JPH08336389A - 糖蛋白質の糖鎖構造を制御する方法 - Google Patents
糖蛋白質の糖鎖構造を制御する方法Info
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- JPH08336389A JPH08336389A JP7147165A JP14716595A JPH08336389A JP H08336389 A JPH08336389 A JP H08336389A JP 7147165 A JP7147165 A JP 7147165A JP 14716595 A JP14716595 A JP 14716595A JP H08336389 A JPH08336389 A JP H08336389A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 所望の糖蛋白質を生産する細胞内において、
該糖蛋白質に結合している糖鎖の構造を制御する方法あ
るいはこれを特徴とする該糖蛋白質の生産方法を提供す
る。 【構成】 ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５と、該
細胞株に比べて高いＧａｌＴ活性量を有するヒトミエロ
ーマＰ１０９株 ＭＰ−５０６２とを融合させることに
より、よりＧａｌＴ活性量の高いＩｇＭ生産性ヒト−ヒ
トハイブリドーマ株 ＭＰ−５０９７を得、該ハイブリ
ドーマ株よりＩｇＭを生産する。 【効果】 本発明により得られる糖蛋白質は、糖鎖の種
類及び構造が制御され、特性あるいは生物活性をも変更
が可能である。また、本発明に係る糖蛋白質を医薬とし
て用いる場合、投与方法や副作用等の面でより優れた医
薬的効果が期待できる。
該糖蛋白質に結合している糖鎖の構造を制御する方法あ
るいはこれを特徴とする該糖蛋白質の生産方法を提供す
る。 【構成】 ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５と、該
細胞株に比べて高いＧａｌＴ活性量を有するヒトミエロ
ーマＰ１０９株 ＭＰ−５０６２とを融合させることに
より、よりＧａｌＴ活性量の高いＩｇＭ生産性ヒト−ヒ
トハイブリドーマ株 ＭＰ−５０９７を得、該ハイブリ
ドーマ株よりＩｇＭを生産する。 【効果】 本発明により得られる糖蛋白質は、糖鎖の種
類及び構造が制御され、特性あるいは生物活性をも変更
が可能である。また、本発明に係る糖蛋白質を医薬とし
て用いる場合、投与方法や副作用等の面でより優れた医
薬的効果が期待できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、糖蛋白質の生産技術に
関する。具体的には、所望の糖蛋白質を生産する細胞内
において、糖蛋白質の糖鎖結合可能部位に結合している
糖鎖の生合成に関与する一種以上の酵素の活性量を調節
することにより、該糖鎖の構造を制御し、改変された糖
鎖構造あるいは均質な糖鎖を有する糖蛋白質を生産する
方法に関する。
関する。具体的には、所望の糖蛋白質を生産する細胞内
において、糖蛋白質の糖鎖結合可能部位に結合している
糖鎖の生合成に関与する一種以上の酵素の活性量を調節
することにより、該糖鎖の構造を制御し、改変された糖
鎖構造あるいは均質な糖鎖を有する糖蛋白質を生産する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子工学あるいは細胞工学の発
展により、本来生体内に極微量しか存在しない糖蛋白質
を大量に得ることが可能になった。これに伴い、糖蛋白
質の糖鎖部分、例えばアスパラギン残基に結合している
糖鎖（以下Ｎ−結合型糖鎖と呼ぶ）は、生体にとって物
理化学的、生物学的に重要な機能を持つことが知られる
ようになっている（Varki,A., Glycobiology, vol.3,
p.97, （1993））（竹内誠他, バイオサイエンスとイン
ダストリー, Vol.47, No.1, PP.44-47,（1989））。こ
のことから、医薬として用いられる糖蛋白質に、有用な
糖鎖構造をより均一に与えることには産業的に大きな価
値があると予想される。Ｎ−結合型糖鎖は、その共通の
母核構造として図１（図１）に示す枝分かれの５糖構造
を含んでいる。このトリマンノシルコアと呼ばれる母核
に対して、最大６残基のマンノースが結合したものは高
マンノース型糖鎖と呼ばれる。一方、トリマンノシルコ
アの非還元末端の両マンノース残基にＮ−アセチルグル
コサミンに始まる側鎖が結合され、ガラクトース、フコ
ース、シアル酸が結合したり、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンの分岐構造を含むように生合成されるものは複合型糖
鎖と呼ばれる。しかしながら、ＤＮＡあるいは蛋白質と
は異なり、細胞内における糖鎖の形成（グリコシル化）
は、鋳型によらず、特定の単糖と結合様式に特異的な複
数の酵素（糖加水分解酵素及び糖転移酵素）によるpost
-translational modification（翻訳後修飾）である（K
ornfeld,R. and Kornfeld,S., Ann.Rev.Biochem., vol.
54, p.631, （1985））。このため、グリコシル化によ
り糖蛋白質の特定の糖鎖結合可能部位に与えられる糖鎖
は必ずしも均一にならず、種々の糖鎖を持つ糖蛋白質が
存在する。また、鋳型が存在しないため、遺伝子工学等
の手法を用いた直接的な構造制御は困難である。
展により、本来生体内に極微量しか存在しない糖蛋白質
を大量に得ることが可能になった。これに伴い、糖蛋白
質の糖鎖部分、例えばアスパラギン残基に結合している
糖鎖（以下Ｎ−結合型糖鎖と呼ぶ）は、生体にとって物
理化学的、生物学的に重要な機能を持つことが知られる
ようになっている（Varki,A., Glycobiology, vol.3,
p.97, （1993））（竹内誠他, バイオサイエンスとイン
ダストリー, Vol.47, No.1, PP.44-47,（1989））。こ
のことから、医薬として用いられる糖蛋白質に、有用な
糖鎖構造をより均一に与えることには産業的に大きな価
値があると予想される。Ｎ−結合型糖鎖は、その共通の
母核構造として図１（図１）に示す枝分かれの５糖構造
を含んでいる。このトリマンノシルコアと呼ばれる母核
に対して、最大６残基のマンノースが結合したものは高
マンノース型糖鎖と呼ばれる。一方、トリマンノシルコ
アの非還元末端の両マンノース残基にＮ−アセチルグル
コサミンに始まる側鎖が結合され、ガラクトース、フコ
ース、シアル酸が結合したり、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンの分岐構造を含むように生合成されるものは複合型糖
鎖と呼ばれる。しかしながら、ＤＮＡあるいは蛋白質と
は異なり、細胞内における糖鎖の形成（グリコシル化）
は、鋳型によらず、特定の単糖と結合様式に特異的な複
数の酵素（糖加水分解酵素及び糖転移酵素）によるpost
-translational modification（翻訳後修飾）である（K
ornfeld,R. and Kornfeld,S., Ann.Rev.Biochem., vol.
54, p.631, （1985））。このため、グリコシル化によ
り糖蛋白質の特定の糖鎖結合可能部位に与えられる糖鎖
は必ずしも均一にならず、種々の糖鎖を持つ糖蛋白質が
存在する。また、鋳型が存在しないため、遺伝子工学等
の手法を用いた直接的な構造制御は困難である。
【０００３】これまで、所望の糖鎖あるいはこれを含む
糖蛋白質を得るためには、以下の様な例が試みられてき
た。即ち、糖蛋白質を得た後、各種の酵素で処理して、
糖鎖構造を酵素的に直接修飾改変する方法（Takeuchi,
M. et al., J.Biol.Chem., vol.265, p.12127, （199
0））。組み換えＤＮＡ技術によって糖蛋白質をコード
する遺伝子をクローニングし、発現する宿主細胞を選択
することにより、糖鎖を改変する方法（Kingsley,D.M.
et al., Cell, vol.44, p.749, （1986））（Takeuchi,
M. and Kobata,A., Glycobiology, vol.1, p.337, （19
91））。糖蛋白質をコードする遺伝子上の糖鎖結合可能
部位をコードする領域を挿入・置換・削除することによ
って糖鎖の結合自体を制御する方法（Williams,A.M. et
al., J.Biol.Chem., vol.266, p.17648, （1991））。
糖鎖近傍のアミノ酸を改変し、この空間的影響によって
間接的に糖鎖構造を変化させる方法（林 勇一郎他, 生
化学, vol.62, p.690, （1990））。糖蛋白質生産細胞
の培養に際して糖鎖生合成系に於ける各プロセッシング
過程の阻害剤を添加することにより、糖鎖生合成系に対
して積極的に干渉する方法（高月 昭他, 蛋白質・核酸
・酵素, vol.38, p.1704, （1993））（Olden,K.et a
l., Biochim.Biophys.Acta., vol.650, p.209, （198
2））等が知られている。また、糖蛋白質生産細胞の培
養による糖蛋白質の生産において、培養手法や装置、血
清の有無、培養期間、緩衝液の組成等の培養条件がグリ
コシル化に多少影響することが知られており（Goochee,
C.F. and Monica,T.J., BIO/TECHNOLOGY,vol.8, p.421,
（1990））（Goochee,C.F. et al., BIO/TECHNOLOGY,
vol.9, p.1347, （1991））、このことを利用した試み
も行われつつある。しかしこれらの方法を用いて所望の
糖鎖構造を得るためには、何れも試行錯誤を伴う非常な
努力を要するうえ、この結果、所望の糖鎖構造を有する
糖蛋白質が得られなかったり、使用する試薬が高価であ
ったりなどの欠点を有している。さらにこれまでの報告
によれば、細胞内糖鎖生合成酵素及び糖鎖構造の量的な
相関は明らかでなく、ましてやその活性量を測定し、こ
れを至適に制御するという恣意的な操作は行われてこな
かった。
糖蛋白質を得るためには、以下の様な例が試みられてき
た。即ち、糖蛋白質を得た後、各種の酵素で処理して、
糖鎖構造を酵素的に直接修飾改変する方法（Takeuchi,
M. et al., J.Biol.Chem., vol.265, p.12127, （199
0））。組み換えＤＮＡ技術によって糖蛋白質をコード
する遺伝子をクローニングし、発現する宿主細胞を選択
することにより、糖鎖を改変する方法（Kingsley,D.M.
