害防控手段。迄今，多种新型昆虫生长调节剂已应用到防治绿盲蝽的危害中，如氟铃脲等第三代杀虫剂，显示出较好的杀虫效果。但是，由于这些农药的特异性靶标表达量的差异，可显著影响其药效。超气门蛋白(ultraspiracle protein，USP)就是多种昆虫生长调节剂的靶标基因，也是绿盲蝽体内一种重要的核基因。绿盲蝽USP基因在不同龄期、不同组织中的蛋白表达量均不相同，导致昆虫生长调节剂施用后，对靶标基因超气门蛋白的抑制效果出现较大差异，从而可引起农药的使用效果下降。因此要求有灵敏度高，特异性好的蛋白检测技术来分析绿盲蝽体内超气门蛋白的表达量，指导这些昆虫生长调节剂的使用时间。目前，应用在昆虫蛋白检测的方法主要有ELLSA和Western blot。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体。

本发明的另一个目的在于提供一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的制备方法。

本发明的又一个目的是提供一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的ELLSA检测方法。

本发明的又一个目的是提供一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的Western blot检测方法。

本发明的又一目的是提供一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的抗体特异性检测方法。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体，将重组ALUSP蛋白免疫家兔后制得。

一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

a、抗原处理：取纯化后的重组ALUSP蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化得到首次免疫抗原；弗氏不完全佐剂和重组ALUSP蛋白等体积混合得到第二、三和四次免疫抗原；

b、动物免疫：采用皮下多点注射法免疫健康的家兔，共免疫4次；首次免疫采用首次免疫抗原；间隔21天后第二次免疫采用第二次免疫抗原，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗血清效价；间隔35天后第三次免疫采用第三次免疫抗原，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗血清效价；间隔49天后第四次免疫采用第四次免疫抗原，末次免疫后第7天，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗血清效价；最后于第四次免疫后第8天，颈动脉采全血，分离血清，抗原亲和纯化法获得绿盲蝽ALUSP多克隆抗体。

其中，上述步骤b中的首次免疫抗原剂量为0.3mg/只，第二、三和四次免疫抗原剂量为0.15mg/只。

本发明中采用的重组ALUSP蛋白为专利申请号为201410017156.0，发明名称为“一种绿盲蝽超气门蛋白、其编码序列、载体和菌株”中的制备方法制备得到的重组ALUSP蛋白。

一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的ELISA检测方法，包括以下步骤：用碳酸盐包被重组ALUSP蛋白抗原，4℃孵育过夜，取出抗原后用PBST洗涤液洗涤三次，然后加入封闭液，取出再用PBST洗涤液洗涤三次，将一抗(兔子血清)首先按照1:1000稀释，然后倍比稀释，37℃孵育1小时；取出用PBST洗涤液洗涤三次，加入二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L))，1:8000稀释，37℃孵育45min；取出用PBST洗涤液洗涤五次，3分钟/次，最后加入底物溶液100μl/孔，反应15min，加入100μl2mol/L硫酸终止反应，在450nm波长下测定OD值，评价抗体效价。

一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的Western blot检测方法，包括以下步骤：取ALUSP重组蛋白按梯度上样。上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束。电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜1.5小时。电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5分钟。然后置于37℃，5％脱脂奶粉封闭液中封闭1小时。用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1小时。洗膜4次，每次5分钟，用含5％牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1小时。洗膜ECL显影。

一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的抗体特异性Western blot检测方法，包括以下步骤：取绿盲蝽若虫提取总蛋白，通过RIPA裂解获得上清，按梯度上样采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，取下凝胶进行转膜，取下膜后先用PBS洗涤，然后将膜置于封闭液中封闭，然后用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中反应，洗膜，封闭液稀释二抗，膜在二抗中反应，洗膜ECL显影。

本发明采用的封闭剂为脱脂奶粉。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：将原核表达纯化的ALUSP重组蛋白应用于免疫家兔后制备了多克隆抗体，在通过利用ELISA法确定了该多克隆抗体的效价后，发明人采用Western blot法发现该多克隆抗体能特异性识别原核表达的ALUSP重组蛋白，可产生特异性免疫反应。基于此，发明人还建立了一套高效、高灵敏度和准确的Westernblot方法，可特异性地从绿盲蝽虫体内检测出超气门蛋白。应用本发明，可为超气门蛋白在绿盲蝽体内的组织分布以及该蛋白的快速检测和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑。

附图说明

图1ELISA检测三免后效价图；1～12孔分别代表表1中的：阴性、空白、稀释1000倍、稀释2000倍、稀释4000倍、稀释8000倍、稀释16000倍、稀释32000倍、稀释64000倍、稀释128000倍、稀释256000倍、稀释512000倍；

图2ELISA检测四免后效价图；1～12孔分别代表表2中的：阴性、空白、稀释1000倍、稀释2000倍、稀释4000倍、稀释8000倍、稀释16000倍、稀释32000倍、稀释64000倍、稀释128000倍、稀释256000倍、稀释512000倍；

图3ELISA检测终放血后效价图；1～12孔分别代表表3中的：阴性、空白、稀释1000倍、稀释2000倍、稀释4000倍、稀释8000倍、稀释16000倍、稀释32000倍、稀释64000倍、稀释128000倍、稀释256000倍、稀释512000倍；

图4Western blot检测ALUSP多克隆抗体与ALUSP重组蛋白结合图；泳道1-4分别为：1-4:5μg、1μg、0.2μg和0.04μg ALUSP重组蛋白。

