一种优化的细胞培养基、细胞培养方法及其在制备蛋白和抗体中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地说,本发明涉及一种细胞培养基、细胞培养工艺及其在制备蛋白和抗体中的应用。
背景技术
哺乳动物细胞能够准确完成糖基化、二硫键折叠和磷酸化等一系列翻译后修饰的过程,以及所表达的蛋白产品在分子结构和生物学特性方面最接近天然蛋白或抗体,因此,哺乳动物细胞已广泛用于蛋白类药物的表达。大规模哺乳动物细胞培养已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法,利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等,已成为医药生物高技术产业的重要部分。
无血清培养基由于具有更高的成分限定性、批次差异小、简化分离纯化和下游生产过程、培养的生理环境易于控制、避免病毒污染以及配方便于优化等优点,被广泛的应用于哺乳动物细胞的培养以生产制备单克隆抗体和重组蛋白等。然而,商业化无血清培养基缺乏对表达不同蛋白的细胞株的通用性,应用于细胞培养时需针对细胞株的生长代谢特性进行配方优化。
目前大多数哺乳细胞大规模培养工艺广泛采用批次流加工艺。在批次流加培养过程中,通过添加浓缩培养液来抑制细胞凋亡、延长细胞培养周期、增加细胞的密度和活性,从而提高蛋白产物的表达。同时,细胞在培养过程中其代谢产物也在不断的累积,会引起细胞凋亡的发生,其中铵离子对细胞生长、蛋白产物性质和数量的影响最为显著。
谷氨酰胺是细胞生长代谢过程中很重要的氮源物质,在细胞培养基中它是维持细胞生长必不可少的组分,为细胞的生物合成提供能源。生产蛋白类药物的动物细胞对谷氨酰胺的利用具有消耗快、代谢率低的特点。铵离子是谷氨酰胺的代谢产物,1分子谷氨酰胺经过代谢进入三羧酸(TCA)循环要产生2分子的铵离子,铵离子的累积对细胞生长会产生毒害作用,也对目的蛋白的糖基化等一系列反应产生副作用。
目前,商业化的基础培养基在哺乳动物细胞的大规模培养中,特别是批次流加培养工艺中,生产培养基中的谷氨酰胺最多能维持细胞生长96小时。为了提供细胞生长所需要的氮源物质,需要不断的补充谷氨酰胺将其维持在一个合适的浓度范围,同时铵离子的生成约为0.2~0.6mM/106cells/天,大多数细胞对铵离子的耐受浓度约在10mmol/L左右,由此易造成铵离子累积超过细胞的耐受浓度。为了避免铵离子对细胞生长和功能以及目的蛋白的质量产生严重影响,将铵离子浓度控制在细胞耐受范围之内尤为重要。
综上,现有技术存在动物细胞培养过程中谷氨酰胺易被耗竭及其代谢副产物铵离子严重累积这一关键技术难题。
发明内容
鉴于现有技术存在技术难题,本发明通过大量实验优选在基础培养基中添加谷氨酸和谷氨酰胺,制备成既能满足动物细胞对氮源物质的需求,又能将铵离子浓度控制在细胞耐受范围之内的生产培养基,以利于动物细胞的生长、代谢以及降低铵离子对目的蛋白质量的影响。
本发明的第一个目的在于提供了一种优化的细胞培养基。所述的优化的细胞培养基具有既能满足动物细胞对氮源物质的需求,又能将铵离子浓度控制在细胞耐受范围之内。
本发明的上述有益效果通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种优化的细胞培养基,所述的细胞培养基是由基础培养基和添加物组成。
所述的添加物为谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)。
具体的,优选所述的添加物谷氨酸的终浓度为2~5mM(Glu添加到培养基后的最终浓度)。
优选所述的添加物谷氨酰胺的终浓度为4mM(Gln添加到培养基后的最终浓度)。
具体的,所述的基础培养基,其特征在于所述的基础培养基具有如下特征:
(1)无血清、无动物源成分;
(2)用于哺乳动物细胞大规模培养;
(3)谷氨酸含量低于2mmol/L,不含谷氨酰胺。
所述的基础培养基选自下述一种或多种商用培养基:EX-CELL302 CHOSerum-Free Medium、EX-CELL325PF CHO、EX-XELL CD Fusion、SFM4CHO、CDM4CHO、Hycell CHO Medium、CDM4Mab。
