KR20150115066A - 항체의 당 함량 조절을 통한 항체의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 당쇄 함량이 조절된 항체의 제조 방법, 항체의 당 함량을 목표하는 함량으로 조절하여 고품질의 항체 집단(population of antibodies)을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 항체 집단에 관한 것이다. 또한, 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 당쇄 함량을 조절하는 방법에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는, 항체 당쇄 함량 조절용 배지에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항체의 제조 방법을 이용하면, 항체의 당쇄 함량을 조절하여 고품질의 목적하는 항체 집단을 일관적으로 제조할 수 있다. 또한, 바이오 시밀러 개발 측면에서도 본 발명에 의한 방법으로 항체의 당쇄 함량을 조절함으로써 대조약과 동등성을 높인 품질을 갖는 항체를 제조할 수 있으며, 이를 배지 조성물을 통하여 조절함에 따라 조절 방법이 간단해지고 시간적 및 경제적 측면에서 효용성이 높아 항체 제조 분야에서 널리 사용될 수 있다.

Description

항체의 당 함량 조절을 통한 항체의 제조 방법 {A method for preparing an antibody by controlling a sugar content of the antibody}
본 발명은 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 당쇄 함량이 조절된 항체의 제조 방법, 항체의 당 함량을 목표하는 함량으로 조절하여 고품질의 항체 집단(population of antibodies)을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 항체 집단에 관한 것이다. 또한, 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 당쇄 함량을 조절하는 방법에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는, 항체 당쇄 함량 조절용 배지 조성물에 관한 것이다.
최근의 재조합 단백질 의약품 시장에서는 항체 치료제, 즉 단클론 항체(mAbs)와 Fc 융합 단백질이 대세를 이루고 있다.
이러한 항체 관련 약물의 치료 효과는 목적 세포의 신호 전달 체계를 저해하여 세포사멸(apoptosis)을 직접 유도되거나, ADCC(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) 또는 CDC(Complement Dependent Cytotoxicity)와 같은 간접 면역 메커니즘을 통해 유도될 수 있으며, 이런 두 가지 간접 면역 메커니즘을 항체의 "작용 기능(effector functions)"이라고 지칭한다. 신규 항체뿐만 아니라 바이오 베터, 바이오 시밀러 분야에서도 작용 기능은 중요한 이슈이기 때문에 기능 최적화 혹은 작용 기능의 in-vitro 유사성 확보를 위한 연구가 계속 진행되고 있다.
항체의 CDC에 영향을 주는 것은 Fc 부분의 갈락토실화(galactosylation)이며, 갈락토실화 메커니즘에서 갈락토즈(Galactose)는 글리코실화 연쇄 반응(glycosylation chain reaction)의 building block으로 갈락토실 전이효소(galactosyltransferase)에 의해 N-아세틸코사민(N-acetylglucosamine) 당 다음에 붙게 되며, 우리딘(Uridine)은 우리딘 인산화효소(uridine kinase)에 의해 UTP(uridine triphosphate)로 전환된 후 칼락토즈-1인산(galactose-1-P)과 결합하여 갈락토실화 전구체인 UDP-갈락토즈(UDP-galactose)가 된다. 망간(Manganese, Mn2+)는 갈락토실 전이효소의 조효소(cofactor)로 효소의 성능을 향상시키는 역할을 수행한다.
항체의 ADCC를 향상시키기 위한 연구는 크게 항체의 Fc 영역 자체의 engineering과 Fc 영역의 당사슬 변형으로 나눌 수 있다. 본 발명자들은 후자인 Fc 영역의 당사슬 변형에 중점적으로 연구하여, 당 함량을 조절하고자 하였다. 다국적 제약회사 및 선진 바이오 업체들은 당사슬 변형 기술들을 활용하여 effector functions 및 지속성이 향상된 차세대 버전을 출시하여 계속해서 시장을 점유하려는 노력을 기울이고 있는 반면 동종 업계 후발 업체들은 바이오 시밀러 시대에 발맞춰 오리지날 제품과 물리화학적 특성뿐만 아니라 당사슬까지 유사한 바이오 시밀러 제품을 만들고자 노력을 기울이고 있다. 그 이유는 당사슬의 성분 및 구조가 치료 효능과 인체 내 체류 시간, 약리 활성 및 면역 반응 등에 큰 영향을 미치게 되기 때문이다. 이에 바이오 시밀러 제품을 개발하고자 하는 업체들은 오리지날 제품의 당사슬 구조와 가능한 한 유사하게 만들어 동등한 치료 효능과 안정성을 나타내며, 면역 반응과 같은 부작용을 줄이려는 연구를 활발히 진행하고 있다.
이미 여러 문헌들에서 재조합 항체의 Fc region의 당사슬에서 core fucosylation이 ADCC에 중요한 영향을 준다는 보고들이 있으며, 많은 연구자들이 주푸코실화(core fucosylation)를 조절할 수 있는 방법들을 연구하고 있으며, 대표적인 연구 성과는 다음과 같다.
푸코실화 경로(fucosylation pathway)의 전구체(building block)인 GDP-푸코즈(GDP-fucose)의 생합성 과정 및 항체의 주푸코실화에 직접적으로 연관된 효소나 전구체에 대해서는 도 1(Sawa et al., "Glycoproteomic probes for fluorescent imaging of fucosylated glycans in vivo", PNAS, 2006, p12372)에 나타난 바와 같다. 이러한 푸코실화와 직접적으로 연관된 효소나 전구체의 합성을 저해시킴으로써 주푸코실화를 조절하는 방법이 연구되어 왔다.
대표적으로 알려진 주푸코실화 관련 효소 유전자는 GMD(GDP-mannose 4, 6-dehyratase) 유전자와 FUT8(Alpha-1,6-fucosyltransferase) 유전자로, 이 두 유전자의 발현을 저하시키거나, 유전자 수준에서 FUT8 knock-out 시킨 CHO host를 만들어 주푸코실화를 조절하는 방법이 소개된 바 있다((YAMANE-OHNUKI ET AL., "Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity.", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 2004, p614 ~ 622).
주푸코실화를 억제시키는 다른 방법으로는 글리코실화 경로(glycosylation pathway) 상에서 글리코시다제(glycosidase) 류의 억제제(inhibitor)를 첨가하는 방법이 있다(도 2, Hossler et al., "Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture", Glycobiology, 2009, p939). 즉, 당단백질들이 세포 내 ER에서 Golgi로 이동하면서 글루코시다제들과 만노시다제(mannosidase)들에 의해 high mannose trimming 과정을 거치게 되는데, 이때 Kifunensine과 같은 alpha-mannosidase I inhibitor를 첨가하여 oligo-mannose type의 당단백질을 만듦으로써 푸코실화를 억제시키는 방법이다. 이 방법은 세포주 구축 등, 유전자 수준의 조절 방법보다 간단하고, 시간 및 비용 측면에서도 장점이 있다.
