CN1724673A

CN1724673A - 美洲商陆抗病毒蛋白(pap)在巴斯德毕赤酵母中的表达方法

Info

Publication number: CN1724673A
Application number: CN 200510012205
Authority: CN
Inventors: 王锡锋; 李莉; 周广和; 刘艳; 韩政; 周倩
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2005-07-15
Filing date: 2005-07-15
Publication date: 2006-01-25

Abstract

本发明涉及美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)在巴斯德毕赤酵母中的表达方法。本发明美洲商陆抗病毒蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，包括重组工程菌在生长培养基BMGY和诱导培养基BMMY培养两个阶段，其特征在于生长培养基以2％葡萄糖为碳源基础；所述诱导培养基含有1％－1.5％甲醇，4×10^－4－8×10^－4g/L生物素，pH为5.0－7.0，诱导培养的接种体积比例为0.5∶1－1.5∶1，诱导培养时间为3－5天，并每隔24小时补足甲醇含量。本发明通过上述各项参数改变对PAP表达量的影响，得到PAP的优化发酵条件，使PAP表达量达到45mg/L左右，使其应用于植物病毒病的防治和人类医学成为可能。

Description

美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)在巴斯德毕赤酵母中的表达方法

技术领域

本发明专利属于生物工程领域，涉及一种来源于美洲商陆(Phytolacca americana)的抗病毒蛋白基因在真核生物巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)体内的表达的条件。

背景技术

植物病毒病害是农作物的主要病害之一，造成作物减产与品质下降，给农业生产带来巨大的经济损失。长期以来，人们一直在探索各种防治病毒病害的方法。

美洲商陆抗病毒蛋白(Pokeweed antiviral protein，PAP)它是从美洲商陆(Phytolaccaamericana)叶片中分离出来的一种单链碱性蛋白，分子量为29Ku(Irvin，J.D.1975)。该蛋白属于I型核糖体灭活蛋白(Ribosome-inactive Protein，RIP)，具有RNA N-糖苷酶的活性，能专一地从真核生物核糖体60S大亚基的28S rRNA特殊位点上切下一腺嘌呤，使其难与蛋白质合成的延伸因子EF-2结合，从而阻碍了蛋白质的合成(Endo，k.et al.，1988)。研究表明，PAP不但能够对7个植物病毒属的成员具有抑制作用(Tomlinson，V.M.et al.1974；Chen，Z.C.et al.1991)，而且对真菌、细菌及人类免疫缺陷型病毒(HIV)等都具有一定的抑制效果(Aron，G.M.1980；Olson，M.1991；Zarling，J.M.1990)，因此PAP是一种广谱性抗病菌蛋白，具有广阔的应用价值。

另外，由于PAP在植物中含量有限，且提取困难，加之PAP在体外稳定性高，使得体外操作成为可能，因此，采用基因工程的方法，构建PAP表达载体，再通过微生物发酵来大量生产PAP，不失为一种可行的方法。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已成功表达了多种外源基因，表达的外源蛋白可分泌到细胞外，也可在细胞质内积累。有些蛋白质容易降解或对细胞有毒性，将其分泌到胞外可以避免对细胞产生毒性，提高蛋白的产量和稳定性。分泌表达的另一优点是分离纯化外源蛋白的下游处理工艺简单。