优选的,所述的商用培养基是EX-CELL302 CHO Serum-Free Medium、SFM4CHO和CDM4CHO。
本发明通过大量实验发现在基础培养基中同时添加谷氨酰胺和谷氨酸,并控制在所述浓度下,以满足细胞在生产培养的前期,主要代谢消耗谷氨酰胺的需求,当谷氨酰胺消耗尽时,细胞会转而利用谷氨酸,这样有力的保证了谷氨酰胺的耗尽对细胞的生长代谢没有影响,同时又能很好的将铵离子控制在细胞耐受范围内。
本发明的第二目在于提供了上述优化的细胞培养基用于哺乳动物细胞培养的方法。
具体的,在37℃,溶氧50%,pH7.0条件下放大培养,当哺乳动物细胞密度达到2×106cells/mL,将哺乳动物细胞接种至7.5L反应器中,接种的初始细胞密度是3×105cells/ml,并使用上述优化的细胞培养基培养,培养体积为3L,培养14天。在哺乳动物细胞培养的生产期内,不再补充氮源,如需要,在不同生产时间段分别补充补料培养基,以维持哺乳动物细胞稳定的生长和生产目的蛋白的能力。
所述的哺乳动物细胞为CHO细胞,优选的所述哺乳动物细胞为DHFR(DihydrofolateReductase,二氢叶酸还原酶)缺陷型CHO细胞(简称CHO-DHFR-)。
所述的氮源为谷氨酰胺。
所述的补料培养基选自商用补料培养基Feed A(如Gibco公司,货号A10234-01)和Feed B(如Gibco公司,货号A10240-01)。
本发明的第三个目的在于提供了利用上述培养基和哺乳动物细胞培养方法在制备重组蛋白和单克隆抗体中的应用。
具体的,利用上述哺乳动物细胞培养方法进行细胞生产培养14天,以获得目的蛋白和抗体的细胞培养液。在生产制备目的蛋白和抗体时,同时检测本发明的多种培养条件,包括细胞密度、细胞活率、代谢副产物铵离子浓度、表达目的蛋白和抗体的糖基化水平和生物学活性。
所述的重组蛋白药物选自人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFRII-Fc)。
所述的单克隆抗体选自抗CD20单克隆抗体。
由于在基础培养基中添加了谷氨酰胺和谷氨酸,不仅为哺乳动物细胞稳定生长提供了足够的营养物质,而且有效的控制了代谢副产物铵离子的浓度,维持或提高了利用哺乳动物细胞生产制备治疗性目的蛋白的糖基化水平和生物学活性。
本发明的技术方案与现有技术相比具有如下优点:
1、提供了一种哺乳动物细胞生产培养的优化培养基,由基础培养基和添加物谷氨酸和谷氨酰胺组成,该培养基具有既能满足哺乳动物细胞对氮源物质的需求,又能将代谢产物铵离子浓度控制在细胞耐受范围之内。
2、提供了一种将优化培养基用于哺乳动物细胞培养的方法,该方法的工艺选择充分考虑了所要表达的目的蛋白的结构及特性,具有生产工艺更简单、蛋白性质稳定等优点。
3、提供了一种优化培养基在生产制备治疗性蛋白药物方面的应用,利用该优化培养基培养哺乳动物细胞生产制备的治疗性目的蛋白具有更高的糖基化水平和生物学活性。
4、通过大量的研究实验发现,谷氨酸浓度不为2-5mM,或者谷氨酰胺不为4mM,在维持细胞生长所需氮源、控制代谢副产物铵离子浓度和保证目的蛋白质量等方面均难以达到本发明优选培养基的效果。
5、根据优选的技术方案,在培养基加入所述浓度谷氨酸和谷氨酰胺的情况下,在培养过程中,无需添加其他氮源和氨基酸,可以达到进一步加入其他氮源和氨基酸的相应培养效果。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。
术语解释(本发明英文代号对应的中文名称)
附图说明
图1为不同培养基(以EX-CELL302为基础培养基)下细胞密度和细胞活率图,显示EX-CELL302优化培养基与对照培养基中表达rhTNFRII-Fc融合蛋白的重组CHO工程细胞密度和细胞活率结果。其中,□、△和○表示细胞密度,■、▲和●表示细胞活率。
图2为不同培养基(以EX-CELL302为基础培养基)下铵离子浓度变化示意图,显示EX-CELL302优化培养基与对照培养基中代谢副产物铵离子浓度。
图3为不同培养基(以EX-CELL302为基础培养基)下唾液酸的含量示意图,显示EX-CELL302优化培养基与对照培养基所生产的rhTNFRII-Fc融合蛋白中唾液酸的含量。