또 다른 푸코실화 조절(fucosylation control)하는 방법으로는 배양 공정에서 삼투압을 조절하는 것으로 YB2/0 세포주에서 삼투압이 높을수록 defucosylation level(deFuc%)이 감소시키는 방법(Yoshinobu et al., Cytotechnology, 2012, p249 ~ 265)이 개시되어 있으며, CHO 세포주의 경우 삼투압이 높고 배양 기간이 길어짐에 따라 mannose 5 glycoform이 증가(Efren Pacis et al., BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 2011, p1078 ~ 1088)한다는 보고가 있다. Mannose 5 glycoform이 증가한다는 것은 defucosylation level이 증가한다는 의미와 같다.
한편, 애보트(Abbott) 사의 아달리무맙(adalimumab) 특허 (US 2012/0276631 및 WO 2012/149197)에 망간과 갈락토즈를 이용하는 항체 당쇄 조절에 대한 내용이 개시되어 있으며, 우리딘의 경우 갈락토실화 관련 기 공지된 문헌들은 있으나, 여전히 당쇄 조절에서는 원하는 목표 함량으로의 항체 제조에는 어려움이 있었다.
항체의 당쇄 조절을 통하여 ADCC 활성을 높이는 기술에 대한 개발이 크게 요구되고 있는 배경 하에, 본 발명자들은 바이오 시밀러 항체 의약품 제조시 정제 산물에 항체의 당쇄 함량이 일정하게 유지되는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 배양 공정 첨가물을 개발하여 항체의 당쇄 함량을 원하는 비율로 조절하여 고품질 또는 동등성이 확보된 항체 집단을 일관되게 제조할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 재조합 항체의 생산에 있어서 배양 공정에 첨가물 및 조건을 조절하여 항체의 당쇄 함량(galactosylation, afucosylation)을 조절하는 방법을 통해 항체의 ADCC 활성을 높이고자 한 결과, 글리세롤이 비푸코실화 수준(fucosylation level)을 높이고, 바이오 시밀러 개발의 경우 대조약과 유사한 수준으로 높일 수 있음을 확인하였다. 또한 첨가물로 글리세롤, 망간 및 우리딘을 이용할 수 있음을 확인하고, 다른 배지를 사용하는 구공정 및 새로 최적화한 공정에서도 유사한 효과가 있음을 확인함으로써 상기 첨가물 및 조건이 항체의 당쇄 함량을 조절하여 항체를 제조하는 방법으로 널리 활용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 하나의 목적은 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 당쇄 함량이 조절된 항체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법에 의해 제조된 당쇄 함량이 조절된 항체 집단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 당쇄 함량을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는, 항체 당쇄 함량 조절용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 고품질 또는 동등성이 확보된 항체 집단을 일관되게 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것으로, 배양 배지에 첨가물을 첨가하여 항체의 당쇄 함량을 조절하여 원하는 당쇄 함량을 가지는 항체를 포함하는 항체 집단을 제조하는 방법을 제공하며, 특히 상기 항체의 당쇄 함량의 조절은 갈락토실화(galactosylation) 또는 비푸코실화(afucosylation)을 조절하는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 항체의 생산 공정 중 배양 배지에 글리세롤, 망간 및 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 첨가물을 첨가하여 항체의 갈락토실화, 비푸코실화 또는 갈락토실화/비푸코실화 함량을 조절하는 것일 수 있으며, 특히 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 당쇄 함량이 조절된 항체의 제조 방법일 수 있다. 또한, 본 발명에서 배지는 글리세롤 뿐 아니라 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 망간 및 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질로서, 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원항체 반응을 일으키는 물질을 의미한다. 본 발명의 항체는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 치료용 항체를 모두 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 HER-2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)를 표적으로 하는 항체인 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 퍼투주맙(pertuzumab)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 트라스투주맙(trastuzumab)일 수 있다. 상기 트라스투주맙은 허셉틴(Herceptin)이라고도 하며, 유방암 세포에서 주로 발현되는 HER2/neu에 대한 항체치료제로 알려져 있는 미국 Genentech사에서 개발한 HER2에 대한 인간화 항체이다.
본 발명에서 항체 발현 세포는 목적하는 항체를 발현하는 천연형 또는 형질전환 세포를 제한없이 포함한다. 본 발명의 목적상 당쇄 함량 조절의 대상이 되는 항체를 발현하는 세포일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 트라스투주맙을 발현하는 HD201 세포주(기탁번호: KCTC 12164BP, 기탁일: 2012.03.19, 기탁장소: 한국생명공학연구원/미생물자원센터)일 수 있다. 상기 항체를 생산할 수 있는 세포는 바람직하게는 동물세포일 수 있으며, 예를 들어 중국 햄스터 난소 세포주(CHO)이거나 마우스 골수종 세포주(NSO)일 수 있다.
본 발명에서 용어, "형질전환(transfection)"은 배양 동물 세포에 DNA를 직접 도입하여 세포의 유전형질을 변이시키는 방법으로서, 일반적으로 목적으로하는 유전자를 플라스미드 등의 매개체에 넣어 도입하는 방법을 사용한다. 상기 형질전환은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있으며, 바람직하게는 그 예로 인산칼슘공침법, DEAE-텍스트란처리법, 전기천공법, 재분포법 등이 있다.
본 발명에서 용어, "항체 집단(a population of antibodies)"은 당쇄 함량이 다양할 수 있는 항체들을 포함하는 항체 군을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 항체 집단은 갈락토실화 항체, 비푸코실화 항체, 갈락토실화/비푸코실화 항체를 목적하는 비율로 포함하는 항체 군을 의미한다. 상기 항체 집단은 한 종류의 항체만을 포함하거나, 갈락토실화가 되거나 되지 않은 항체 및 비푸코실화 된 항체나 되지 않은 항체를 모두 포함하는 항체 군을 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 항체 집단은 바람직하게는 본 발명의 제조 방법을 통하여 당쇄 함량 조절된 항체 군을 의미한다.
본 발명에서 당쇄 함량은 갈락토실(Galactosylation) 함량 및 비푸코실(afucosylation) 함량으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 함량일 수 있다.
본 발명에서 갈락토실 함량이란 갈락토즈가 결합된 항체에 함량을 의미하며 비푸코실 함량이란 푸코실 잔기가 제거된 상태의 항체 함량을 의미한다. 갈락토실화와 비푸코실화는 항체의 ADCC 및 CDC에 큰 영향을 미치는 중요한 modification으로 널리 알려져 있다.
바이오 시밀러(Biosimilar)를 개발하기 위해서는 quality(당쇄 함량) 측면에서 대조약과 높은 동등성을 갖는 결과물을 제조하는 것이 가장 중요한 개발 point 중 하나이다.