et al., Cell, vol.44, p.749, （1986））（Takeuchi,
M. and Kobata,A., Glycobiology, vol.1, p.337, （19
91））。糖蛋白質をコードする遺伝子上の糖鎖結合可能
部位をコードする領域を挿入・置換・削除することによ
って糖鎖の結合自体を制御する方法（Williams,A.M. et
al., J.Biol.Chem., vol.266, p.17648, （1991））。
糖鎖近傍のアミノ酸を改変し、この空間的影響によって
間接的に糖鎖構造を変化させる方法（林 勇一郎他, 生
化学, vol.62, p.690, （1990））。糖蛋白質生産細胞
の培養に際して糖鎖生合成系に於ける各プロセッシング
過程の阻害剤を添加することにより、糖鎖生合成系に対
して積極的に干渉する方法（高月 昭他, 蛋白質・核酸
・酵素, vol.38, p.1704, （1993））（Olden,K.et a
l., Biochim.Biophys.Acta., vol.650, p.209, （198
2））等が知られている。また、糖蛋白質生産細胞の培
養による糖蛋白質の生産において、培養手法や装置、血
清の有無、培養期間、緩衝液の組成等の培養条件がグリ
コシル化に多少影響することが知られており（Goochee,
C.F. and Monica,T.J., BIO/TECHNOLOGY,vol.8, p.421,
（1990））（Goochee,C.F. et al., BIO/TECHNOLOGY,
vol.9, p.1347, （1991））、このことを利用した試み
も行われつつある。しかしこれらの方法を用いて所望の
糖鎖構造を得るためには、何れも試行錯誤を伴う非常な
努力を要するうえ、この結果、所望の糖鎖構造を有する
糖蛋白質が得られなかったり、使用する試薬が高価であ
ったりなどの欠点を有している。さらにこれまでの報告
によれば、細胞内糖鎖生合成酵素及び糖鎖構造の量的な
相関は明らかでなく、ましてやその活性量を測定し、こ
れを至適に制御するという恣意的な操作は行われてこな
かった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、所望
の糖鎖あるいはこれを持つ糖蛋白質を生産するための、
あるいは糖蛋白質の糖鎖を改変するための方法を提供す
ることにある。より具体的には、本発明の目的は、糖蛋
白質生産細胞による糖蛋白質の生産において、該糖蛋白
質の糖鎖結合部位の糖鎖構造を制御する方法を提供する
ことにある。
の糖鎖あるいはこれを持つ糖蛋白質を生産するための、
あるいは糖蛋白質の糖鎖を改変するための方法を提供す
ることにある。より具体的には、本発明の目的は、糖蛋
白質生産細胞による糖蛋白質の生産において、該糖蛋白
質の糖鎖結合部位の糖鎖構造を制御する方法を提供する
ことにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは糖蛋白質の
糖鎖構造に関する研究を進める課程において、糖鎖の生
合成に関与する酵素の活性量と糖鎖構造との間には定量
的な正の相関があることを見いだし、上記知見をもとに
目的とする糖蛋白質あるいは糖鎖を得るための簡便且つ
画期的手法の開発に成功した。
糖鎖構造に関する研究を進める課程において、糖鎖の生
合成に関与する酵素の活性量と糖鎖構造との間には定量
的な正の相関があることを見いだし、上記知見をもとに
目的とする糖蛋白質あるいは糖鎖を得るための簡便且つ
画期的手法の開発に成功した。
【０００６】即ち本発明は、所望の糖蛋白質を生産する
細胞内において、該糖蛋白質の糖鎖結合部位に結合して
いる糖鎖の生合成に関与する一種以上の酵素の活性量を
調節することにより、該糖鎖の構造を制御する方法を提
供するものである。また本発明は、所望の糖蛋白質を生
産する細胞内において、該糖蛋白質の糖鎖結合可能部位
に結合している糖鎖の生合成に関与する一種以上の酵素
の活性量を調節することにより、該糖鎖の構造を制御す
ることを特徴とする、糖蛋白質の生産方法を提供するも
のである。
細胞内において、該糖蛋白質の糖鎖結合部位に結合して
いる糖鎖の生合成に関与する一種以上の酵素の活性量を
調節することにより、該糖鎖の構造を制御する方法を提
供するものである。また本発明は、所望の糖蛋白質を生
産する細胞内において、該糖蛋白質の糖鎖結合可能部位
に結合している糖鎖の生合成に関与する一種以上の酵素
の活性量を調節することにより、該糖鎖の構造を制御す
ることを特徴とする、糖蛋白質の生産方法を提供するも
のである。
【０００７】本発明に係わる糖蛋白質とは、蛋白質のア
ミノ酸配列中のアスパラギン残基又はセリン若しくはス
レオニン残基等の糖鎖が結合する可能性のあるアミノ酸
残基の内、少なくとも一カ所に糖鎖が結合している蛋白
質を示す。その様なものの代表例として、免疫グロブリ
ン（Ｉｇ）Ｍ及びＧ、組織プラスミノーゲン活性化因子
（ｔ−ＰＡ）等を挙げることができる。糖蛋白質ＩｇＭ
の単量体は、図２（図２）に示すようにＮ−結合型糖鎖
の結合部位を重鎖の定常領域に５箇所（以下、アミノ末
端より数えて１６７、３３０、３９３、４００及び５６
０番目のアミノ酸であるアスパラギンに結合した糖鎖を
各々Ｎ１６７、Ｎ３３０、Ｎ３９３、Ｎ４００、Ｎ５６
０と記載する）有している(Shimizu.A. et al., Nature
New Biology, vol.231, p.73, （1971））（Patnum,F.
W. et al., Science, vol.182, p.287, （1973））。
ミノ酸配列中のアスパラギン残基又はセリン若しくはス
レオニン残基等の糖鎖が結合する可能性のあるアミノ酸
残基の内、少なくとも一カ所に糖鎖が結合している蛋白
質を示す。その様なものの代表例として、免疫グロブリ
ン（Ｉｇ）Ｍ及びＧ、組織プラスミノーゲン活性化因子
（ｔ−ＰＡ）等を挙げることができる。糖蛋白質ＩｇＭ
の単量体は、図２（図２）に示すようにＮ−結合型糖鎖
の結合部位を重鎖の定常領域に５箇所（以下、アミノ末
端より数えて１６７、３３０、３９３、４００及び５６
０番目のアミノ酸であるアスパラギンに結合した糖鎖を
各々Ｎ１６７、Ｎ３３０、Ｎ３９３、Ｎ４００、Ｎ５６
０と記載する）有している(Shimizu.A. et al., Nature
New Biology, vol.231, p.73, （1971））（Patnum,F.
W. et al., Science, vol.182, p.287, （1973））。
【０００８】本発明に係わる糖鎖とは糖蛋白質に結合し
ている糖鎖であって、その結合可能部位とは、糖蛋白質
を構成する蛋白質部分のアミノ酸配列中のアスパラギン
残基あるいはセリン若しくはスレオニン残基を示してい
る。また、本発明の糖鎖は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−マン
ノース、Ｄ−ガラクトース、フコース及びシアル酸等の
単糖により構成される。
ている糖鎖であって、その結合可能部位とは、糖蛋白質
を構成する蛋白質部分のアミノ酸配列中のアスパラギン
残基あるいはセリン若しくはスレオニン残基を示してい
る。また、本発明の糖鎖は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−マン
ノース、Ｄ−ガラクトース、フコース及びシアル酸等の
単糖により構成される。
【０００９】本発明に係わる糖鎖の生合成に関与する一
種以上の酵素とは、αマンノシダーゼＩ及びＩＩ、α１
−６フコース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移
酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶ、β１−４ガラクト
ース転移酵素、α２−６シアル酸転移酵素等に代表さ
れ、細胞内ゴルジにおいて糖鎖の生合成に関与する酵素
群を指す。β１−４ガラクトース転移酵素（以下、Ｇａ
ｌＴと記載する）は、複合型糖鎖の非還元末端Ｎ−アセ
チルラクトサミン構造を形成する酵素として知られてい
る。
種以上の酵素とは、αマンノシダーゼＩ及びＩＩ、α１
−６フコース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移
酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶ、β１−４ガラクト
ース転移酵素、α２−６シアル酸転移酵素等に代表さ
れ、細胞内ゴルジにおいて糖鎖の生合成に関与する酵素
群を指す。β１−４ガラクトース転移酵素（以下、Ｇａ
ｌＴと記載する）は、複合型糖鎖の非還元末端Ｎ−アセ
チルラクトサミン構造を形成する酵素として知られてい
る。
【００１０】本発明に用いることのできる所望の糖蛋白
質を生産する細胞あるいはその細胞株としては、真核生
物由来のものであれば特に制限はなく、付着性細胞、浮
遊性細胞の何れも使用できる。その様なものの代表例と
して糖蛋白質を細胞内に蓄積生産する動物細胞、及び糖
蛋白質を細胞外に分泌生産する動物細胞等が例示でき
る。具体的には例えば、抗体生産Ｂ細胞、ｔ−ＰＡ生産
細胞等を挙げることができ、抗緑膿菌ＩｇＭ抗体生産Ｂ
細胞株 ＭＰ−５０４５（本細胞株は通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４９７６として寄託されている）等が好適に使用され
る。
質を生産する細胞あるいはその細胞株としては、真核生
物由来のものであれば特に制限はなく、付着性細胞、浮
遊性細胞の何れも使用できる。その様なものの代表例と
して糖蛋白質を細胞内に蓄積生産する動物細胞、及び糖
蛋白質を細胞外に分泌生産する動物細胞等が例示でき
る。具体的には例えば、抗体生産Ｂ細胞、ｔ−ＰＡ生産
細胞等を挙げることができ、抗緑膿菌ＩｇＭ抗体生産Ｂ
細胞株 ＭＰ−５０４５（本細胞株は通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４９７６として寄託されている）等が好適に使用され
る。
【００１１】また上記細胞（所望の糖蛋白質を生産する
細胞）とは糖鎖の生合成に関与する酵素の活性量が異な
っている、細胞融合の際に用いることのできる細胞ある
いはその細胞株としては、糖蛋白質を生産する細胞ある
いはその細胞株の細胞内での糖鎖の生合成に関与する酵
素の活性量及び所望の糖鎖構造を考慮して適宜選択すれ
ばよく特に制限はないが、糖鎖の生合成に関与する酵素
の活性量の比較を考慮すれば、本発明における所望の糖
鎖を生産する細胞とその融合パートナーとなる細胞とは
分類学的に同種あるいは近縁な種の生物に由来すること
が好ましい。例えば、抗緑膿菌ＩｇＭ抗体（以下ＩｇＭ
と記載する）生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５に対しては
ヒトミエローマＰ１０９株 ＭＰ−５０６２（本細胞株
は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９７７として寄託されている）
を好適に用いることができる。
細胞）とは糖鎖の生合成に関与する酵素の活性量が異な
っている、細胞融合の際に用いることのできる細胞ある
いはその細胞株としては、糖蛋白質を生産する細胞ある
いはその細胞株の細胞内での糖鎖の生合成に関与する酵
素の活性量及び所望の糖鎖構造を考慮して適宜選択すれ
ばよく特に制限はないが、糖鎖の生合成に関与する酵素
の活性量の比較を考慮すれば、本発明における所望の糖
鎖を生産する細胞とその融合パートナーとなる細胞とは
分類学的に同種あるいは近縁な種の生物に由来すること
が好ましい。例えば、抗緑膿菌ＩｇＭ抗体（以下ＩｇＭ
と記載する）生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５に対しては
ヒトミエローマＰ１０９株 ＭＰ−５０６２（本細胞株
は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９７７として寄託されている）
を好適に用いることができる。
【００１２】酵素活性を調節する方法としては、糖鎖の
生合成に関与する酵素の活性量を測定しつつ各種公知の
