ES2893536T3 - Método para preparar anticuerpo mediante la regulación del contenido de azúcares del anticuerpo - Google Patents

Abstract

Un método para preparar trastuzumab, el método comprende: cultivar células animales que expresan trastuzumab recombinante en un medio que comprende glicerol a una concentración de 0,5 a 3 % (v/v), manganeso a una concentración de 20 a 120 μM y uridina a una concentración de 3 a 10 mM como aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo; en donde las células animales se seleccionan de: línea celular HD201 que expresa trastuzumab depositada con el núm. de acceso: KCTC 12164BP y línea celular de ovario de hámster chino que expresa trastuzumab; en donde la etapa de cultivo comprende: (a) cultivar las células que expresan trastuzumab en un medio que comprende glicerol a una concentración de 0,5 a 3 % (v/v) y manganeso a una concentración de 20 a 120 mM; y (b) cultivar las células cultivadas en la etapa (a) mediante la adición de uridina a una concentración de 3 a 10 mM el día 5 de cultivo; y opcionalmente, en donde el método comprende además (c) cultivar las células cultivadas en la etapa (b) mediante la adición de un medio de alimentación que comprende glicerol y manganeso.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para preparar anticuerpo mediante la regulación del contenido de azúcares del anticuerpo

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente descripción se refiere a un método para preparar un anticuerpo con un contenido de cadenas de azúcares regulado, donde el método incluye la etapa de cultivar células que expresan anticuerpos en un medio que incluye glicerol como aditivo para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo, un método para preparar una población de anticuerpos de alta calidad mediante la regulación del contenido de azúcares del anticuerpo a un contenido deseado, y una población de anticuerpos preparada mediante el método. Además, la presente descripción se refiere a un método para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo, donde el método incluye la etapa de cultivar células que expresan el anticuerpo en un medio que incluye glicerol como aditivo para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo. Además, la presente descripción se refiere a una composición de medio para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo, donde la composición del medio incluye glicerol como aditivo para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo.

2. Descripción de la técnica relacionada

Los anticuerpos terapéuticos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales (mAb) y proteínas de fusión Fc, ocupan una gran parte del mercado actual de fármacos de proteínas recombinantes.

Los efectos terapéuticos de los fármacos relacionados con anticuerpos son inducir directamente la apoptosis mediante la inhibición de un sistema de transducción de señales de las células objetivo o inducir mecanismos inmunitarios indirectos tales como la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) o la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento), y estos dos mecanismos inmunitarios indirectos se denominan "funciones efectoras" de los anticuerpos. En los campos de los biofármacos mejorados o biosimilares, así como también de los nuevos anticuerpos, las funciones efectoras son un tema importante y, por lo tanto, se han continuado estudios para optimizar las funciones o asegurar la similitud in vitro de las funciones efectoras.

La galactosilación de la región Fc afecta la CDC de los anticuerpos. En el mecanismo de galactosilación, la galactosa es un componente básico de la reacción en cadena de la glicosilación y se une a continuación al azúcar N-acetilglucosamina por la galactosiltransferasa, y la uridina se convierte en UTP (trifosfato de uridina) por la uridina quinasa, y después el UTP se une a la galactosa-1-fosfato (galactosa-1-P) para producir un componente básico de la galactosilación, la UDP-galactosa. El manganeso (Mn2+) es un cofactor de la galactosiltransferasa y funciona para mejorar el rendimiento enzimático.

Los estudios para mejorar la ADCC de los anticuerpos pueden dividirse en gran medida en ingeniería genética de la región Fc en sí misma y la modificación de la cadena de azúcares de la región Fc de los anticuerpos. Los presentes inventores se han centrado en la última, la modificación de la cadena de azúcares de la región Fc, y pretenden regular el contenido de azúcares. Las compañías farmacéuticas multinacionales y las compañías de biotecnología avanzada lanzan la versión de próxima generación de anticuerpos con funciones efectoras mejoradas y persistencia mediante la utilización de tecnologías de modificación de la cadena de azúcares y continuamente hacen esfuerzos para ocupar el mercado, mientras que los que entran tarde al mercado en el mismo campo trabajan para adaptarse a la era de los biosimilares y para producir biosimilares que son similares a los productos originales en términos de cadenas de azúcares así como también en propiedades fisicoquímicas. La razón es que los componentes y estructuras de las cadenas de azúcares afectan en gran medida la eficacia terapéutica, el tiempo de retención en el cuerpo humano, la actividad farmacológica, la respuesta inmunitaria, etc. En consecuencia, las empresas que pretenden desarrollar productos biosimilares realizan activamente investigaciones sobre biosimilares que tienen cadenas de azúcares tan similares como sea posible a los productos originales y, por lo tanto, exhiben una eficacia y estabilidad terapéuticas equivalentes y menos efectos adversos tales como la respuesta inmunitaria.

Anteriormente, muchas publicaciones informaron que la fucosilación del núcleo en la cadena de azúcares de la región Fc de un anticuerpo recombinante afecta en gran medida la ADCC, y muchos investigadores han estudiado un método capaz de regular la fucosilación del núcleo. Resultados de investigación representativos son los siguientes.

Un proceso biosintético de GDP-fucosa que es un componente básico de la ruta de fucosilación, y enzimas o componentes básicos que están implicados directamente en la fucosilación del núcleo de anticuerpos son como se muestra en la Figura 1 (Sawa y otros, "Glycoproteomic probes for fluorescent imaging of fucosylated glycans in vivo", PNAS, 2006, p12372). Se han estudiado métodos para regular la fucosilación del núcleo mediante la inhibición de la síntesis de enzimas o componentes básicos que están asociados directamente con la fucosilación.

Los genes de enzimas representativas que se conoce que están asociadas con la fucosilación del núcleo son el gen GMD (GDP-manosa 4,6-deshidratasa) y el gen FUT8 (alfa-1,6-fucosiltransferasa), y se ha sugerido un método para regular la fucosilación del núcleo mediante la inhibición de la expresión de los dos genes o mediante la preparación de un huésped CHO con desactivación de FUT8 a nivel de gen ((YAMANE-OHNUKI y otros, "Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 2004, p614 ~ 622) Dicho enfoque también se ha usado para obtener una versión negativa para fucosa del trastuzumab (ver Suzuki Eiji y otros, "A nonfucosylated anti-HER2 antibody augments antibody-dependent cellular cytotoxicity in breast cancer patients", Clinical cancer research: una revista oficial de la American Association for Cancer Research, EE. UU., Vol.

13, núm. 6, 15 de marzo de 2007, páginas 1875-1882).

Otro método para inhibir la fucosilación del núcleo es un método para añadir un inhibidor de la glucosidasa en la vía de glicosilación (Figura 2, Hossler y otros, "Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture", Glycobiology, 2009, p939). Es decir, cuando las glicoproteínas se mueven del ER al Golgi en las células, estas experimentan una elevada eliminación de manosas por la glucosidasa y la manosidasa. En este momento, se añade un inhibidor de la alfa-manosidasa I tal como la kifunensina para preparar glicoproteínas de tipo oligomanosa, lo que inhibe de esta manera la fucosilación. Este método es más fácil que un método de regulación realizado a nivel de gen, tal como el establecimiento de una línea celular, etc., y también es ventajoso en términos de tiempo y costo.

El otro método de control de la fucosilación es un método para regular la osmolalidad durante un proceso de cultivo, en el que disminuye el nivel de desfucosilación (% desFuc) con el incremento de la osmolalidad en la línea celular YB2/0 (Yoshinobu y otros, Cytotechnology, 2012, p249 ~ 265), y también existe un informe de que las glicoformas de manosa 5 se incrementan en la línea celular CHO como resultado del incremento de la osmolalidad y la extensión de la duración del cultivo (Efren Pacis y otros, BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 2011, p1078 ~ 1088). El alto nivel de glicoformas de manosa 5 indica el alto nivel de desfucosilación.

Por otro lado, las patentes de Abbott con respecto al adalimumab (documentos US 2012/0276631 y WO 2012/149197) describen la regulación de las cadenas de azúcares del anticuerpo mediante el uso de manganeso y galactosa, y existen publicaciones que informan sobre galactosilación con respecto a la uridina. Sin embargo, ha habido dificultades en la preparación de anticuerpos mediante la regulación de las cadenas de azúcares hasta un contenido deseado.

Con el trasfondo de exigir una tecnología para aumentar la actividad de ADCC mediante la regulación de las cadenas de azúcares del anticuerpo, los presentes inventores han realizado muchos esfuerzos para desarrollar un método para mantener el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo en productos de purificación tras la preparación de fármacos de anticuerpos biosimilares. Como resultado, los presentes inventores desarrollaron un aditivo para su uso durante un proceso de cultivo y descubrieron un método para preparar de manera consistente una población de anticuerpos con calidad o equivalencia asegurada mediante la regulación del contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo en una proporción deseada, lo que de esta manera completa la presente invención.

En detalle, los presentes inventores pretendían mejorar la actividad de ADCC de los anticuerpos al controlar los aditivos y las condiciones en un proceso de cultivo durante la preparación de anticuerpos recombinantes para regular el contenido de cadenas de azúcares (galactosilación, afucosilación) de los anticuerpos. Como resultado, los presentes inventores descubrieron que el glicerol aumenta el nivel de afucosilación y que el glicerol también aumenta el nivel de afucosilación similar al de un fármaco de control en el caso del desarrollo de biosimilares. Los presentes inventores también descubrieron que pueden usarse glicerol, manganeso y uridina como aditivos, y pueden obtenerse efectos similares en un proceso antiguo o en un proceso nuevo optimizado donde se usan diferentes medios, y los aditivos y condiciones pueden aplicarse ampliamente a un método para la preparación de anticuerpos mediante la regulación del contenido de las cadenas de azúcares de los anticuerpos.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un método para preparar trastuzumab, el método comprende: cultivar células animales recombinantes que expresan trastuzumab en un medio que comprende glicerol a una concentración de 0,5 a 3 % (v/v), manganeso a una concentración de 20 a 120 pM y uridina a una concentración de 3 a 10 mM como aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo; en donde las células animales se seleccionan de: línea celular HD201 que expresa trastuzumab, depositada con el núm. de acceso: KCTC 12164BP, 19.03.2012 y línea celular de ovario de hámster chino que expresa trastuzumab; en donde la etapa de cultivo comprende:

(a) cultivar las células que expresan trastuzumab en un medio que comprende glicerol a una concentración de 0,5 a 3 % (v/v) y manganeso a una concentración de 20 a 120 mM; y

(b) cultivar las células cultivadas en la etapa (a) mediante la adición de uridina a una concentración de 3 a 10 mM el día 5 de cultivo; y opcionalmente, en donde el método comprende además

(c) cultivar las células cultivadas en la etapa (b) mediante la adición de un medio de alimentación que comprende glicerol y manganeso.