影响外源基因在毕赤酵母中表达的因素很多，不仅受到基因剂量，整合位点，cDNA的AT含量，翻译起始区和信号肽等影响，也受到宿主菌，蛋白酶，酶切，糖基化和培养条件的影响。许多实验表明，合适的拷贝数是需要的，但是表达量与拷贝数之间没有相关性，增加拷贝数对产率并没有什么显著影响。Clare在研究破伤风毒素片段C在毕赤酵母中的表达指出影响重组蛋白产量的关键因素是存在多拷贝的表达单元。但是研究小牛溶菌酶的表达随拷贝数从1-3的上升反而减少。高拷贝数不能达到高表达的可能原因是外源mRNA的翻译效率或蛋白质通过内质网中不能正确折叠造成的。cDNA的AT含量影响蛋白表达最好的例子是HIV-1外壳蛋白的表达，由于cDNA的AT含量过高，从而使转录提前终止。载体整合位点主要涉及到Mut表现型问题。Mut^s菌株虽然在诱导阶段生长较慢，但是有时外源蛋白的表达反而更高。Frank D等1997年发现PepT1在Mut^s菌株中比在Mut⁺菌株中表达量高。Antonio等发现改造了的信号肽提高了外源蛋白表达量。Hayasuke N等1996年修饰了人血清白蛋白(HAS)的信号肽序列，使HAS在毕赤酵母中的分泌提高几倍。了解毕赤酵母在密码子使用上的偏爱性可以为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。赵翔等研究发现毕赤酵母以GAG为高表达优越密码子。重组蛋白的表达除了与上述因素有关外，还与特定宿主菌、培养条件和蛋白本身有关，即使同一种宿主菌的重组子，表达量也往往有所差别，因此筛选高表达量的菌株尤为重要。此外还可以通过优化组合培养条件来提高外源蛋白的表达量。

本实验室采用分子生物学方法对PAP基因进行改造，获得了去除了N端信号肽编码序列及C端毒性基因的对生物无毒的缺失型PAP基因，构建了缺失型PAP基因的真核表达载体pPIC9K，通过电转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株，获得PAP重组工程菌(PAP20)。经PCR鉴定和双膜免疫杂交法筛选获得高效表达的甲醇利用快速型重组子(Mut^s和Mut⁺)，但Mut⁺较Mut^s重组子的发酵周期短(陈定虎等，农业生物技术学报2003 11(2)：183-186；周倩等，植物病理学报，2003，33(5)：425-428)，但是常规的巴斯德毕赤酵母发酵方法是菌体利用培养基中的甘油生长，然后添加甲醇诱导外源基因的表达，其PAP的表达量很小，无法满足大量生产PAP的需求。

发明内容

本发明在本实验室上述工作基础上，对利用摇瓶发酵制备美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)的条件，如碳源、接种比例、生物素浓度、甲醇诱导浓度、培养基pH值、诱导时间、摇床转速等进行了研究，建立了摇瓶发酵方案，目的是大量生产PAP，使其应用于植物病毒病的防治和人类医学成为可能。

美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，包括重组工程菌在生长培养基和诱导培养基培养两个阶段，其特征在于生长培养基BMGY以2％葡萄糖为碳源基础；所述诱导培养基BMMY含有1％-1.5％甲醇，4×10^-4-8×10^-4g/L生物素，pH为5.0-7.0，诱导培养的接种体积比例为0.5∶1-1.5∶1，诱导培养时间为3-5天，并每隔24小时补足甲醇含量。

所述培养基中甲醇含量为1％。

所述生物素浓度为4×10^-4g/L。

所述pH为6.0-6.4。

所述接种比例为1.5∶1。

所述诱导培养时间为4天。

所述重组工程菌在生长培养基上的培养条件为30℃，250rpm/min。

所述重组工程菌在生长培养基上达OD₆₀₀为5.0，1500g离心收集。

优选：诱导培养基含有1％甲醇，4×10^-4g/L生物素，pH为6.0-6.4，诱导培养的接种体积比例为1.5∶1，诱导培养时间为4天，并每隔24小时补足甲醇含量。

本发明通过上述各项参数改变对PAP表达量的影响，得到PAP的优化发酵条件，使摇瓶水平PAP表达量达到45mg/L，实验证明表达产物在体外对烟草花叶病毒(TMV)的侵染有明显的抑制作用。

本发明美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，使得PAP表达量得到较大的提高，使其应用于植物病毒病的防治和人类医学成为可能。