方法を適宜選択して用いることができる。例えば具体的
には、所望の糖蛋白質を生産する細胞に対して、所望の
糖鎖構造を与えるに適当な酵素の活性量を有する細胞
を、例えばポリエチレングリコールを用いて、あるいは
電気的に融合せしめることにより達成することができ
る。
生合成に関与する酵素の活性量を測定しつつ各種公知の
方法を適宜選択して用いることができる。例えば具体的
には、所望の糖蛋白質を生産する細胞に対して、所望の
糖鎖構造を与えるに適当な酵素の活性量を有する細胞
を、例えばポリエチレングリコールを用いて、あるいは
電気的に融合せしめることにより達成することができ
る。
【００１３】また、所望の糖鎖の生合成に関与する酵素
の遺伝子配列が明らかであるものについては、これを発
現制御可能な状態でベクターと接続して細胞に導入する
方法、あるいはアンチセンス法、遺伝子破壊法等も用い
ることができる。
の遺伝子配列が明らかであるものについては、これを発
現制御可能な状態でベクターと接続して細胞に導入する
方法、あるいはアンチセンス法、遺伝子破壊法等も用い
ることができる。
【００１４】糖鎖の生合成に関与する酵素の活性を定量
する測定法は各酵素の測定法に従えばよいが、検出感度
が高く定量性、再現性の高い手法が望ましい。ＧａｌＴ
活性を測定するには、例えば受容体糖鎖及び基質となる
糖ヌクレオチドを含む反応液中に、測定試料として細胞
の破砕液を加え、残存する受容体糖鎖をＨＰＬＣを用い
て定量し、その活性を市販のウシＧａｌＴをもとに作製
した検量線より算出することも可能である。この時、受
容体糖鎖や生成物及び基質を分解するような、反応の定
量性を妨げる物質の存在を考慮した系であることが望ま
しい。
する測定法は各酵素の測定法に従えばよいが、検出感度
が高く定量性、再現性の高い手法が望ましい。ＧａｌＴ
活性を測定するには、例えば受容体糖鎖及び基質となる
糖ヌクレオチドを含む反応液中に、測定試料として細胞
の破砕液を加え、残存する受容体糖鎖をＨＰＬＣを用い
て定量し、その活性を市販のウシＧａｌＴをもとに作製
した検量線より算出することも可能である。この時、受
容体糖鎖や生成物及び基質を分解するような、反応の定
量性を妨げる物質の存在を考慮した系であることが望ま
しい。
【００１５】細胞の培養は各種公知の方法を用いて行う
ことができ、細胞の増殖及び糖蛋白質の生産を阻害しな
いものであれば特に制限はない。例えば動物細胞の場
合、タンクでの浮遊培養、細胞をスチレン製のマイクロ
ビーズ表面あるいはローラーボトル内壁等に付着させた
接着培養、フラスコを用いた静置培養等を細胞に応じて
適宜選択することができる。培養時間は、バッチ法で培
養する場合には細胞が十分に増殖して糖蛋白質が十分に
生産されるまで行えばよく、通常１週間〜６カ月程度で
ある。培養に際して培地の一部を無菌的に交換しながら
連続的に培養を行う場合は、培養時間は１週間〜６カ月
程度である。また培養に際しては、糖蛋白質を生産する
細胞を播種した後、適当な温度、通気状態、培地のｐＨ
を保ちながら該細胞を培養する。本発明の培養に使用で
きる培地としては、基本培地に血清等の添加物を添加し
たものを用いることができる。基本培地としては市販さ
れている細胞培養用の培地を用いることができ、例えば
イーグル最少必須培地、ＲＰＭＩ-１６４０培地、ハム
Ｆ１２培地、ダルベッコ変法イーグル培地等を単独ある
いは適宜混合して使用すればよい。また、細胞の培養を
細胞数の増加と糖蛋白質の生産と二段階に区別して行
い、異なる２種類の培地を用いることもできる。この場
合には、増殖培地としては例えば上記基本培地に１〜３
０％濃度のウシ胎児血清（以下ＦＣＳと記載する）を添
加した栄養培地を、生産培地としてはＦＣＳを含まない
培地を使用できる。
ことができ、細胞の増殖及び糖蛋白質の生産を阻害しな
いものであれば特に制限はない。例えば動物細胞の場
合、タンクでの浮遊培養、細胞をスチレン製のマイクロ
ビーズ表面あるいはローラーボトル内壁等に付着させた
接着培養、フラスコを用いた静置培養等を細胞に応じて
適宜選択することができる。培養時間は、バッチ法で培
養する場合には細胞が十分に増殖して糖蛋白質が十分に
生産されるまで行えばよく、通常１週間〜６カ月程度で
ある。培養に際して培地の一部を無菌的に交換しながら
連続的に培養を行う場合は、培養時間は１週間〜６カ月
程度である。また培養に際しては、糖蛋白質を生産する
細胞を播種した後、適当な温度、通気状態、培地のｐＨ
を保ちながら該細胞を培養する。本発明の培養に使用で
きる培地としては、基本培地に血清等の添加物を添加し
たものを用いることができる。基本培地としては市販さ
れている細胞培養用の培地を用いることができ、例えば
イーグル最少必須培地、ＲＰＭＩ-１６４０培地、ハム
Ｆ１２培地、ダルベッコ変法イーグル培地等を単独ある
いは適宜混合して使用すればよい。また、細胞の培養を
細胞数の増加と糖蛋白質の生産と二段階に区別して行
い、異なる２種類の培地を用いることもできる。この場
合には、増殖培地としては例えば上記基本培地に１〜３
０％濃度のウシ胎児血清（以下ＦＣＳと記載する）を添
加した栄養培地を、生産培地としてはＦＣＳを含まない
培地を使用できる。
【００１６】上述のようにして得られた培養物からの糖
蛋白質の回収は通常の精製、回収方法により分離精製で
きる。即ち、例えば糖蛋白質が細胞外に分泌生産される
場合には、適時培養液を交換する方法により培養液を回
収する。また、糖蛋白質が細胞内に生産蓄積される場合
には、培養液をろ過あるいは遠心分離する方法により細
胞を回収する。糖蛋白質の精製は、目的の糖蛋白質に応
じて、例えばイオン交換、生物学的親和性、吸着あるい
は疎水度、親水度、分子サイズ、限外濾過等を利用した
各種公知の精製方法で達成されるが、糖蛋白質が細胞内
に生産蓄積されるものである場合には、精製に先立って
細胞を破砕する必要がある。
蛋白質の回収は通常の精製、回収方法により分離精製で
きる。即ち、例えば糖蛋白質が細胞外に分泌生産される
場合には、適時培養液を交換する方法により培養液を回
収する。また、糖蛋白質が細胞内に生産蓄積される場合
には、培養液をろ過あるいは遠心分離する方法により細
胞を回収する。糖蛋白質の精製は、目的の糖蛋白質に応
じて、例えばイオン交換、生物学的親和性、吸着あるい
は疎水度、親水度、分子サイズ、限外濾過等を利用した
各種公知の精製方法で達成されるが、糖蛋白質が細胞内
に生産蓄積されるものである場合には、精製に先立って
細胞を破砕する必要がある。
【００１７】上記により得られた糖蛋白質より更に糖鎖
を得るためには、各種公知の方法を利用できる。その代
表例として例えば公知のヒドラジン分解法や各種のグリ
コペプチダーゼを用いて糖鎖と蛋白質部分とを切断する
方法がある。また、糖蛋白質の特定部位に結合している
糖鎖のみを必要とする場合には、トリプシン、リジルエ
ンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ等の蛋白質分解酵
素を用いて予め糖蛋白質を断片化して糖蛋白質の精製に
準じた方法で目的の糖鎖を含むペプチド断片を得た後、
上記と同様の方法にて糖鎖とペプチドとを切断すればよ
い。糖蛋白質あるいは糖ペプチドより上記の方法で糖鎖
を切り出した後にペプチドあるいはアミノ酸と糖鎖を個
別に分離するためには、疎水度や分子量または親水度を
利用した各種の精製方法で行うことができる。糖を含む
画分の検出にはオルシノール硫酸法等の糖特異的な発色
法を用いることができる。
を得るためには、各種公知の方法を利用できる。その代
表例として例えば公知のヒドラジン分解法や各種のグリ
コペプチダーゼを用いて糖鎖と蛋白質部分とを切断する
方法がある。また、糖蛋白質の特定部位に結合している
糖鎖のみを必要とする場合には、トリプシン、リジルエ
ンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ等の蛋白質分解酵
素を用いて予め糖蛋白質を断片化して糖蛋白質の精製に
準じた方法で目的の糖鎖を含むペプチド断片を得た後、
上記と同様の方法にて糖鎖とペプチドとを切断すればよ
い。糖蛋白質あるいは糖ペプチドより上記の方法で糖鎖
を切り出した後にペプチドあるいはアミノ酸と糖鎖を個
別に分離するためには、疎水度や分子量または親水度を
利用した各種の精製方法で行うことができる。糖を含む
画分の検出にはオルシノール硫酸法等の糖特異的な発色
法を用いることができる。
【００１８】この様にして得られた糖鎖の構造を分析、
確認するためには、各種公知の方法を適宜利用すること
ができるが、検出感度が高くなることから、得られた糖
鎖に対して２−アミノピリジンによる蛍光標識を行い後
述する様な高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
よる解析を行うことが望ましい。ＨＰＬＣを利用した糖
鎖の分離及び分析に際しては、糖鎖の持つ電荷、分子
量、親水度、疎水度、各種レクチンに対する親和性等に
基づき公知となっているいずれの手法をも利用すること
ができる。その代表例として、陰イオン交換カラムを利
用してシアル酸数の異なる糖鎖をその電荷の違いにより
分離し定量した後にシアル酸を脱離し、得られた中性糖
鎖を逆相カラムにて分離するとともに、この逆相カラム
を用いたＨＰＬＣ（以下逆相ＨＰＬＣと記載する）で得
られた各ピーク成分の糖鎖を更に順相カラムと逆相カラ
ムを使用して分離し、各成分の糖鎖構造を高橋らの２次
元糖鎖マップ（高橋禮子, 糖蛋白質糖鎖研究法 生化学
実験法23, 学会出版センター, （1989））（高橋禮子
他, 蛋白質核酸酵素増刊, 共立出版, vol.37, p.2117,
（1992））によるフィンガープリントを行い同定する方
法がある。この時、シアル酸の除去には、例えば酸性条
件下で酸加水分解を行う方法や微生物由来のシアリダー
ゼを用いる方法が使用できる。
確認するためには、各種公知の方法を適宜利用すること
ができるが、検出感度が高くなることから、得られた糖
鎖に対して２−アミノピリジンによる蛍光標識を行い後
述する様な高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
よる解析を行うことが望ましい。ＨＰＬＣを利用した糖
鎖の分離及び分析に際しては、糖鎖の持つ電荷、分子
量、親水度、疎水度、各種レクチンに対する親和性等に
基づき公知となっているいずれの手法をも利用すること
ができる。その代表例として、陰イオン交換カラムを利
用してシアル酸数の異なる糖鎖をその電荷の違いにより
分離し定量した後にシアル酸を脱離し、得られた中性糖
鎖を逆相カラムにて分離するとともに、この逆相カラム
を用いたＨＰＬＣ（以下逆相ＨＰＬＣと記載する）で得
られた各ピーク成分の糖鎖を更に順相カラムと逆相カラ
ムを使用して分離し、各成分の糖鎖構造を高橋らの２次
元糖鎖マップ（高橋禮子, 糖蛋白質糖鎖研究法 生化学
実験法23, 学会出版センター, （1989））（高橋禮子
他, 蛋白質核酸酵素増刊, 共立出版, vol.37, p.2117,
（1992））によるフィンガープリントを行い同定する方
法がある。この時、シアル酸の除去には、例えば酸性条
件下で酸加水分解を行う方法や微生物由来のシアリダー
ゼを用いる方法が使用できる。
【００１９】
【実施例】以下に記す実施例は、糖蛋白質の例としてＩ
ｇＭ生産細胞株の培養によって生産されるＩｇＭの糖鎖
を変更した方法について説明する。 実施例１ １．ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５における酵素
活性量の定量 ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５における細胞内Ｇ
ａｌＴ活性量の測定を行った。本細胞株を１×１０6ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度にて、ＦＣＳを含まない改変
ＮＹＳＦ培地に播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下
で、フラスコを用いて静置培養した。播種後３、４日目
に生細胞数を計測し、各時点で５×１０5の細胞を含む
細胞培養液をサンプリングし、遠心分離にて集めた後、