En una modalidad, el contenido de cadenas de azúcares de dicho trastuzumab comprende un contenido de galactosilación dentro del intervalo del 35 al 50 % y un contenido de afucosilación dentro del intervalo del 8 al 20 %. En una modalidad, el cultivo consiste en un cultivo principal y un cultivo por lote alimentado.

En una modalidad, la etapa (a) se realiza durante 3 a 8 días; o el cultivo de la etapa (c) es un cultivo por lote alimentado. En una modalidad, el manganeso es cloruro de manganeso.

Un objeto de la presente descripción es proporcionar un método para preparar un anticuerpo con un contenido de cadenas de azúcares regulado, donde el método incluye la etapa de cultivar células que expresan anticuerpos en un medio que incluye glicerol como aditivo para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo.

Otro objeto de la presente descripción es proporcionar una población de anticuerpos con el contenido de cadenas de azúcares regulado, que se prepara mediante el método.

Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar un método para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo, donde el método incluye la etapa de cultivar células que expresan el anticuerpo en un medio que incluye glicerol como aditivo para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo. En la presente descripción se describe una composición de medio para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo, donde la composición del medio incluye glicerol como aditivo para regular la cadena de azúcares del anticuerpo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra una biosíntesis de GDP-fucosa que es un componente básico de la ruta de fucosilación, y enzimas o componentes básicos implicados directamente en la fucosilación del núcleo del anticuerpo;

La Figura 2 ilustra la ruta de glicosilación;

La Figura 3 muestra curvas de crecimiento celular medidas en condiciones de aditivos que inducen la afucosilación;

La Figura 4 muestra la viabilidad celular medida en condiciones de aditivos que inducen la afucosilación;

La Figura 5 muestra los niveles finales de expresión medidos en condiciones de aditivos que inducen la afucosilación;

La Figura 6 es un gráfico que muestra los contenidos relativos de glicoformas galactosiladas de anticuerpos producidos en condiciones de aditivos que inducen la afucosilación;

La Figura 7 es un gráfico que muestra los contenidos relativos de glicoformas afucosiladas de anticuerpos producidos en condiciones de aditivos que inducen la afucosilación;

La Figura 8 es un gráfico que muestra los resultados de analizar el incremento y la disminución en anticuerpos galactosilados y afucosilados, en comparación con el control sin adición;

La Figura 9 muestra curvas de crecimiento celular medidas en condiciones de tratamiento único o combinado de manganeso (M), galactosa y uridina (Urd);

La Figura 10 muestra la viabilidad celular medida en condiciones de tratamiento único o combinado de manganeso (M), galactosa y uridina (Urd);

La Figura 11 muestra los niveles finales de expresión medidos en condiciones de tratamiento único o combinado de manganeso (M), galactosa y uridina (Urd);

La Figura 12 es un gráfico que muestra los contenidos de galactosilación en condiciones de tratamiento único o combinado de manganeso (M), galactosa y uridina (Urd);

La Figura 13 es un gráfico que muestra los contenidos de afucosilación medidos en condiciones de tratamiento único o combinado de manganeso (M), galactosa y uridina (Urd);

La Figura 14 es un gráfico que muestra los resultados de analizar el incremento y la disminución en anticuerpos galactosilados y afucosilados, en comparación con el control sin adición;

La Figura 15 es un gráfico que muestra los resultados de medir (A) el crecimiento celular y (B) la viabilidad celular de acuerdo con la concentración de glicerol;

La Figura 16 muestra los resultados de medir los niveles finales de expresión de anticuerpos de acuerdo con la concentración de glicerol;

La Figura 17 muestra los resultados de medir los contenidos de cadenas de azúcares de acuerdo con la concentración de glicerol, en la que se muestran contenidos de cadenas de azúcares (A) galactosiladas y (B) afucosiladas;

La Figura 18 es un gráfico que muestra los resultados de medir (A) el crecimiento celular y (B) la viabilidad celular en los experimentos de cultivo en matraz mediante el uso de mezclas de aditivos para coinducir galactosilación y afucosilación de un nuevo proceso;

La Figura 19 muestra los resultados de medir los niveles finales de expresión de anticuerpos en los experimentos de cultivo en matraz mediante el uso de mezclas de aditivos para coinducir la galactosilación y afucosilación del nuevo proceso;

La Figura 20 muestra los resultados de analizar los contenidos de cadenas de azúcares en los experimentos de cultivo en matraz mediante el uso de mezclas de aditivos para inducir la galactosilación y afucosilación del nuevo proceso, en la que se muestran los contenidos de cadenas de azúcares (A) galactosiladas y (B) afucosiladas; La Figura 21 muestra los resultados de analizar los contenidos de cadenas de azúcares en los experimentos de cultivo en matraz mediante el uso de mezclas de aditivos para coinducir la galactosilación y afucosilación del nuevo proceso, en la que se muestra una diferencia de la galactosilación/afucosilación (cambio porcentual) medida;

La Figura 22 es un gráfico que muestra los resultados de medir (A) el crecimiento celular y (B) la viabilidad celular en los experimentos de cultivo en biorreactor de acuerdo con la concentración de glicerol;

La Figura 23 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de los niveles finales de expresión de anticuerpos en los experimentos de cultivo en biorreactor de acuerdo con la concentración de glicerol;

La Figura 24 muestra los resultados del análisis de los contenidos de cadenas de azúcares en los experimentos de cultivo en biorreactor de acuerdo con la concentración de glicerol, en la que se muestran los contenidos de cadenas de azúcares (A) galactosiladas y (B) afucosiladas;

La Figura 25 muestra los resultados del análisis del contenido de cadenas de azúcares en los experimentos de cultivo en biorreactor de acuerdo con la concentración de glicerol, en la que se muestra una diferencia de la galactosilación/afucosilación (cambio porcentual) medida;

La Figura 26 muestra la selección final de aditivos del nuevo proceso y un gráfico que muestra los resultados de medir (A) el crecimiento celular y (B) la viabilidad celular en experimentos en biorreactor de 3 lotes;

La Figura 27 muestra la selección final de aditivos del nuevo proceso y los resultados de medir los niveles finales de expresión de anticuerpos en experimentos en biorreactor de 3 lotes;

La Figura 28 muestra la selección final de aditivos del nuevo proceso y los resultados del análisis de los contenidos de cadenas de azúcares en experimentos en biorreactor de 3 lotes, en la que se muestra los contenidos de cadenas de azúcares (A) galactosiladas y (B) afucosiladas;

La Figura 29 muestra la selección final de aditivos del nuevo proceso y los resultados del análisis de los contenidos de cadenas de azúcares en experimentos en biorreactor de 3 lotes, en la que se muestra una diferencia de la galactosilación/afucosilación (cambio porcentual) medida;

La Figura 30 es un gráfico que muestra los resultados de medir (A) el crecimiento celular y (B) la viabilidad celular en los experimentos para examinar los efectos de los componentes de aditivos aplicados a un proceso antiguo (proceso de ensayo clínico de fase I);

La Figura 31 es un gráfico que muestra los resultados de medir los niveles finales de expresión de anticuerpos en los experimentos para examinar los efectos de los componentes de aditivos aplicados al proceso antiguo (proceso de ensayo clínico de fase I);

La Figura 32 muestra los resultados del análisis de los contenidos de cadenas de azúcares en los experimentos para examinar los efectos de los componentes de aditivos aplicados al proceso antiguo (proceso de ensayo clínico de fase I), en la que se muestran los contenidos de cadenas de azúcares (A) galactosiladas y (B) afucosiladas;

La Figura 33 muestra los resultados del análisis del contenido de la cadena de azúcar en los experimentos para examinar los efectos de los componentes aditivos aplicados al proceso antiguo (proceso de ensayo clínico de fase I), en la que se muestra una diferencia de la galactosilación/afucosilación (cambio porcentual) con relación al grupo de control;

La Figura 34 muestra los resultados de analizar el contenido de la cadena de azúcar en los experimentos para examinar los efectos de los componentes aditivos, en comparación con el proceso antiguo (proceso de ensayo clínico de fase I), en la que se muestra un aumento de la galactosilación/afucosilación (cambio porcentual) con relación a la de una muestra del proceso antiguo; y

La Figura 35 muestra los resultados del análisis de los contenidos de cadenas de azúcares en el experimento de cultivo en matraz para la selección de aditivos inductores de afucosilación, en la que se muestran los contenidos de cadenas de azúcar (A) galactosiladas y (B) afucosiladas.

Descripción detallada de las modalidades preferidas

En la presente descripción se describe un método para preparar de manera consistente una población de anticuerpos con alta calidad o equivalencia asegurada, en el que el contenido de cadenas de azúcares de los anticuerpos se regula mediante la adición de aditivos a un medio, lo que prepara de esta manera una población de anticuerpos que incluye anticuerpos con un contenido de cadenas de azúcares deseado. En particular, la regulación del contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo puede ser la regulación de la galactosilación o afucosilación.

Específicamente, el método puede ser un método para regular el contenido de galactosilación, afucosilación o galactosilación/afucosilación de anticuerpos mediante la adición de uno o más aditivos seleccionados del grupo que consiste en glicerol, manganeso y uridina a un medio de cultivo durante un proceso de producción de anticuerpos, y en particular, un método para preparar anticuerpos con regulación del contenido de cadenas de azúcares, lo que incluye la etapa de cultivar células que expresan anticuerpos en un medio que incluye glicerol como aditivo para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo. En la presente descripción, el medio puede incluir además uno o más seleccionados del grupo que consiste en manganeso y uridina como aditivo para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo, además del glicerol.

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo", una sustancia producida por estimulación de un antígeno en el sistema inmunitario, se refiere a una sustancia que se une específicamente a un antígeno en particular para provocar una reacción antígeno-anticuerpo en la linfa y la sangre. El anticuerpo puede incluir, pero no se limita a, preferentemente, todos los anticuerpos terapéuticos usados comúnmente en la técnica, con mayor preferencia, trastuzumab o pertuzumab que es un anticuerpo que se dirige a1HER-2 (receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano), y con la máxima preferencia, trastuzumab. El trastuzumab, también llamado Herceptin, es un anticuerpo humanizado contra HER2, desarrollado por Genentech, Inc., (EE. UU.), que se conoce como un anticuerpo terapéutico contra HER2/neu expresado principalmente en células de cáncer de mama.