본 발명자들은 트라스투주맙(Trastuzumab)의 유전자를 이용하여 발현 수득한 재조합 단백질과 대조약(오리지날사 제품)과의 N-글리칸(N-glycan; 갈락토실화 및 비푸코실화, galactosylation and afucosylation)의 유사성을 높이기 위한 연구를 지속적으로 추진하였다. 트라스투주맙을 제조할 경우 배양조건에 따라 N-글리칸들의 함량, 특히 갈락토실 함량 및 비푸코실 함량이 상대적으로 대조약보다 낮은 분포를 가지는 것을 확인하였다. 특히 비푸코실 함량은 항체의 활성(ADCC)에 매우 중요한 지표이기 때문에 비푸코실 함량을 상승시켜 대조약과 동등한 품질로 맞추기 위한 배양 공정 첨가물 연구를 진행하였다.
구체적으로, 본 발명은 신공정 개발 과정에서 생산된 항체의 ADCC(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) 활성을 측정해 본 결과 대조약의 60~80% 수준으로 낮은 것에서 시작되었다. 위에서 언급한 바와 같이 ADCC 활성에 중요한 역할을 하는 비푸코실화 수준(afucosylation level)을 N-글리칸 분석을 통해 확인해본 결과 대조약은 8~10% 범위였고, HD201 항체는 5~7% 범위에 불과한 것을 확인하였다. 이에 따라 본 발명자들은 갈락토실 함량과 비푸코실 함량을 증대하기 위하여 실험을 진행하였다.
본 발명에 앞서 갈락토실화를 유도하기 위해 당전구체를 첨가한 조건 실험을 진행한 결과 분석 결과에서 갈락토실화 효과는 크지 않았지만, 비푸코실화 함량이 높게 나타난 갈락토즈 + 망간(Mn2 +) 조건을 바탕으로 하여 다른 조건에 변화를 주어 당쇄 함량(quality) 변화를 확인하고자 하였다.
이에 따라, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 망간(Mn2 +)과 갈락토즈를 첨가한 조건에 비푸코실화 유도 첨가물을 첨가한 조건과 망간(Mn2 +)과 갈락토즈를 첨가하지 않은 조건에 첨가물을 첨가한 조건으로 나누어 실험을 진행해 본 결과 대조약과의 갈락토실화 수준을 맞추기 위해서는 망간(Mn2 +)과 갈락토즈, 두 원료의 첨가가 필요함을 확인하였으며, 글리세롤이 비푸코실화에 영향을 준다는 것을 확인하였다. 글리세롤과 비푸코실화 현상(afucosylation effect)와 관련된 기술은 기존에 알려진 바 없으며 본 발명자들이 최초로 개발한 것이다.
글리세롤 첨가 적정 농도를 결정하기 위해 0~3.0%(v/v)까지의 농도 범위에서 실험을 실시하였고, 글리세롤 첨가 농도가 증가될수록 항체의 비푸코실화 함량이 함께 증가된다는 것을 확인하였다. 특히 상대적으로 비푸코실 함량은 높이면서, 미첨가 조건 대비 배양 성능은 유사한 농도 범위를 시험한 결과, 글리세롤 농도 범위 1% 내지 2%에서 우수한 효과를 가지는 것을 확인되었다.
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 갈락토즈 함량을 증진시키기 위한 첨가물로 망간과 갈락토즈 외에 대체 가능한 물질을 탐색하여 우리딘을 후보에 선택한 후 실험을 진행하였다. 각각 세 원료들을 단독으로 첨가한 조건들 중에는 망간 첨가 조건들의 G0F ratio와 G1F ratio가 갈락토즈, 우리딘 단독 첨가 조건보다 대조약에 가까운 값을 나타냈기 때문에 망간이 신공정에서 갈락토실화의 주요인자임을 확인할 수 있었다. 한편 우리딘 단독 첨가 조건의 경우 첨가 농도가 증가할수록 갈락토실 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었으나, 고농도 첨가 조건(8 mM)에서 성장 저해 현상 및 발현량 저하 현상이 확인되었기 때문에 배양 초기에 고농도의 우리딘을 첨가하는 것은 신공정에 부적합한 것으로 판단되었다. 비푸코실화 관점에서 망간, 갈락토즈 그리고 우리딘 세 원료를 비교해 본 결과 망간과 갈락토즈는 연관성이 별로 없었으며, 우리딘의 경우 첨가 농도가 증가할수록 비푸코실 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
신공정의 망간, 갈락토즈 및 우리딘 첨가 조건 실험을 통하여 항체의 갈락토실화에 가장 중요한 인자는 망간임을 확인하였으며, 갈락토즈를 우리딘으로 대체하였을 때 갈락토실화와 비푸코실화 측면에서 개선된 공정을 설계할 수 있는 가능성을 발견하였다. 따라서 본 발명자들는 대조약과 갈락토실화 뿐만 아니라 비푸코실화 동등성도 높이기 위해 망간, 우리딘 및 글리세롤 혼합 첨가 조건들을 적용하여 실험하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 지금까지 진행된 첨가물 조건 실험들의 결과를 조합하여 항체(Trastuzumab)가 대조약(Herceptin®)과 가장 유사한 갈락토실화와 푸코실화 패턴이 되도록 조절하기 위하여 실험을 수행하였다. 항체의 당쇄 함량 조절용 첨가물로 갈락토실화 향상의 주요인자 첨가물인 망간과 비푸코실화 유도 첨가물인 글리세롤, 마지막으로 갈락토즈를 대체할 수 있으며, 갈락토실화와 비푸코실화의 보조인자 첨가물인 우리딘을 이용하여 실험을 설계하였다.
우리딘의 경우 고농도로 첨가하면 비푸코실화를 촉진하는 반면 성장 저해에 의한 발현량 저하라는 단점을 확인하였는바, 배양 5일차에 우리딘을 별도로 첨가하여 성장 저해 및 고 만노즈 생성(Growth inhibition 및 high mannose form) 증가를 최소화할 수 있도록 하였다.
망간의 경우 갈락토실화를 촉진하는 효과가 가장 큰 것을 확인하였고, 20 ~ 120μM 농도 범위에서 유사한 효과를 확인하였다. 또한, 글리세롤은 비푸코실화 효과가 확인된 1% 내지 3% 농도 범위에서 유사한 효과를 보이는 것을 확인하였다.
세 가지의 요소를 혼합하여 첨가물을 처리한 결과 우리딘의 경우 갈락토실화을 향상시키는 효과가 확인되어 갈락토즈 대체가 가능할 것으로 판단되었으며, 작지만 비푸코실화를 향상시키는 결과도 확인하였다. 한편, 플라스트 배양 실험에서 대조약(Herceptin® H0717)과 가장 유사한 조건은 40μM 망간 + 1% 글리세롤 조합을 바탕으로 우리딘을 첨가(배양 5일차)하는 조건인 것을 확인하였다.
반면 생물반응기(bioreactor) 배양 실험 결과 본배양 배지에 1%보다는 2% 글리세롤을 첨가해 주는 것이 비푸코실화 관점에서 대조약(Herceptin®)과의 유사성이 높다는 것을 확인할 수 있었다. 비푸코실화 비율에서 대조약을 '1'로 볼 때 임상 1상 시료의 비푸코실화 비율은 0.43이고, 2% 글리세롤 첨가 조건은 0.86으로 대조약 대비로는 약간 낮으나, 임상 1상 시료보다 무려 2배 증가한 것을 확인하였다.