图4为不同培养基(以EX-CELL302为基础培养基)生产的目的蛋白的受体结合力示意图,显示EX-CELL302优化培养基与对照培养基所生产的rhTNFRII-Fc融合蛋白的受体结合力。
图5为不同培养基(以CDM4CHO为基础培养基)下细胞密度和细胞活率图,显示CDM4CHO优化培养基与对照培养基中表达抗CD20单克隆抗体的重组CHO工程细胞密度和细胞活率。□、△和○表示细胞密度,■、▲和●表示细胞活率。
图6为不同培养基(以SFM4CHO为基础培养基)下细胞密度和细胞活率图,显示SFM4CHO优化培养基与对照培养基中表达抗CD20单克隆抗体的重组CHO工程细胞密度和细胞活率。□、△和○表示细胞密度,■、▲和●表示细胞活率。
图7为不同培养基(以CDM4CHO为基础培养基)下铵离子浓度变化示意图,显示CDM4CHO优化培养基与对照培养基中代谢副产物铵离子浓度。
图8为不同培养基(以SFM4CHO为基础培养基)下铵离子浓度变化示意图,显示SFM4CHO优化培养基与对照培养基中代谢副产物铵离子浓度。
图9为不同培养基(以CDM4CHO为基础培养基)下CD20单克隆抗体的CDC生物学活性示意图,显示CDM4CHO优化培养基与对照培养基所生产的抗CD20单克隆抗体的CDC生物学活性。
图10为不同培养基(以SFM4CHO为基础培养基)下CD20单克隆抗体的CDC生物学活性示意图,显示SFM4CHO优化培养基与对照培养基所生产的抗CD20单克隆抗体的CDC生物学活性。
图11为不同培养基(以CDM4CHO为基础培养基)下CD20单克隆抗体的ADCC生物学活性示意图,显示CDM4CHO优化培养基与对照培养基所生产的抗CD20单克隆抗体的ADCC生物学活性。
图12为不同培养基(以SFM4CHO为基础培养基)下CD20单克隆抗体的ADCC生物学活性示意图,显示SFM4CHO优化培养基与对照培养基所生产的抗CD20单克隆抗体的ADCC生物学活性。
其中,Gln对照组(0mM Glu组)为:商用培养基中添加终浓度为4mM的Gln;2mM Glu组:商用培养基中添加终浓度为4mM的Gln+2mM Glu;5mMGlu组:商用培养基中添加终浓度为4mM的Gln+5mM Glu。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,意外地发现,在基础培养基中添加不同浓度的谷氨酸和一定浓度的谷氨酰胺能够有效维持细胞的正常生长,后续动物细胞生产培养过程中无需再额外补充氮源,在此基础上完成了本发明。
下面结合具体实施例和附图,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)或植物分子生物学-实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual,MelodyS.Clark编,Springer-verlag Berlin Heidelberg,1997)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.培养基的配制
按照表1和表2中的配方,在基础培养基中添加不同浓度的谷氨酸和4mM谷氨酰胺,作为重组CHO工程细胞株培养工艺中优化的生产培养基,与基础培养基中只补充谷氨酰胺的对照培养基进行对比,用于相同细胞培养工艺条件下生产制备具有治疗性的目的蛋白,以评价二者对代谢副产物铵离子水平、细胞密度、细胞活率、目的蛋白糖基化水平和生物学活性等的影响。
表1
培养基编号 |
|
基础培养基 |
添加物1 |
添加物2 |
A |
优化培养基 |
EX-CELL302 |
谷氨酸2mM |
谷氨酰胺4mM |
B |
对照培养基 |
EX-CELL302 |
|
谷氨酰胺4mM |
C |
优化培养基 |
CDM4CHO |
谷氨酸2mM |
谷氨酰胺4mM |
D |
对照培养基 |
CDM4CHO |
|
谷氨酰胺4mM |
E |
优化培养基 |
SFM4CHO |
谷氨酸2mM |
谷氨酰胺4mM |
F |
对照培养基 |
SFM4CHO |
|
谷氨酰胺4mM |
表2
培养基编号 |
|
基础培养基 |
添加物1 |
添加物2 |
A |
优化培养基 |
EX-CELL302 |
谷氨酸5mM |
谷氨酰胺4mM |
B |
对照培养基 |
EX-CELL302 |