En la presente descripción, las células que expresan anticuerpos incluyen células naturales o transfectadas que expresan los anticuerpos deseados sin limitación. Con respecto a los objetos de la presente descripción, las células que expresan anticuerpos pueden ser células que expresan anticuerpos que son objeto de la regulación del contenido de cadenas de azúcares. En una modalidad de la presente invención, las células que expresan anticuerpos pueden ser una línea celular HD201 que expresa trastuzumab (núm. acceso: KCTC 12164BP, fecha de depósito: 19.03.2012, institución depositaria: el Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology / la Korean Collection for Type Cultures). Las células capaces de producir anticuerpos pueden ser, preferentemente, células animales, por ejemplo, línea celular de ovario de hámster chino (CHO) o línea celular de mieloma de ratón (NSO).

Como se usa en la presente descripción, el término "transfección" es un método para alterar los rasgos genéticos de las células mediante la introducción directa de ADN en células animales cultivadas y, en general, se usa un método para introducir un gen objetivo a través de un vehículo tal como un plásmido, etc. La transfección puede realizarse de acuerdo con un método común en la técnica, preferentemente, por ejemplo, coprecipitación con fosfato de calcio, tratamiento con DEAE-dextrano, electroporación, redistribución, etc.

Como se usa en la presente descripción, el término "una población de anticuerpos" significa un grupo de anticuerpos que incluye anticuerpos con diferentes contenidos de cadenas de azúcares. Con respecto a los objetos de la presente descripción, la población de anticuerpos significa un grupo de anticuerpos que incluye una relación deseada de anticuerpos galactosilados, anticuerpos afucosilados y anticuerpos galactosilados/afucosilados. La población de anticuerpos puede incluir solo un tipo de anticuerpo o todos los anticuerpos que están galactosilados o no y anticuerpos que están afucosilados o no. Con respecto a los objetos de la presente descripción, la población de anticuerpos puede referirse, preferentemente, a un grupo de anticuerpos con contenidos de cadenas de azúcares regulados mediante el método de preparación de la presente invención.

En la presente invención, el contenido de cadenas de azúcares puede ser uno o más contenidos seleccionados del grupo que consiste en un contenido de galactosilación y un contenido de afucosilación.

En la presente invención, el contenido de galactosilación significa un contenido de anticuerpos con cadenas de azúcares unidas a galactosa y el contenido de afucosilación significa un contenido de anticuerpos con cadenas de azúcares libres de fucosilo. La galactosilación y afucosilación se conocen ampliamente como modificaciones importantes que afectan en gran medida la ADCC y la CDC de los anticuerpos.

Para desarrollar biosimilares, la preparación de un producto altamente equivalente a un fármaco de control en términos de calidad (contenido de cadenas de azúcares) es uno de los puntos del desarrollo más importantes.

Los presentes inventores continuaron el estudio para la mejora de la similitud de N-glicanos (galactosilación y afucosilación) entre una proteína recombinante expresada y obtenida mediante el uso de un gen de trastuzumab y un fármaco de control (el producto original). Se confirmó que cuando se prepara trastuzumab, el contenido de N-glicanos, en particular, los contenidos de galactosilación y afucosilación son menores que los del fármaco de control, en dependencia de las condiciones de cultivo. En particular, dado que el contenido de afucosilación es un índice muy importante para la actividad (ADCC) de los anticuerpos, se han realizado estudios sobre aditivos usados en un proceso de cultivo para mejorar la calidad como equivalente a la de un fármaco de control mediante el incremento del contenido de afucosilación.

En detalle, se midió la actividad de ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) de los anticuerpos producidos durante el desarrollo de un nuevo proceso y, como resultado, la actividad fue tan baja como 60-80 % de la del fármaco de control. Este resultado condujo a la presente invención. Como se mencionó anteriormente, el nivel de afucosilación que desempeña un papel importante en la actividad de ADCC se examinó mediante el análisis de los N-glicanos y, como resultado, el fármaco de control mostró un nivel de afucosilación en el intervalo de 8-10 %, y el anticuerpo HD201 mostró simplemente un nivel de afucosilación en el intervalo de 5-7 %. En consecuencia, los presentes inventores realizaron experimentos para mejorar los contenidos de galactosilación y afucosilación.

Antes de la presente invención, los experimentos se realizaban en condiciones de adición de componentes básicos de azúcares para inducir la galactosilación, y como resultado, no había un gran efecto de galactosilación, pero se observó un alto contenido de afucosilación en presencia de galactosa manganeso (Mn2+). Basado en esta condición, se examinaron los cambios en el contenido de cadenas de azúcares (calidad) mediante la variación de otras condiciones.

En una modalidad de la presente descripción, los experimentos se realizaron en condiciones en las que se añadieron manganeso (Mn2+) y galactosa, junto con un aditivo inductor de afucosilación, y donde se añadió un aditivo inductor de afucosilación sin manganeso (Mn2+) y galactosa. Como resultado, se confirmó que la adición de los dos materiales, manganeso (Mn2+) y galactosa, es necesaria para obtener un nivel de galactosilación equivalente al de un fármaco de control, y el glicerol influye en la afucosilación. No existen informes de una tecnología con respecto al efecto de afucosilación del glicerol, y los presentes inventores desarrollaron la tecnología por primera vez.

Para determinar una concentración apropiada de glicerol, se realizaron experimentos en un intervalo de concentración de 0~3,0 % (v/v), y se confirmó que el contenido de afucosilación de los anticuerpos se incrementa con el aumento de la concentración de glicerol. En particular, aunque se incrementó el contenido relativo de afucosilación, se examinó el rendimiento del cultivo con relación al de una condición sin adición en el intervalo similar de concentración de glicerol. Como resultado, se obtuvo un efecto excelente en la concentración de glicerol del 1 % al 2 %.

Además, en una modalidad específica de la presente descripción, se exploraron sustitutos para el manganeso y la galactosa como aditivos para mejorar el contenido de galactosa, y se seleccionó la uridina como candidata y se usó para llevar a cabo experimentos. De las adiciones únicas de los tres materiales, la adición única de manganeso mostró una relación G0F y una relación G1F similares a las del fármaco de control, en comparación con la adición única de galactosa o uridina y, por lo tanto, puede verse que el manganeso es un factor importante de galactosilación en un nuevo proceso. Por el contrario, tras la adición única de uridina, el contenido de galactosilación se incrementó al aumentar la concentración de uridina. Sin embargo, en una condición de alta concentración (8 mM), se observó inhibición del crecimiento y reducción en los niveles de expresión, y por lo tanto, se consideró que la adición de una alta concentración de uridina en la etapa inicial de cultivo es inadecuada para el nuevo proceso. En términos de afucosilación, se compararon tres materiales de manganeso, galactosa y uridina. Como resultado, se confirmó que existía poca relación entre el manganeso y la galactosa, pero el contenido de afucosilación se incrementó con el aumento de la concentración de uridina.

Los resultados de los experimentos realizados mediante la adición de manganeso, galactosa y uridina en el nuevo proceso mostraron que el manganeso es el factor más importante que influye en la galactosilación de anticuerpos, y se descubrió que cuando la uridina se sustituye por galactosa, es posible diseñar un proceso mejorado en términos de galactosilación y afucosilación. Por lo tanto, los presentes inventores llevaron a cabo experimentos mediante la adición de combinaciones de manganeso, uridina y glicerol, para mejorar la equivalencia con el fármaco de control en términos de afucosilación y galactosilación.

En una modalidad específica de la presente descripción, mediante el uso de combinaciones de las condiciones de aditivos de los experimentos llevados a cabo hasta el momento, se llevaron a cabo experimentos para controlar los patrones de galactosilación y fucosilación del anticuerpo (Trastuzumab) para que sean los más similares a los de un fármaco de control (Herceptin®). Como aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo, pueden usarse para diseñar experimentos el manganeso, que es un aditivo principal para mejorar la galactosilación, el glicerol, que es un aditivo inductor de la afucosilación, y la uridina, que puede sustituirse por galactosa y es un coaditivo para la galactosilación y la afucosilación.

Se observó que la adición de una alta concentración de uridina facilita la afucosilación pero reduce los niveles de expresión por inhibición del crecimiento. Por esta razón, se añadió uridina por separado el día 5 de cultivo para minimizar la inhibición del crecimiento y la forma de alto contenido de manosa.

Se confirmó que el manganeso tuvo el mayor efecto de facilitar la galactosilación y mostró efectos similares en un intervalo de concentración de 20 ~ 120 pM. Además, el glicerol mostró un efecto de facilitar la afucosilación proporcional a su concentración en el intervalo de 1 % a 3 %.

Estos tres factores se mezclaron y añadieron como aditivos, y como resultado, se confirmó que la uridina tenía un efecto de mejorar la galactosilación, y por lo tanto, se consideró que la uridina era un sustituto de la galactosa, y también mostró un efecto de mejorar la afucosilación incluso cuando el efecto es bajo. Mientras, en los experimentos de cultivo en matraces, se encontró que las condiciones que son más similares a las del fármaco de control (Herceptin® H0717) fueron la adición de uridina (el día 5 de cultivo) basado en la combinación de 40 pM de manganeso glicerol al 1 %.

Por el contrario, el resultado de los experimentos de cultivo en biorreactor mostró que la adición de glicerol al 2 %, en lugar de glicerol al 1 %, a un medio de producción mostró una alta equivalencia con el fármaco de control (Herceptin®) en términos de afucosilación. Cuando la relación de afucosilación del fármaco de control se considera '1', la muestra del proceso antiguo mostró una relación de afucosilación de 0,43, y la condición con adición de glicerol al 2 % mostró una relación de afucosilación de 0,86, que era ligeramente inferior que la del fármaco de control, pero 2 veces superior a la de la muestra del proceso antiguo.

En los resultados de los experimentos en biorreactor de los aditivos para mejorar la regulación de la cadenas de azúcares (galactosilación y afucosilación), la adición de glicerol al 2 % mostró el efecto de incrementar la relación de afucosilación, en comparación con la muestra del proceso antiguo, en los perfiles de N-glicano, y en términos de galactosilación, la adición de manganeso y uridina mostró el efecto de mejorar la galactosilación. Sin embargo, no muestran una equivalencia completa con la del fármaco de control (Herceptin®), y por lo tanto, se intentó cambiar las concentraciones de glicerol y uridina y el método de adición.