당쇄 조절(galactosylation and afucosylation) 개선 첨가물 생물반응기 조건 실험들의 결과에서 글리세롤 2%를 첨가하였을 때, N-글리칸 profile 상에서 구공정 시료 대비 비푸코실 비율을 높이는데 효과가 있었고, 갈락토실화 측면에서는 망간과 우리딘을 첨가했을 때 갈락토실화 개선 효과를 확인하였다. 그러나 대조약(Herceptin® )과의 완전한 동일성을 보이는 것은 아니므로 글리세롤과 우리딘의 첨가 농도 및 방법을 변경하여 보았다.
우선 글리세롤의 경우 첨가의 효과를 높이기 위하여 유가 배지(feed media)에도 2% 글리세롤을 첨가하여 feeding 하고자 하였다. 우리딘의 경우 갈락토즈를 대체하여 첨가하는 것으로 갈락토실화 효과를 높이기 위하여 첨가하는 농도를 4mM에서 8mM로 높여 첨가하였다. 또한 우리딘을 첨가한 Flask 실험에서 배양 최종일 pH를 측정해본 결과 pH 6.9 수준으로 나타났기 때문에 우리딘 첨가 이후 배양 pH를 pH 6.8에서 pH 6.9로 조절해 주었다. 생물반응기에서는 pH 6.8을 유지하기 위하여 CO2 gas를 공급해주기 때문에 배양 4일차부터 pCO2가 지속적으로 증가하는 경향성이 있으며, 배양 5일차에 100 mmHg 이상으로 급격하게 증가함을 확인한바, pCO2가 높으면 glycosylation에 부정적인 영향을 준다는 문헌(Kimura R, 1997)을 참고하여 배양 5일차에 본배양 pH를 pH 6.9로 높이면 pCO2양이 감소시켰다. 이러한 사항을 반영하여 신공정의 첨가물에 대한 선정으로 3 batches 모두 동일하게 본배양 배지에 당쇄 함량 조절용(quality improvement) 첨가물인 40μM 망간(M) 및 2%(v/v) 글리세롤(Gcr)을 첨가하였으며, 본배양 5일차에 우리딘(Urd) 8mM을 첨가하여 배양을 진행하도록 실험을 설계하였다. 그 결과 40μM 망간과 2% 글리세롤을 바탕으로 8mM 우리딘을 배양 5일차에 첨가하는 조건으로 신공정을 설계하였다. 또한 동일한 조건으로 3 batches 생물반응기 배양을 통해 생산되는 항체의 글리코실화 함량을 확인하였으며, 각 batch 별로 본배양 8일차 시료의 N-글리칸 profile을 구공정과 비교해본 결과 HD201P-1102 ref.(In-house standard)의 갈락토실화(Sum of all oligosaccharide with galactose) %는 33.9%였고, 신공정 3 batches의 갈락토실화 %는 41.8 ~ 42.2%로 8% 정도 높은 수치를 나타내었다. 또한 비푸코실화(Sum of all oligosaccharide without fucose) %의 경우 HD201P-1102 시료가 3.8%였고, 신공정 3 batches는 9.1 ~ 9.5%로 6% 정도 향상된 수치를 나타내었다. 대조약(Herceptin®)과 비교해본 결과 대조약(Herceptin® Lot.H0717)의 갈락토실화 %는 43%로 신공정 3 batches의 갈락토실화 %와의 차이가 2% 미만이었고, 비푸코실화 % 는 8.9%로 신공정과의 차이가 2% 미만으로 나타났기 때문에 대조약과의 동등성 측면에서 그 효과를 확인할 수 있었다. Oligo-mannose type(Sum of all oligosaccharide with mannose)의 경우 대조약은 1.7%로, 신공정의 oligo-mannose type(4%)이 2%가량 높은 것을 확인할 수 있었다.
추가적으로 신공정에서 설계한 당쇄 함량 조절용(quality(Fc N-glycan) improvement) 첨가물(망간, 글리세롤, 우리딘)에 대하여 small scale 생물 반응기에서 구공정(서로 다른 배지 환경)에 동시에 적용하여, 글리코실화 profile (galactosylation /afucosylation)이 조절되는지를 확인하였다. 글리세롤의 경우 신공정에서 본배양 배지와 유가 배지에 모두 2% 글리세롤을 첨가하였으나 이번 실험에서는 글리세롤첨가 농도를 3%로 높여 첨가하였다. 생물반응기 본배양 회수 시료 중 구공정에 첨가물 첨가 조건과 미첨가 조건의 N-글리칸 profile을 비교해본 결과 갈락토실화 %는 첨가물 첨가 조건이 43.8%, 미첨가 조건이 43%로 1%정도 증가한 것을 확인하였다. 비푸코실화 %의 경우 첨가물 첨가 조건이 18.7%, 미첨가 조건이 9.1%로 2배 가량 증가한 것을 확인하였다. 또한, 신공정에 첨가물 첨가 조건과 미첨가 조건을 비교해본 결과 갈락토실화 %는 첨가물 첨가 조건이 40.5%, 미첨가 조건이 31.8%로 8%정도 증가한 것을 확인하였다. 비푸코실화 %의 경우 첨가물 첨가 조건이 14.1%, 미첨가 조건이 6.1%로 임상 1상 공정과 유사하게 2배 이상 증가한 것을 확인하였다.
본 발명에서 개발한 당쇄 함량 조절용(quality(Fc N-glycan) improvement) 첨가물(망간, 글리세롤, 우리딘)을 첨가하는 공정이 신공정뿐만 아니라 구공정에도 유사한 효과가 있음을 확인하였다.
HD201 항체의 ADCC 활성 분석은 항체의존 세포독성 분석 시험법 SOP[HD201 항체의존 세포독성 분석 assay]에 따라 분석을 수행하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 당쇄 함량 조절용 첨가물(망간, 글리세롤, 우리딘) 첨가하여 제조한 항체의 ADCC 활성을 In vitro 활성 측정법인 relative ADCC assay를 통하여 측정하였다. ADCC 활성의 기준 물질(대조약)은 현재 판매되고 있는 오리지날 사 제품(Herceptin®)을 사용하였다. 시험 결과는 기존과 동일한 EC50값을 통한 relative ADCC%(A) 및 PLA s/w로 계산되는 relative activity ratio를 사용한 relative ADCC activity%(B)로 나타내었으며, EC50를 사용한 결과값과 PLA를 사용한 결과값에 약간의 차이는 있으나 전체적인 경향성은 동일한 것을 알 수 있었다.