附图说明

图1 Mut+重组子诱导产物SDS-PAGE

1分子量对照(kD)，2阴性对照，3-81-6天的表达产物

图2诱导产物Western-blotting分析

1标准分子量(kD)，2阴性对照，3-4诱导产物

图3pH对蛋白表达的影响

1分子量对照(KD)，2-9不同pH培养基诱导的表达产物(5.97、6.09、6.18、6.30、6.41、6.60、6.74、7.23)

图4 PAP表达产物抗病毒生物活性的测定

A对照：左半叶涂抹蒸馏水后接种TMV，右半叶涂抹空载体发酵液后接种TMV；

B PAP表达产物生测：左半叶涂抹空载体发酵液后接种TMV，右半叶涂抹发Mut+发酵液后接种TMV。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实验材料

1重组工程菌含有PAP基因的甲醇诱导型巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株，经MM平板培养基和MD平板培养基筛选的的Mut⁺阳性转化子均由中国科学院植物保护研究所植物病毒实验室筛选并保存。

2主要试剂

YNB购自上海生工公司，PAP兔抗血清由中国科学院植物保护研究所植物病毒实验室制备并保存。

3培养基

YPD培养基：酵母提取物1.0g，蛋白胨2.0g，加蒸馏水定容至90ml，121℃高压蒸汽灭菌20分钟取出后加入10ml 10×D(20g D-葡萄糖溶于100ml蒸馏水水后过滤灭菌，室温保存)；

MM平板培养基：80ml蒸馏水加1.5g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20分钟取出，冷却至60℃后加入10ml 10×YNB(3.4g不含硫酸铵和氨基酸的YNB加10g硫酸铵溶于水后过滤灭菌，4℃保存)、0.2ml 500×B(20mg生物素溶于100ml蒸馏水水后过滤灭菌，4℃保存)、10ml 10×M(5ml甲醇加入95mL蒸馏水水后过滤灭菌，4℃保存)混匀倒板；

MD平板培养基：80ml蒸馏水加1.5g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20分钟取出，冷却至60℃后加入10ml 10×YNB、0.2ml 500×B、10ml 10×D混匀倒板；

BMGY培养基：70ml蒸馏水加1.0g酵母提取物和2.0g蛋白胨，121℃高压蒸汽灭菌20分钟取出，冷却至60℃后加入10ml 10×YNB、0.2ml 500×B、10ml 10×GY(10ml甘油加入900mL蒸馏水，121℃高压蒸汽灭菌20分钟后室温保存)和10ml 1mol/L的磷酸钾缓冲液(pH值至6.0)，然后121℃高压蒸汽灭菌20分钟后室温保存)；(BMGY平板培养基再加入加1.5g琼脂粉即可)。

BMMY培养基：70ml蒸馏水加1.0g酵母提取物和2.0g蛋白胨，121℃高压蒸汽灭菌20分钟取出，冷却至60℃后加入10ml 10×YNB、0.2ml 500×B、10ml 10×M和10ml 1mol/L的磷酸钾缓冲液；(BMMY平板培养基：另外加入1.5g琼脂粉)。

酵母菌体生长量的测定：采用细胞光密度分析方法。将摇瓶培养液稀释20倍后，测定600nm处的OD值，以同样处理的培养液为对照。OD₆₀₀＝OD读数×稀释倍数。

SDS-PAGE分析蛋白含量及分子量：培养液5000g离心5min，取上清再加入等体积的蛋白电泳缓冲液，沸水浴2min，然后进行12％的SDS-PAGE(采用Laemmli法Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2^nd Edtion，New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)分析。每个点样孔加20ul的样品。考马斯亮蓝R-250染色后，应用KODAK公司的Kodak EDAS 290照相分析系统分析蛋白的含量和分子量。

Western-blotting分析：转膜：经SDS-PAGE电泳后，在蛋白质转移缓冲液中将蛋白质从胶上转移至硝酸纤维素膜(NC)上(电压30伏，时间6小时)。转膜后，取出NC，用立春红染液染色分钟，使蛋白质显色，用针对Marker进行标记后，再用PBST冲洗掉红色染液。