Primero, se pretendía que la alimentación se realizara mediante la adición de glicerol al 2 % a un medio de alimentación para mejorar el efecto de adición de glicerol. Se añadió uridina como sustituto de la galactosa mediante el incremento de su concentración de 4 mM a 8 mM para mejorar el efecto de galactosilación. Además, en los experimentos en matraces realizados mediante la adición de uridina, se midió el pH el último día de cultivo. Como resultado, el pH fue de 6,9. Por tanto, el pH del cultivo se ajustó de pH 6,8 a pH 6,9 después de la adición de uridina. Para mantener un pH de 6,8 en un biorreactor, debe suministrarse CO² , pero la pCO² tiende a incrementarse continuamente desde el día 4 de cultivo y se incrementa rápidamente a 100 mmHg o superior el día 5 de cultivo. Por lo tanto, referido a la literatura que informa que una pCO² alta afecta negativamente a la glicosilación (Kimura R, 1997), la pCO² disminuyó cuando el pH del cultivo principal se incrementó a 6,9 el día 5 de cultivo. Para reflejar este hecho, los experimentos se diseñaron de la siguiente manera: los 3 lotes se realizaron mediante la adición de aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares (mejora de la calidad), 40 pM de manganeso (M) y glicerol (Gcr) al 2 % (v/v), al medio de producción para la selección de aditivos de un nuevo proceso, y en el día 5 del cultivo principal, se añadió 8 mM de uridina (Urd), seguido de cultivo. En consecuencia, se diseñó un nuevo proceso que implica la adición de 8 mM de uridina el día 5 del cultivo después de la adición de 40 pM de manganeso y glicerol al 2 %. Además, se examinaron los contenidos de glicosilación de los anticuerpos que se produjeron mediante el cultivo en biorreactor de 3 lotes en las mismas condiciones, y se compararon los perfiles de N-glicanos de las muestras que se obtuvieron de los respectivos lotes el día 8 del cultivo principal con los del proceso antiguo. Como resultado, el % de galactosilación (suma de todos los oligosacáridos con galactosa) de HD201P-1102 de ref. (Estándar interno) fue del 33,9 %, y el % de galactosilación de 3 lotes del nuevo proceso estuvo en el intervalo de 41,8 ~ 42,2 %, que es aproximadamente un 8 % más alto que el de HD201P-1102. Además, el % de afucosilación (suma de todos los oligosacáridos sin fucosa) de HD201P-1102 fue del 3,8 %, y el % de afucosilación de 3 lotes del nuevo proceso estuvo en el intervalo de 9,1 ~ 9,5 %, que es aproximadamente un 6 % más alto que el de HD201P-1102. En comparación con el fármaco de control (Herceptin®), el % de galactosilación del fármaco de control (Herceptin® Lot. H0717) fue del 43 %, y por tanto la diferencia en el % de galactosilación entre el fármaco de control y 3 lotes del nuevo proceso fue inferior al 2 %, y el % de afucosilación fue del 8,9 %, por lo que la diferencia en el % de afucosilación entre el fármaco de control y el nuevo proceso fue inferior al 2 %, lo que indica que las condiciones son eficaces en términos de equivalencia con el fármaco de control. El tipo de oligomanosa (suma de todos los oligosacáridos con manosa) del fármaco de control fue del 1,7 % y el tipo de oligomanosa (4 %) del nuevo proceso fue un 2 % mayor que el del fármaco de control.

Adicionalmente, los aditivos (manganeso, glicerol y uridina) para regular el contenido de cadenas de azúcares (mejora de la calidad de N-glicanos de Fc) diseñados en el nuevo proceso se aplicaron al proceso antiguo (diferentes entornos de medio) en un biorreactor a pequeña escala para examinar si regulan los perfiles de glicosilación (galactosilación/afucosilación). Se añadió glicerol al 2 % tanto al medio de cultivo de producción como al medio de alimentación en el nuevo proceso, pero en este experimento, la concentración de glicerol se incrementó al 3 %. En las muestras recolectadas del cultivo principal en el biorreactor, se compararon los perfiles de N-glicanos entre la condición con adición de aditivo y la condición sin adición en el proceso antiguo. La condición con adición de aditivo mostró un % de galactosilación del 43,8 % y la condición sin adición mostró un % de galactosilación del 43 %, es decir, la condición con adición de aditivo mostró un aumento del 1 % en el % de galactosilación. Además, la condición con adición de aditivo mostró un % de afucosilación del 18,7 % y la condición sin adición mostró un % de afucosilación del 9,1 %, es decir, la condición con adición de aditivo mostró un incremento de 2 veces en el % de afucosilación. Además, en el nuevo proceso, se compararon la condición con adición de aditivo y la condición sin adición. Como resultado, la condición con adición de aditivo mostró un % de galactosilación del 40,5 % y la condición sin adición mostró un % de galactosilación del 31,8 %, es decir, la condición con adición de aditivo mostró un incremento del 8 % en el % de galactosilación. La condición con adición de aditivo mostró un % de afucosilación del 14,1 % y la condición de adición mostró un % de afucosilación del 6,1 %, es decir, la condición con adición de aditivo mostró un incremento de 2 veces en el % de afucosilación, similar a los resultados del proceso antiguo.

Se confirmó que la adición de los aditivos (manganeso, glicerol y uridina) para regular el contenido de cadenas de azúcares (mejora de la calidad de N-glicanos de Fc) desarrollados en la presente invención mostró efectos similares tanto en el proceso antiguo como en el nuevo.

El análisis de la actividad de ADCC del anticuerpo HD201 se realizó de acuerdo con el SOP del ensayo de citotoxicidad dependiente de anticuerpos [ensayo de citotoxicidad dependiente del anticuerpo HD201].

Además, en una modalidad específica de la presente descripción, la actividad de ADCC de los anticuerpos preparados mediante la adición de aditivos (manganeso, glicerol y uridina) para regular el contenido de cadenas de azúcares de la presente descripción, se midió mediante un ensayo de ADCC relativo que es un ensayo in vitro. Como material de referencia (fármaco de control) de la actividad de ADCC, se usó un producto original disponible actualmente (Herceptin®). Los resultados experimentales se expresaron como % de ADC^c relativa (A) determinada mediante los valores de EC⁵⁰ usados comúnmente, y el % de actividad de ADCC relativa (B) mediante el uso de una relación de actividad relativa calculada mediante el uso de PLA s/w. Puede verse que existe una ligera diferencia entre los resultados obtenidos con EC⁵⁰ y PLA, pero los patrones completos eran los mismos.

En el proceso antiguo a pequeña escala, la condición con adición de aditivo mostró un 217,5 % de actividad de ADCC, en comparación con el fármaco de control, y la condición sin adición mostró un 78,7 % de actividad de ADCC, que es una actividad menor que la del fármaco de control. Por lo tanto, cuando los aditivos (manganeso, glicerol y uridina) para regular el contenido de cadenas de azúcares (mejora de la calidad de N-glicanos de Fc) se añadieron al proceso antiguo, la relación de afucosilación puede aumentarse al doble, lo que lleva a una mejora del 100 % o superior en la actividad de ADCC, en comparación con la condición sin adición. En el nuevo proceso, la condición con adición de aditivo mostró 130 % de actividad de ADCC, en comparación con el fármaco de control, y la condición sin adición mostró 42,7 % de actividad de ADCC, que es la actividad más baja, en comparación con la del fármaco de control. Por lo tanto, como en el proceso antiguo mediante el uso de diferentes medios, cuando se añadieron al nuevo proceso los aditivos (manganeso, glicerol y uridina) para regular el contenido de cadenas de azúcares (mejora de la calidad de N-glicano de Fc), la relación de afucosilación puede aumentarse en 2 veces, lo que conduce a una mejora del 80 % o superior en la actividad de ADCC, en comparación con la condición sin adición.

Como se confirma en los Ejemplos de la presente invención, cuando se realiza un proceso de producción de trastuzumab mediante el uso de los aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares de la presente invención, es posible la regulación del contenido de cadenas de azúcares de los anticuerpos. En particular, no ha habido estudios o bibliografía con respecto al efecto de afucosilación del glicerol en Corea o en el extranjero. Sobre la base de los resultados experimentales anteriores, los presentes inventores desarrollaron un método para preparar anticuerpos mediante la regulación del contenido de cadenas de azúcares mediante el uso de glicerol por primera vez.

En la presente descripción, el cultivo puede llevarse a cabo mediante un método ampliamente conocido por los expertos en la técnica en condiciones apropiadas de temperatura, medio y gas, en dependencia de las células que expresan anticuerpos. No existe limitación en un método aplicable a la preparación de anticuerpos de la presente descripción, tal como cultivo discontinuo, cultivo por lote alimentado, cultivo continuo, una combinación de los mismos, etc.

El método de preparación de la presente descripción puede incluir las etapas de (a) cultivar células que expresan anticuerpos en un medio que incluye glicerol y manganeso; y (b) cultivar las células cultivadas en la etapa (a) en un medio que incluye además uridina. En particular, el método puede incluir además la etapa (c) de cultivar las células cultivadas en la etapa (b) mediante la adición de un medio de alimentación que incluye glicerol y manganeso. La etapa (a) puede llevarse a cabo durante 3 días a 8 días, y en los Ejemplos de la presente invención, el tratamiento con uridina se llevó a cabo el día 5 de cultivo.

Además, el método de preparación de la presente descripción puede incluir las etapas de (a) cultivar células que expresan anticuerpos en un medio que incluye glicerol y manganeso; (b) cultivar las células cultivadas en la etapa (a) en un medio que incluye uridina; y (c) realizar un cultivo por lote alimentado mediante el uso de un medio que incluye glicerol y manganeso.

Mientras, la etapa (a) y la etapa (b) pueden realizarse mediante cultivo discontinuo, y la etapa (c) puede realizarse mediante cultivo por lote alimentado, pero no se limita a ello.

Además, el método de preparación de la presente descripción puede incluir además la etapa de purificar anticuerpos a partir de un caldo de cultivo celular, y el método para purificar los anticuerpos puede realizarse mediante una variedad de métodos ampliamente conocidos en la técnica, por ejemplo, columna de proteína A/G, HPLC, etc.

El medio de la presente descripción puede incluir glicerol dentro de un intervalo de concentración de 0 a 10 %, o de 0,1 a 5 % (v/v), y en particular, dentro de un intervalo de concentración de 0,5 a 3 % (v/v). Además, el medio puede incluir manganeso dentro de un intervalo de concentración de 0 a 250 pM, o de 10 a 200 pM, y en particular, dentro de un intervalo de concentración de 20 a 120 pM. Además, el medio puede incluir uridina dentro de un intervalo de concentración de 0 a 20 mM, o de 1 a 10 mM, y en particular, dentro de un intervalo de concentración de 4 a 8 mM. Específicamente, el medio de la presente descripción puede incluir glicerol en un intervalo de concentración de 0,5 a 3 % (v/v), manganeso en un intervalo de concentración de 20 a 120 pM y uridina en un intervalo de concentración de 3 a 10 mM.