|
谷氨酰胺4mM |
C |
优化培养基 |
CDM4CHO |
谷氨酸5mM |
谷氨酰胺4mM |
D |
对照培养基 |
CDM4CHO |
|
谷氨酰胺4mM |
E |
优化培养基 |
SFM4CHO |
谷氨酸5mM |
谷氨酰胺4mM |
F |
对照培养基 |
SFM4CHO |
|
谷氨酰胺4mM |
通过大量的研究实验发现,一方面,在基础细胞培养基中添加4mM Gln时,可维持细胞生长3d所需的氮源,然而,选用更高浓度Gln,会导致代谢副产物铵离子浓度很快累积至10mM以上,不利于细胞的生长代谢,从而影响目的蛋白的质量。另一方面,Glu浓度高于7mM易打破细胞的营养平衡,如果高于10mM会造成细胞损伤,不利于目的蛋白的表达、生产;当Glu浓度低于2mM时,为了维持细胞生产阶段后期所需的氮源而补充Gln,将会导致铵离子浓度增加。因此,谷氨酸浓度不为2-5mM(如1mM、10mM),或者谷氨酰胺不为4mM(如10mM、15mM),在维持细胞生长所需氮源、控制代谢副产物铵离子浓度和保证目的蛋白质量等方面均难以达到本发明优选培养基的效果。
并且,根据优选的技术方案,在培养基加入所述浓度谷氨酸和谷氨酰胺的情况下,在培养过程中,无需添加其他氮源和氨基酸,可以达到进一步加入其他氮源和氨基酸的相应培养效果。
实施例2表达重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体(rhTNFRII-Fc)融合蛋白的重组CHO工程细胞培养
1、rhTNFRII-Fc融合蛋白表达载体的构建
采用PCR技术和DNA重组技术将pSV2-dhfr载体(ATCC产品)中的dhfr(二氢叶酸还原酶)表达单元克隆到pCDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司产品)中,构建可表达DHFR的哺乳动物细胞表达载体pBF01。
根据hTNFRII的基因序列(Genebank登记号AH006638)和人IgG1 Fc片段基因序列(WO9411026)分别设计引物进行PCR扩增,并克隆至PUC18质粒中。
重新设计引物,对上述获得的hTNFRII和人IgG1 Fc的cDNA片段进行重叠(overlap)PCR扩增,以得到rhTNFRII-Fc融合蛋白全长cDNA片段,并采用DNA重组技术将其克隆到pBF01载体中,构建可表达rhTNFRII-Fc融合蛋白的重组表达载体pBF01-rhTNFRII-Fc。
2、表达rhTNFRII-Fc融合蛋白的重组CHO工程细胞株的构建
采用脂质体转染法,将构建的重组表达载体pBF01-rhTNFRII-Fc转染Invitrogen公司的CHO-DG44细胞,然后经G418抗性筛选阳性克隆,然后再通过ELISA法筛选高表达抗体的克隆,然后再用MTX(甲氨蝶呤)逐步加压、筛选、克隆,最终获得一株高表达rhTNFRII-Fc融合蛋白的重组CHO工程细胞株(CHO-BF02)。
3、CHO-BF02种子细胞培养
从种子细胞库中复苏CHO-BF02种子细胞,添加实施例1中的基础培养基,于Coring方瓶中培养24h,以3~5×105cells/ml的活细胞密度接种于摇瓶,置于37℃、5%CO2湿度饱和的二氧化碳培养箱中培养,转速为50r/min,每48h传代扩增一次。
4、细胞流加培养
将步骤3中的CHO-BF02细胞驯化完全适用于无血清悬浮培养,当细胞密度达到约2×106cells/ml,种子液体积扩增至500ml时,以接种初始密度为3×105cells/ml,将细胞转移到7.5L生物反应器中放大培养,并添加实施例1中配制的EX-CELLTM 302无血清培养基(Sigma,24326C-100L)(如表1和表2中所示,A:优化培养基和B:对照培养基),培养体积为3L,培养条件是37℃,溶氧50%,pH7.0,此后的培养过程中不再补充额外的谷氨酰胺。流加培养的第4天、第7天和第10天按照5%(V:V)添加补料培养基Feed A(Gibco公司,货号A10234-01);第5天和第8天添加6g/L补料培养基Feed B(Gibco公司,货号A10240-01)。同时,每天取样NOVA检测葡萄糖浓度,若低于2g/L时,补加葡萄糖至5g/L(表3)。流加培养至第7天时,将反应器温度从37℃调到30℃,继续培养至第14天,收获细胞培养液,离心取上清液。
