CN102321161B

CN102321161B - 一种可提高蛋白质在植物细胞内表达量的短肽及其应用

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Publication number: CN102321161B
Application number: CN 201110271705
Authority: CN
Inventors: 唐玉林; 欧忠华; 郑易之
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2011-09-14
Filing date: 2011-09-14
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2031-09-14
Also published as: CN102321161A

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，公开了一种可提高蛋白质在植物细胞内表达量的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1。本发明构建了SP-GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA1302-SP-GFP；将植物表达载体pCAMBIA1302-SP-GFP利用农杆菌转化烟草，获得转SP-GFP基因烟草悬浮细胞；提取转基因烟草悬浮细胞总蛋白，进行蛋白定量，并用流式细胞仪分析GFP及SP-GFP的平均荧光强度，证明转SP-GFP基因细胞系中的GFP的积累量约为转GFP基因细胞系的3倍。

Description

一种可提高蛋白质在植物细胞内表达量的短肽及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种可提高蛋白质在植物细胞内表达量的短肽。

背景技术

植物生物反应器指通过基因工程途径，以整株植物或植物悬浮细胞培养物作为“化学工厂”，通过大规模培养，生产具有高经济附加值的医用蛋白(活性多肽、人疫苗、抗体等)、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料及其它一些次生代谢产物等的方法。植物生物反应器与动物和微生物生物反应器相比，具有生产成本较低，易于大规模工业化生产，产物无毒副作用，安全性好等特性。当用动物或其细胞作为生物反应器时，在培养过程中很可能会感染病毒，而这些病毒对人类健康具有潜在的危害；细菌作为生物反应器多用来生产特定的蛋白，但细菌不能对目的蛋白进行翻译后的加工及修饰，且细菌本身可能是人类病原物。植物作为生物反应器生产特定的蛋白或代谢产物时，不含致病微生物或潜在的致病微生物，对人畜安全，大大提高了表达产物的生物安全性。并且，在植物中所表达的蛋白能够进行正确的糖基化、磷酸化、酰胺化及翻译后的加工，因此，所表达产物与高等动物细胞的产物具有相当的生物活性和免疫原性，是用来生产医用蛋白的理想材料。

1989年，Hiatt等报道了从小鼠中克隆IgG的重链和轻链基因导入烟草表达免疫球蛋白，就此开创了植物抗体的先河。Benvenuto等报道了将编码重链可变区(VH)的基因在烟草中表达，其表达量约占可溶性蛋白的1.0％。Duing等利用大麦α-淀粉酶的信号肽序列分别和编码成熟单克隆抗体重链、轻链的cDNA构建成重组基因，转化到烟草中表达，用亲和层析法分析证明重组抗体具有生物活性。Firek等报道了Single chain Fv(Sc Fv，单链Fv)在转基因烟草中的表达，结果发现，在Sc Fv的N-端整合有信号肽序列PR1a的情况下，其转化的烟草悬浮细胞培养体系要比转化不含信号序列的ScFv的烟草悬浮细胞培养体系积累的Sc Fv蛋白量要高。2005年，Hull等报道了在烟草中表达炭疽杆菌保护抗原的特异性单克隆抗体，且在活体内或体外均表现出消除毒素活性的作用。Shchelkunov等将编码艾滋病病毒中致免疫的ENV、GAC抗原表位及乙肝表面抗原的嵌合基因导入番茄并得以表达，研究了一种能同时抗两种病毒的疫苗。Fitchen等将小鼠ZP3蛋白的一个含13个氨基酸残基的抗原决定簇表达在烟草花叶病毒的衣壳蛋白中，用受感染植物中提取的含融合蛋白的病毒样颗粒免疫小鼠，结果产生了抗ZP3的特异性血清抗体。这些研究表明了利用植物细胞生产人类所需各种蛋白的可行性。