El tipo de manganeso de la presente descripción no está limitado particularmente, siempre que no sea tóxico para el cuerpo humano, y se ejemplifica por el cloruro de manganeso.

Con respecto a los aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares incluidos en el medio de la presente descripción, una relación de glicerol (%, v/v): manganeso (|^j M) puede ser 0,5 : 20, 1 : 20, 2: 20, 3 : 20, 0,5 : 40, 1 : 40, 2 : 40, 3 : 40, 0,5 : 80, 1 : 80, 2 : 80, 3 : 80, 0,5 : 120, 1 : 120, 2 : 120 o 3 : 120, basado en la concentración final del medio. Además, en la presente invención, la uridina que se incluye en el medio de la presente descripción y constituye los aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares puede añadirse a una concentración de 2 a 8 mM, basado en la concentración final del medio.

Se confirmó que cuando los aditivos para la regulación del contenido de cadenas de azúcares de acuerdo con la presente invención pueden tener una relación de glicerol (%, v/v): manganeso (j M): uridina (mM) de 1,0: 40: 80 o 2,0: 40: 80, basado en la concentración final del medio, puede obtenerse un contenido de cadenas de azúcares similar al del fármaco de control conocido, Herceptin®.

En el contenido de cadenas de azúcares de los anticuerpos preparados mediante el método de preparación de la presente invención, el contenido de galactosilación puede estar dentro del intervalo de 35 a 50 % y el contenido de afucosilación puede estar dentro del intervalo de 8 a 20 %.

Otro ejemplo de la presente descripción proporciona una población de anticuerpos con regulación del contenido de cadenas de azúcares, preparada mediante el método de la presente invención.

El método, la población de anticuerpos y la población de anticuerpos con regulación del contenido de cadenas de azúcares son los mismos que los descritos anteriormente.

Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo, donde el método incluye la etapa de cultivar las células que expresan el anticuerpo en un medio que incluye glicerol como aditivo para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo. El medio puede incluir además uno o más seleccionados del grupo que consiste en manganeso y uridina como aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares.

El contenido de cadenas de azúcares, el anticuerpo, las células que expresan el anticuerpo y el cultivo son los mismos que los descritos anteriormente.

Otro ejemplo más de la presente descripción proporciona una composición de medio para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo, donde la composición del medio incluye glicerol como aditivo para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo.

El contenido de cadenas de azúcares y el anticuerpo son los mismos que los descritos anteriormente.

La composición del medio para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo de la presente descripción puede incluir además uno o más seleccionados del grupo que consiste en manganeso y uridina como aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo.

Como se usa en la presente descripción, el término "medio" se refiere en general a una solución que contiene nutrientes que proporciona nutrientes para la proliferación de células, y esta solución puede incluir aminoácidos esenciales y no esenciales, vitaminas, fuentes de carbono, lípidos, oligoelementos, etc., que son generalmente necesarios para la proliferación y/o supervivencia celular, pero no se limitan a ellos. El medio se formula, preferentemente, a un pH y una concentración de sal óptimos para la supervivencia y proliferación celular, en dependencia del tipo de células a cultivar. El medio puede incluir además una sustancia ampliamente usada en la técnica como componente que potencia la proliferación y/o supervivencia, lo que incluye hormonas y factores de crecimiento.

Además, los componentes, lo que excluye los aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo, en el medio de la presente descripción pueden incluir cualquier componente para la producción de anticuerpos ampliamente usado en la técnica, y los componentes pueden constituirse fácilmente de acuerdo con el sentido común o experimentos de los expertos en la técnica.

En una modalidad específica de la presente descripción, el cultivo principal se realizó al controlar los aditivos basado en el Medio A, y el cultivo por lote alimentado se realizó al controlar los aditivos basado en la Alimentación C.

En lo adelante, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son solo para fines ilustrativos.

Ejemplo 1: Experimento de aditivos para regular las cadenas de azúcares de anticuerpos

1-1. Experimento de cultivo en matraz para la selección de aditivos inductores de la afucosilación Para inducir la galactosilación, se llevaron a cabo experimentos en condiciones en las que se añadieron componentes básicos de azúcares (glucosamina, N-acetilglucosamina, N-acetilmanosamina, galactosa, uridina, manganeso (Mn2+), glicerol). Como se muestra en los resultados del análisis de los datos experimentales de la Figura 35, no se observó un gran efecto de galactosilación, pero sí se observó un alto contenido de afucosilación. Sobre la base de estos resultados, en los estudios subsecuentes, se usaron en combinación galactosa manganeso (Mn2+) que se conoce muestran efectos relacionados con la galactosilación, y se examinaron los cambios. Además, para encontrar un factor que muestra el efecto cuando se usa solo, se llevaron a cabo experimentos paralelos en condiciones en las que se excluyeron galactosa manganeso (Mn2+).

En detalle, se realizaron experimentos en condiciones en las que se añadieron manganeso (Mn2+) y galactosa, junto con el aditivo inductor de afucosilación, y en condiciones en las que se añadió el aditivo inductor de afucosilación sin manganeso (Mn2+) y galactosa.

Se preparó y usó una solución madre de 200 g/l de galactosa, y se preparó y usó una solución madre de 40 mM de cloruro de manganeso^ agua (Mn2+). El manganeso y la galactosa añadidos a un medio de producción se diluyeron, basado en 35 ml que es un volumen de un cultivo en matraz principal, y se dividió por separado un medio de alimentación en 20 ml por condiciones, y se diluyeron las soluciones madre, basado en un volumen de 20 ml, y se añadieron.

Se preparó cada solución madre 1 M de los aditivos inductores de la afucosilación, glucosamina y N-acetilglucosamina, y el glicerol puro se consideró como del 100 % y se añadió en una relación de volumen (v/v, %), se prepararon y se diluyeron 1/100 una solución madre de 50 mM de butirato de sodio y solución madre de 50 g/l de lactosa. La kifunensina, un inhibidor de la alfa-manosidasa I, es una sustancia que se conoce tiene el efecto de afucosilación y se preparó a una concentración de 100 pg/ml (Qun Zhou y otros, 2008; documento US 2007/0092521 A1).

Las condiciones experimentales se resumen en la siguiente Tabla 1.

[Tabla 1] Condiciones para el experimento de cultivo en matraz de aditivos inductores de afucosilación

1-2. Resultados del cultivo celular del experimento de cultivo en matraz de aditivos inductores de afucosilación En el cultivo en matraz para la selección de aditivos inductores de afucosilación, se midieron el perfil de crecimiento celular, el perfil de viabilidad celular y el perfil del nivel de expresión final (perfil de títulos).

Como se muestra en la Figura 3, los resultados de los perfiles de crecimiento celular mostraron que el crecimiento celular más alto se observó cuando no se añadieron manganeso y galactosa (Control), y se observó inhibición del crecimiento cuando se añadió 0,5 mM de butirato de sodio.

Como se muestra en la Figura 4, los resultados de los perfiles de viabilidad celular también mostraron que la viabilidad celular se redujo al 80 % o menos en el punto final del cultivo cuando se añadió butirato de sodio, y la viabilidad celular se redujo al 77 % en el punto final del cultivo cuando se añadieron 10 ng/ml de kifunensina junto con manganeso y galactosa. Otras condiciones de aditivos mostraron perfiles similares de crecimiento celular y viabilidad celular.

Mientras, los niveles finales de expresión con relación a los de un grupo de control (perfil de títulos) se midieron en condiciones de aditivos que inducen la afucosilación y, como resultado, cuando se añadió glucosamina, N-acetilglucosamina o glicerol, el nivel de expresión mostró un aumento de 1,1 veces, en comparación con el grupo de control. Por el contrario, cuando se añadió butirato de sodio, el nivel de expresión mostró un aumento de 0,8 veces, que fue más bajo que los de otras condiciones. Parece que dicha disminución en el nivel de expresión se atribuye a una reducción en el crecimiento celular y la viabilidad celular.

1-3. Análisis del contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo

Para analizar el contenido de cadenas de azúcares de los anticuerpos, se realizó un ensayo de N-glicanos de anticuerpos. En detalle, el ensayo de N-glicanos se realizó de acuerdo con el SOP del ensayo de N-glicano HD201 [ensayo NP-UPLC de N-glicano de HD201], en el que los anticuerpos se trataron con PNGasa para separar sólo las estructuras de N-glicano. Se analizaron las glicoformas galactosiladas y afucosiladas, y cada uno de los contenidos relativos calculados se mostró en un gráfico (Figuras 6 y 7). Adicionalmente, los resultados del análisis del incremento y la disminución de la galactosilación y la afucosilación, en comparación con el control sin adición, también se muestran en un gráfico (Figura 8).

Como se muestra en las Figuras 6 a 8, la mayor diferencia entre la condición con adición de manganeso y galactosa y la condición sin adición es una diferencia en el contenido de galactosilación, y se observaron contenidos de galactosilación relativa altos, cuando se añadieron los dos materiales, en comparación con el control sin adición. Por el contrario, se observaron contenidos de galactosilación relativa similares o inferiores cuando no se añadieron ambos materiales, en comparación con el grupo de control. Estos resultados indican que se requieren tanto manganeso como galactosa para aumentar el contenido de galactosilación.

1-4. Experimento de cambios en las cadenas de azúcares del anticuerpo de acuerdo con el tratamiento único o combinado de manganeso (M), galactosa y uridina (Urd)

Como método para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo, se describió previamente un método para usar manganeso y galactosa (por ejemplo, Abbott, documento US 2012/0276631; documento WO 2012/149197). Este experimento tenía como objetivo descubrir otros sustitutos del manganeso y la galactosa.

El proceso antiguo es un proceso para la producción de muestras para el ensayo clínico de fase I en la etapa inicial de desarrollo, y el nuevo proceso es un proceso desarrollado para el ensayo clínico de fase III mediante la mejora del proceso. El nuevo proceso y el proceso antiguo son diferentes en el medio de producción y el medio de alimentación, y se pretendía que los aditivos de la presente invención se usaran para aumentar la actividad de los anticuerpos mediante la preparación de un patrón de cadenas de azúcares, en particular, un contenido de afucosilación similar al del producto original durante un proceso de desarrollo del nuevo proceso.

Se preparó y usó una solución madre de 200 g/l de galactosa, y se preparó y usó una solución madre de 40 mM de cloruro de manganeso^ agua (Mn2+). El manganeso y la galactosa añadidos a un medio de producción se diluyeron, basado en 35 ml que es un volumen de un cultivo en matraz principal, y se dividió por separado un medio de alimentación en 20 ml por condiciones, y se diluyeron las soluciones madre, basado en un volumen de 20 ml, y se añadieron.

Las condiciones experimentales son las que se muestran en la siguiente Tabla 2.

