CN105219699A - 一种适于bhk21细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方法，所述培养基包括氨基酸、维生素、无机盐、微量元素及其他组分。本发明制备的适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方法，具有无蛋白、无动物源成份、化学成份明确几大优点，在工业上减少了血清对细胞培养过程的干扰，降低了生产成本，为细胞的产业化生产带来极大方便。

Description

一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方法。

背景技术

BHK细胞是指幼年叙利亚地鼠肾细胞(BabyHamsterSyrianKidney)，该细胞系于1961年由MacphersonIA和StokerMGP建系，源自5只未辨性别的1天龄仓鼠肾。原始的细胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性生长。它在1963年经过84天连续培养，获得单细胞克隆细胞。最常用的是BHK21的一个亚克隆细胞，即克隆13或C13。经无数次传代后细胞可悬浮生长，它可用于增殖各种病毒，已成为制备口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想细胞培养系，它还可用于兽用狂犬病毒，乙型脑炎病毒以及伪狂犬病毒等疫苗的生产和研究。

口蹄疫由于传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的“头号杀手”。它是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病，最易感染的动物是牛。口蹄疫发病后一般不致死，但会使病兽的口、蹄部出现大量水疱，高烧不退，使实际畜产量锐减。另外，有个别口蹄疫病毒的变种可传染给人。因此，每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患。国际上英美等发达国家都已全面消灭了口蹄疫，在发展中国家中，中国也走在牲畜防疫的前列。我国对口蹄疫的防治，预防主要通过疫苗注射接种，发生口蹄疫的则捕杀。而BHK21细胞则常用于制备口蹄疫疫苗。

传统的BHK21细胞培养大多采用有贴壁培养方式，使用基础培养基添加10％的小牛血清作为培养液。然而血清是由血浆去除细胞及纤维蛋白原而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，并且其成分随着供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件的不同而存在质量差异，使得实验和生产过程难以实现标准化。而且可能含有潜在的传染性物质比如支原体、真菌、病毒等，产生微生物污染，会使蛋白质产物的下游分离纯化工作困难。此外，血清来源困难，价格昂贵，大规模动物细胞培养过程中使用血清将会大大增加生产成本。

发明内容

本发明主要提供了一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方法，具有无蛋白、无动物源成份、化学成份明确几大优点，在工业上减少了血清对细胞培养过程的干扰，降低了生产成本，为细胞的产业化生产带来极大方便。其技术方案如下：一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基，其包括以下组分：

氨基酸部分包括以下组分：

维生素部分包括以下组分：

无机盐部分包括以下组分：

微量元素部分包括以下组分：

还包括以下其他组分：

优选的，一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基的组分如下：氨基酸部分包括以下组分：

维生素部分包括以下组分：

无机盐部分包括以下组分：

微量元素部分包括以下组分：

还包括以下其他组分：

一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基的制备方法，包括如下步骤：

(1)取干燥后的各组分分别装入球磨罐内，球磨1.5-3小时，得培养基干粉；

(2)将步骤(1)制得的培养基干粉溶解于超纯水中，并进行定容，用滤菌膜过滤灭菌，即得适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白液态培养基。

优选的，步骤(1)中球磨时间为2小时，步骤(2)中滤菌膜的孔径为0.22μm。

采用上述培养基及其制备方法，本发明具有以下优点：

(1)本发明的培养基，具有无蛋白、无动物源成份、化学成份明确几大优点，在科研上可减少血清对实验过程和结果的干扰，在工业生产上可提高生产效率，保证产品质量，在保留了传统工艺设备的基础上，通过降低血清的使用量减少生产成本，同时最重要的是，它并没有改变BHK21细胞的贴壁生长状态，本发明提供的培养基适用于细胞的贴壁培养，与微载体等其它技术结合，可在摇瓶、生物反应器等进行规模化培养，从而广泛用于工业化生产中；

(2)本发明的BHK21细胞低血清无蛋白培养基添加2％小牛血清与基础培养基添加10％小牛血清进行了细胞培养比较，其细胞培养的生长曲线及病毒接毒增殖能力相近，无显著差别，本发明的培养基不改变传统生产工艺，不需更换新的生产设备，可用于现有的国内生产。

附图说明

图1为ATCC(美国模式培养物保藏所)提供的10％血清浓度条件下培养的BHK21细胞显微镜下状态图；

图2为使用本发明的低血清培养基在添加2％小牛血清浓度条件下连续培养两个月的BHK21细胞显微镜下状态图；

图3为使用本发明的低血清培养基在添加2％小牛血清浓度条件下培养的BHK21细胞的生长曲线与使用现有的10％小牛血清DMEM高糖培养的BHK21细胞的生长曲线对比图。

具体实施方式

实施例1

本实施例用于制备适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白细胞培养基。

1.培养基的配方

表1培养基配方

2.制备方法

(1)取配方中干燥后的各组分分别装入球磨罐内，球磨2小时，得培养基干粉；

(2)将步骤(1)制得的培养基干粉溶解于900ml超纯水中，然后用超纯水定容至1L，用孔径为0.22μm的滤菌膜过滤灭菌，即得适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白液态培养基，在6℃下冷藏备用。

实施例2

本实施例用于制备适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白细胞培养基。

1.培养基的配方

表2培养基配方

2.制备方法

(1)取配方中干燥后的各组分分别装入球磨罐内，球磨1.5小时，得培养基干粉；

(2)将步骤(1)制得的培养基干粉溶解于900ml超纯水中，然后用超纯水定容至1L，用孔径为0.22μm的滤菌膜过滤灭菌，即得适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白液态培养基，在8℃下冷藏备用。