封闭：在封闭液中封闭2小时，然后用PBST洗膜3次，每次10min；

一抗结合：经封闭后的NC膜在用PBST稀释的PAP抗血清(1∶1000)中室温下孵育1小时后用PBST洗膜3次，每次10分钟；

二抗结合：与一抗结合后的NC膜放入PBST稀释的碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG-AP(1∶7500)，室温孵育一小时，PBST洗膜3次，每次10分钟；

显色反应：将NC膜放入显色底物中(10ml AP缓冲液中加入11μl NBT和BCIP)显色至条带清楚后即用蒸馏水冲洗。

实施例1 发酵条件对PAP表达量的影响

1.1.碳源选择：挑取单菌落分别接种100ml以2％的葡萄糖、甘油、山梨醇糖、甲醇、乙醇和甘氨酸为碳源的基础培养基，每隔一小时取一次样，检测各种培养基中菌体的OD₆₀₀达到5.0和10.0所需的时间。结果表明不同碳源对PAP工程酵母菌生长的影响不同，在以葡萄糖为碳源的培养基上生长最旺盛，其次是甘油、山梨醇糖；而在以甲醇、乙醇和甘氨酸为碳源的培养基上生长比较缓慢(表1)。因此采用葡萄糖作为碳源进行培养，可以使酵母发酵周期提前至少2小时，成本更低廉。

表1 碳源对重组酵母生长的影响

碳源	葡萄糖	甘油	山梨醇糖	甲醇	乙醇	甘氨酸
碳源	葡萄糖	甘油	山梨醇糖	甲醇	乙醇	甘氨酸	OD₆₀₀达5.0的时间(小时)OD₆₀₀达10.0的时间(小时)	7.510.0	8.012.0	8.513.0	11.020以上	11.020以上	11.020以上

1.2 PAP基因的诱导表达：发酵在250ml三角瓶中进行，按照Francis R.(2000年)的方法进行诱导表达。挑取在YPD平板培养基上生长的重组工程菌的单菌落接种到20ml以葡萄糖为碳源的BMGY培养基中，30℃，250r/min培养48小时，1500g离心收集菌体，并将菌体重新悬浮于20mlBMMY培养基中诱导培养，生物素浓度为4×10^-4g/L，每隔24小时添加甲醇至终浓度约为1％，上清即含有PAP的表达产物，可用于检测和分析。

表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳结果表明第3-8泳道均有约30kD的条带，而空载体对照没有该条带(图1)，经Western-blotting分析表明该条带为是PAP基因的表达产物(图2)。

1.3 pH值对PAP表达量的影响

培养基的pH通过影响重组菌的生理环境而影响外源蛋白的表达。本发明在1.2给出的PAP基因诱导表达条件下，采用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液配制诱导培养基(BMMY)，pH分别调为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0。挑取重组工程菌单菌落(PAP20)接种20ml的BMGY培养基，在30℃、250rpm条件下培养48小时，1500g离心收集菌体，并将菌体重新悬浮于20ml BMMY培养基中诱导培养，每24小时添加甲醇至培养基浓度的1.0％，诱导培养72小时，检测发酵液的细胞光密度(OD₆₀₀值)，并进行SDS-PAGE电泳，(表2)，结果表明，菌体在pH为6.0的诱导培养基上生长最好，对PAP的分泌表达最有利。

表2 pH对PAP表达量和菌体生长的影响

pH条件	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0
pH条件	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0	PAP表达量OD₆₀₀	2.719.7	20.824.0	25.431.2	16.024.7	7.023.3

进一步将BMMY诱导培养基pH分别调为5.97、6.09、6.18、6.30、6.41、6.60、6.74、7.23，进行诱导培养96小时后取样检测，结果见表3，图3。由基因工程菌P.pastoris表达目的蛋白和细胞光密度曲线可以看出，pH在5.97-6.41之间目的蛋白的表达量保持较高的水平，pH6.41时达到最高。从图3表明pH高于6.60后杂蛋白明显增加，当pH达到7.23后目的蛋白基本不表达。

