CN101033458A - 无血清动物细胞培养基及其制备方法 - Google Patents

无血清动物细胞培养基及其制备方法 Download PDF

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徐俊杰
徐斌
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Abstract

本发明公开了一种无血清动物细胞培养基及其制备方法。无血清培养基是一种不需要动物血清的人工合成培养基，它可避免动物血清在细胞培养过程中带来的污染和血清中不明成分对培养结果造成不确定影响。本发明公开的技术成品为粉末型便于运输，特别为配合有血清下游产品衔接操作而设计的方法，但是，其存在着血清与培养基双成本；血清对环境污染大，后续处理成本高；使用血清后对培养结果产生一定概率的不确定因素；的缺陷，因此必须进行改进，最好的办法是避免使用血清，而本发明方法可使生产无血清培养基时减低成本便于操作，从而使得在低成本代价下产生高效益。

Description

无血清动物细胞培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，是一种不存在动物源物质血清情况下，生产下游产品的无血清动物细胞培养基制备方法。
背景技术
无血清培养基是一种不需要动物血清的人工合成培养基，它可避免动物血清在细胞培养过程中带来的污染和血清中不明成分对培养结果造成不确定影响。中国专利申请号2004100184938公开了一种无血清动物细胞培养基，该专利公开的技术成品为粉末型便于运输，特别为配合有血清下游产品衔接操作而设计的方法，但是，其存在着血清与培养基双成本；血清对环境污染大，后续处理成本高；使用血清后对培养结果产生一定概率的不确定因素的缺陷，因此必须进行改进，最好的办法是避免使用血清，而本专利方法可使生产无血清培养基时减低成本便于操作，从而使得在低成本代价下产生高效益。以满足有关部门的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种无血清动物细胞培养基及其制备方法，以克服现有技术存在的缺陷，满足有关部门的需要。
本发明的无血清动物细胞培养基，由A部分和B部分组成，以无血清动物细胞培养基的总重量为基准，A部分和B部分的组分和重量份数包括：
A部分：
基础培养基    1000份
丙酮酸钠             22份
谷胱甘肽             0.1份
硫酸锌·7H2O         0.1732份
维生素C              0.01132份
硫酸亚铁·7H2O       0.26份
柠檬酸三钠           0.26份
维生素B12            0.272份
次黄嘌呤             0.06份
硫辛酸               0.0412份
L-丙氨酸             1.78份
L-门冬氨酸           2.64份
L-谷氨酸             2.94份
甘氨酸               1.5份
L-脯氨酸             2.3份
L-丝氨酸             2.1份
L-门冬酰胺           2.64份
B部分：
必需脂肪酸           0.01682份
痕量元素A            1份
痕量元素B            1份
痕量元素C            1份
痕量元素D            1份
维生素E              0.02份
胆固醇               0.04份
盐酸丁二胺           0.04份
生物素                  0.001466份
吐温80                  1份
L-丙氨酸-谷氨酰胺       120份。
所说的基础培养基选自上海旭太生物工程有限公司产的MEM(α)或GlasgowMEM(上海旭太生物工程有限公司产的MEM(G))；
MEM(α)的组成和制备方法在文献stanners，N.P；Eliceiri，G.L；Green，H：Nature New Biology 230 52-54(1971)中已经有公开的报道，可采用市售产品，如上海旭太生物工程有限公司旭字牌MEM(α)的产品；
GlasgowMEM的组成和制备方法在House，W：Medical ResearchCouncil，Institute of Visology University of Glasgow Scotland November1964文献中已经有公开的报道，可采用市售产品，如上海旭太生物工程有限公司牌号为MEM(G)的产品；
所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；
所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；
痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；
痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；
痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；
生物素选自市售D生物素。
优选的A部分和B部分的组分和重量份数包括：
A部分：
基础培养基     1000份
丙酮酸钠       22份
谷胱甘肽       0.1份
硫酸锌·7H2O   0.1732份
维生素C              0.01132份
硫酸亚铁·7H2O       0.26份
柠檬酸三钠           0.26份
维生素B12            0.272份
次黄嘌呤             0.06份
硫辛酸               0.0412份
L-丙氨酸             1.78份
L-门冬氨酸           2.64份
L-谷氨酸             2.94份
甘氨酸               1.5份
L-脯氨酸             2.3份
L-丝氨酸             2.1份
L-门冬酰胺           2.64份
B部分：
必需脂肪酸           0.01682份
痕量元素A            1份
痕量元素B            1份
痕量元素C            1份
痕量元素D            1份
维生素E              0.02份