到目前为止，人们利用植物生物反应器已经成功地表达的重组蛋白有人胰岛素、红细胞生成素、干扰素、溶菌酶、人生长激素、人表皮生长因子、人凝血因子、白细胞介素、人血红蛋白、人血清蛋白等。但是，在植物反应器研究中存在一个较为突出的问题，即目标蛋白的表达量低。生产植物疫苗或在植物中表达抗体以及药用蛋白，其表达量必须达到一定水平时才具有商业开发价值。因此，建立高效稳定的新型植物生物反应器技术体系，提高外源蛋白在植物细胞或植物生物反应器中的表达水平具有重要产业价值。使用特定的信号肽指引目标蛋白定向到合适的亚细胞部位(如细胞质、质外体、内质网腔、叶绿体、液泡等)，被认为是实现目标蛋白高效表达的有效方法。例如，利用叶绿体基因组拷贝数多的特点，将外源基因整合到叶绿体基因组中，可使其拷贝数达到100～10 000个/细胞，可明显提高外源基因表达产物的积累。Kmi等将融合了内质网滞留信号序列(SEKDEL)的霍乱毒素β亚单位在莴苣中表达，结果发现重组蛋白有较高水平的积累。可见，寻找特定的信号肽，是建立高效、稳定的植物生物反应器蛋白表达体系的重要途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可提高蛋白质在植物细胞内表达量的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，命名为SP。

本发明的第二个目的在于提供一种编码SP短肽的核苷酸序列，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的第三个目的在于提供一种含有碱基序列如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的表达载体。

所述表达载体为植物表达载体。

本发明的第四个目的在于提供SP短肽在利用植物细胞生产蛋白质中的应用。

本发明的第五个目的在于提供所述表达载体在生产蛋白质中的应用，所述植物表达载体在生产蛋白质中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

1)克隆Sali3-2基因及编码SP短肽的核苷酸序列片段；

2)构建SP-GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA1302-SP-GFP；

3)将植物表达载体pCAMBIA1302-SP-GFP利用农杆菌转化烟草，获得转SP-GFP基因烟草悬浮细胞；

4)SP-GFP的亚细胞定位；

5)提取转基因烟草悬浮细胞总蛋白，进行蛋白定量，并用流式细胞仪分析转GFP及SP-GFP细胞的平均荧光强度，证明转SP-GFP基因细胞系中的GFP的积累量约为转GFP基因细胞系的3倍。

本发明克隆了一种编码SP短肽的核苷酸序列，构建pCAMBIA1302-SP-GFP植物表达载体，用农杆菌转化烟草，获得转SP-GFP基因烟草，以表达SP-GFP。对比分析转GFP和转SP-GFP的细胞系中GFP的表达，结果发现，1)SP的存在可使目的蛋白在表达后储存到植物细胞液泡中；2)SP的存在可提高细胞内目的蛋白的积累量。与对照的无SP片段的目的基因相比，有SP的融合基因在烟草细胞中的蛋白表达量提高了200％。转SP-GFP的细胞其GFP积累于液泡中，并且该细胞中GFP的积累量要是转GFP的细胞中的积累量的3倍之多。证明SP短肽在植物生物反应器生产目的蛋白时对提高目的蛋白的表达量有重要应用价值。

附图说明

图1植物表达载体pCAMBIA1302质粒图谱；

图2表达载体pCAMBIA1302-SALI3-2-GFP质粒图谱；

图3SALI3-2蛋白氨基酸序列结构示意图；

图4表达载体pCAMBIA1302-SP-GFP构建流程图；

图5在潮霉素抗性平板上筛选的转基因细胞图(自左至右分别为：未转基因的细胞，转染了GFP的细胞，转染了SP-GFP的细胞)；

图6转基因烟草细胞中的荧光分布图(上：转pCAMBIA1302-SP-GFP的烟草细胞，下：转pCAMBIA1302的烟草细胞；左：暗视野下，中：激发光下，右：合并后；红色为细胞膜染料FM4-64发光情况，激发光波长543nm；绿色为GFP融合蛋白发光情况，激发光为488nm；黄色为合并后红、绿荧光共定位；Bar＝20μm)；