ＰＢＳ緩衝液にて洗浄した。これに対して１％濃度のＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５μｌ量の１０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液を加え、細胞を懸濁した後、バス型超音波
破砕装置を用いて細胞を破砕した。受容体糖鎖（ピリジ
ルアミノ化ガラクトシルバイアンテナ）１２．５ｍＭを
含む２０μｌ量の反応溶液（１０ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａ
ｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１２．５ｍ
Ｍ ＭｎＣｌ2、４１．２５ｍＭ ＮａＣｌ、３．７５ｍ
Ｍ ＫＣｌ、及び７．０ｍＭ濃度のγ−ラクトンを含
む）を上記細胞破砕液に対して添加し、３７℃にて加温
した。これより経時的に５μｌを反応停止液に対してサ
ンプリングし、Ｓｈｉｍ−ｐａｋ ＣＬＣ−ＯＤＳカラ
ムを用いたＨＰＬＣにより分析し、受容体糖鎖残存率の
対数値を反応時間に対してプロットした傾きによりＧａ
ｌＴ活性量を反応速度として算出した。この結果ＩｇＭ
生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５のＧａｌＴ活性量及びそ
のときの細胞増殖の推移は図３ａ（図３）に記したとお
りであった。
ｇＭ生産細胞株の培養によって生産されるＩｇＭの糖鎖
を変更した方法について説明する。 実施例１ １．ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５における酵素
活性量の定量 ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５における細胞内Ｇ
ａｌＴ活性量の測定を行った。本細胞株を１×１０6ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度にて、ＦＣＳを含まない改変
ＮＹＳＦ培地に播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下
で、フラスコを用いて静置培養した。播種後３、４日目
に生細胞数を計測し、各時点で５×１０5の細胞を含む
細胞培養液をサンプリングし、遠心分離にて集めた後、
ＰＢＳ緩衝液にて洗浄した。これに対して１％濃度のＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５μｌ量の１０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液を加え、細胞を懸濁した後、バス型超音波
破砕装置を用いて細胞を破砕した。受容体糖鎖（ピリジ
ルアミノ化ガラクトシルバイアンテナ）１２．５ｍＭを
含む２０μｌ量の反応溶液（１０ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａ
ｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１２．５ｍ
Ｍ ＭｎＣｌ2、４１．２５ｍＭ ＮａＣｌ、３．７５ｍ
Ｍ ＫＣｌ、及び７．０ｍＭ濃度のγ−ラクトンを含
む）を上記細胞破砕液に対して添加し、３７℃にて加温
した。これより経時的に５μｌを反応停止液に対してサ
ンプリングし、Ｓｈｉｍ−ｐａｋ ＣＬＣ−ＯＤＳカラ
ムを用いたＨＰＬＣにより分析し、受容体糖鎖残存率の
対数値を反応時間に対してプロットした傾きによりＧａ
ｌＴ活性量を反応速度として算出した。この結果ＩｇＭ
生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５のＧａｌＴ活性量及びそ
のときの細胞増殖の推移は図３ａ（図３）に記したとお
りであった。
【００２０】２．ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５
の生産するモノクローナルＩｇＭ糖鎖構造の解析 ２−１．ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５の培養 先に測定された酵素活性量存在下において糖蛋白質Ｉｇ
Ｍに対して結合される糖鎖の構造を検討するため、上記
ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５を培養し、ＩｇＭ
を含む培養上清を得た。具体的には、２％濃度のＦＣＳ
を含む改変ＮＹＳＦ培地 ５００ｍｌを有する２ｌのコ
ーン型沈降管付培養槽３台に対して５×１０5ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌになるよう各細胞を播種し、３７℃、ｐＨ７．
０、溶存酸素濃度２．０ｐｐｍの条件下に置き、２日目
以降１ＶＶＤで灌流培養した。細胞播種後６日目より２
日間ＦＣＳを含まない上記の培地に交換し、それぞれ１
０日目より１４日目までＩｇＭを含む培養上清、計２．
５ｌを取得し、この培養上清中に、約２０ｍｇのＩｇＭ
を得た（以下ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５より
得られるＩｇＭをＩｇＭ−ａとする）。 培養上清を濾
過して不溶物を除去した後、該濾液を限外濾過により濃
縮し、これに対して飽和硫酸アンモニウム溶液を等量添
加することにより沈澱画分を得た。得られた沈澱画分を
０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）１２ｍｌに再溶解し、同一の緩衝
液で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィーカラムに供
してＩｇＭ−ａを精製した。
の生産するモノクローナルＩｇＭ糖鎖構造の解析 ２−１．ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５の培養 先に測定された酵素活性量存在下において糖蛋白質Ｉｇ
Ｍに対して結合される糖鎖の構造を検討するため、上記
ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５を培養し、ＩｇＭ
を含む培養上清を得た。具体的には、２％濃度のＦＣＳ
を含む改変ＮＹＳＦ培地 ５００ｍｌを有する２ｌのコ
ーン型沈降管付培養槽３台に対して５×１０5ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌになるよう各細胞を播種し、３７℃、ｐＨ７．
０、溶存酸素濃度２．０ｐｐｍの条件下に置き、２日目
以降１ＶＶＤで灌流培養した。細胞播種後６日目より２
日間ＦＣＳを含まない上記の培地に交換し、それぞれ１
０日目より１４日目までＩｇＭを含む培養上清、計２．
５ｌを取得し、この培養上清中に、約２０ｍｇのＩｇＭ
を得た（以下ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５より
得られるＩｇＭをＩｇＭ−ａとする）。 培養上清を濾
過して不溶物を除去した後、該濾液を限外濾過により濃
縮し、これに対して飽和硫酸アンモニウム溶液を等量添
加することにより沈澱画分を得た。得られた沈澱画分を
０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）１２ｍｌに再溶解し、同一の緩衝
液で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィーカラムに供
してＩｇＭ−ａを精製した。
【００２１】２−２．各結合部位の糖鎖の調製 精製されたＩｇＭ−ａを凍結乾燥した後、凍結乾燥試料
を８Ｍ 尿素の存在下で２０ｍＭ濃度のジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）にてＳ−Ｓ結合を還元処理し、ＤＴＴに
対して３倍濃度になるようにヨード酢酸を加え、ＳＨ基
を修飾保護した。反応液を、ゲル濾過クロマトグラフィ
ーカラムに供して目的の糖鎖が結合する重鎖を精製し
た。得られた重鎖をリジルエンドペプチダーゼ消化した
後、逆相ＨＰＬＣによりペプチドを分離し、オルシノー
ル硫酸法及びＬＣ−ＭＳ、アミノ酸シークエンサーを用
いて糖ペプチドの溶出される画分を確認、同定した。そ
の結果、Ｎ１６７の付加したペプチド及びＮ５６０の付
加したペプチドを含む画分、リジルエンドペプチダーゼ
消化により切断を受けないＮ３９３とＮ４００の付加し
たペプチドを含む画分、Ｎ３３０の付加したペプチドを
含む画分を認めた。２種の糖ペプチドを含む画分は、更
にトリプシンによる消化を行い逆相ＨＰＬＣにより各糖
ペプチドを個別に単離した。また、Ｎ３９３とＮ４００
の付加したペプチドを含む画分については、Ｖ８プロテ
アーゼ消化した後、同じく逆相ＨＰＬＣによりそれぞれ
の糖ペプチドを単離した。この様にして精製した５種の
糖ペプチドは、アミノ酸配列から予想される糖鎖結合配
列を有する目的の糖ペプチドとして均一であることをア
ミノシークエンサーを用いて確認した。各糖ペプチドか
ら、公知であるアーモンド由来グリコペプチダーゼＡ
（Sugiyama,K. et al., Biochem.Biophys.Res.Commun.,
vol.112, p.115, （1983））及びヒドラジン分解（Tak
asaki,S., et al., Methods in Enzymology （Ginsbur
g,V,ed.）（Academic Press,New York） vol.83, p.26
3, （1982））を用いて糖鎖を切り出し、各結合部位の
糖鎖を精製した。得られた各糖鎖は、２−アミノピリジ
ンを用いた公知の方法（Hase,S. et al., J.Biochem.
（Tokyo）, vol.100, p.1, （1986））にてピリジルア
ミノ（以下ＰＡと記載する）化し、蛍光標識した。標識
化された糖鎖（以下ＰＡ化糖鎖と記載する）は、Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−１５（ファルマシア社製）を担体とし
たゲル濾過クロマトグラフィーカラムを用いて精製し、
以下の分析に用いた。
を８Ｍ 尿素の存在下で２０ｍＭ濃度のジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）にてＳ−Ｓ結合を還元処理し、ＤＴＴに
対して３倍濃度になるようにヨード酢酸を加え、ＳＨ基
を修飾保護した。反応液を、ゲル濾過クロマトグラフィ
ーカラムに供して目的の糖鎖が結合する重鎖を精製し
た。得られた重鎖をリジルエンドペプチダーゼ消化した
後、逆相ＨＰＬＣによりペプチドを分離し、オルシノー
ル硫酸法及びＬＣ−ＭＳ、アミノ酸シークエンサーを用
いて糖ペプチドの溶出される画分を確認、同定した。そ
の結果、Ｎ１６７の付加したペプチド及びＮ５６０の付
加したペプチドを含む画分、リジルエンドペプチダーゼ
消化により切断を受けないＮ３９３とＮ４００の付加し
たペプチドを含む画分、Ｎ３３０の付加したペプチドを
含む画分を認めた。２種の糖ペプチドを含む画分は、更
にトリプシンによる消化を行い逆相ＨＰＬＣにより各糖
ペプチドを個別に単離した。また、Ｎ３９３とＮ４００
の付加したペプチドを含む画分については、Ｖ８プロテ
アーゼ消化した後、同じく逆相ＨＰＬＣによりそれぞれ
の糖ペプチドを単離した。この様にして精製した５種の
糖ペプチドは、アミノ酸配列から予想される糖鎖結合配
列を有する目的の糖ペプチドとして均一であることをア
ミノシークエンサーを用いて確認した。各糖ペプチドか
ら、公知であるアーモンド由来グリコペプチダーゼＡ
（Sugiyama,K. et al., Biochem.Biophys.Res.Commun.,
vol.112, p.115, （1983））及びヒドラジン分解（Tak
asaki,S., et al., Methods in Enzymology （Ginsbur
g,V,ed.）（Academic Press,New York） vol.83, p.26
3, （1982））を用いて糖鎖を切り出し、各結合部位の
糖鎖を精製した。得られた各糖鎖は、２−アミノピリジ
ンを用いた公知の方法（Hase,S. et al., J.Biochem.