胆固醇               0.04份
盐酸丁二胺           0.04份
生物素               0.001466份
吐温80               1份
L-丙氨酸-谷氨酰胺    120份。
本发明的无血清动物细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：
a.按照比例，将A部分的原料在60～80℃下真空干燥18～30小时；B部分的原料在30～50℃真空干燥18～30小时；
b.将干燥后的A部分原料球磨2～4小时，然后过30～50目筛成为固态粉末状中间体；
c.将B部分原料与A部分原料混合，球磨2～4小时，可采用市售双头2缸球磨机，然后过30～50目筛，获得产品。
本发明的无血清动物细胞培养基可以用于动物细胞的培养，优选的动物细胞为BHK21细胞或Vero细胞，所说的BHK21细胞为一种细胞是制造口蹄疫疫苗的重要细胞株，农业部第336号公告(2004年)，猪口蹄疫O型灭活疫苗质量标准为：“O型口蹄疫疫猪源病毒需接种在BHK-21细胞之中。可采用市售产品，如中国科学院细胞库提供的产品，所说的Vero细胞为一种绿猴肾细胞，可采用市售产品，如中国科学院细胞库公司提供的产品。
本发明的无血清动物细胞培养基用于动物细胞的培养时，培养基方法如下一例：
按比例配成重量浓度为1.1～1.36％的水溶液；
将原有有血清培养细胞换上不含小牛血清的无血清培液洗涤1～2次，加入不含小牛血清的培液，培养2～3天(此时可接种病毒)，倒出培液；再加不含小牛血清的无血清培液，继续培养2～3天，此时细胞培养在无血清培养中成长。
本发明的无血清动物细胞培养基用于培养动物细胞，与有血清下游产品衔接较好，根据技术监督局批准的企业标准Q/TOSC-2003的规程来检验产品：经培养细胞一般从1～5×104经三天培养后达到1×106，在无血清阶段细胞数量达到1×106能够满足有关部门的需要。
具体实施方式
实施例中，基础培养基MEM的组分和重量份数含量采用参考文献：stanners，N.P；Eliceiri，G.L；Green，H：Nature New Biology 23052-54(1971)公开的技术；
GlasgowMEM组分和重量份数含量采用参考文献：House，W：Medical Research Council，Institute of Visology University ofGlasgow Scotland November 1964.均采用上海旭太生物有限公司的市售产品，
                      实施例1～2
BHK21细胞无血清培养基(粉末)
         实施例1                            实施例2
A组                 单位：g       A组                  单位：g
MEM                 500           GlasgowMEM           500
丙酮酸钠            11            丙酮酸钠             11
谷胱甘肽            0.05          谷胱甘肽             0.05
硫酸锌·7H2O        0.0866        硫酸锌·7H2O         0.0863
维生素C             0.00566       维生素C              0.00566
硫酸亚铁·7H2O     0.13          硫酸亚铁·7H2O      0.13
柠檬酸三钠          0.13          柠檬酸三钠           0.13
维生素B12           0.0136        维生素B12            0.0136
次黄嘌呤            0.03          次黄嘌呤             0.03
硫辛酸              0.0206        硫辛酸               0.0206
                                  L-丙氨酸             0.89
                                  L-门冬氨酸           1.32
                                  L-谷氨酸             1.47
                                 甘氨酸               0.75
                                 L-脯氨酸             1.15
                                 L-丝氨酸             1.05
                                 L-门冬酰胺           1.32
B组              单位：g         B组                  单位：g
必需脂肪酸*     0.00841         必需脂肪酸*         0.00841
痕量元素A*      0.5             痕量元素A*          0.5
痕量元素B*      0.5             痕量元素B*          0.5
痕量元素C*      0.5             痕量元素C*          0.5
痕量元素D*      0.5             痕量元素D*          0.5
维生素E          0.01            维生素E              0.01
胆固醇           0.02            胆固醇               0.02
盐酸丁二胺       0.02            盐酸丁二胺           0.0161
生物素           0.000733        生物素               0.000733
吐温80           0.5             吐温80               0.5
                                 L-丙氨酸-谷氨酰胺     60
实施例1中，所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；