5、检测分析
(1)细胞密度及活率测定
用磷酸缓冲液(PBS)将样品细胞浓度稀释至合适的范围,使用0.4%台盼蓝进行活细胞染色,吹打均匀后,用血球计数板计算细胞数,并测定细胞活率,计数三次,取平均值。优化培养基与对照培养基中CHO-BF02细胞密度和活率如图1所示。优化培养基所培养的CHO-BF02细胞密度高于对照培养基所培养的细胞密度,其中2mM Glu组细胞密度较对照组的提高了10.10%,5mM Glu组较对照组提高了14.25%。
(2)代谢副产物铵离子浓度测定
氨浓度采用Berthelot尿素氮试剂盒(上海科欣生物技术研究所)测定,不使用脲酶,改用5mmol/L的NH4Cl作为铵离子标准液,具体操作按说明书进行。优化培养基与对照培养基中代谢副产物铵离子浓度如图2所示。优化培养基培养的CHO-BF02细胞过程中所产生的NH4 +浓度显著低于对照培养基的,其中2mMGlu组NH4 +浓度较对照组的降低了20.82%,5mM Glu组NH4 +浓度较对照组的降低了35.91%。
表3重组CHO工程细胞流加培养工艺
实施例3.重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体(rhTNFRII-Fc)融合蛋白的制备
1、rhTNFRII-Fc融合蛋白的分离纯化:
通过Millipore公司的D0HC和B1HC深层滤器按顺序过滤实施例2中所得到的细胞培养液,收集滤过液后用Protein A亲和层析法进行纯化。
将MabselectSuRe(GE公司)层析柱以PBS缓冲液冲洗平衡后,以50~300cm/h的速度将细胞培养液上清上样,用PBS缓冲液冲洗直至未结合的蛋白全被洗脱(以A280进行监测),然后用20mmol/L柠檬酸(pH3.5)洗脱融合蛋白,融合蛋白原液收集后用Tris调节pH值至7.2。
2、检测分析
(1)rhTNFRII-Fc融合蛋白中唾液酸含量的测定
按照2010版《中华人民共和国药典》,采用间苯二酚显色法测定rhTNFRII-Fc融合蛋白中唾液酸的含量,并以每㎎rhTNFRII-Fc融合蛋白含有多少μg唾液酸来表征。优化培养基和对照培养基生产的rhTNFRII-Fc融合蛋白中唾液酸的含量如图3所示。优化培养基所生产的rhTNFRII-Fc融合蛋白中唾液酸的含量显著高于对照培养基的,其中2mM Glu组唾液酸的含量较对照组的提高了38.18%,5mM Glu组唾液酸的含量较对照组的提高了47.27%。
(2)rhTNFRII-Fc融合蛋白受体结合力检测0.05mol/L碳酸钠缓冲液(pH9.6)作为包被液将羊抗人IgG(Fc)抗体(KPL公司,货号为01-10-20)稀释到浓度为5μg/ml,以100μl/孔加入到酶标板中,2~8℃过夜。含0.05%Tween 20的0.01mol/LPBS(PBST)溶液作为洗涤液洗板。含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBST溶液作为封闭液,以300μl/孔加入酶标板中,37℃ 2h,洗涤液洗板。将rhTNFRII-Fc融合蛋白用封闭液稀释到2μg/ml,连续3倍稀释,共稀释11个浓度。将各稀释度rhTNFRII-Fc融合蛋白以100μl/孔加入酶标板,37℃2h,洗涤液洗板。用封闭液将生物素标记的人TNF-α(GIBCO公司)稀释后,以100μl/孔加入酶标板,37℃ 2h,洗涤液洗板。以100μl/孔加入封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP,R&D公司,货号为DY998),37℃ 1h,洗涤液洗板。每孔加入100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物,显色10~15min。每孔加入50μl2mol/L硫酸终止显色。以450nm为检测波长于酶标仪检测OD值。优化培养基和对照培养基生产的rhTNFRII-Fc融合蛋白的受体结合力如图4所示。优化培养基所生产的rhTNFRII-Fc融合蛋白EC50值低于对照培养基的,受体结合力优于对照培养基的,其中2mM Glu组EC50值为9.08ng/mL,5mM Glu组EC50值为7.4ng/mL,对照组EC50值为9.74ng/mL。