（Tokyo）, vol.100, p.1, （1986））にてピリジルア
ミノ（以下ＰＡと記載する）化し、蛍光標識した。標識
化された糖鎖（以下ＰＡ化糖鎖と記載する）は、Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−１５（ファルマシア社製）を担体とし
たゲル濾過クロマトグラフィーカラムを用いて精製し、
以下の分析に用いた。
【００２２】２−３．陰イオン交換クロマトグラフィー
カラムを用いたシアル酸分析 各結合部位のＰＡ化糖鎖は、まず陰イオン交換カラム
ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（内径５ｍｍ×長さ５０ｍｍ、
ファルマシア社製）を用いて、非還元末端に存在するシ
アル酸残基数の違いにより分離、分析した。ＩｇＭ−ａ
より得たアミノ末端側の３種類の糖鎖（Ｎ１６７、Ｎ３
３０、Ｎ３９３）は、負電荷によって１つの中性画分と
３つの酸性画分に分離された。この大部分を占める酸性
画分は、Arthrobacter ureafaciens由来のシアリダーゼ
（ナカライテスク社製）処理により全量が中性画分に移
行した。また、カルボキシル末端側の２種類の糖鎖（Ｎ
４００、Ｎ５６０）はそのほぼ全量が中性画分に溶出し
た。ＩｇＭ−ａから得られたＰＡ化糖鎖についての陰イ
オン交換ＨＰＬＣの結果を図４ａ（図６）に、また図４
ａ（図６）のピーク面積より定量して得られる各結合部
位毎のシアル酸が０〜３残基である糖鎖の含有率を表１
ａ（表１）に示す。
カラムを用いたシアル酸分析 各結合部位のＰＡ化糖鎖は、まず陰イオン交換カラム
ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（内径５ｍｍ×長さ５０ｍｍ、
ファルマシア社製）を用いて、非還元末端に存在するシ
アル酸残基数の違いにより分離、分析した。ＩｇＭ−ａ
より得たアミノ末端側の３種類の糖鎖（Ｎ１６７、Ｎ３
３０、Ｎ３９３）は、負電荷によって１つの中性画分と
３つの酸性画分に分離された。この大部分を占める酸性
画分は、Arthrobacter ureafaciens由来のシアリダーゼ
（ナカライテスク社製）処理により全量が中性画分に移
行した。また、カルボキシル末端側の２種類の糖鎖（Ｎ
４００、Ｎ５６０）はそのほぼ全量が中性画分に溶出し
た。ＩｇＭ−ａから得られたＰＡ化糖鎖についての陰イ
オン交換ＨＰＬＣの結果を図４ａ（図６）に、また図４
ａ（図６）のピーク面積より定量して得られる各結合部
位毎のシアル酸が０〜３残基である糖鎖の含有率を表１
ａ（表１）に示す。
【００２３】
【表１】 この結果から、ＩｇＭ−ａのアミノ末端側３糖鎖は大部
分がα２−６結合のシアル酸を１〜３残基を有してお
り、カルボキシル末端側２糖鎖は、ほとんどがシアル酸
を持たない中性糖鎖であった。
分がα２−６結合のシアル酸を１〜３残基を有してお
り、カルボキシル末端側２糖鎖は、ほとんどがシアル酸
を持たない中性糖鎖であった。
【００２４】２−４．各結合部位の糖鎖の構造解析 各結合部位のＰＡ化糖鎖を上記シアリダーゼを用いて消
化し、中性化した（シアル酸を脱離した）画分を先の陰
イオン交換カラムを用いて分取した。得られた中性糖鎖
を逆相カラム Ｓｈｉｍ−ｐａｃ ＣＬＣ−ＯＤＳ（内
径６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、島津製作所製）にて分離す
るとともに、このクロマトグラムの示すパターンからそ
れぞれの糖鎖結合部位に含まれる各糖鎖成分の定量を行
った。この時の各ピーク成分の糖鎖構造は、順相カラム
と逆相カラムを使用したフィンガープリントによる２次
元糖鎖マップ（高橋禮子, 糖蛋白質糖鎖研究法 生化学
実験法23, 学会出版センター, （1989））（高橋禮子
他, 蛋白質核酸酵素増刊, 共立出版, vol.37, p.2117,
（1992））により同定した。また、それぞれの構造を確
認するため、各成分の糖鎖を各種のエキソグリコシダー
ゼ（ウシ腎臓由来のα−Ｌ−フコシダーゼ（Boehringer
Mannheim社製）、ナタマメ由来のβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼまたはβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（生
化学工業株式会社製））を用いて逐次消化後、消化産物
の挙動を同様に２次元糖鎖マップ上で解析した。試料糖
鎖構造と同一の標準ＰＡ化糖鎖が市販されているものに
ついては両者を逆相カラムへ共打ちすることにより、単
一ピークの出現を確認した。この時の逆相ＨＰＬＣのク
ロマトグラムを図５ａ（図８）に、また同定されたクロ
マトグラム（図５ａ（図８））中のピークＡ〜Ｇの推定
構造及びこのピーク面積より定量した各結合部位に於け
るその存在率を表２（表２）に示す。
化し、中性化した（シアル酸を脱離した）画分を先の陰
イオン交換カラムを用いて分取した。得られた中性糖鎖
を逆相カラム Ｓｈｉｍ−ｐａｃ ＣＬＣ−ＯＤＳ（内
径６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、島津製作所製）にて分離す
るとともに、このクロマトグラムの示すパターンからそ
れぞれの糖鎖結合部位に含まれる各糖鎖成分の定量を行
った。この時の各ピーク成分の糖鎖構造は、順相カラム
と逆相カラムを使用したフィンガープリントによる２次
元糖鎖マップ（高橋禮子, 糖蛋白質糖鎖研究法 生化学
実験法23, 学会出版センター, （1989））（高橋禮子
他, 蛋白質核酸酵素増刊, 共立出版, vol.37, p.2117,
（1992））により同定した。また、それぞれの構造を確
認するため、各成分の糖鎖を各種のエキソグリコシダー
ゼ（ウシ腎臓由来のα−Ｌ−フコシダーゼ（Boehringer
Mannheim社製）、ナタマメ由来のβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼまたはβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（生
化学工業株式会社製））を用いて逐次消化後、消化産物
の挙動を同様に２次元糖鎖マップ上で解析した。試料糖
鎖構造と同一の標準ＰＡ化糖鎖が市販されているものに
ついては両者を逆相カラムへ共打ちすることにより、単
一ピークの出現を確認した。この時の逆相ＨＰＬＣのク
ロマトグラムを図５ａ（図８）に、また同定されたクロ
マトグラム（図５ａ（図８））中のピークＡ〜Ｇの推定
構造及びこのピーク面積より定量した各結合部位に於け
るその存在率を表２（表２）に示す。
【００２５】
【表２】 その結果、各結合部位に含まれるそれぞれの糖鎖の含有
率にはわずかな違いが見られるものの、ＩｇＭ生産Ｂ細
胞株 ＭＰ−５０４５由来ＩｇＭ−ａのアミノ末端側３
箇所に主要に含まれる糖鎖（Ｎ１６７、Ｎ３３０、Ｎ３
９３）は、その還元末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基
にフコースが結合した複合型二本鎖構造（表２（表２）
中の推定構造Ａ〜Ｃ）であり、非還元末端のガラクトー
ス残基及びバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン
残基の有無により微細に不均一であることが判明した。
一方、カルボキシル末端側２箇所に主要に含まれる糖鎖
（Ｎ４００、Ｎ５６０）はマンノース５残基から８残基
を有する高マンノース型の糖鎖（表２（表２）中の推定
構造Ｄ〜Ｇ）であった。
率にはわずかな違いが見られるものの、ＩｇＭ生産Ｂ細
胞株 ＭＰ−５０４５由来ＩｇＭ−ａのアミノ末端側３
箇所に主要に含まれる糖鎖（Ｎ１６７、Ｎ３３０、Ｎ３
９３）は、その還元末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基
にフコースが結合した複合型二本鎖構造（表２（表２）
中の推定構造Ａ〜Ｃ）であり、非還元末端のガラクトー
ス残基及びバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン
残基の有無により微細に不均一であることが判明した。
一方、カルボキシル末端側２箇所に主要に含まれる糖鎖
（Ｎ４００、Ｎ５６０）はマンノース５残基から８残基
を有する高マンノース型の糖鎖（表２（表２）中の推定
構造Ｄ〜Ｇ）であった。
【００２６】実施例２ ヒトミエローマＰ１０９株 Ｍ
Ｐ−５０６２における酵素活性量の定量 ヒトミエローマＰ１０９株 ＭＰ−５０６２における細
胞内ＧａｌＴ活性量を先に述べた方法にて測定した。そ
の結果、本ヒトミエローマ株のＧａｌＴ活性量は、先の
ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５に比べ、２倍以上
高い値を示した（図３ｂ（図４））。
Ｐ−５０６２における酵素活性量の定量 ヒトミエローマＰ１０９株 ＭＰ−５０６２における細
胞内ＧａｌＴ活性量を先に述べた方法にて測定した。そ
の結果、本ヒトミエローマ株のＧａｌＴ活性量は、先の
ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５に比べ、２倍以上
高い値を示した（図３ｂ（図４））。
【００２７】実施例３ １．細胞融合法による糖蛋白質の糖鎖構造の改変 実施例１に記載のＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５
と実施例２に記載のヒトミエローマＰ１０９株 ＭＰ−
５０６２をポリエチレングリコールを用いた方法により
細胞融合（Campling,B.G. et al., The EBV hybridoma
technique andits applications. In Human Hybridoma
s, Marcel Dekker, Inc., New York. （1987））し、Ｉ
ｇＭを生産するヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５
０９７（本細胞株は通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１４９７８として寄
託されている）を得た。上記で得られたヒト−ヒトハイ
ブリドーマ株 ＭＰ−５０９７の酵素活性を実施例１に
示した方法により測定した。結果を図３ｃ（図５）に示
す。本細胞株のＧａｌＴ活性量はヒトミエローマＰ１０
９株 ＭＰ−５０６２のそれと同等であり、ＩｇＭ生産
Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５よりも２倍以上高い値を示し
た。このことから今回の細胞融合により本ＩｇＭ生産細
胞株のＧａｌＴ活性量が変化したことがわかる。
と実施例２に記載のヒトミエローマＰ１０９株 ＭＰ−
５０６２をポリエチレングリコールを用いた方法により
細胞融合（Campling,B.G. et al., The EBV hybridoma
technique andits applications. In Human Hybridoma
s, Marcel Dekker, Inc., New York. （1987））し、Ｉ
ｇＭを生産するヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５
０９７（本細胞株は通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１４９７８として寄
託されている）を得た。上記で得られたヒト−ヒトハイ
ブリドーマ株 ＭＰ−５０９７の酵素活性を実施例１に
示した方法により測定した。結果を図３ｃ（図５）に示
す。本細胞株のＧａｌＴ活性量はヒトミエローマＰ１０
９株 ＭＰ−５０６２のそれと同等であり、ＩｇＭ生産
Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５よりも２倍以上高い値を示し
た。このことから今回の細胞融合により本ＩｇＭ生産細
胞株のＧａｌＴ活性量が変化したことがわかる。
【００２８】２．ヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−
５０９７の生産するモノクローナルＩｇＭ糖鎖構造の解
析 上記１において確認された酵素活性量の変化が糖鎖構造
に反映されるか否かを検討するため、上記融合後のヒト
−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５０９７を培養してＩ
ｇＭを含む培養上清を取得し、得られたＩｇＭの糖鎖構
造を解析した（以下本ＩｇＭをＩｇＭ−ｂと記載す
る）。細胞株の培養、及びＩｇＭ各結合部位糖鎖の調
製、構造解析の方法等、実験の詳細に関しては実施例１
と同様に行った。
５０９７の生産するモノクローナルＩｇＭ糖鎖構造の解
析 上記１において確認された酵素活性量の変化が糖鎖構造
に反映されるか否かを検討するため、上記融合後のヒト
−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５０９７を培養してＩ
ｇＭを含む培養上清を取得し、得られたＩｇＭの糖鎖構
造を解析した（以下本ＩｇＭをＩｇＭ−ｂと記載す
る）。細胞株の培養、及びＩｇＭ各結合部位糖鎖の調
製、構造解析の方法等、実験の詳細に関しては実施例１
と同様に行った。
【００２９】２−１．陰イオン交換クロマトグラフィー