实施例3

本实施例用于制备适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白细胞培养基。

1.培养基的配方

表3培养基配方

2.制备方法

(1)取配方中干燥后的各组分分别装入球磨罐内，球磨3小时，得培养基干粉；

(2)将步骤(1)制得的培养基干粉溶解于900ml超纯水中，然后用超纯水定容至1L，用孔径为0.22μm的滤菌膜过滤灭菌，即得适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白液态培养基，在4℃下冷藏备用。

实施例4

本实施例用于说明本发明的适用于BHK21细胞生长的低血清无蛋白细胞培养基液体的实验室使用方法。

1.BHK21细胞培养

a)在现有的DMEM高糖培养基(DMEM高糖培养基为已知且成分确定的含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)中加入10％浓度小牛血清培养的BHK21细胞，生长至铺满T25方瓶底部约80-90％后，去掉培养液，用不含钙镁的无菌PBS液(0.2ml/cm²)漂洗细胞；

b)加入含0.25％(w/v)胰蛋白酶和0.02％(w/v)EDTA的无菌消化液(0.2ml/cm²)后，置于5％CO₂、饱和湿度的培养箱，37℃孵育至细胞收缩变圆，吸出消化液，加入培养基吹打均匀后传代，接种密度为1～2×10⁵cells/ml。

2.用本发明的培养基对BHK21细胞进行低血清驯化

采用直接法或逐步降血清适应法进行BHK21细胞低血清培养的适应和驯化。

a)直接法：将上述稳定生长的细胞直接接种到实施例1、2、或3制备完成的低血清无蛋白培养基中培养，培养基在细胞培养时添加2％的小牛血清，待其生长状态稳定且能连续传代后即代表驯化成功。

b)逐步降血清适应法：将上述稳定生长的细胞接种于含10％小牛血清浓度的本发明的培养基中进行培养，逐步降低培养基中的血清含量，即血清含量分别从10％、5％最终降至2％，进行细胞持续的2％低血清培养，在每一血清浓度下，细胞进行持续传代，待状态稳定后将细胞转移至含更低浓度血清的培养基中，直至完全适应低血清无蛋白培养基，上述使用的本发明的培养基均为实施例1、2或3中制备完成的培养基。

结果分析：在含有10％小牛血清DMEM高糖培养基中培养的BHK21细胞，采用直接法和逐步降血清适应法均能成功地将BHK21细胞从10％小牛血清培养适应到本发明中的2％低血清培养基中培养。

直接法驯化过程时间短，但适应过程初期细胞会出现明显的不适应性，而在逐步降血清适应过程中细胞并未出现太明显的不适应现象。不管是直接或者是间接的方法降血清培养驯化，本发明中的低血清无蛋白培养基在2％小牛血清浓度条件下都能很好地为BHK21细胞提供了一个合适的生长环境。

图1为ATCC(美国模式培养物保藏所)提供的10％小牛血清浓度条件下培养的BHK21细胞培养图片，图2为使用本发明的低血清培养基在添加2％小牛血清浓度条件下连续培养两个月的BHK21细胞图片。由图1和图2对比可知，采用本发明的培养基添加2％小牛血清浓度条件下更适于BHK21细胞的生长。

实施例5

本实施例用于说明本发明的适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白细胞培养基培养细胞更优于常规使用10％小牛血清浓度培养基培养细胞。

细胞生长曲线测定：将现有的加入10％小牛血清的DMEM高糖培养基培养的细胞、加入2％小牛血清的实施例1中培养基培养的细胞分别接种于12孔板中，1×10⁵cells/孔，并用对应培养基培养，每隔24h测一次细胞密度，每种细胞每次取3孔，胰酶消化后，用台盼蓝染色计数。

结果分析：两种培养体系培养的细胞生长动力曲线，如图3所显示，2％低血清培养的BHK21细胞的生长速度与10％小牛血清DMEM高糖培养的BHK21细胞形态没有明显差异，2％低血清培养的BHK21细胞相较于10％小牛血清DMEM高糖培养的BHK21细胞生长速度和细胞数量也稍有优势。由此可知，采用本发明制备的培养基适用于2％低血清培养环境，能够减少血清用量，节约成本。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基，其特征在于：其包括以下组分：

氨基酸部分包括以下组分：

维生素部分包括以下组分：

无机盐部分包括以下组分：

微量元素部分包括以下组分：

还包括以下其他组分：

胸苷0.01-1mg/L次黄嘌呤0.01-1mg/L

亚油酸0.01-1mg/LD-葡萄糖3000-5000mg/L

酚红1-20mg/LHEPES1000-4000mg/L。

2.根据权利要求1所述的一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基，其特征在于：其包括以下组分：

氨基酸部分包括以下组分：

维生素部分包括以下组分：

无机盐部分包括以下组分：

微量元素部分包括以下组分：

还包括以下其他组分：

胸苷0.09125mg/L次黄嘌呤0.52mg/L

亚油酸0.0402mg/LD-葡萄糖4537mg/L

酚红9.53mg/LHEPES1979mg/L。

3.一种如权利要求1所述的适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取干燥后的各组分分别装入球磨罐内，球磨1.5-3小时，得培养基干粉；

(2)将步骤(1)制得的培养基干粉溶解于超纯水中，并进行定容，用滤菌膜过滤灭菌，即得适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白液态培养基。

4.根据权利要求3所述的适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基的制备方法，其特征在于：步骤(1)中球磨时间为2小时，步骤(2)中滤菌膜的孔径为0.22μm。