Small scale 구공정의 경우 첨가물 첨가 조건은 대조약 대비 217.5%의 ADCC 활성을 나타내었으며, 미첨가 조건은 78.7%로 대조약 대비 낮을 활성을 나타내었다. 따라서 당쇄 함량 조절용(quality(Fc N-glycan) improvement) 첨가물(망간, 글리세롤, 우리딘)를 구공정에 첨가할 경우 비푸코실화 비율을 두 배까지 높일 수 있으며, 이로 인한 ADCC 활성을 미첨가 조건 대비 100% 이상 향상시킬 수 있었다. 신공정은 첨가물 첨가 조건은 대조약 대비 130%의 ADCC 활성을 나타내었으며, 미첨가 조건은 42.7%로 대조약 대비 가장 낮은 활성을 나타내었다. 신공정은 다른 배지를 사용하는 구공정에서와 마찬가지로 당쇄 함량 조절용(quality(Fc N-glycan) improvement) 첨가물(망간, 글리세롤, 우리딘)를 첨가할 경우 비푸코실화 비율을 두 배까지 높일 수 있으며, 이로 통해 ADCC 활성을 미첨가 조건 대비 80% 이상 향상시킬 수 있었다.
본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이 본 발명의 당쇄 함량 조절용 첨가물을 이용한 트라스투주맙 제조공정을 진행할 경우 항체의 당쇄 함량 조절이 충분히 가능함을 확인하였다. 특히 글리세롤의 경우 국내 또는 외국에서도 afucosylation effect 관련 연구나 문헌으로 보고된 적이 없는 바, 본 발명자들은 상기 실험 결과들을 바탕으로 글리세롤을 이용한 당쇄 함량 조절을 통한 항체 제조하는 방법을 처음으로 개발하였다.
본 발명에서 배양은 항체 발현 세포에 따라 적절한 온도, 배지, 기체 조건으로 당업자에게 널리 알려진 방법으로 이루어질 수 있으며, 회분 배양, 유가 배양, 연속식 배양 또는 이들의 조합 등 본 발명의 항체 제조 방법에 적용 가능한 방법에 제한되지 않는다.
본 발명의 제조 방법은 (a) 글리세롤 및 망간을 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계; 및, (b) 상기 (a) 단계를 통해 배양한 세포를 우리딘을 추가로 포함하는 배지로 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 특히 (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 세포를 글리세롤 및 망간을 포함하는 배지에 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 (a) 단계는 3일 내지 7일 동안 이루어지는 것일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 배양 5일차에 우리딘을 처리하였다.
또한, 본 발명의 제조 방법은 (a) 글리세롤 및 망간을 포함하는 배지에 항체 발현 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계 통해 배양한 세포를 우리딘을 포함하는 배지로 배양하는 단계; 및 (c) 글리세롤 및 망간을 포함하는 배지로 유가 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
한편, 상기 (a) 및 (b) 단계를 회분식 배양으로 이루어질 수 있고, 상기 (c) 단계는 유가식 배양으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 제조 방법은 세포 배양액으로부터 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 항체를 정제하는 방법은 당업계에 널리 알려진 다양한 방법, 예를 들어 protein A/G 컬럼, HPLC 등의 방법을 통하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 배지는 글리세롤을 0 내지 10%, 혹은 0.1 내지 5%(v/v) 농도 범위 내로 포함하는 것일 수 있고, 특히 0.5 내지 3 %(v/v) 농도 범위 내로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 배지는 망간을 0 내지 250 μM, 혹은 10 내지 200 μM 농도 범위 내로 포함하는 것일 수 있고, 특히 20 내지 120 μM 농도 범위 내로 포함하는 것일 수 있다. 아울러, 상기 배지는 우리딘을 0 내지 20 mM, 혹은 1 내지 10 mM 농도 범위 내로 포함하는 것일 수 있으며, 특히 4 내지 8 mM 농도 범위 내로 포함하는 것일 수 있다.
특히, 본 발명의 배지는 글리세롤을 0.5 내지 3 %(v/v) 농도 범위 내로 포함하고, 망간을 20 내지 120 μM 농도 범위 내로 포함하고, 우리딘을 3 내지 10 mM 농도 범위 내로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 망간은 인체에 무해한 이상 형태에 제한되지 않으나 예를 들어 염화 망간(Maganese chloride)일 수 있다.
본 발명에서 본 발명의 배지에 포함되는 당쇄 함량 조절용 첨가물은 배지 최종 농도를 기준으로 글리세롤 (%, v/v) : 망간 (μM)의 비는 0.5 : 20, 1 : 20, 2: 20, 3 : 20, 0.5 : 40, 1 : 40, 2 : 40, 3 : 40, 0.5 : 80, 1 : 80, 2 : 80, 3 : 80, 0.5 : 120, 1 : 120, 2 : 120 또는 3 : 120일 수 있다. 또한, 본 발명에서 본 발명의 배지에 포함되고 당쇄 함량 조절용 첨가물을 구성하는 배지 최종 농도를 기준으로 우리딘은 2 내지 8 mM일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 당쇄 함량 조절용 첨가물은 배지 최종 농도를 기준으로 글리세롤 (%, v/v) : 망간 (μM) : 우리딘 (mM)의 비가 1.0 : 40 : 80 또는 2.0 : 40 : 80의 경우에 기존 대조약 Herceptin®과 유사한 정도의 당쇄 함량을 가질 수 있음을 확인한 바 있다.
본 발명의 제조 방법은 해당 제조 방법에 의해 제조된 항체의 당쇄 함량이 갈락토실 함량이 35 내지 50 % 범위 내이고, 비푸코실 함량이 8 내지 20 % 범위 내인 것일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 당쇄 함량이 조절된 항체 집단을 제공한다.
상기 방법, 항체 집단 및 당쇄 함량이 조절된 항체 집단에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 당쇄 함량을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 배지는 당쇄 함량 조절용 첨가물로 망간 및 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 당쇄 함량, 항체, 항체 발현 세포, 배양 등은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는, 항체 당쇄 함량 조절용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
상기 당쇄 함량, 항체 등은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 항체 당쇄 함량 조절용 배지 조성물에서 상기 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 망간 및 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "배지"는 증식성 세포에 영양을 공급하는 영양소 함유 용액을 폭넓게 의미하며, 이러한 용액은 일반적으로 세포가 증식 및/또는 생존하는데 필요한 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 탄소원, 지질 및 미량 원소 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 배지는 배양하고자 하는 세포 종류에 따라 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염농도로 제조되는 것이 바람직하며, 호르몬 및 성장인자를 비롯하여 증식 및/또는 생존을 증가시키는 성분으로 당업계에서 널리 사용되는 물질을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 배지에 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물을 제외한 포함되는 성분은 당업계에서 항체 생산에 널리 사용되는 임의의 성분을 포함할 수 있으며, 이는 당업자가 당업계의 상식 또는 실험에 의하여 용이하게 구성할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본배양에서는 Media A를 기반으로 첨가물을 조절하여 배양하였고, 유가 배양에서는 Feed C를 기반으로 첨가물을 조절하여 배양하였다.