カラムを用いたシアル酸分析 ヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５０９７より得ら
れたＩｇＭ−ｂのアミノ末端側の３種類の糖鎖（Ｎ１６
７、Ｎ３３０、Ｎ３９３）は、ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 Ｍ
Ｐ−５０４５より得られたＩｇＭ−ａと同様、負電荷に
よって１つの中性画分と３つの酸性画分に分離され（図
４ｂ（図７））、α２−６結合のシアル酸１〜３残基を
有していることが確認された。また、カルボキシル末端
側の２種類の糖鎖（Ｎ４００、Ｎ５６０）はそのほぼ全
量が中性画分に溶出した（図４ｂ（図７））。図４ｂ
（図７）のピーク面積より定量して得られる各結合部位
毎のシアル酸が０〜３残基である糖鎖の含有率を表１ｂ
（表３）に示す。
カラムを用いたシアル酸分析 ヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５０９７より得ら
れたＩｇＭ−ｂのアミノ末端側の３種類の糖鎖（Ｎ１６
７、Ｎ３３０、Ｎ３９３）は、ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 Ｍ
Ｐ−５０４５より得られたＩｇＭ−ａと同様、負電荷に
よって１つの中性画分と３つの酸性画分に分離され（図
４ｂ（図７））、α２−６結合のシアル酸１〜３残基を
有していることが確認された。また、カルボキシル末端
側の２種類の糖鎖（Ｎ４００、Ｎ５６０）はそのほぼ全
量が中性画分に溶出した（図４ｂ（図７））。図４ｂ
（図７）のピーク面積より定量して得られる各結合部位
毎のシアル酸が０〜３残基である糖鎖の含有率を表１ｂ
（表３）に示す。
【００３０】
【表３】 この結果から、ヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５
０９７由来ＩｇＭ−ｂのアミノ末端側３種類の糖鎖に含
まれるシアル酸量はＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４
５由来ＩｇＭ−ａのアミノ末端側３種類の糖鎖に含まれ
るシアル酸量よりわずかに高い値を示すことが明らかと
なった。
０９７由来ＩｇＭ−ｂのアミノ末端側３種類の糖鎖に含
まれるシアル酸量はＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４
５由来ＩｇＭ−ａのアミノ末端側３種類の糖鎖に含まれ
るシアル酸量よりわずかに高い値を示すことが明らかと
なった。
【００３１】２−２．各結合部位の糖鎖の構造解析 ＩｇＭ−ｂより得た各結合部位のＰＡ化糖鎖を上記シア
リダーゼを用いて消化し、得られた中性糖鎖を逆相カラ
ム（実施例１参照）を用いて分離するとともに、このク
ロマトグラムの示すパターンからそれぞれの糖鎖結合部
位に含まれる各糖鎖成分の定量を行った。また、この時
の各ピーク成分の糖鎖構造は、先と同様に順相カラムと
逆相カラムを使用したフィンガープリントによる２次元
糖鎖マップにより同定した。この時の逆相ＨＰＬＣのク
ロマトグラムを図５ｂ（図９）に、また同定されたクロ
マトグラム（図５ｂ（図９））中のピークＡ〜Ｇの推定
構造及びこのピーク面積より定量した各結合部位に於け
るその存在率を表２（表３）に示す。その結果、ＩｇＭ
生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５由来のＩｇＭ−ａとヒト
−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５０９７由来のＩｇＭ
−ｂの糖鎖構造は明らかに異なることが判明した。Ｉｇ
Ｍ−ａのアミノ末端側３種類の糖鎖には非還元末端のガ
ラクトースが一部付加されない二本鎖の複合型糖鎖（表
２（表２）中の推定構造Ｂ）が含まれたにもかかわら
ず、ＩｇＭ−ｂのアミノ末端側３種類の糖鎖には非還元
末端ガラクトースの欠損した糖鎖は全く含まれずガラク
トシル化が完全に行われていた。このことから先のシア
ル酸含有量の違いは、このような非還元末端のガラクト
ース付加率の差異によると思われた。また上記の結果
は、用いたＩｇＭ生産Ｂ細胞株ＭＰ−５０４５に比べて
高いＧａｌＴ活性量を有したヒトミエローマＰ１０９株
ＭＰ−５０６２を細胞融合させることにより、より酵素
活性の高い糖蛋白質ＩｇＭの生産株であるヒト−ヒトハ
イブリドーマ株 ＭＰ−５０９７が得られ、これにより
ＩｇＭのガラクトース付加率が向上したことを示してい
る。一方、ＩｇＭ−ｂではＩｇＭ−ａに比べて複合型２
本鎖糖鎖（表２（表２）中の推定構造Ａ〜Ｃ）の内バイ
セクティングＮ−アセチルグルコサミン構造を有する糖
鎖（表２（表２）中の推定構造Ｃ）の占める割合が低い
こと、及びＮ４００、Ｎ５６０の高マンノース型糖鎖の
組成（表２（表２）中の推定構造Ｄ〜Ｇ）が異なること
が明らかとなった。このような変化についても、ヒトミ
エローマＰ１０９株 ＭＰ−５０６２との細胞融合がも
たらした結果である。以上のことより、ＩｇＭ−ａ生産
細胞株とＩｇＭ−ｂ生産細胞株の酵素活性量の変化と、
それぞれの細胞株から得られるＩｇＭ−ａとＩｇＭ−ｂ
の糖鎖構造の変化には相関性があることが証明された。
リダーゼを用いて消化し、得られた中性糖鎖を逆相カラ
ム（実施例１参照）を用いて分離するとともに、このク
ロマトグラムの示すパターンからそれぞれの糖鎖結合部
位に含まれる各糖鎖成分の定量を行った。また、この時
の各ピーク成分の糖鎖構造は、先と同様に順相カラムと
逆相カラムを使用したフィンガープリントによる２次元
糖鎖マップにより同定した。この時の逆相ＨＰＬＣのク
ロマトグラムを図５ｂ（図９）に、また同定されたクロ
マトグラム（図５ｂ（図９））中のピークＡ〜Ｇの推定
構造及びこのピーク面積より定量した各結合部位に於け
るその存在率を表２（表３）に示す。その結果、ＩｇＭ
生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５由来のＩｇＭ−ａとヒト
−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５０９７由来のＩｇＭ
−ｂの糖鎖構造は明らかに異なることが判明した。Ｉｇ
Ｍ−ａのアミノ末端側３種類の糖鎖には非還元末端のガ
ラクトースが一部付加されない二本鎖の複合型糖鎖（表
２（表２）中の推定構造Ｂ）が含まれたにもかかわら
ず、ＩｇＭ−ｂのアミノ末端側３種類の糖鎖には非還元
末端ガラクトースの欠損した糖鎖は全く含まれずガラク
トシル化が完全に行われていた。このことから先のシア
ル酸含有量の違いは、このような非還元末端のガラクト
ース付加率の差異によると思われた。また上記の結果
は、用いたＩｇＭ生産Ｂ細胞株ＭＰ−５０４５に比べて
高いＧａｌＴ活性量を有したヒトミエローマＰ１０９株
ＭＰ−５０６２を細胞融合させることにより、より酵素
活性の高い糖蛋白質ＩｇＭの生産株であるヒト−ヒトハ
イブリドーマ株 ＭＰ−５０９７が得られ、これにより
ＩｇＭのガラクトース付加率が向上したことを示してい
る。一方、ＩｇＭ−ｂではＩｇＭ−ａに比べて複合型２
本鎖糖鎖（表２（表２）中の推定構造Ａ〜Ｃ）の内バイ
セクティングＮ−アセチルグルコサミン構造を有する糖
鎖（表２（表２）中の推定構造Ｃ）の占める割合が低い
こと、及びＮ４００、Ｎ５６０の高マンノース型糖鎖の
組成（表２（表２）中の推定構造Ｄ〜Ｇ）が異なること
が明らかとなった。このような変化についても、ヒトミ
エローマＰ１０９株 ＭＰ−５０６２との細胞融合がも
たらした結果である。以上のことより、ＩｇＭ−ａ生産
細胞株とＩｇＭ−ｂ生産細胞株の酵素活性量の変化と、
それぞれの細胞株から得られるＩｇＭ−ａとＩｇＭ−ｂ
の糖鎖構造の変化には相関性があることが証明された。
【００３２】
【発明の効果】本発明によれば、糖鎖生合成酵素の活性
を適宜調節することにより、糖蛋白質糖鎖の構造を制御
し、目的の種類及び構造を持つ糖鎖及びこれを含む糖蛋
白質をより均一かつ大量に得ることができる。即ち、糖
鎖の種類あるいは構造を改変して特性の変化した糖蛋白
質をより均一に生産すること、あるいは糖鎖の改変によ
って糖蛋白質の生物活性をも変更することが可能であ
る。具体的には、このことにより従来には入手の難しか
った天然に極微量しか存在しない糖蛋白質あるいは天然
にない新規な糖蛋白質を大量に供給することも可能とな
る。また、糖蛋白質を医薬として生産する場合には、該
糖蛋白質に目的の構造を有する糖鎖をより均一に与える
ことにより、例えば生理学的機能が高い糖鎖または半減
期の長い糖鎖、目的の組織に特異的レセプターが存在す
る糖鎖等を多く与えることにより、投与量、投与間隔、
副作用の面でより優れた医薬を製造することができる。
を適宜調節することにより、糖蛋白質糖鎖の構造を制御
し、目的の種類及び構造を持つ糖鎖及びこれを含む糖蛋
白質をより均一かつ大量に得ることができる。即ち、糖
鎖の種類あるいは構造を改変して特性の変化した糖蛋白
質をより均一に生産すること、あるいは糖鎖の改変によ
って糖蛋白質の生物活性をも変更することが可能であ
る。具体的には、このことにより従来には入手の難しか
った天然に極微量しか存在しない糖蛋白質あるいは天然
にない新規な糖蛋白質を大量に供給することも可能とな
る。また、糖蛋白質を医薬として生産する場合には、該
糖蛋白質に目的の構造を有する糖鎖をより均一に与える
ことにより、例えば生理学的機能が高い糖鎖または半減
期の長い糖鎖、目的の組織に特異的レセプターが存在す
る糖鎖等を多く与えることにより、投与量、投与間隔、
副作用の面でより優れた医薬を製造することができる。
【図１】Ｎ−結合型糖鎖に共通に存在する５糖構造トリ
マンノシルコアを示した図である。
マンノシルコアを示した図である。
【図２】糖蛋白質ＩｇＭ単量体の模式図及び重鎖定常領
域に於けるＮ−結合型糖鎖の結合部位を示した図であ
る。
域に於けるＮ−結合型糖鎖の結合部位を示した図であ
る。
【図３】ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５の細胞増
殖とこの時のＧａｌＴ活性量の推移を示した図である。
殖とこの時のＧａｌＴ活性量の推移を示した図である。
【図４】ヒトミエローマＰ１０９株 ＭＰ−５０６２の
細胞増殖とこの時のＧａｌＴ活性量の推移を示した図で
ある。
細胞増殖とこの時のＧａｌＴ活性量の推移を示した図で
ある。
【図５】ヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５０９７
の細胞増殖とこの時のＧａｌＴ活性量の推移を示した図
である。
の細胞増殖とこの時のＧａｌＴ活性量の推移を示した図
である。
【図６】ＩｇＭ−ａの糖鎖結合部位毎に得られたＰＡ化
糖鎖の陰イオン交換ＨＰＬＣに於けるクロマトグラムを
示す図である。
糖鎖の陰イオン交換ＨＰＬＣに於けるクロマトグラムを
示す図である。
【図７】ＩｇＭ−ｂの糖鎖結合部位毎に得られたＰＡ化
糖鎖の陰イオン交換ＨＰＬＣに於けるクロマトグラムを
示す図である。
糖鎖の陰イオン交換ＨＰＬＣに於けるクロマトグラムを
示す図である。
【図８】ＩｇＭ−ａの糖鎖結合部位毎に得られたＰＡ化
糖鎖のシアル酸を脱離した中性化糖鎖を逆相ＨＰＬＣで
分析して得られるクロマトグラムを示す図である。図中
Ａ〜Ｇはそれぞれ表２に於ける推定構造Ａ〜Ｇのピーク
を表す。
糖鎖のシアル酸を脱離した中性化糖鎖を逆相ＨＰＬＣで
分析して得られるクロマトグラムを示す図である。図中
Ａ〜Ｇはそれぞれ表２に於ける推定構造Ａ〜Ｇのピーク
を表す。
【図９】ＩｇＭ−ｂの糖鎖結合部位毎に得られたＰＡ化
糖鎖のシアル酸を脱離した中性化糖鎖を逆相ＨＰＬＣで
分析して得られるクロマトグラムを示す図である。図中
Ａ〜Ｇはそれぞれ表２に於ける推定構造Ａ〜Ｇのピーク
を表す。
糖鎖のシアル酸を脱離した中性化糖鎖を逆相ＨＰＬＣで
分析して得られるクロマトグラムを示す図である。図中
Ａ〜Ｇはそれぞれ表２に於ける推定構造Ａ〜Ｇのピーク
を表す。
図６及び図７中の矢印（↓）：この時使用した標準糖鎖
（宝酒造製）の溶出位置を示す。 図６及び図７中のＮ：中性糖鎖（シアル酸残基数０）で
あることを示す。 図６及び図７中のＭＳ：モノシアリルＰＡ化糖鎖（シア
ル酸残基数１）であることを示す。 図６及び図７中のＤＳ：ジシアリルＰＡ化糖鎖（シアル
酸残基数２）であることを示す。 図６及び図７中のＴＳ：トリシアリルＰＡ化糖鎖（シア
ル酸残基数３）であることを示す。
（宝酒造製）の溶出位置を示す。 図６及び図７中のＮ：中性糖鎖（シアル酸残基数０）で
あることを示す。 図６及び図７中のＭＳ：モノシアリルＰＡ化糖鎖（シア
ル酸残基数１）であることを示す。 図６及び図７中のＤＳ：ジシアリルＰＡ化糖鎖（シアル
酸残基数２）であることを示す。 図６及び図７中のＴＳ：トリシアリルＰＡ化糖鎖（シア
ル酸残基数３）であることを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年１１月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】
【実施例】以下に記す実施例は、糖蛋白質の例としてＩ
ｇＭ生産細胞株の培養によって生産されるＩｇＭの糖鎖
を変更した方法について説明する。 実施例１ １．ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５における酵素
活性量の定量 ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５における細胞内Ｇ