所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；
痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；
痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；
痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；
生物素选自市售D生物素。
实施例2中，所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；
所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；
痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；
痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；
痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；
生物素选自市售D生物素。
制备方法：
a.按照比例，将A部分的原料在70℃下真空干燥24小时；B部分的原料在45℃真空干燥24小时；
b.将干燥后的A部分原料球磨3小时，然后过40目筛成为固态粉末状中间体；
c.将B部分原料与A部分原料混合，球磨3小时，可采用市售双头2缸球磨机，然后过40目筛，获得产品。
                     实施例3～4
Vero细胞无血清培养基(粉末)
        实施例3                            实施例4
A组              单位：g          A组                  单位：g
DMEM             500              DMEM                 500
谷胱甘肽         0.05             谷胱甘肽             0.05
硫酸锌·7H2O    0.0863           硫酸锌·7H2O        0.0863
维生素C          0.011            维生素C              0.00566
柠檬酸三钠       0.13             柠檬酸三钠           0.13
偏硅酸钠         0.014            维生素B12            0.0136
维生素B12        0.0136           次黄嘌呤             0.03
次黄嘌呤         0.03             硫辛酸               0.0206
硫辛酸           0.0206           硫酸亚铁·7H2O       0.13
                                  L-丙氨酸-谷氨酰胺    60
B组               单位：g       B组            单位：g
必需脂肪酸*      0.016         必需脂肪酸*   0.0084
痕量元素A*       0.5           痕量元素A*    0.5
痕量元素B*       0.5           痕量元素B*    0.5
痕量元素C*       0.5           痕量元素C*    0.5
痕量元素D*       0.5           痕量元素D*    0.5
维生素E           0.001         维生素E        0.001
胆固醇            0.02          胆固醇         0.02
盐酸丁二胺        0.0161        盐酸丁二胺     0.0161
生物素            0.000733      生物素         0.000733
吐温80            0.5           吐温80         0.5
硫酸亚铁·7H2O   0.13
实施例3中，所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；
所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；
痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；
痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；
痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；
生物素选自市售D生物素。
实施例4中，所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；
所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；
痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；
痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；
痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；
生物素选自市售D生物素。
制备方法同实施例1。
                           实施例5
将1～5×104的BHK21细胞接种于2ml实施例1的培养基，然后在18～24℃下无菌培养48小时，采用Q/TOSC-2003企业标准规定以定量法的方法计数细胞，进行检测，结果如下：
细胞形态饱满，稳定；在所需生长周期内恰好完成生长数量任务。
由此可见，本发明的培养基工艺，具有使所生产的无血清培养基达到可用，稳定的效果。
                            实施例6
将1～5×104的Vero细胞接种于2ml实施例4的培养基，然后在18～24℃下无菌培养培养48小时，采用Q/TOSC-2003企业标准规定以定量法的方法计数细胞，进行检测，结果如下：
细胞形态饱满，稳定；在所需生长周期内恰好完成生长数量任务。
由此可见，本发明的培养基本发明的培养基工艺，具有使所生产的无血清培养基达到可用，稳定的效果。