表3 pH对重组毕赤酵母表达PAP影响的结果

诱导前pH	诱导后pH	(细胞光密度)OD₆₀₀	PAP表达量(mg/L)
诱导前pH	诱导后pH	(细胞光密度)OD₆₀₀	PAP表达量(mg/L)	5.976.096.186.306.416.606.747.23	6.326.406.446.566.637.446.828.30	31.3331.7831.3234.4132.3530.8830.6030.77	29.832.332.731.434.27.618.60.00

1.4.诱导时间对PAP表达量的影响

本发明在1.2给出的PAP基因诱导表达条件下，pH保持在6.30-6.40之间，用10g/L甲醇浓度诱导培养6天，每24小时取两个样品进行分析，结果见表4(表中数据为2个样品的平均值)，结果表明：在诱导初期，随着诱导时间的延长，菌体量增加，PAP蛋白的表达量也相应增加，96小时的表达量达到最高；随着时间的进一步延长，随着菌体量的增加，而PAP蛋白的表达量减少。

表4 诱导时间对PAP表达量的影响

诱导时间(hour)	pH值	细胞光密度(OD₆₀₀)	PAP表达量(mg/L)
诱导时间(hour)	pH值	细胞光密度(OD₆₀₀)	PAP表达量(mg/L)	024487296120144	6.326.336.356.336.366.336.40	29.330.430.631.131.331.832.3	0.0018.324.827.432.431.525.8

1.5.甲醇浓度对PAP表达量的影响

甲醇既是重组毕赤酵母的碳源，也是外源基因表达的诱导物，提高甲醇的浓度是否可以提高外源蛋白表达量呢？本发明对甲醇浓度对PAP表达量的影响进行了研究。

按照1.2给出的PAP基因诱导表达条件，pH保持在6.30-6.40之间，在甲醇浓度为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％和3.0％的诱导培养基上进行诱导培养(每24h补足甲醇)，诱导培养96小时，检测PAP的表达量和菌体的生长量，结果见表5。在摇瓶条件下，诱导PAP基因表达的最佳甲醇浓度是1％(即10g/L)。在甲醇浓度为1.0％时外源蛋白量达到最高，而在1.5％时菌体细胞生长最佳，当浓度高于1.5％时，外源蛋白的表达量随着甲醇浓度的升高而降低，菌体细胞的光密度值也随之下降。说明过高甲醇的浓度抑制了菌体的生长和PAP的分泌。

表5 甲醇浓度对PAP基因表达的影响

甲醇浓度(g/L)	pH值	细胞光密度(OD₆₀₀)	PAP表达量(mg/L)
甲醇浓度(g/L)	pH值	细胞光密度(OD₆₀₀)	PAP表达量(mg/L)	51015202530	6.286.346.326.376.416.35	30.3532.3834.9230.0529.9229.82	7.131.421.219.013.012.7

1.6.接种比例对PAP表达量的影响：

分别取OD₆₀₀为5.0的重组酵母菌50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml，低速离心后接种到100ml pH保持在6.30-6.40之间，在甲醇浓度为1.0％的诱导培养基上进行诱导培养(每24h补足甲醇)，按照1.2给出的PAP基因诱导表达条件诱导培养72小时，检测菌体OD₆₀₀值及上清中PAP的表达量。结果表明：接种量越大，菌体的收获量越大，但不与PAP的分泌量成正比关系(见表6)，PAP的收获量以1.5∶1的接种量为最优。

表6 接种比例对PAP表达量和菌体生长的影响

接种比例	0.5∶1	1∶1	1.5∶1	2∶1	2.5∶1	3∶1
接种比例	0.5∶1	1∶1	1.5∶1	2∶1	2.5∶1	3∶1	PAP表达量(mg/L)OD₆₀₀	24.119.5	25.828.4	26.231.6	15.034.2	11.535.6	10.038.5