ａｌＴ活性量の測定を行った。本細胞株を１×１０６ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度にて、ＦＣＳを含まない改変
ＮＹＳＦ培地に播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下
で、フラスコを用いて静置培養した。播種後３、４日目
に生細胞数を計測し、各時点で５×１０５の細胞を含む
細胞培養液をサンプリングし、遠心分離にて集めた後、
ＰＢＳ緩衝液にて洗浄した。これに対して１％濃度のＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５μｌ量の１０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液を加え、細胞を懸濁した後、バス型超音
波破砕装置を用いて細胞を破砕した。受容体糖鎖（ピリ
ジルアミノ化ガラクトシルバイアンテナ）１２．５ｍＭ
を含む２０μｌ量の反応溶液（１０ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａ
ｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１２．５ｍ
Ｍ ＭｎＣｌ２、４１．２５ｍＭ ＮａＣｌ、３．７５ｍ
Ｍ ＫＣｌ、及び７．０ｍＭ濃度のγ−ラクトンを含
む）を上記細胞破砕液に対して添加し、３７℃にて加温
した。これより経時的に５μｌを反応停止液に対してサ
ンプリングし、Ｓｈｉｍ−ｐａｋ ＣＬＣ−ＯＤＳカラ
ムを用いたＨＰＬＣにより分析し、受容体糖鎖残存率の
対数値を反応時間に対してプロットした傾きによりＧａ
ｌＴ活性量を反応速度として算出した。この結果ＩｇＭ
生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５のＧａｌＴ活性量及びそ
のときの細胞増殖の推移は図３に記したとおりであっ
た。
ｇＭ生産細胞株の培養によって生産されるＩｇＭの糖鎖
を変更した方法について説明する。 実施例１ １．ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５における酵素
活性量の定量 ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５における細胞内Ｇ
ａｌＴ活性量の測定を行った。本細胞株を１×１０６ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度にて、ＦＣＳを含まない改変
ＮＹＳＦ培地に播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下
で、フラスコを用いて静置培養した。播種後３、４日目
に生細胞数を計測し、各時点で５×１０５の細胞を含む
細胞培養液をサンプリングし、遠心分離にて集めた後、
ＰＢＳ緩衝液にて洗浄した。これに対して１％濃度のＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５μｌ量の１０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液を加え、細胞を懸濁した後、バス型超音
波破砕装置を用いて細胞を破砕した。受容体糖鎖（ピリ
ジルアミノ化ガラクトシルバイアンテナ）１２．５ｍＭ
を含む２０μｌ量の反応溶液（１０ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａ
ｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１２．５ｍ
Ｍ ＭｎＣｌ２、４１．２５ｍＭ ＮａＣｌ、３．７５ｍ
Ｍ ＫＣｌ、及び７．０ｍＭ濃度のγ−ラクトンを含
む）を上記細胞破砕液に対して添加し、３７℃にて加温
した。これより経時的に５μｌを反応停止液に対してサ
ンプリングし、Ｓｈｉｍ−ｐａｋ ＣＬＣ−ＯＤＳカラ
ムを用いたＨＰＬＣにより分析し、受容体糖鎖残存率の
対数値を反応時間に対してプロットした傾きによりＧａ
ｌＴ活性量を反応速度として算出した。この結果ＩｇＭ
生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５のＧａｌＴ活性量及びそ
のときの細胞増殖の推移は図３に記したとおりであっ
た。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】２−３．陰イオン交換クロマトグラフィー
カラムを用いたシアル酸分析 各結合部位のＰＡ化糖鎖は、まず陰イオン交換カラム
ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（内径５ｍｍ×長さ５０ｍｍ、
ファルマシア社製）を用いて、非還元末端に存在するシ
アル酸残基数の違いにより分離、分析した。ＩｇＭ−ａ
より得たアミノ末端側の３種類の糖鎖（Ｎ１６７、Ｎ３
３０、Ｎ３９３）は、負電荷によって１つの中性画分と
３つの酸性画分に分離された。この大部分を占める酸性
画分は、Arthrobacter ureafaciens由来のシアリダーゼ
（ナカライテスク社製）処理により全量が中性画分に移
行した。また、カルボキシル末端側の２種類の糖鎖（Ｎ
４００、Ｎ５６０）はそのほぼ全量が中性画分に溶出し
た。ＩｇＭ−ａから得られたＰＡ化糖鎖についての陰イ
オン交換ＨＰＬＣの結果を図６に、また図６のピーク面
積より定量して得られる各結合部位毎のシアル酸が０〜
３残基である糖鎖の含有率を表１ａ（表１）に示す。
カラムを用いたシアル酸分析 各結合部位のＰＡ化糖鎖は、まず陰イオン交換カラム
ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（内径５ｍｍ×長さ５０ｍｍ、
ファルマシア社製）を用いて、非還元末端に存在するシ
アル酸残基数の違いにより分離、分析した。ＩｇＭ−ａ
より得たアミノ末端側の３種類の糖鎖（Ｎ１６７、Ｎ３
３０、Ｎ３９３）は、負電荷によって１つの中性画分と
３つの酸性画分に分離された。この大部分を占める酸性
画分は、Arthrobacter ureafaciens由来のシアリダーゼ
（ナカライテスク社製）処理により全量が中性画分に移
行した。また、カルボキシル末端側の２種類の糖鎖（Ｎ
４００、Ｎ５６０）はそのほぼ全量が中性画分に溶出し
た。ＩｇＭ−ａから得られたＰＡ化糖鎖についての陰イ
オン交換ＨＰＬＣの結果を図６に、また図６のピーク面
積より定量して得られる各結合部位毎のシアル酸が０〜
３残基である糖鎖の含有率を表１ａ（表１）に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】２−４．各結合部位の糖鎖の構造解析 各結合部位のＰＡ化糖鎖を上記シアリダーゼを用いて消
化し、中性化した（シアル酸を脱離した）画分を先の陰
イオン交換カラムを用いて分取した。得られた中性糖鎖
を逆相カラム Ｓｈｉｍ−ｐａｃ ＣＬＣ−ＯＤＳ（内
径６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、島津製作所製）にて分離す
るとともに、このクロマトグラムの示すパターンからそ
れぞれの糖鎖結合部位に含まれる各糖鎖成分の定量を行
った。この時の各ピーク成分の糖鎖構造は、順相カラム
と逆相カラムを使用したフィンガープリントによる２次
元糖鎖マップ（高橋禮子, 糖蛋白質糖鎖研究法 生化学
実験法23, 学会出版センター, (1989)）（高橋禮子他,
蛋白質核酸酵素増刊， 共立出版, vol.37, p.2117, (1
992)）により同定した。また、それぞれの構造を確認す
るため、各成分の糖鎖を各種のエキソグリコシダーゼ
（ウシ腎臓由来のα−Ｌ−フコシダーゼ（Boehringer M
annheim社製）、ナタマメ由来のβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼまたはβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（生化
学工業株式会社製））を用いて逐次消化後、消化産物の
挙動を同様に２次元糖鎖マップ上で解析した。試料糖鎖
構造と同一の標準ＰＡ化糖鎖が市販されているものにつ
いては両者を逆相カラムへ共打ちすることにより、単一
ピークの出現を確認した。この時の逆相ＨＰＬＣのクロ
マトグラムを図８に、また同定されたクロマトグラム
（図８）中のピークＡ〜Ｇの推定構造及びこのピーク面
積より定量した各結合部位に於けるその存在率を表２
（表２）に示す。
化し、中性化した（シアル酸を脱離した）画分を先の陰
イオン交換カラムを用いて分取した。得られた中性糖鎖
を逆相カラム Ｓｈｉｍ−ｐａｃ ＣＬＣ−ＯＤＳ（内
径６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、島津製作所製）にて分離す
るとともに、このクロマトグラムの示すパターンからそ
れぞれの糖鎖結合部位に含まれる各糖鎖成分の定量を行
った。この時の各ピーク成分の糖鎖構造は、順相カラム
と逆相カラムを使用したフィンガープリントによる２次
元糖鎖マップ（高橋禮子, 糖蛋白質糖鎖研究法 生化学
実験法23, 学会出版センター, (1989)）（高橋禮子他,
蛋白質核酸酵素増刊， 共立出版, vol.37, p.2117, (1
992)）により同定した。また、それぞれの構造を確認す
るため、各成分の糖鎖を各種のエキソグリコシダーゼ
（ウシ腎臓由来のα−Ｌ−フコシダーゼ（Boehringer M
annheim社製）、ナタマメ由来のβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼまたはβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（生化
学工業株式会社製））を用いて逐次消化後、消化産物の
挙動を同様に２次元糖鎖マップ上で解析した。試料糖鎖
構造と同一の標準ＰＡ化糖鎖が市販されているものにつ
いては両者を逆相カラムへ共打ちすることにより、単一
ピークの出現を確認した。この時の逆相ＨＰＬＣのクロ
マトグラムを図８に、また同定されたクロマトグラム
（図８）中のピークＡ〜Ｇの推定構造及びこのピーク面
積より定量した各結合部位に於けるその存在率を表２
（表２）に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２６】実施例２ ヒトミエローマＰ１０９株 Ｍ
Ｐ−５０６２における酵素活性量の定量 ヒトミエローマＰ１０９株 ＭＰ−５０６２における細
胞内ＧａｌＴ活性量を先に述べた方法にて測定した。そ
の結果、本ヒトミエローマ株のＧａｌＴ活性量は、先の
ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５に比べ、２倍以上
高い値を示した（図４）。
Ｐ−５０６２における酵素活性量の定量 ヒトミエローマＰ１０９株 ＭＰ−５０６２における細
胞内ＧａｌＴ活性量を先に述べた方法にて測定した。そ
の結果、本ヒトミエローマ株のＧａｌＴ活性量は、先の
ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５に比べ、２倍以上
高い値を示した（図４）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】実施例３ １．細胞融合法による糖蛋白質の糖鎖構造の改変 実施例１に記載のＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ−５０４５
と実施例２に記載のヒトミエローマＰ１０９株 ＭＰ−
５０６２をポリエチレングリコールを用いた方法により
細胞融合（Campling,B.G. et al., The EBV hybridoma
technique andits applications. In Human Hybridoma
s, Marcel Dekker, Inc., New York. (1987)）し、Ｉｇ
Ｍを生産するヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５０
９７（本細胞株は通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９７８として寄
託されている）を得た。上記で得られたヒト−ヒトハイ
ブリドーマ株 ＭＰ−５０９７の酵素活性を実施例１に
示した方法により測定した。結果を図５に示す。本細胞
株のＧａｌＴ活性量はヒトミエローマＰ１０９株ＭＰ−
５０６２のそれと同等であり、ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 Ｍ
Ｐ−５０４５よりも２倍以上高い値を示した。このこと
から今回の細胞融合により本ＩｇＭ生産細胞株のＧａｌ
Ｔ活性量が変化したことがわかる。
と実施例２に記載のヒトミエローマＰ１０９株 ＭＰ−
５０６２をポリエチレングリコールを用いた方法により
細胞融合（Campling,B.G. et al., The EBV hybridoma
technique andits applications. In Human Hybridoma
s, Marcel Dekker, Inc., New York. (1987)）し、Ｉｇ
Ｍを生産するヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５０
９７（本細胞株は通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９７８として寄