图7BSA蛋白标准曲线图；

图8表达GFP，S-GFP蛋白的烟草细胞提取液单位毫克蛋白的相对荧光强度；

图9蛋白SDS-PAGE和蛋白免疫印迹，1.转SP-GFP的细胞蛋白提取液，2.转GFP的细胞蛋白提取液，3.未转基因细胞蛋白提取液；上：考马司亮兰染色，下：Western-blot，一抗anti-GFP(来源于兔)，二抗HRP-IgG(羊抗兔)；

图10流式细胞仪比较细胞中的平均荧光强度图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。

实施例1克隆Sali3-2基因及编码SP短肽的核苷酸序列片段

以大豆(Glycine max.L)白农六号(由吉林省白城农业科学研究所提供)未成熟种子的cDNA为模版，进行聚合酶链扩增反应，获得插入的目的基因片段Sali3-2。在该片段中含有编码SP短肽的核苷酸片段。

PCR引物如下所示：

SF：5′-cacaggataatttcgatgctcag-3′，带有Nco I酶切位点

SR：5′-tgcgc

aacaacaacgttagtctgatagga-3′，带有XbaI的酶切位点

实施例2构建SP-GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA1302-SP-GFP首先，构建植物表达载体pCAMBIA1302-SALI3-2-GFP：

设定引物SF(5′-cacaggat

aatttcgatgctcag-3′，带有Nco I酶切位点)和SR(5′-tgcgc

aacaacaacgttagtctgatagga-3′，带有XbaI的酶切位点)，以大豆(Glycinemax.L)白农六号(由吉林省白城农业科学研究所提供)未成熟种子的cDNA为模版，进行聚合酶链扩增反应，获得插入的目的基因片段Sali3-2。将获得的Sali3-2目的基因片段利用Nco I和Xba I进行双酶切并获得酶切产物；利用Nco I和Spe I对pCAMBIA1302质粒(质粒图谱如图1所示)进行双酶切，并获得载体酶切产物；连接插入片段Sali3-2和载体酶切片段，转化TOP10大肠杆菌，鉴定获得Sali3-2-GFP融合表达载体pCAMBIA1302-Sali3-2-GFP(质粒图谱如图2所示)，Sali3-2基因片段位于35S启动子和GFP基因之间，即片段顺序为35S-Sali3-2-GFP。

其次，获得35S-SP核苷酸片段，构建SP-GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA1302-SP-GFP

大豆SALI3-2蛋白由276个氨基酸组成，利用Expasy网的软件分析，发现大豆SALI3-2蛋白N端为一信号肽序列，其断裂位点可能发生于第19与第20位氨基酸之间(SignalP 3.0 server)，中间53个氨基酸为保守片段，C端包含有完整的BURPdomain保守序列(如图3所示)。

由于信号肽只有19个氨基酸，在pCAMBIA1302的第9787位自带Hind III，设计上游引物SPF(5′-gcatgcggcactgg-3′，带有Hind III酶切位点)，下游引物SPR(5′-gcatg

gctctctcctgcaagag-3′，带有Spe I的酶切位点)，以质粒pCAMBIA1302-SALI3-2-GFP为模板，利用该对引物进行聚合酶链扩增反应(PCR反应条件为94℃，30s；55℃，60s；72℃，30s，26个循环后72℃延伸10min)，获得35S-SP核苷酸片段的PCR产物，利用Hind III和Spe I对PCR产物进行双酶切并获得插入片段35S-SP；利用Hind III和Spe I对pCAMBIA1302质粒进行双酶切，并获得酶切后的载体片段；将获得的目的基因片段和载体酶切片段用T4连接酶在18℃下进行连接过夜。利用常规的CaCl₂处理转化法将连接产物转化TOP10大肠杆菌，经卡那霉素抗性平板筛选获得阳性克隆，并进行菌落PCR鉴定(使用引物SPF和SPR，PCR反应条件为94℃，30s；55℃，60s；72℃，30s，30个循环后72℃延伸10min。获得产物长度为760bp)，获得SP-GFP融合表达载体pCAMBIA1302-SP-GFP，如图4所示，SP片段位于35S启动子和GFP基因之间，即片段顺序为35S-SP-GFP。再经上海生物工程技术服务有限公司测序确认了构建的重组质粒的正确性。其中SP片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2，具体为atggaatttcgatgctca gtcatctctt ttaccattct cttctctctt gctcttgcag gagagagc，对应的氨基酸序列如SEQID NO：1，具体为MEFRCSVISFTILFSLALAGES，共22个氨基酸，前19个氨基酸为推测的信号肽序列。