1.7.碳源、接种量及甲醇浓度对PAP表达量的综合影响：

为了考虑诸影响因素间的交互作用，提高PAP的产量，本发明采用3因素3水平的正交试验研究了碳源、接种量和甲醇浓度对PAP表达影响作用，目的是筛选出表达PAP量最高的组合。按照1.2给出的PAP基因诱导表达条件，pH保持在6.30-6.40之间。

表7 正交试验表

Table7 Levels of factors in orthogonal erperiment

编号	碳源	接种量	甲醇浓度(％)	PAP表达量(mg/L)
编号	碳源	接种量	甲醇浓度(％)	PAP表达量(mg/L)	1234567891011121314151617	葡萄糖葡萄糖葡萄糖甘油甘油甘油山梨醇糖山梨醇糖山梨醇糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖甘油甘油甘油山梨醇糖山梨醇糖	0.5∶10.5∶10.5∶10.5∶10.5∶10.5∶10.5∶10.5∶10.5∶11∶11∶11∶11∶11∶11∶11∶11∶1	0.51.01.50.51.01.50.51.01.50.51.01.50.51.01.50.51.0	25.226.325.023.224.922.521.322.820.926.126.825.924.326.824.022.524.7

18192021222324252627

山梨醇糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖甘油甘油甘油山梨醇糖山梨醇糖山梨醇糖

1∶13∶23∶23∶23∶23∶23∶23∶23∶23∶2

1.50.51.01.50.51.01.50.51.01.5

21.627.031.426.727.526.023.723.023.223.8

表8 正交试验结果

Table8 The result of orthogonal erperiment

因素	T值	Prob＞\|T\|	重要性排序
因素	T值	Prob＞\|T\|	重要性排序	碳源接种量甲醇浓度	-2.19851.9490-0.5942	0.03820.06360.5582	123

用SAS 8.0软件对试验数据进行回归分析(见表7和表8)，结果表明：各因素对产量的影响不同，以碳源作用最大，接种量次之，甲醇最小；以2％葡萄糖为碳源，接种比例3∶2，甲醇诱导浓度1％的组合为最佳，其次为2％甘油为碳源，接种比例3∶2，甲醇诱导浓度0.5％的组合。

1.8.生物素浓度对PAP表达量的影响：

按照1.2给出的PAP基因诱导表达条件，pH保持在6.30-6.40之间，甲醇浓度1.0％，诱导培养基的生物素浓度分别为0、2×10^-4g/L、4×10^-4g/L、6×10^-4g/L和8×10^-4g/L，培养72小时后检测发酵液上清的OD₆₀₀值和PAP的表达量，进行SDS-PAGE电泳。结果表明：培养基中生物素浓度为4×10^-4g/L时，菌体OD₆₀₀值为最大值34.2，PAP表达量高达31.2mg/L(如表9)。

表9 生物素浓度对PAP表达量和菌体生长的影响

Table9 Influence of D-biotin concentration on PAP expression and cell density

生物素浓度(10^-4g/L)	0	2	4	6	8
生物素浓度(10^-4g/L)	0	2	4	6	8	PAP表达量OD₆₀₀	2.721.9	20.827.0	31.234.2	28.028.7	27.027.3

实施例2-5 重组毕赤酵母工程菌表达PAP的条件

综合上述实验结果，本发明将摇瓶发酵PAP的条件确定为：挑取YPD平板培养基上生长的PAP重组工程菌单菌落接种于以2％葡萄糖为碳源基础生长培养基(BMGY)上，30℃，250rpm/min培养至OD₆₀₀＝5.0，1500g离心收集菌体，重悬浮于BMGY诱导培养液中，诱导培养条件如表10所述，测定PAP表达量：