본 발명에 따른 항체의 제조 방법을 이용하면, 항체의 당쇄 함량을 조절하여 고품질의 목적하는 항체 집단을 일관적으로 제조할 수 있다. 또한, 바이오 시밀러 개발 측면에서도 본 발명에 의한 방법으로 항체의 당쇄 함량을 조절함으로써 대조약과 동등성을 높인 품질을 갖는 항체를 제조할 수 있으며, 이를 배지 조성물을 통하여 조절함에 따라 조절 방법이 간단해지고 시간적 및 경제적 측면에서 효용성이 높아 항체 제조 분야에서 널리 사용될 수 있다.
도 1은 푸코실화 경로(fucosylation pathway)의 전구체(building block)인 GDP-푸코즈(GDP-fucose)의 생합성 과정 및 항체의 주푸코실화에 직접적으로 연관된 효소나 전구체에 대한 모식도이다.
도 2는 글리코실화 경로(glycosylation pathway)를 개시하고 있는 모식도이다.
도 3은 비푸코실화 유도 첨가물 조건 실험 세포 성장 곡선을 측정한 도이다.
도 4는 비푸코실화 유도 첨가물 조건 실험 세포 생존율을 측정한 도이다.
도 5는 비푸코실화 유도 첨가물 조건 실험 최종 발현량을 측정한 도이다.
도 6은 비푸코실화 유도 첨가물 조건 실험에서 생산된 항체의 갈락토실화(galactoxylation) glycoform의 상대 함량을 그래프로 나타낸 도이다.
도 7은 비푸코실화 유도 첨가물 조건 실험에서 생산된 항체의 비푸코실화(afucosylation) glycoform의 상대 함량을 그래프로 나타낸 도이다.
도 8은 미첨가 조건인 대조군(Control) 대비 갈락토실화 및 비푸코실화 항체의 증감 정도를 비교 분석한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 9는 망간(M), 갈락토즈, 우리딘(Urd) 개별 또는 혼합 첨가 조건 실험에서 세포 성장 곡선을 측정한 도이다.
도 10은 망간(M), 갈락토즈, 우리딘(Urd) 개별 또는 혼합 첨가 조건 실험에서 세포 생존율을 측정한 도이다.
도 11은 망간(M), 갈락토즈, 우리딘(Urd) 개별 또는 혼합 첨가 조건 실험에서 최종 발현량을 측정한 도이다.
도 12는 망간(M), 갈락토즈, 우리딘(Urd) 개별 또는 혼합 첨가 조건 실험에서 갈락토실화 함량을 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 망간(M), 갈락토즈, 우리딘(Urd) 개별 또는 혼합 첨가 조건 실험에서 비푸코실화 함량을 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 미첨가 조건인 대조군(Control) 대비 갈락토실화 및 비푸코실화 항체의 증감 정도를 비교 분석한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 15는 글리세롤 첨가 농도에 따른 (A) 세포 성장 곡선과 (B) 세포 생존율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 16은 글리세롤 첨가 농도에 따른 최종 항체 발현량을 측정한 도이다.
도 17은 글리세롤 첨가 농도에 따른 당쇄 함량 분석 결과로 (A) 갈락토실화 및 (B) 비푸코실화 당쇄 함량을 측정한 도이다.
도 18은 신공정의 갈락토실화 및 비푸코실화 동시 유도를 위한 첨가물 혼합 플라스크 배양 실험에서 (A) 세포 성장 곡선과 (B) 세포 생존율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 19는 신공정의 갈락토실화 및 비푸코실화 동시 유도를 위한 첨가물 혼합 플라스크 배양 실험에서 최종 항체 발현량을 측정한 도이다.
도 20은 신공정의 갈락토실화 및 비푸코실화 동시 유도를 위한 첨가물 혼합 플라스크 배양 실험에서 당쇄 함량 분석 결과로 (A) 갈락토실화 및 (B) 비푸코실화 당쇄 함량을 측정한 도이다.
도 21은 신공정의 갈락토실화 및 비푸코실화 동시 유도를 위한 첨가물 혼합 플라스크 배양 실험에서 당쇄 함량 분석 결과로 갈락토실화/ 비푸코실화 차이(percent change)를 측정한 도이다.
도 22는 글리세롤 첨가 농도에 따른 생물반응기(Scale up) 배양 실험의 (A) 세포 성장 곡선과 (B) 세포 생존율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 23은 글리세롤 첨가 농도에 따른 생물반응기(Scale up) 배양 실험의 최종 항체 발현량을 측정한 도이다.
도 24는 글리세롤 첨가 농도에 따른 생물반응기(Scale up) 배양 실험의 당쇄 함량 분석 결과로 (A) 갈락토실화 및 (B) 비푸코실화 당쇄 함량을 측정한 도이다.
도 25는 글리세롤 첨가 농도에 따른 생물반응기(Scale up) 배양 실험의 당쇄 함량 분석 결과로 갈락토실화/ 비푸코실화 차이(percent change)를 측정한 도이다.
도 26은 신공정 첨가물 최종 선정 및 3 batches 생물 반응기 실험의 (A) 세포 성장 곡선과 (B) 세포 생존율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 27은 신공정 첨가물 최종 선정 및 3 batches 생물 반응기 실험의 최종 항체 발현량을 측정한 도이다.
도 28은 신공정 첨가물 최종 선정 및 3 batches 생물 반응기 실험의 당쇄 함량 분석 결과로 (A) 갈락토실화 및 (B) 비푸코실화 당쇄 함량을 측정한 도이다.
도 29는 신공정 첨가물 최종 선정 및 3 batches 생물 반응기 실험의 당쇄 함량 분석 결과로 갈락토실화/ 비푸코실화 차이(percent change)를 측정한 도이다.
도 30은 첨가물 구성의 구공정(임상 1상 공정) 적용 효과 확인 실험의 (A) 세포 성장 곡선과 (B) 세포 생존율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 31은 첨가물 구성의 구공정(임상 1상 공정) 적용 효과 확인 실험의 최종 항체 발현량을 측정한 도이다.
도 32는 첨가물 구성의 구공정(임상 1상 공정) 적용 효과 확인 실험의 당쇄 함량 분석 결과로 (A) 갈락토실화 및 (B) 비푸코실화 당쇄 함량을 측정한 도이다.
도 33은 첨가물 구성의 구공정(임상 1상 공정) 적용 효과 확인 실험의 당쇄 함량 분석 결과로 대조군 대비 갈락토실화/ 비푸코실화 차이(percent change)를 측정한 도이다.
도 34는 첨가물 구성의 구공정(임상 1상 공정) 대비 첨가 효과 확인 실험의 당쇄 함량 분석 결과로 구공정 시료 대비 갈락토실화/ 비푸코실화 상승 효과를(percent change) 측정한 도이다.