实施例4.表达抗CD20单克隆抗体的重组CHO工程细胞培养
1、抗CD20单克隆抗体表达载体的构建:
采用PCR技术和DNA重组技术将pSV2-dhfr载体(ATCC产品)中的dhfr(二氢叶酸还原酶)表达单元克隆到pCDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司产品)中,构建可表达DHFR的哺乳动物细胞表达载体pBF01。
根据文献报道(US Patent,US6399061),采用化学合成技术合成重组抗CD20单克隆抗体的轻链和重链基因片段;采用DNA重组技术将合成的基因片段分别克隆到pBF01载体中,分别构建可表达抗CD20单克隆抗体的轻链和重链多肽的重组表达载体pBF01-CD20L和pBF01-CD20H。
2、表达抗CD20单克隆抗体的重组CHO工程细胞的构建:
采用脂质体转染法,将构建的重组表达载体pBF01-CD20L和pBF01-CD20H共转染Invitrogen公司的CHO-DG44细胞,然后经G418抗性筛选阳性克隆,然后再通过ELISA法筛选高表达抗体的克隆,然后再用MTX逐步加压、筛选、克隆,最终获得一株高表达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞株CHO-CD20。
3、CHO-CD20种子细胞培养
同实施例2
4、细胞流加培养
将步骤3中的CHO-CD20细胞驯化完全适用于无血清悬浮培养,当细胞密度达到约2×106cells/ml,种子液体积扩增至500ml时,以接种初始密度为3×105cells/ml,将细胞转移到7.5L生物反应器中放大培养,并添加实施例1中配制的CDM4CHO无血清培养基(Hyclone,SH30556)(如表1和表2中所示,C:优化培养基,D:对照培养基)或SFM4CHO无血清培养基(Hyclone,SH30518)(如表1和表2中所示,E:优化培养基,D:对照培养基),培养体积为3L,培养条件是37℃,溶氧50%,pH7.0,此后的培养过程中不再补充额外的谷氨酰胺。流加培养的第4天、第7天和第10天按照5%(V:V)添加补料培养基FeedA(Gibco公司,货号A10234-01);第5天和第8天添加6g/L补料培养基FeedB(Gibco公司,货号A10240-01)。同时,每天取样NOVA检测葡萄糖浓度,若低于2g/L时,补加葡萄糖至5g/L(表3)。培养至第14天,收获细胞培养液,离心取上清液。
5、检测分析
(1)细胞密度及活率测定
同实施例2。CDM4CHO优化培养基与对照培养基中CHO-CD20细胞密度和活性如图5所示,CDM4CHO优化培养基所培养的CHO-CD20细胞密度高于对照培养基所培养的细胞密度,其中2mM Glu组细胞密度较对照组的提高了9.39%,5mM Glu组细胞密度较对照组的提高了15.47%。;SFM4CHO优化培养基与对照培养基中CHO-CD20细胞密度和活性如图6所示,SFM4CHO优化培养基所培养的CHO-CD20细胞密度高于对照培养基所培养的细胞密度,其中2mM Glu组细胞密度较对照组的提高了10%,5mM Glu组细胞密度较对照组的提高了20.56%。
(2)代谢副产物铵离子浓度测定
同实施例2。CDM4CHO优化培养基与对照培养基中代谢副产物铵离子浓度如图7所示,CDM4CHO优化培养基培养的CHO-CD20细胞过程中所产生的NH4 +浓度显著低于对照培养基的,其中2mM Glu组NH4 +浓度较对照组的降低了21.73%,5mM Glu组较对照组降低了43.05%。SFM4CHO优化培养基与对照培养基中代谢副产物铵离子浓度如图8所示,SFM4CHO优化培养基培养的CHO-CD20细胞过程中所产生的NH4 +浓度显著低于对照培养基的,其中2mMGlu组NH4 +浓度较对照组的降低了23.49%,5mM Glu组NH4 +浓度较对照组的降低了47.87%。
实施例5.抗CD20单克隆抗体的制备
1、抗CD20单克隆抗体的分离纯化
通过Millipore公司的D0HC和B1HC深层滤器按顺序过滤实施例4中所得到的细胞培养液,收集滤过液后用Protein A亲和层析法进行纯化。