表10 重组毕赤酵母工程菌表达PAP的条件

表达条件	甲醇浓度(占总诱导培养基)％	接种比例(重组菌∶诱导培养基)	PH值	生物素浓度10^-4g/L	诱导时间(天)	甲醇补足量达％	PAP表达量mg/L
表达条件	甲醇浓度(占总诱导培养基)％	接种比例(重组菌∶诱导培养基)	PH值	生物素浓度10^-4g/L	诱导时间(天)	甲醇补足量达％	PAP表达量mg/L	实施例2	1.0	1.5∶1	6.0	4	4	1.0	45.0
实施例3	1.5	0.5∶1	5.0	8	6	1.5	33.5	实施例2	1.0	1.5∶1	6.0	4	4	1.0	45.0
实施例3	1.5	0.5∶1	5.0	8	6	1.5	33.5	实施例4	1.0	1.5∶1	6.4	4	4	1.0	45.6
实施例5	1.5	1∶1	7.0	6	5	1.5	26.7	实施例4	1.0	1.5∶1	6.4	4	4	1.0	45.6

从上表的实验结果看出，摇瓶发酵PAP最优条件为：生长培养基BMGY以2％葡萄糖为碳源基础，所述诱导培养基BMMY含有1％甲醇，4×10^-4g/L生物素，pH为6.0-6.4，诱导培养的接种体积比例为1.5∶1，诱导培养时间为4天，并每隔24小时补加甲醇，使甲醇含量达诱导培养基总量的1％。重组菌在生长培养基上的培养条件为30℃，250rpm/min。

此优化发酵条件可使摇瓶水平PAP表达量达到45mg/L左右。

实验例：PAP表达产物抗病毒生物活性的测定

用半叶法测定表达产物抗病毒活性。取实施例2中诱导表达的产物上清液，用0.01mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)稀释10倍，加入0.5％农药助剂OP-10/JFC(1∶1配比)，均匀涂抹于TMV枯斑寄主心叶烟的右半叶上，左半叶用含空载体的转化子发酵液上清做对照，12小时后摩擦接种TMV。每个处理重复10次，5天后观察统计发病情况(如图4)，结果表明：PAP表达产物对TMV有明显的抑制效果，平均抑制率为95.3％(见表11)。(PAP对病毒的抑制率＝(对照病斑数-病斑数)÷对照病斑数×100％)。

表11 PAP表达产物对TMV病毒的抑制效率

重复	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	平均
重复	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	平均	PAP	96.1％	100％	94.0％	82.5％	93.0％	95.2％	96.4％	100％	97.3％	98.4％	95.3％

Claims

1.美洲商陆抗病毒蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，包括重组工程菌在生长培养基BMGY和诱导培养基BMMY培养两个阶段，其特征在于生长培养基以2％葡萄糖为碳源基础；所述诱导培养基含有1％-1.5％甲醇，4×10^-4-8×10^-4g/L生物素，pH为5.0-7.0，诱导培养的接种体积比例为0.5∶1-1.5∶1，诱导培养时间为3-5天，并每隔24小时补足甲醇含量。

2.根据权利要求1所述的美洲商陆抗病毒蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，所述诱导培养基中甲醇含量为1％。

3.根据权利要求1所述的美洲商陆抗病毒蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，所述生物素浓度为4×10^-4g/L。

4.根据权利要求1所述的美洲商陆抗病毒蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，所述pH为6.0-6.4。

5.根据权利要求1所述的美洲商陆抗病毒蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，所述接体积种比例为1.5∶1。

6.根据权利要求1所述的美洲商陆抗病毒蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，所述诱导培养时间为4天。

7.根据权利要求1所述的美洲商陆抗病毒蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，所述重组菌在生长培养基上的培养条件为30℃，250rpm/min。

8.根据权利要求1所述的美洲商陆抗病毒蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，所述重组菌在生长培养基上达OD₆₀₀为5.0，1500g离心收集。

9.根据权利要求1所述的美洲商陆抗病毒蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达方法，所述诱导培养基含有1％甲醇，4×10^-4g/L生物素，pH为6.0-6.4，诱导培养的接种体积比例为1.5∶1，诱导培养时间为4天，并每隔24小时补足甲醇含量。