託されている）を得た。上記で得られたヒト−ヒトハイ
ブリドーマ株 ＭＰ−５０９７の酵素活性を実施例１に
示した方法により測定した。結果を図５に示す。本細胞
株のＧａｌＴ活性量はヒトミエローマＰ１０９株ＭＰ−
５０６２のそれと同等であり、ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 Ｍ
Ｐ−５０４５よりも２倍以上高い値を示した。このこと
から今回の細胞融合により本ＩｇＭ生産細胞株のＧａｌ
Ｔ活性量が変化したことがわかる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】２−１．陰イオン交換クロマトグラフィー
カラムを用いたシアル酸分析 ヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５０９７より得ら
れたＩｇＭ−ｂのアミノ末端側の３種類の糖鎖（Ｎ１６
７、Ｎ３３０、Ｎ３９３）は、ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 Ｍ
Ｐ−５０４５より得られたＩｇＭ−ａと同様、負電荷に
よって１つの中性画分と３つの酸性画分に分離され（図
７）、α２−６結合のシアル酸１〜３残基を有している
ことが確認された。また、カルボキシル末端側の２種類
の糖鎖（Ｎ４００、Ｎ５６０）はそのほぼ全量が中性画
分に溶出した（図７）。図７のピーク面積より定量して
得られる各結合部位毎のシアル酸が０〜３残基である糖
鎖の含有率を表１ｂ（表３）に示す。
カラムを用いたシアル酸分析 ヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−５０９７より得ら
れたＩｇＭ−ｂのアミノ末端側の３種類の糖鎖（Ｎ１６
７、Ｎ３３０、Ｎ３９３）は、ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 Ｍ
Ｐ−５０４５より得られたＩｇＭ−ａと同様、負電荷に
よって１つの中性画分と３つの酸性画分に分離され（図
７）、α２−６結合のシアル酸１〜３残基を有している
ことが確認された。また、カルボキシル末端側の２種類
の糖鎖（Ｎ４００、Ｎ５６０）はそのほぼ全量が中性画
分に溶出した（図７）。図７のピーク面積より定量して
得られる各結合部位毎のシアル酸が０〜３残基である糖
鎖の含有率を表１ｂ（表３）に示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】２−２．各結合部位の糖鎖の構造解析 ＩｇＭ−ｂより得た各結合部位のＰＡ化糖鎖を上記シア
リダーゼを用いて消化し、得られた中性糖鎖を逆相カラ
ム（実施例１参照）を用いて分離するとともに、このク
ロマトグラムの示すパターンからそれぞれの糖鎖結合部
位に含まれる各糖鎖成分の定量を行った。また、この時
の各ピーク成分の糖鎖構造は、先と同様に順相カラムと
逆相カラムを使用したフィンガープリントによる２次元
糖鎖マップにより同定した。この時の逆相ＨＰＬＣのク
ロマトグラムを図９に、また同定されたクロマトグラム
（図９）中のピークＡ〜Ｇの推定構造及びこのピーク面
積より定量した各結合部位に於けるその存在率を表２
（表３）に示す。その結果、ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ
−５０４５由来のＩｇＭ−ａとヒト−ヒトハイブリドー
マ株 ＭＰ−５０９７由来のＩｇＭ−ｂの糖鎖構造は明
らかに異なることが判明した。ＩｇＭ−ａのアミノ末端
側３種類の糖鎖には非還元末端のガラクトースが一部付
加されない二本鎖の複合型糖鎖（表２（表２）中の推定
構造Ｂ）が含まれたにもかかわらず、ＩｇＭ−ｂのアミ
ノ末端側３種類の糖鎖には非還元末端ガラクトースの欠
損した糖鎖は全く含まれずガラクトシル化が完全に行わ
れていた。このことから先のシアル酸含有量の違いは、
このような非還元末端のガラクトース付加率の差異によ
ると思われた。また上記の結果は、用いたＩｇＭ生産Ｂ
細胞株ＭＰ−５０４５に比べて高いＧａｌＴ活性量を有
したヒトミエローマＰ１０９株ＭＰ−５０６２を細胞融
合させることにより、より酵素活性の高い糖蛋白質Ｉｇ
Ｍの生産株であるヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−
５０９７が得られ、これによりＩｇＭのガラクトース付
加率が向上したことを示している。一方、ＩｇＭ−ｂで
はＩｇＭ−ａに比べて複合型２本鎖糖鎖（表２（表２）
中の推定構造Ａ〜Ｃ）の内バイセクティングＮ−アセチ
ルグルコサミン構造を有する糖鎖（表２（表２）中の推
定構造Ｃ）の占める割合が低いこと、及びＮ４００、Ｎ
５６０の高マンノース型糖鎖の組成（表２（表２）中の
推定構造Ｄ〜Ｇ）が異なることが明らかとなった。この
ような変化についても、ヒトミエローマＰ１０９株 Ｍ
Ｐ−５０６２との細胞融合がもたらした結果である。以
上のことより、ＩｇＭ−ａ生産細胞株とＩｇＭ−ｂ生産
細胞株の酵素活性量の変化と、それぞれの細胞株から得
られるＩｇＭ−ａとＩｇＭ−ｂの糖鎖構造の変化には相
関性があることが証明された。
リダーゼを用いて消化し、得られた中性糖鎖を逆相カラ
ム（実施例１参照）を用いて分離するとともに、このク
ロマトグラムの示すパターンからそれぞれの糖鎖結合部
位に含まれる各糖鎖成分の定量を行った。また、この時
の各ピーク成分の糖鎖構造は、先と同様に順相カラムと
逆相カラムを使用したフィンガープリントによる２次元
糖鎖マップにより同定した。この時の逆相ＨＰＬＣのク
ロマトグラムを図９に、また同定されたクロマトグラム
（図９）中のピークＡ〜Ｇの推定構造及びこのピーク面
積より定量した各結合部位に於けるその存在率を表２
（表３）に示す。その結果、ＩｇＭ生産Ｂ細胞株 ＭＰ
−５０４５由来のＩｇＭ−ａとヒト−ヒトハイブリドー
マ株 ＭＰ−５０９７由来のＩｇＭ−ｂの糖鎖構造は明
らかに異なることが判明した。ＩｇＭ−ａのアミノ末端
側３種類の糖鎖には非還元末端のガラクトースが一部付
加されない二本鎖の複合型糖鎖（表２（表２）中の推定
構造Ｂ）が含まれたにもかかわらず、ＩｇＭ−ｂのアミ
ノ末端側３種類の糖鎖には非還元末端ガラクトースの欠
損した糖鎖は全く含まれずガラクトシル化が完全に行わ
れていた。このことから先のシアル酸含有量の違いは、
このような非還元末端のガラクトース付加率の差異によ
ると思われた。また上記の結果は、用いたＩｇＭ生産Ｂ
細胞株ＭＰ−５０４５に比べて高いＧａｌＴ活性量を有
したヒトミエローマＰ１０９株ＭＰ−５０６２を細胞融
合させることにより、より酵素活性の高い糖蛋白質Ｉｇ
Ｍの生産株であるヒト−ヒトハイブリドーマ株 ＭＰ−
５０９７が得られ、これによりＩｇＭのガラクトース付
加率が向上したことを示している。一方、ＩｇＭ−ｂで
はＩｇＭ−ａに比べて複合型２本鎖糖鎖（表２（表２）
中の推定構造Ａ〜Ｃ）の内バイセクティングＮ−アセチ
ルグルコサミン構造を有する糖鎖（表２（表２）中の推
定構造Ｃ）の占める割合が低いこと、及びＮ４００、Ｎ
５６０の高マンノース型糖鎖の組成（表２（表２）中の
推定構造Ｄ〜Ｇ）が異なることが明らかとなった。この
ような変化についても、ヒトミエローマＰ１０９株 Ｍ
Ｐ−５０６２との細胞融合がもたらした結果である。以
上のことより、ＩｇＭ−ａ生産細胞株とＩｇＭ−ｂ生産
細胞株の酵素活性量の変化と、それぞれの細胞株から得
られるＩｇＭ−ａとＩｇＭ−ｂの糖鎖構造の変化には相
関性があることが証明された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/10 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 尾前 二三雄 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内 (72)発明者 槇野 正 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内 (72)発明者 島崎 幸雄 東京都千代田区霞が関三丁目２番５号 三 井東圧化学株式会社内
Claims (8)
- 【請求項１】 所望の糖蛋白質を生産する細胞内におい
て、該糖蛋白質の糖鎖結合可能部位に結合している糖鎖
の生合成に関与する一種以上の酵素の活性量を調節する
ことにより、該糖鎖の構造を制御する方法。 - 【請求項２】 所望の糖蛋白質を生産する細胞内におい
て、該糖蛋白質の糖鎖結合可能部位に結合している糖鎖
の生合成に関与する一種以上の酵素の活性量を調節する
ことにより、該糖鎖の構造を制御することを特徴とす
る、糖蛋白質の生産方法。 - 【請求項３】 所望の糖蛋白質を生産する細胞と、該細
胞に比して該糖蛋白質の糖鎖結合可能部位に結合してい
る糖鎖の生合成に関与する一種以上の酵素の活性量が異
なる細胞を融合させることによって、該糖蛋白質を生産
する細胞の該酵素活性量を調節することを特徴とする、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 所望の糖蛋白質を生産する細胞と、該細
胞に比して該糖蛋白質の糖鎖結合可能部位に結合してい
る糖鎖の生合成に関与する一種以上の酵素の活性量が異
なる細胞を融合させることによって、該糖蛋白質を生産
する細胞の該酵素活性量を調節することを特徴とする、
請求項２に記載の生産方法。 - 【請求項５】 糖鎖がＮ−結合型糖鎖であることを特徴
とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 糖鎖がＮ−結合型糖鎖であることを特徴
とする請求項２に記載の生産方法。 - 【請求項７】 糖鎖の生合成に関与する酵素の一つがガ
ラクトース転移酵素であることを特徴とする、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項８】 糖鎖の生合成に関与する酵素の一つがガ
ラクトース転移酵素であることを特徴とする、請求項２
に記載の生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7147165A JPH08336389A (ja) | 1995-06-14 | 1995-06-14 | 糖蛋白質の糖鎖構造を制御する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7147165A JPH08336389A (ja) | 1995-06-14 | 1995-06-14 | 糖蛋白質の糖鎖構造を制御する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08336389A true JPH08336389A (ja) | 1996-12-24 |
Family
ID=15424064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7147165A Pending JPH08336389A (ja) | 1995-06-14 | 1995-06-14 | 糖蛋白質の糖鎖構造を制御する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08336389A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004507613A (ja) * | 2000-09-11 | 2004-03-11 | インダストリア エ コメルシオ デ コスメティコス ナチュラ リミタダ | 非硫酸化フコース・ベースのオリゴ糖混合物、上記混合物を含む化粧用又は医薬組成物、及び化粧品又は薬学におけるその使用 |
| WO2015152658A1 (ko) * | 2014-04-02 | 2015-10-08 | 한화케미칼 주식회사 | 항체의 당 함량 조절을 통한 항체의 제조 방법 |
-
1995
- 1995-06-14 JP JP7147165A patent/JPH08336389A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004507613A (ja) * | 2000-09-11 | 2004-03-11 | インダストリア エ コメルシオ デ コスメティコス ナチュラ リミタダ | 非硫酸化フコース・ベースのオリゴ糖混合物、上記混合物を含む化粧用又は医薬組成物、及び化粧品又は薬学におけるその使用 |
| WO2015152658A1 (ko) * | 2014-04-02 | 2015-10-08 | 한화케미칼 주식회사 | 항체의 당 함량 조절을 통한 항체의 제조 방법 |
| KR20150115066A (ko) * | 2014-04-02 | 2015-10-14 | 한화케미칼 주식회사 | 항체의 당 함량 조절을 통한 항체의 제조 방법 |
| US10808272B2 (en) | 2014-04-02 | 2020-10-20 | Prestige Biopharma Pte. Ltd. | Method for preparing antibody through regulation of sugar content of antibody |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050419 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050817 |