实施例3烟草悬浮细胞的转化

将pCAMBIA1302-SP-GFP载体转化农杆菌LB4404，筛选并鉴定获得转入了pCAMBIA1302-SP-GFP的农杆菌。挑取该根癌农杆菌阳性单菌落接种于LB液体培养基(含有50mg/L Kan和50mg/LRif)中，28℃振荡培养36～48h；取1mL农杆菌菌液扩接于50mL LB液体培养基(含有50mg/L Kan和50mg/L Rif)中，28℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.5取1mL农杆菌菌液，4000rpm离心2min，弃上清；加入等体积的烟草悬浮细胞培养液重悬沉淀，取200μL农杆菌加入到5mL培养4天的烟草悬浮细胞中，再加入5μL 100μM乙酰丁香酮(AS)，混匀，26℃静止培养，两天后收集共培养物于1.5mL的EP管，低速离心，然后用烟草悬浮细胞培养液洗涤细胞3次，将烟草悬浮细胞涂布于筛选培养基上(含有Hyg 50mg/L和Cef250mg/L)，28℃，避光培养，4-6周。

由图5可知，非转基因的烟草细胞在筛选平板上没有细胞团的生长，而转染了GFP和SP-GFP的细胞在平板上均有细胞团或愈伤组织，细胞团或愈伤组织即为转基因的候选细胞团。取这些细胞团转移到新鲜的筛选培养基上继续培养，2周后转入液体培养基中进行悬浮培养，经PCR扩增SP片段、GFP和抗潮霉素基因片段进行鉴定，确定为转基因烟草细胞系。

实施例4 SP-GFP的亚细胞定位

用移液枪吸取50μL继代时间为4～5天、分裂旺盛的烟草悬浮细胞到激光共聚焦专用皿，再滴加5μL的膜染料FM4-64(浓度为5μmol/L)，混匀，在OlympusFV1000型激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白的分布情况。激发光为488nm、吸收光为500～550nm观察SP-GFP绿色荧光；激发光为546nm、吸收光为430-640nm观察FM4-64标记的细胞膜，采图时，图像中的标记物颜色为红色。

由图6可见，转染了SP-GFP的细胞其细胞内绿色荧光分布在液泡中，转染了GFP的细胞其绿色荧光分布在细胞质、核中。

实施例5总蛋白定量

提取总蛋白

取生长旺盛的悬浮细胞，在4℃，3000rpm条件下离心5min，去掉培养基，尽可能吸干，收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。然后将细胞放到加好液氮的研钵中研磨，200mg的粉末中加进500ul冷的蛋白裂解液(50mM Tris-HCl，pH8.0；150mM Nacl；0.001％聚乙烯吡咯烷酮；0.02％叠氮钠)，混匀后，在4℃条件下振荡15-20分钟。在4℃，12000rpm条件下离心15分钟。快速将上清吸进另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。

总蛋白定量

利用Bradford试剂(如表1所示)对蛋白进行考马斯亮蓝(Coomassie brilliantblue G-250)染色。考马斯亮蓝-蛋白质的结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。

表1 Brandford试剂[Bradford，1976]

采用Bradford法测定蛋白浓度，先以BSA为蛋白标准品，测定并绘制出蛋白的标准曲线(如图7所示)。将10μL待测样品中加入990μL去离子水，将蛋白样品稀释100倍，然后加到盛有5mL的Bradford试剂的试管中，利用酶标仪测定样品在595nm下的吸光值，根据蛋白的标准曲线计算出样品的蛋白浓度(如表2所示)。