[Tabla 2]

Como se muestra en la Figura 9, los resultados del cultivo en matraz mostraron que la mayoría de los perfiles de crecimiento celular fueron similares cuando se añadieron manganeso y galactosa, y se observó el pico de densidad celular más alto cuando no se añadió el aditivo (control) y solo se añadieron 40 pM de manganeso. Cuando se añadió uridina (Urd) a una concentración de 8 mM, se observó inhibición del crecimiento en la etapa inicial del cultivo, y cuando se añadió uridina a una concentración de 4 mM, la reducción en la densidad celular se incrementó considerablemente en la etapa tardía del cultivo.

En los perfiles de viabilidad celular (Figura 10), la viabilidad se redujo rápidamente cuando se añadió 8 mM de uridina y otras condiciones mostraron patrones similares.

Como se muestra en los perfiles de nivel de expresión de anticuerpos (perfiles de títulos) de la Figura 11, las condiciones con adición de manganeso mostraron aproximadamente 0,9 ~ 1,1 de la relación de contenido relativo, en comparación con la condición sin adición (control) y las condiciones con adición de galactosa mostraron 0,9 ~ 1,0 de la relación de contenido relativo. Cuando se añadió uridina, se incrementó una reducción en el nivel de expresión con relación al de la condición sin adición (Control) al incrementarse la concentración de uridina. Cuando se añadieron 8 mM de uridina, la proporción de contenido relativo se redujo a 0,36, en comparación con la de la condición sin adición (Control), lo que sugiere que esta reducción se atribuye a una reducción en los niveles de expresión debido a la inhibición del crecimiento celular. Por lo tanto, se confirmó que cuando se añade manganeso dentro del intervalo de concentración de 40 pM ~ 120 pM, no tiene influencia en el proceso.

1-5. Análisis del contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo

Como en las condiciones de la Tabla 2, se añadieron manganeso, galactosa y uridina a matraces a diferentes concentraciones, y se examinaron los contenidos de cadenas de azúcares (calidad de glicosilación) de los productos de cultivo. En detalle, se analizaron las glicoformas galactosiladas y afucosiladas, y cada uno de los contenidos relativos calculados se mostró en un gráfico (Figuras 12 y 13). Adicionalmente, los resultados del análisis del incremento y la disminución de la galactosilación y la afucosilación, en comparación con el control sin adición, también se muestran en un gráfico (Figura 14).

Como se muestra en la Figura 12, los resultados del cálculo del contenido de galactosilación mostraron que cuando se añadieron 40 pM de manganeso y 2 g/l de galactosa al mismo tiempo, se observó el contenido más alto, en comparación con el control (condición sin adición), y de las adiciones únicas de los tres materiales, los grupos experimentales con adición de manganeso mostraron valores más altos que los grupos experimentales con adición de galactosa o uridina, lo que indica que el manganeso es un factor importante de galactosilación en el nuevo proceso. Por el contrario, tras la adición única de uridina, el contenido de galactosilación se incrementó al aumentar la concentración de uridina. Sin embargo, en una condición de alta concentración (8 mM), se observó inhibición del crecimiento y reducción en los niveles de expresión, y por lo tanto, se consideró que la adición de una alta concentración de uridina en la etapa inicial de cultivo es inadecuada para el nuevo proceso.

Como se muestra en los resultados del cálculo del contenido de afucosilación de la Figura 13, se compararon tres materiales de manganeso, galactosa y uridina. Como resultado, se confirmó que el manganeso y la galactosa no mostraron efectos, pero el contenido de afucosilación se incrementó con el aumento de la concentración de uridina. En un gráfico (Figura 14) que muestra una diferencia en la galactosilación/afucosilación, en comparación con el grupo sin adición, se confirmó que cuando se añadió manganeso, la galactosilación se potenció al 10 % o más, en comparación con el grupo sin adición, y la afucosilación se potenció con el incremento de la concentración de uridina, en comparación con el grupo sin adición.

De acuerdo con estos resultados de examinar los efectos de la adición de manganeso, galactosa y uridina en el nuevo proceso, se confirmó que el manganeso es el factor más importante en la galactosilación de anticuerpos, y cuando la uridina se sustituye por galactosa, puede lograrse una mejora en términos de galactosilación y afucosilación.

En los experimentos subsecuentes, se añadieron manganeso, uridina y glicerol en combinación, para mejorar la equivalencia de galactosilación/afucosilación con respecto a un fármaco de control comercial (Herceptin®) en términos de desarrollo de biosimilares.

1-6. Experimento de cultivo en matraz de cambios en la cadena de azúcares de acuerdo con la adición de glicerol En este experimento, se añadió glicerol (Gcr) obtenido mediante la selección de aditivos inductores de afucosilación, con variación de su concentración, además de manganeso y galactosa, y se examinaron los efectos.

El glicerol es una sustancia bien conocida como agente anticongelante y estabilizador de proteínas, y existe una literatura que informa que el glicerol incrementa los niveles de expresión de proteínas recombinantes o el contenido de ácido siálico (Rodríguez y otros, 2005, Chi-Hsien Liu 2007), pero no se menciona la afucosilación de anticuerpos referida a la presente invención.

Por lo tanto, para examinar el efecto del glicerol sobre la afucosilación de anticuerpos, se llevaron a cabo experimentos. En detalle, se añadió glicerol a una concentración de 0, 0,5, 1 o 2 % (v/v) y se midió el contenido de afucosilación de acuerdo con la adición de glicerol.

Las condiciones experimentales son las que se muestran en la siguiente Tabla 3.

[Tabla 3]

Se midieron los perfiles de crecimiento celular y los perfiles de viabilidad celular de acuerdo con las concentraciones de glicerol. Como se muestra en los resultados de la Figura 15, se observaron un crecimiento celular y una viabilidad celular similares en condiciones de adición de glicerol y sin adición de glicerol. Se confirmó que la viabilidad celular era ligeramente baja, en comparación con la condición sin adición, en el último día de cultivo.

Además, como se muestra en los resultados de la medición de los niveles finales de expresión de anticuerpos de la Figura 16, los niveles de expresión de anticuerpos se incrementaron al aumentar la concentración de glicerol, en comparación con la condición sin adición. Cuando se añadió glicerol al 2,0 %, el nivel de expresión aumentó 1,1 veces o más, lo que se registró como la relación de contenido relativo más alta.

1-7. Análisis del contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo

Se midieron los contenidos de cadenas de azúcares galactosiladas y afucosiladas de acuerdo con la concentración de glicerol en las condiciones de la Tabla 3.

Como se muestra en la Figura 17, a medida que se incrementó la concentración de glicerol, la galactosilación disminuyó ligeramente, pero el contenido de anticuerpos galactosilados se mantuvo al 40 % o más, sin mostrar grandes efectos (Figura 17 (A)), y en términos de afucosilación, a medida que se incrementó la concentración de glicerol, los contenidos de anticuerpos afucosilados se incrementaron notablemente, en comparación con el control (grupo sin adición) (Figura 17 (B)).

1-8. Experimento de cultivo en matraz de mezcla de aditivos para la coinducción de galactosilación y afucosilación en un nuevo proceso

Mediante el uso de combinaciones de los resultados experimentales de las condiciones de aditivos obtenidos en los ejemplos anteriores, se llevaron a cabo experimentos para examinar una condición en la cual una población de anticuerpos finalmente preparados muestra los contenidos de cadenas de azúcares, a saber, contenidos de galactosilación y afucosilación, más similares a los del fármaco de control (Herceptin®).

En el presente experimento se usaron como aditivos el manganeso (M), que es un factor principal para la mejora de la galactosilación, el glicerol (Gcr), que es un aditivo inductor de la afucosilación, y la uridina (Urd) como sustituto para la galactosa, que es un cofactor de la galactosilación y la afucosilación.

Mientras, el experimento anterior (Ejemplos 1-4) mostró que la adición de uridina con una concentración de 4 mM o superior facilita la afucosilación pero reduce los niveles de expresión mediante la inhibición del crecimiento. En el presente experimento, por lo tanto, se añadió por separado 4 mM de uridina el día 5 del cultivo principal como en las condiciones experimentales de la siguiente Tabla 4 para minimizar la inhibición del crecimiento y la forma con alto contenido de manosa.

El experimento anterior (Ejemplos 1-4) confirmó que el manganeso (M) tenía el mayor efecto en facilitar la galactosilación y mostró efectos similares en el intervalo de concentración de 40 a 120 pM.

En este experimento, se añadieron 40 pM o menos de manganeso a un medio de producción y un medio de alimentación.

Por último, se añadió glicerol sólo al medio de producción a una concentración de 1 % y 2 % que mostró efectos en el experimento anterior de adición de glicerol (Ejemplo 1-6).

Las condiciones experimentales se resumen en la siguiente Tabla 4.

[Tabla 4]

Como en la Figura 18 que muestra los resultados de examinar los perfiles de crecimiento celular y los perfiles de viabilidad celular mediante cultivo en matraz en las condiciones de la Tabla 4, la mayoría de los perfiles de crecimiento celular fueron similares cuando se añadió manganeso (M), pero la adición de glicerol al 2 % mostró una tasa de crecimiento celular más baja que la adición de glicerol al 1 %. Se observó una densidad celular máxima similar en condiciones sin adición de glicerol (40 pM de manganeso 2,0 g/l de galactosa) y en condiciones de adición de glicerol al 1 %, lo que sugiere que la adición de glicerol al 1 % no afecta la eficiencia del crecimiento celular en el proceso anterior. Dado que se añadió uridina el día 5 del cultivo principal, no se produjo la inhibición del crecimiento en la etapa inicial del cultivo, pero se incrementó una reducción en la viabilidad celular después de la adición de uridina, en comparación con la condición sin adición.

Los resultados del examen de los niveles finales de expresión (Figura 19) mostraron que otras condiciones además de la condición sin glicerol y con adición de uridina (40 pM de manganeso 2,0 g/l de galactosa) mostraron niveles de expresión similares o superiores.

1-9. Análisis del contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo

Se midieron los contenidos de cadenas de azúcares galactosiladas y afucosiladas de acuerdo con las combinaciones de los aditivos en las condiciones de la Tabla 4. En detalle, las áreas de los picos de los perfiles de análisis de N-glicanos se calcularon como contenidos de galactosilación y afucosilación.