图5Western blot检测ALUSP多克隆抗体特异性结果图；泳道1-5分别为：1-3:80μg、40μg和20μg绿盲蝽总蛋白(加1抗和2抗)，4为水(加1抗和2抗)；5为80μg绿盲蝽总蛋白(不加1抗和2抗)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的获得

首先进行抗原处理：取纯化后的重组ALUSP蛋白总量约5mg，初免剂量为0.3mg/只，二免、三免、四免剂量为0.15mg/只；初免抗原为蛋白抗原与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化；二免、三免、四免抗原为蛋白抗原与等体积弗氏不完全佐剂混匀乳化。然后进行动物免疫：采用皮下多点注射法免疫健康的雌性新西兰大白兔，共免疫4次；首次免疫抗原为弗氏完全佐剂和蛋白抗原；间隔21天后第二次免疫，抗原为弗氏不完全佐剂和蛋白抗原；间隔35天后第三次免疫，抗原为弗氏不完全佐剂和蛋白抗原，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗血清效价(图1、表1)；间隔49天后第四次免疫，抗原为弗氏不完全佐剂和蛋白抗原，末次免疫后第7天，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗血清效价(图2、表2)；最后于末次免疫后第8天，颈动脉采全血，分离血清，抗原亲和纯化法获得绿盲蝽ALUSP的多克隆抗体(图3，表3)

表1 三免后OD值

表2 四免后OD值

表3 终放血后OD值

实施例2绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的ELLSA检测

用pH9.6、0.05mol/l碳酸盐包被抗原，4℃孵育过夜；取出抗原后用PBST洗涤液含0.05％Tween-20洗涤三次，3分钟每次；每孔然后加入5％脱脂奶粉100μl封闭液，37℃封闭60分钟；取出再用PBST洗涤液含0.05％Tween-20洗涤三次，3分钟/次；将兔子的血清首先按照1:1000稀释，然后倍比稀释，37℃孵育1小时；取出用PBST洗涤液含0.05％Tween-20洗涤三次，3分钟/次；加入辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，1:8000稀释，37℃孵育45min；取出用PBST洗涤液含0.05％Tween-200洗涤五次，3分钟/次；最后加入底物溶液(TMB)100μl/孔，反应15min，加入100μl2mol/L硫酸终止反应。在450nm波长下测定OD值，评价效价。

结论：ALUSP抗体效价均大于1:256000。

实施例3：绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的Western blot检测

取ALUSP重组蛋白按梯度上样。上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束。电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜1.5小时。电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5分钟。然后置于37℃，5％脱脂奶粉封闭液中封闭1小时。用封闭液稀释一抗(1:1000)，膜在一抗稀释液中37℃反应1小时。洗膜4次，每次5分钟，用含5％牛奶的封闭液稀释二抗(1:5000)。膜在二抗中37℃反应1小时。洗膜ECL显影。

结论：ALUSP多克隆抗体可较好的与ALUSP重组蛋白结合。

实施例4：Western blot检测ALUSP抗体特异性

取绿盲蝽3龄若虫20头，提取总蛋白。组织样品通过RIPA裂解获得上清，按梯度上样。上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束。电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5小时。电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5分钟。然后置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1小时。用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1小时(稀释倍数1:1000)。洗膜4次，每次5分钟；用含5％牛奶的封闭液稀释二抗(稀释倍数1:5000)。膜在二抗中37℃反应1小时。洗膜ECL显影(图5)。

结论：ALUSP抗体能特异性的结合绿盲蝽虫体内的超气门蛋白。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体，其特征在于，将重组ALUSP蛋白免疫家兔后制得。

2.权利要求1所述的一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

b、动物免疫：采用皮下多点注射法免疫家兔，共免疫4次；首次免疫采用首次免疫抗原；间隔21天后第二次免疫采用第二次免疫抗原，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗体效价；间隔35天后第三次免疫采用第三次免疫抗原，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗体效价；间隔49天后第四次免疫采用第四次免疫抗原，末次免疫后第7天，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗体效价；最后于第四次免疫后第8天，颈动脉采全血，分离血清，抗原亲和纯化法获得绿盲蝽ALUSP多克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤b中的首次免疫抗原剂量为0.3mg/只，第二、三和四次免疫抗原剂量为0.15mg/只。

4.权利要求1所述的一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的ELLSA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：用碳酸盐包被重组ALUSP蛋白抗原，4℃孵育过夜；取出抗原后用PBST洗涤液洗涤三次，然后加入封闭液，取出再用PBST洗涤液洗涤三次，将一抗首先按照1:1000稀释，然后倍比稀释，37℃孵育1小时，取出用PBST洗涤液洗涤三次，加入二抗，1:8000稀释，37℃孵育45min，取出用PBST洗涤液洗涤五次，3分钟/次，最后加入底物溶液100μl/孔，反应15min，加入100μl2mol/L硫酸终止反应，在450nm波长下测定OD值，评价抗体效价。

5.权利要求1所述的一种绿盲蝽ALUSP多克隆抗体的抗体特异性Western blot检测方法，其特征在于，包括以下步骤：取绿盲蝽提取总蛋白，通过RIPA裂解获得上清，按梯度上样采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，取下凝胶进行转膜，取下膜后先用PBS洗涤，然后将膜置于封闭液中封闭，然后用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中反应，洗膜，封闭液稀释二抗，膜在二抗中反应，洗膜ECL显影。