将MabselectSuRe(GE公司)层析柱以PBS缓冲液冲洗平衡后,以50~200cm/h的速度将细胞培养液上清上样,用PBS缓冲液冲洗直至未结合的蛋白全被洗脱(以A280进行监测),然后用20mmol/L柠檬酸+50mmol/L NaCl(pH3.5)洗脱融合蛋白,抗体蛋白收集后用Tris调节pH值至7.2。
2、测试分析
(1)CDC生物学活性检测
收集对数生长期的Raji细胞,离心弃上清,用无酚红无血清的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)洗涤重悬,调整细胞密度为2×105cells/mL,接种于96孔细胞培养板中,100μL/孔。用含5%正常人血清的无酚红RPMI1640培养基(稀释液)将CD20单抗稀释至16μg/mL,再用稀释液进行一系列2倍稀释,共12个稀释度,加入已接种Raji细胞的96孔板中,100μL/孔,于37℃,5%CO2条件下孵育3h;然后,300×g离心5min,取50μL上清,加入到新的96孔板中,并在每孔中加入水性乳酸脱氢酶(LDH)法细胞杀伤试验试剂盒(Promega公司)试剂50μL,室温避光孵育30min,加入终止液50μL/孔终止显色。以490nm为检测波长于酶标仪测量A490光吸收值(OD值),并计算EC50值。CDM4CHO优化培养基和对照培养基生产的抗CD20单抗在补体的参与下,对Raji细胞具有CDC作用,不同浓度的抗CD20单抗与Raji细胞释放的LDH的量之间有明显的量效关系,如图9所示,优化培养基所生产的抗CD20单抗EC50值低于对照培养基的,其中2mM Glu组EC50值为0.313μg/mL,5mMGlu组EC50值为0.285μg/mL,对照组EC50值为0.384μg/mL。SFM4CHO优化培养基和对照培养基生产的抗CD20单抗CDC活性如图10所示,优化培养基所生产的抗CD20单抗EC50值低于对照培养基的,其中2mM Glu组EC50值为0.274μg/mL,5mM Glu组EC50值为0.248μg/mL,对照组EC50值为0.331μg/mL。
(2)ADCC生物学活性检测
收集对数生长期的Daudi细胞及NK92细胞,离心弃上清,以含1%BSA无酚红RPMI1640培养基(稀释液)重悬细胞,调整细胞数分别至1×105和6×105cells/mL。将靶细胞Daudi接种于96孔细胞培养板中,每孔25μL;用稀释液将抗CD20单抗稀释至15μg/mL,再用稀释液进行一系列5倍稀释,共11个稀释度;将稀释好的抗CD20单抗加入已接种Daudi细胞的96孔板中,每孔25μL,再加入效应细胞NK92细胞,每孔25μL。置于37℃,5%CO2条件下诱导6h后,250×g离心10min,取100μL上清,加入到新的96孔板中,并在每孔中加入LDH乳酸脱氢酶-细胞毒性检测分析试剂盒(Biovision,K311-400)反应混合液100μL,室温避光孵育30min。以490nm为检测波长于酶标仪测量A490光吸收值(OD值),并计算EC50值。CDM4CHO优化培养基和对照培养基生产的抗CD20单抗对Daudi细胞具有ADCC生物学活性,不同浓度的抗CD20单抗与Daudi细胞释放的LDH的量之间有明显的量效关系,如图11所示,优化培养基所生产的抗CD20单抗EC50值低于对照培养基的,其中2mM Glu组EC50值为2.57ng/mL,5mM Glu组EC50值为1.96ng/mL,对照组EC50值为5.82ng/mL。SFM4CHO优化培养基和对照培养基生产的抗CD20单抗ADCC活性如图12所示,优化培养基所生产的抗CD20单抗EC50值低于对照培养基的,其中2mM Glu组EC50值为2.39ng/mL,5mM Glu组EC50值为1.87ng/mL,对照组EC50值为5.53ng/mL。
其中,前述实施例中Gln对照组(0mM Glu组)为:商用培养基中添加终浓度为4mM的Gln;2mM Glu组:商用培养基中添加终浓度为4mM的Gln+2mMGlu;5mM Glu组:商用培养基中添加终浓度为4mM的Gln+5mM Glu。
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