Como se muestra en la Figura 20, en comparación con la condición sin adición de uridina, los contenidos de galactosilación se incrementaron en condiciones en las que se añadió uridina el día 5 de cultivo, basado en una combinación de 40 pM de manganeso glicerol al 1 %. En términos de afucosilación, en comparación con las condiciones sin adición de uridina, los contenidos de afucosilación se incrementaron cuando se añadieron 4 mM de uridina. En comparación con la condición sin adición de uridina, los contenidos de galactosilación se incrementaron en condiciones en las que se añadió uridina el día 5 de cultivo, basado en una combinación de 40 pM de manganeso glicerol al 2 %. En términos de afucosilación, en comparación con las condiciones sin adición de uridina, los contenidos de afucosilación se incrementaron cuando se añadieron 4 mM de uridina. En particular, los contenidos de afucosilación se incrementaron proporcionalmente a la cantidad de glicerol añadida.

En comparación con la condición sin adición de uridina, los contenidos de galactosilación se incrementaron en condiciones en las que se añadió uridina el día 5 de cultivo, basado en una combinación de 20 pM de manganeso glicerol al 1 %. En términos de afucosilación, en comparación con las condiciones sin adición de uridina, los contenidos de afucosilación se incrementaron. Se observaron patrones similares en condiciones en las que se añadió uridina, basado en una combinación de 20 pM de manganeso glicerol al 2 %.

En conjunto, se confirmó que la adición de uridina al nuevo proceso mejora la galactosilación y, por lo tanto, la uridina puede sustituirse por galactosa. También se confirmó que la uridina mejora ligeramente la afucosilación. Como grupo de control, solo se añadió 2,0 g/l de galactosa al nuevo proceso, y se examinó una diferencia de galactosilación/afucosilación (cambio porcentual) de acuerdo con la adición de manganeso, glicerol y uridina. Como resultado, la Figura 21 mostró que el contenido de galactosilación se incrementó a 6 ~ 13 % por la adición de manganeso, y el contenido de afucosilación se incrementó a 1,5 ~ 4 % por la adición de glicerol.

Ejemplo 2: Experimento de aditivos para regular las cadenas de azúcares a nivel de biorreactor

Sobre la base de los resultados experimentales del cultivo en matraz del Ejemplo 1, se examinó si es posible la regulación de las cadenas de azúcares del anticuerpo en un biorreactor.

2-1. Experimentos en biorreactores mediante la variación de la concentración de glicerol

Para examinar la afucosilación mediante la adición de glicerol como en los resultados experimentales de cultivo en matraces anteriores del Ejemplo 1-6, el presente experimento se llevó a cabo a nivel de reactor.

Como en el Ejemplo 1-6, el glicerol se añadió sólo al medio de producción a una concentración del 1 % y 2 % (v/v) que se muestra en la siguiente Tabla 5. El glicerol añadido al medio de producción se preparó al diluir la solución pura (100 %), basada en 3,5 l, que es un volumen de un cultivo del reactor principal, y no se añadió glicerol al medio de alimentación. Se pretendía que los aditivos tales como el manganeso y el glicerol se usaran para lograr contenidos de galactosilación y afucosilación similares a los del fármaco de control (Herceptin®) durante un proceso de desarrollo del nuevo proceso.

Las condiciones experimentales a nivel de reactor se resumen en la siguiente Tabla 5.

[Tabla 5]

El cultivo se llevó a cabo en un biorreactor en las condiciones de la Tabla 5 y se midieron los perfiles de crecimiento celular y los perfiles de viabilidad celular. Como en los resultados de la Figura 22, la adición de glicerol al 1 % mostró altos perfiles de crecimiento celular, en comparación con la adición de glicerol al 2 % (aproximadamente un 10 % de diferencia, basada en la densidad celular máxima), y mostró perfiles de alto crecimiento celular similares a los de la condición sin adición.

Los resultados de los niveles finales de expresión relativa (Figura 23) mostraron que todos los grupos con adición de glicerol mostraron niveles finales de expresión relativa altos, en comparación con el grupo sin adición, en el último día de cultivo.

2-2. Análisis del contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo

Se midieron los contenidos de cadenas de azúcares galactosiladas y afucosiladas de acuerdo con las combinaciones de los aditivos en las condiciones de la Tabla 5. En detalle, los resultados del análisis de N-glicanos en caldos de cultivo cultivados durante 8 días en un biorreactor de 2 unidades (adición de glicerol al 1 % o 2 %) se calcularon como contenido de galactosilación (A) y contenido de afucosilación (B).

Como se muestra en la Figura 24, los resultados experimentales del cultivo en reactor mostraron que los contenidos de afucosilación se incrementaron mediante la adición de glicerol al 2 %, en lugar de la adición de glicerol al 1 %, al medio de producción.

Como se muestra en la Figura 25, los resultados de la medición de los contenidos de galactosilación/afucosilación con relación a los del grupo de control (sin adición de manganeso, galactosa ni glicerol) mostraron que los aditivos incrementaron la galactosilación al 12 % o superior, y también incrementaron la afucosilación al 1,5 %, en comparación con el grupo de control sin adición. Como se muestra en la Figura 34, este efecto de incrementar el contenido de afucosilación fue aproximadamente 2 veces mayor que el de la muestra anterior del ensayo clínico de fase I.

2-3. Selección final de aditivos para el nuevo proceso y experimento en biorreactor de 3 lotes

Como se confirmó en el Ejemplo 2-2, la adición de glicerol al 2 % mostró el efecto de mejorar la afucosilación en los perfiles de N-glicano, en comparación con la condición sin adición, y como se confirmó en el Ejemplo 1, la adición de manganeso y uridina mostró el efecto de mejorar la galactosilación. En términos de equivalencia con respecto al fármaco de control (Herceptin®), se añadió glicerol a un medio de producción y un medio de alimentación, y se añadió uridina el día 5 de cultivo a una concentración de 8 mM. Se realizó un cultivo repetido de 3 lotes.

En detalle, se añadió glicerol sólo al medio de producción en el experimento anterior (Ejemplo 2-1), pero para incrementar el efecto de la adición, también se añadió glicerol al 2 % al medio de alimentación para la alimentación. Cuando se añade una alta concentración de glicerol desde el comienzo del cultivo, existe una preocupación acerca de la inhibición del crecimiento. Por lo tanto, se añadió igualmente glicerol al 2 % al medio de alimentación, y se pretendía eliminar el efecto de dilución mediante la alimentación.

De manganeso y galactosa, la galactosa se sustituyó por uridina, y para aumentar el efecto de galactosilación, la concentración de uridina se incrementó de 4 mM a 8 mM. Además, en el experimento del matraz al que se añadió uridina, se midió el pH el último día de cultivo. Como resultado, el pH fue de aproximadamente 6,9. En este experimento, después de la adición de uridina, el pH del cultivo se incrementó de pH 6,8 a pH 6,9, porque el pH puede provocar la diferencia de efecto debido a las concentraciones de aditivo entre el matraz y el biorreactor. Cuando se pretende que el pH se mantenga en 6,8 en el reactor, la pCO² tiende a aumentar continuamente desde el día 4 de cultivo y se incrementa rápidamente a 100 mmHg o más en el día 5 de cultivo. Por lo tanto, se esperaba que la pCO² pudiera disminuirse cuando el pH del cultivo principal se incrementara a pH 6,9 en el día 5 de cultivo, por referencia a la literatura que informa que una pCO² alta afecta negativamente a la glicosilación (Kimura R, 1997). Las condiciones experimentales cuando se considera este hecho se resumen en la siguiente Tabla 6. Con respecto a las siguientes condiciones, los 3 lotes se realizaron igualmente mediante la adición de aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares (mejora de la calidad), 40 pM de manganeso (M) y glicerol al 2 % (v/v) de (Gcr), al medio de producción (medio A), y en el día 5 del cultivo principal, se añadió uridina 8 mM (Urd), seguido de cultivo.

[Tabla 6]

Como en la Figura 26 que muestra los resultados de la medición de los perfiles de crecimiento celular y los perfiles de viabilidad celular mediante la realización de un cultivo en el biorreactor en las condiciones de la Tabla 6, los perfiles de crecimiento celular mostraron que una densidad celular máxima fue de aproximadamente 18 a 24 x 106 células/ml, similar a la del grupo de control sin adición.

Se encontró que el nivel final de expresión relativa (Figura 27) fue de aproximadamente 1,05 en el último día del cultivo principal, que fue ligeramente superior o similar al del grupo de control sin adición.

2-4. Análisis del contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo

Se midieron los contenidos de cadenas de azúcares galactosiladas y afucosiladas de los anticuerpos HD201, que se produjeron mediante un cultivo en biorreactor de 3 lotes mediante el nuevo proceso en condiciones de adición de 8 mM de uridina el día 5 de cultivo sobre la base de 40 pM de manganeso y glicerol al 2 % de la Tabla 6. En detalle, se compararon los perfiles de N-glicanos de las muestras el día 8 del cultivo principal entre cada lote y el grupo de control sin adición. Como resultado, el % de galactosilación (suma de todos los oligosacáridos con galactosa) del grupo de control fue del 31,8 % y el % de galactosilación (suma de todos los oligosacáridos con galactosa) de 3 lotes del nuevo proceso fue de 41,8 a 42,2 %, lo que muestra un incremento de aproximadamente un 10 %. Además, el % de afucosilación (suma de todos los oligosacáridos sin fucosa) del grupo de control sin adición fue del 6,1 % y el % de afucosilación (suma de todos los oligosacáridos sin fucosa) de 3 lotes del nuevo proceso fue de 9,1 ~ 9,5 %, lo que muestra un incremento de aproximadamente un 3 %.

Estos resultados se compararon con los del fármaco de control (Herceptin®). Como resultado, el % de galactosilación del fármaco de control (Herceptin® Lot.H0717) fue del 43 %, lo que muestra una diferencia de 2 % o menos, en comparación con 3 lotes del nuevo proceso, y el % de afucosilación del fármaco de control fue de 8,9 %, lo que muestra una diferencia del 1 % o menos, en comparación con el nuevo proceso, lo que indica efectos notablemente excelentes en términos de equivalencia con respecto al fármaco de control.

2-5. Efecto de la aplicación de la composición de aditivos al proceso antiguo

Se examinó si los perfiles de glicosilación deseados (galactosilación/afucosilación) pueden regularse cuando las composiciones de aditivos (manganeso, glicerol y uridina) desarrolladas en el nuevo proceso mediante los Ejemplos anteriores se aplican al proceso antiguo en un biorreactor a pequeña escala, y de esta forma se confirmó si los aditivos mostraban efectos similares tanto en el proceso antiguo como en el nuevo.

Se añadió glicerol al 2 % al medio de producción y al medio de alimentación en el nuevo proceso, pero la concentración de glicerol se aumentó al 3 % en el proceso anterior, y a continuación se examinó un incremento en el contenido de afucosilación de acuerdo con el aumento en la concentración del glicerol añadido. Mientras, se añadieron manganeso y uridina en las mismas concentraciones que en el nuevo proceso.