表2各样品提取液中总蛋白的含量

细胞种类	未转基因细胞	转GFP细胞	转SP-GFP细胞
				总蛋白含量(mg/ml)	0.62±0.24	1.10±0.03	1.53±0.44

总蛋白荧光值的测定

根据计算出的总蛋白的含量，把总蛋白含量最低的样品设为参照，用蛋白裂解液将各蛋白样品稀释并调整蛋白浓度，使各样品蛋白浓度与参照样品相同(以测定的各蛋白样品最低浓度为调整基准，如0.42mg/mL)。取调整后的各蛋白液0.8ml到石英比色杯中，用荧光分光光度计测定样品的荧光强度。设置激发光为480nm，发射光为500-550nm。如图8所示，以未转基因细胞蛋白提取液为对照(0)，转GFP的细胞其蛋白提取液的相对荧光强度为71，而转SP-GFP的细胞，其蛋白提取液的相对荧光强度为201，后者约为前者的3倍。

实施例6蛋白印记法比较两种转基因细胞的目的蛋白含量

将定量好的蛋白(WT，GFP及SP-GFP)进行两份SDS-PAGE蛋白电泳(90V电压20min，120V电压80min)，一份进行考马司亮蓝染色，一份用于转膜进行蛋白免疫印迹。进行蛋白免疫印迹时，利用半干法转膜30min，将蛋白转至PVDF膜上。

转膜完成后，将膜取出放入封闭液中，室温、摇床上封闭1h后，将膜放入按1∶2000比例稀释的一抗(anti-GFP，来源于兔)中，4℃孵育过夜，并不断摇动；用TTBS洗膜，每次10min，4次；按1∶2000比例稀释二抗(HRP-IgG，羊抗兔)，室温孵育膜2h，并不断摇动；用TTBS洗膜，每次10min，4次。再用TBS洗膜1次，10min；用TMD显色试剂盒(碱性磷酸酶的底物BCIP/NBT)显色30min；用水冲洗终止反应，观察结果。

从图9可见，转SP-GFP的细胞积累的GFP的量要明显高于转GFP的细胞的GFP积累量，且二者蛋白分子量大小一致，这是由于设计的SP多肽片段末端设计有蛋白酶切位点，在蛋白表达修饰过程中即可将SP片段切除，表达的SP-GFP经修饰后的成熟蛋白即为GFP。SP只为改变了GFP在细胞内的定位。

实施例7流式细胞术分析转基因细胞的平均荧光值

将生长旺盛且长势一致的烟草悬浮细胞，用400目的滤网过滤，收集在离心管中，静置，去上清，培养基洗两遍，静置，去上清，用一定体积的培养基重悬，血球计数板计数，将细胞数目用培养基稀释到低于10⁶/mL，上流式细胞仪(FACSCalibur)，用488nm激发光，荧光通道收集荧光信号，获取10000个细胞，以未转基因的烟草细胞为阴性对照，分析转基因细胞中的平均荧光强度(Mean值)。

利用流式细胞仪在488nm波长的激发光下检测未转基因、转GFP、转SP-GFP的细胞的荧光信号强度(平均荧光强度，Mean值)。从图10可知，未转基因细胞的Mean值为10.24，转GFP，表达GFP蛋白细胞的Mean值为16.37，转SP-GFP，表达SP-GFP蛋白细胞的Mean值为51.60。由此可见，转SP-GFP基因细胞系中的GFP的积累量约为转GFP基因细胞系的3倍。结果与利用荧光分光光度计测定的结果一致。

Claims

1.SP短肽在烟草细胞中提高目的蛋白表达量的应用，其特征在于，将SP短肽编码基因与目的蛋白编码基因融合构建到植物表达载体中，利用所述植物表达载体在烟草细胞中进行目的蛋白的生产；其中，所述SP短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。