Claims (6)

1.一种无血清动物细胞培养基，其特征在于，由A部分和B部分组成，以无血清动物细胞培养基的总重量为基准，A部分和B部分的组分和重量份数包括：
A部分：
基础培养基         1000份
丙酮酸钠           22份
谷胱甘肽           0.1份
硫酸锌·7H2O       0.1732份
维生素C            0.01132份
硫酸亚铁·7H2O     0.26份
柠檬酸三钠         0.26份
维生素B12          0.0544份
次黄嘌呤           0.12份
硫辛酸             0.0412份
L-丙氨酸           1.78份
L-门冬氨酸         2.64份
L-谷氨酸           2.94份
甘氨酸             1.5份
L-脯氨酸           2.23份
L-丝氨酸           2.1份
L-门冬酰胺         2.64份
B部分：
必需脂肪酸         0.01682份
痕量元素A            1份
痕量元素B            1份
痕量元素C            1份
痕量元素D            1份
维生素E              0.02份
胆固醇               0.04份
盐酸丁二胺           0.0322份
生物素               0.001466份
吐温80               1份
L-丙氨酸-谷氨酰胺    120份。
2.根据权利要求1所述的无血清动物细胞培养基，其特征在于，所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；
所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；
痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；
痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；
痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；
生物素选自市售D生物素。
3.根据权利要求1所述的无血清动物细胞培养基，其特征在于，优选的A部分和B部分的组分和重量份数包括：
A部分：
基础培养基      1000份
丙酮酸钠        22份
谷胱甘肽        0.1份
硫酸锌·7H2O    0.1732份
维生素C         0.01132份
硫酸亚铁·7H2O      0.26份
柠檬酸三钠          0.26份
维生素B12           0.272份
次黄嘌呤            0.06份
硫辛酸              0.0412份
L-丙氨酸            1.78份
L-门冬氨酸          2.64份
L-谷氨酸            2.94份
甘氨酸              1.5份
L-脯氨酸            2.3份
L-丝氨酸            2.1份
L-门冬酰胺          2.64份
B部分：
必需脂肪酸          0.01682份
痕量元素A           1份
痕量元素B           1份
痕量元素C           1份
痕量元素D           1份
维生素E             0.02份
胆固醇              0.04份
盐酸丁二胺          0.04份
生物素              0.001466份
吐温80              1份
L-丙氨酸-谷氨酰胺   120份。
4.根据权利要求3所述的无血清动物细胞培养基，其特征在于，优选的A部分和B部分的组分和重量份数包括：
A部分：
基础培养基         1000份
丙酮酸钠           22份
谷胱甘肽           0.1份
硫酸锌·7H2O       0.1732份
维生素C            0.01132份
硫酸亚铁·7H2O     0.26份
柠檬酸三钠         0.26份
维生素B12          0.272份
次黄嘌呤           0.06份
硫辛酸             0.0412份
L-丙氨酸           1.78份
L-门冬氨酸         2.64份
L-谷氨酸           2.94份
甘氨酸             1.5份
L-脯氨酸           2.3份
L-丝氨酸           2.1份
L-门冬酰胺         2.64份
B部分：
必需脂肪酸         0.01682份
痕量元素A          1份
痕量元素B          1份
痕量元素C          1份
痕量元素D          1份
维生素E            0.02份
胆固醇             0.04份
盐酸丁二胺         0.04份
生物素             0.001466份
吐温80             1份
L-丙氨酸-谷氨酰胺  120份。
5.根据权利要求1～4任一项所述的无血清动物细胞培养基，其特征在于，动物细胞为BHK21细胞或Vero细胞。
6.制备权利要求1～5任一项无血清动物细胞培养基的方法，包括如下步骤：
a.按照比例，将A部分的原料在60～80℃下真空干燥18～30小时；B部分的原料在30～50℃真空干燥18～30小时；
b.将干燥后的A部分原料球磨2～4小时，然后过30～50目筛成为固态粉末状中间体；
c.将B部分原料与A部分原料混合，球磨2～4小时，可采用市售双头2缸球磨机，然后过30～50目筛，获得产品。
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