En detalle, en el ensayo clínico fase I de pequeña escala, se añadieron a un medio de producción (medio D) 40 pM de manganeso (M) y glicerol (Gcr) al 3 % (v/v) como aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares (aditivos de mejora de la calidad), y también se añadieron manganeso y glicerol a un medio de alimentación (Alimentación A) a las mismas concentraciones que en el medio de producción. En el nuevo proceso, se añadieron 40 pM de manganeso (M) y glicerol (Gcr) al 3 % (v/v) como aditivos para regular el contenido de cadena de azúcares (mejora de la calidad de N-glicanos de Fc) a un medio de producción (medio A), y un medio de alimentación (Alimentación C), respectivamente. Los grupos experimentales cultivados mediante la adición equitativa de 8 mM de uridina (Urd) el día 5 del cultivo principal tanto en el proceso antiguo como en el nuevo proceso se compararon con un grupo de control al que no se le añadieron los aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares (mejora de la calidad de N-glicanos de Fc).

Las condiciones experimentales se resumen en la siguiente Tabla 7.

[Tabla 7]

El cultivo en biorreactor se realizó en las condiciones de la Tabla 7 para medir los perfiles de crecimiento celular y los perfiles de viabilidad celular. Como se muestra en la Figura 30, una diferencia en la densidad celular máxima entre el nuevo proceso sin adición de aditivos y el nuevo proceso con adición de aditivos fue de aproximadamente el 24 % en los perfiles de crecimiento celular, y se observó una inhibición del crecimiento celular mediante la adición de aditivos. En el proceso antiguo también se observó inhibición del crecimiento celular mediante la adición de aditivos. Se considera que las inhibiciones del crecimiento celular son provocadas por la adición de glicerol al 3 % entre los aditivos, y los experimentos anteriores mostraron que las inhibiciones del crecimiento celular tienden a incrementarse al aumentar la concentración de glicerol.

Se confirmó una diferencia en los perfiles de crecimiento celular entre el nuevo proceso y el proceso antiguo al comparar un proceso antiguo sin adición de aditivos con un nuevo proceso sin adición de aditivos y comparar un proceso antiguo con adición de aditivo con un nuevo proceso con adición de aditivo. Una diferencia en la densidad celular máxima entre las condiciones sin adición fue de aproximadamente el 34 %, lo que indica que se observó una gran masa celular en el nuevo proceso. Además, una diferencia en la densidad celular máxima entre las condiciones con adición de aditivos fue de aproximadamente el 28 %, y el nuevo proceso mostró una densidad celular máxima más alta que el proceso antiguo. En el proceso antiguo, el cultivo principal se llevaba a cabo durante 7 días y, por lo tanto, en el lote a pequeña escala también se llevó a cabo el cultivo durante 7 días.

La viabilidad celular (B) se mantuvo al 80 % o más en las condiciones con adición de aditivo y en las condiciones sin adición de aditivo tras la terminación del cultivo. Se consideró que la alta tasa de reducción de la viabilidad después del día 5 de cultivo en el proceso antiguo sin adición de aditivos se atribuye al agotamiento de la glucosa después del día 3 de cultivo.

Los resultados de los niveles finales de expresión relativa (Figura 31) mostraron que el proceso antiguo mostró patrones similares en el día 7 de cultivo independientemente de la adición de aditivo, mientras que el nuevo proceso mostró un nivel de expresión 13 % menor en la condición con adición de aditivo que en la condición sin adición de aditivos. El nivel de expresión del nuevo proceso con relación al del proceso antiguo fue de 1.8, lo que indica un 80 % o más de incremento de la productividad.

2-6. Análisis del contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo

Se midieron los contenidos de cadenas de azúcares galactosiladas y afucosiladas de los anticuerpos producidos en las condiciones de la Tabla 7. El presente experimento se llevó a cabo para comparar las condiciones en las que se añadieron o no aditivos (manganeso, glicerol y uridina) para regular el contenido de cadenas de azúcares (mejora de la calidad) en el nuevo proceso y en el antiguo.

En detalle, se examinaron los contenidos de glicosilación (calidad de glicosilación) de los productos de las muestras de cultivo del biorreactor mediante análisis de N-glicanos, y se ilustraron los contenidos de galactosilación y afucosilación resultantes. Los perfiles de N-glicanos de las muestras recuperadas del cultivo principal se compararon entre la condición con adición de aditivo y la condición sin adición en el proceso antiguo. Como resultado, el contenido de galactosilación (%) fue del 43,8 % en la condición con adición de aditivo y 43 % en la condición sin adición, lo que muestra aproximadamente un 1 % de aumento en la condición con adición de aditivo. El contenido de afucosilación (%) fue del 18,7 % en la condición con adición de aditivo y del 9,1 % en la condición sin adición, lo que muestra un incremento de aproximadamente 2 veces en la condición con adición de aditivo.

En el nuevo proceso, la condición con adición de aditivo se comparó con la condición sin adición. Como resultado, el contenido de galactosilación (%) fue del 40,5 % en la condición con adición de aditivo y del 31,8 % en la condición sin adición, lo que muestra aproximadamente un 8 % de incremento en la condición con adición de aditivo. El contenido de afucosilación (%) fue del 14,1 % en la condición con adición de aditivo y 6,1 % en la condición sin adición, lo que muestra un incremento de aproximadamente 2 veces en la condición con adición de aditivo, como en el proceso antiguo.

Estos resultados experimentales mostraron que las adiciones de aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo que consisten en manganeso, glicerol y uridina tienen efectos similares en el proceso antiguo así como también en el nuevo proceso donde se usan diferentes medios, lo que sugiere que los aditivos correspondientes pueden usarse en cualquier proceso sin limitación en el medio.

Ejemplo 3. Examen de la actividad de ADCC

El análisis de la actividad de ADCC del anticuerpo HD201 se llevó a cabo de acuerdo con el SOP del ensayo de citotoxicidad dependiente del anticuerpo [ensayo de citotoxicidad dependiente del anticuerpo HD201].

La actividad de ADCC de los anticuerpos preparados mediante la adición de aditivos (manganeso, glicerol y uridina) para regular el contenido de cadenas de azúcares (mejora de la calidad de N-glicanos de Fc) en el proceso antiguo a pequeña escala y el nuevo proceso se midió mediante un ensayo de ADCC relativa que es un ensayo in vitro. Como material de referencia (fármaco de control) de la actividad de ADCC, se usó un producto original disponible actualmente (Herceptin® H4158B03150 mg).

[Tabla 8]

Los resultados experimentales se expresaron como % de ADCC relativa (A) determinada mediante los valores de EC⁵⁰ usados comúnmente, y % de actividad ADCC relativa (B) mediante el uso de una relación de actividad relativa calculada mediante el uso de PLA s/w. Puede verse que existe una ligera diferencia entre los resultados obtenidos con EC⁵⁰ y PLA, pero los patrones completos eran los mismos.

En el proceso antiguo a pequeña escala, la condición con adición de aditivo mostró un 217,5 % de actividad de ADCC, en comparación con el fármaco de control, y la condición sin adición mostró un 78,7 % de actividad de ADCC, que es una actividad menor que la del fármaco de control. Por lo tanto, cuando los aditivos (manganeso, glicerol y uridina) para regular el contenido de cadenas de azúcares (mejora de la calidad de N-glicanos de Fc) se añadieron al proceso antiguo, la relación de afucosilación puede aumentarse al doble, lo que lleva a una mejora del 100 % o superior en la actividad de ADCC, en comparación con la condición sin adición. En el nuevo proceso, la condición con adición de aditivo mostró 130 % de actividad de ADCC, en comparación con el fármaco de control, y la condición sin adición mostró 42,7 % de actividad de ADCC, que es la actividad más baja, en comparación con la del fármaco de control. Por lo tanto, como en el proceso antiguo mediante el uso de diferentes medios, cuando se añadieron al nuevo proceso los aditivos (manganeso, glicerol y uridina) para regular el contenido de cadenas de azúcares (mejora de la calidad de N-glicano de Fc), la relación de afucosilación puede aumentarse en 2 veces, lo que conduce a una mejora del 80 % o superior en la actividad de ADCC, en comparación con la condición sin adición.

Tomados en conjunto, los resultados anteriores mostraron que se demostró por primera vez en la presente invención la mejora del contenido de afucosilación de los anticuerpos mediante el uso de glicerol, y se desarrolló un proceso para regular el contenido de cadenas de azúcares de los anticuerpos mediante el uso de manganeso y uridina junto con glicerol.

El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas más que por la descripción que las precede.

Puede usarse un método de preparación de anticuerpos de acuerdo con la presente descripción para preparar una población deseada de anticuerpos de alta calidad mediante la regulación del contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo. Además, en términos del desarrollo de biosimilares, el método de la presente descripción puede usarse para regular el contenido de cadenas de azúcares de los anticuerpos, lo que prepara de esta manera anticuerpos que tienen una alta equivalencia con un fármaco de control. Dado que el contenido de cadenas de azúcares puede regularse mediante una composición de medio, el método de regulación es fácil y eficaz en términos de tiempo y coste y, por lo tanto, se aplica ampliamente a los campos de la preparación de anticuerpos.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar trastuzumab, el método comprende: cultivar células animales que expresan trastuzumab recombinante en un medio que comprende glicerol a una concentración de 0,5 a 3 % (v/v), manganeso a una concentración de 20 a 120 pM y uridina a una concentración de 3 a 10 mM como aditivos para regular el contenido de cadenas de azúcares del anticuerpo; en donde las células animales se seleccionan de: línea celular HD201 que expresa trastuzumab depositada con el núm. de acceso: KCTC 12164BP y línea celular de ovario de hámster chino que expresa trastuzumab;

en donde la etapa de cultivo comprende:

(a) cultivar las células que expresan trastuzumab en un medio que comprende glicerol a una concentración de 0,5 a 3 % (v/v) y manganeso a una concentración de 20 a 120 mM; y

(b) cultivar las células cultivadas en la etapa (a) mediante la adición de uridina a una concentración de 3 a 10 mM el día 5 de cultivo;

y opcionalmente, en donde el método comprende además

(c) cultivar las células cultivadas en la etapa (b) mediante la adición de un medio de alimentación que comprende glicerol y manganeso.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el contenido de cadenas de azúcares de dicho trastuzumab comprende un contenido de galactosilación dentro del intervalo del 35 al 50 % y un contenido de afucosilación dentro del intervalo del 8 al 20 %.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el cultivo consiste en cultivo principal y cultivo por lote alimentado.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el cultivo de la etapa (c) es un cultivo por lote alimentado.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el manganeso es cloruro de manganeso.