도 35는 비푸코실화(afucosylation) 유도 첨가물 선별을 위한 플라스크 배양 실험에서의 3 batches 생물 반응기 실험의 당쇄 함량 분석 결과로 (A) 갈락토실화 및 (B) 비푸코실화 당쇄 함량을 측정한 도이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 항체의 당쇄 조절을 위한 첨가물 실험
1-1. 비푸코실화 ( afucosylation ) 유도 첨가물 선별을 위한 플라스크 배양 실험
갈락토실화를 유도하기 위해 당 전구체(glucosamine, N-acetylglucosamine, N-acetylmannosamine , galactose, uridine Manganese(Mn2 +), glycerol)를 첨가한 조건에서 실험을 진행하였다. 그 결과 도 35의 실험 데이터 분석 결과에서 확인할 수 있듯이 갈락토실화 효과는 크지 않았지만, 비푸코실화 함량이 높게 나타났다. 상기 결과를 바탕으로 이후 연구에서 갈락토실화 관련 효과가 알려진 갈락토즈 + 망간(Mn2 +) 조건에 첨가물을 병용 투여해보는 실험을 통하여 변화를 확인하고자 하였다. 또한, 단독으로 효과가 있는 인자의 발견을 위해 갈락토즈 + 망간(Mn2 +)을 뺀 조건을 parallel하게 진행하였다.
구체적으로는, 망간(Mn2 +)과 갈락토즈를 첨가한 조건에 비푸코실화 유도 첨가물을 처리한 조건과 망간(Mn2 +)과 갈락토즈를 첨가하지 않은 조건에 비푸코실화 유도 첨가물을 처리한 조건으로 나누어 실험을 진행해보고자 하였다.
갈락토즈는 200 g/L stock을 제조하여 사용하였으며, 염화망간·4수(Mn2 +)는 40 mM stock을 제조하여 사용하였다. 본배양 배지(production media)에 첨가되는 망간과 갈락토즈는 플라스크 본 배양 부피인 35 mL 기준으로 농도를 희석하여 첨가하였으며, 유가 배지(feed media)는 각 조건당 20 mL씩 별도로 소분한 후 20 mL 부피 기준으로 stock들을 희석하여 첨가하였다.
비푸코실화 유도 첨가물들인 글루코사민(glucosamine)과 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)은 각각 1M stock을 제조하여 사용하였으며, 글리세롤은 원액을 100%로 간주하여 부피비(v/v, %)로 첨가해 주었고, 소디움 부티레이트(Sodium butyrate)는 50 mM stock, 락토즈(Lactose)는 50 g/L stock으로 각각 제조하여 1/100로 희석하여 사용하였다. Kifunensine의 경우 α-만노시다제 Ⅰ 억제제(alpha-mannosidase Ⅰ inhibitor)로 비푸코실화 효과가 기존에 알려진 물질로 100 ㎍/mL 농도로 제조하여 사용하였다(Qun Zhou et al., 2008; US 2007/0092521 A1).
상기 실험한 조건을 정리하면 하기 표 1과 같다.
비푸코실화 첨가물 플라스크 배양 실험 조건
실험군 배지 2.0 g/L 갈락토즈 +
40μM Mn2 + 		당 전구체
M(40), Gal(2.0) Media A 첨가 무첨가;
음성 대조군
M(40), Gal(2.0), Glucosamine (10) Media A 첨가 Glucosamine(10 mM)
M(40), Gal(2.0), N- acetylglucosamine (10) Media A 첨가 N-acetylglucosamine(10 mM)
M(40), Gal(2.0), Glycerol (1) Media A 첨가 1%(v/v) Glycerol
M(40), Gal(2.0), Sodium butyrate (0.5) Media A 첨가 Sodium butyrate(0.5 mM)
M(40), Gal(2.0), Lactose (0.5) Media A 첨가 Lactose(0.5 g/L)
M(40), Gal(2.0), Kifunensine (10) Media A 첨가 Kifunensine(10 ng / mL );
양성 대조군
Control Media A 무첨가 무첨가;
음성 대조군
Glucosamine (10) Media A 무첨가 Glucosamine(10 mM)
N- acetylglucosamine (10) Media A 무첨가 N-acetylglucosamine(10 mM)
Glycerol (1) Media A 무첨가 1%(v/v) Glycerol
Sodium butyrate (0.5) Media A 무첨가 Sodium butyrate(0.5 mM)
Lactose (0.5) Media A 무첨가 Lactose(0.5 g/L)
Kifunensine (10) Media A 무첨가 Kifunensine(10 ng / mL );
양성 대조군
1-2. 비푸코실화 유도 첨가물 플라스크 배양 실험 세포 배양 결과
비푸코실화 유도 첨가물 선별을 위한 플라스크 배양에서 세포 성장 profile, 세포 생존율 profile, 최종 발현량 profile(titer profile)을 측정하였다.
도 3에서 볼 수 있듯이 세포 성장 profile을 측정한 결과 망간과 갈락토즈 미첨가 조건(Control)이 가장 좋았으며, 0.5 mM 소디움 부티레이트 첨가할 경우에는 성장 저해(growth inhibition) 현상이 관찰되었다.
도 4에서 볼 수 있듯이 세포 생존율 profile을 측정한 결과에서도 소티움 부티레이트 첨가 조건의 경우 배양 종료 시점에서의 생존율이 80 % 이하로 떨어졌으며, Kifunensine 10 ng/mL과 망간과 갈락토즈를 같이 첨가한 조건에서는 생존율이 배양 종료일까지 77 %까지 떨어지는 것을 확인하였다. 그 외의 첨가물들의 조건에서 세포 성장 profile과 세포 생존율 profile은 유사한 경향성을 나타내었다.
한편, 비푸코실화 유도 첨가물 조건 실험에서 대조군(control) 대비 최종 발현량(titer profile)을 측정한 결과, 글루코사민 첨가, N-아세틸글루코사민 첨가, 또는 글리세롤 첨가 조건에서 대조군 대비 1.1 배 수준으로 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 소디움 부티레이트 첨가한 경우에는 발현량이 0.8 배 수준으로 다른 조건들 대비 낮았으며, 이것은 상기 세포 성장 및 세포 생존율의 감소에 따른 발현량 저하에 인한 것으로 판단된다.
1-3. 항체의 당쇄 함량 분석
항체의 당쇄 함량을 분석하기 위하여 항체 N-글리칸(N-glycan) 분석을 수행하였다. 구체적으로 N-글리칸 분석은 HD201 N-글리칸 시험법 SOP[HD201의 N-글리칸 NP-UPLC 시험법]에 따라 항체에서 PNGase를 처리하여 N-글리칸 구조체만을 분리하여 분석을 진행하였다. 갈락토실화(galactoxylation)과 비푸코실화(afucosylation) glycoform 들을 분석하였으며, 각각의 계산된 상대 함량을 그래프로 나타내었다(도 6 및 도 7). 또한 추가적으로 미첨가 조건인 대조군(control) 대비 갈락토실화 및 비푸코실화 증감 정도를 비교 분석한 결과도 그래프로 나타내었다(도 8)
그 결과 도 6 내지 도 8에서 확인할 수 있듯이, 망간과 갈락토즈를 첨가한 조건과 미첨가한 조건 간의 가장 큰 차이는 갈락토실화 함량의 차이로, 두 원료를 첨가한 조건에서 미첨가한 대조군보다 갈락토실화 상대 함량이 대부분 높은 것을 확인할 수 있었다. 반면, 두 원료를 첨가하지 않은 경우에는 대조군 대비 유사하거나 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로 볼 때 갈락토실화 함량을 높이기 위해 망간과 갈락토즈 두 원료의 첨가가 필요함을 다시 확인할 수 있었다.
1-4. 망간(M), Galactose , Uridine ( Urd ) 개별 또는 혼합 첨가에 따른 항체의 당쇄 변화 확인 실험
기존 항체의 당쇄 함량의 조절을 위한 방법(예를 들어, Abbott사 US 2012/0276631; WO 2012/149197)으로 망간과 갈락토즈를 이용하는 방법이 개시되어 있었다. 본 실험에서는 망간과 갈락토즈 외에 다른 물질로 두 원료에 대해 대체 가능한 물질을 찾고자 실험을 진행하였다.
구공정은 개발 초기 임상 1상 시료 생산을 위해 만들어진 공정이며, 신공정은 공정 개선을 통해 임상 3상 공정을 목표로 개발된 공정이다. 신공정과 구공정은 본 배양 배지와 유가 배지가 다르며, 또한 본 특허의 첨가물은 신공정 개발 과정에서 오리지날사 제품 대비 당쇄 형성 패턴, 특히 비푸코실화 함랴을 유사하게 만들어 항체의 활성을 넓히고자 하였다.
갈락토즈는 200 g/L stock을 제조하여 사용하였으며, 염화망간·4수(Mn2 +)는 40 mM stock을 제조하여 사용하였다. 본배양 배지(production media)에 첨가되는 망간과 갈락토즈는 플라스크 본 배양 부피인 35 mL 기준으로 농도를 희석하여 첨가하였으며, 유가 배지(feed media)는 각 조건당 20 mL씩 별도로 소분한 후 20 mL 부피 기준으로 stock들을 희석하여 첨가하였다.
실험을 진행한 조건은 하기 표 2와 같다.
망간(Mn2 +), 갈락토즈(Gal) 및 우리딘(Urd) 첨가 조건
실험군 본배양 배지 유가 배지
대조군(미첨가) Media A Feed C
M(40), Gal(2) Media A + Gal 2g/L + 40μM Mn2 + Feed C + Gal 2g/L + 40μM Mn2 +
Gal(2), Urd(2) Media A + Gal 2g/L + 2mM Uridine Feed C + Gal 2g/L + 2mM Uridine
Gal(2) Media A + Gal 2g/L Feed C + Gal 2g/L
Gal(4) Media A + Gal 4g/L Feed C + Gal 4g/L
Gal(8) Media A + Gal 8g/L Feed C + Gal 8g/L
M(40) Media A + 40μM Mn2 + Feed C + 40μM Mn2 +
M(80) Media A + 80μM Mn2 + Feed C + 80μM Mn2 +
M(120) Media A + 120μM Mn2 + Feed C + 120μM Mn2 +
Urd(2) Media A + 2mM Uridine Feed C + 2mM Uridine
Urd(4) Media A + 4mM Uridine Feed C + 4mM Uridine
Urd(8) Media A + 8mM Uridine Feed C + 8mM Uridine
그 결과 도 9에서 확인할 수 있듯이 플라스크 배양 결과 망간과 갈락토즈 첨거한 조건에서 세포 성장 profile은 대부분 유사한 경향성을 나타내었으며, 첨가물 미첨가 조건(Control)가 망간만 40 μM 첨가한 조건의 peak cell density가 가장 높았다. 우리딘(Urd) 첨가 조건들의 경우 8 mM 농도 조건에서 배양 초기부터 성장 저해(growth inhibition) 현상을 관찰할 수 있었고, 4 mM 첨가 조건의 경우 배양 후반에 세포 농도의 감소폭이 컸다.
세포 생존율 profile(Viability profile, 도 10)에서도 우리딘 8 mM 첨가 조건에서 생존율 급격히 감소하였으며, 그 외에는 유사한 경향성을 나타내었다.
항체 발현량 profile(titer profile)을 측정한 결과 도 11에서 확인할 수 있듯이, 망간 첨가 조건들은 미첨가 조건(Control) 대비 상대 함량비가 0.9 ~ 1.1 수준이었으며, 갈락토즈 첨가 조건들의 상대 함량비는 0.9 ~ 1.0 수준이었다. 우리딘 첨가 조건들의 경우 첨가 농도가 높을수록 미첨가 조건(Control) 대비 발현량 저하 현상을 확인하였으며, 8 mM 농도 조건에서는 미첨가 조건(Control) 대비 상대 함량비가 0.36까지 떨어지는 것을 확인하였다. 이것은 세포 성장 저해에 따르는 발현량 저하로 판단되었다. 따라서 망간의 경우 40μM ~ 120μM 농도 구간에서 첨가하여도 공정에는 영향이 없다는 것을 확인하였다.
1-5. 항체의 당쇄 함량 분석
상기 표 2의 조건, 즉 망간, 갈락토즈 및 우리딘을 각각 농도별로 플라스크에 첨가하여 배양한 산물의 당쇄 함량(glycosylation quality)을 확인하였다. 구체적으로 갈락토실화(galactoxylation)과 비푸코실화(afucosylation) glycoform 들을 분석하였으며, 각각의 계산된 상대 함량을 그래프로 나타내었다(도 12 및 도 13). 또한 추가적으로 미첨가 조건인 대조군(control) 대비 갈락토실화 및 비푸코실화 증감 정도를 비교 분석한 결과도 그래프로 나타내었다(도 14)
갈락토실화 함량을 계산한 결과 도 12에서 확인할 수 있듯이, 40μM 망간과 2g/L 갈락토즈가 동시에 첨가된 조건에서 대조군(미첨가 조건) 대비 가장 높은 함량을 나타내었으며, 각각 세 원료들을 단독으로 첨가한 조건들 중에는 망간 첨가 실험군들이 갈락토즈, 우리딘 단독 첨가 실험군들 보다 높은 값을 나타냈기 때문에 신공정에서 망간이 갈락토실화의 주요인자 기능을 함을 확인할 수 있었다. 한편, 우리딘 단독 첨가 조건의 경우 첨가 농도가 증가할수록 갈락토실화 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었으나, 고농도 첨가 조건(8 mM)에서 성장 저해 및 발현량 저하 현상이 확인되었기 때문에 배양 초기에 고농도의 우리딘을 첨가하는 것은 신공정 공정에 부적합한 것으로 판단되었다.
비푸코실화 함량을 계산한 결과 도 13에서 확인할 수 있듯이, 망간, 갈락토즈 그리고 우리딘 세 원료를 비교해 본 결과 망간과 갈락토즈는 효과가 없었으며, 우리딘의 경우 첨가 농도가 증가할수록 비푸코실화 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 미첨가군 대비 갈락토실화/비푸코실화 차이를 확인한 그래프(도 14)에서 망간을 첨가한 경우 미첨가군 대비 10% 이상의 갈락토실화 증진 효과를 확인할 수 있었으며, 우리딘 첨가 농도가 증가할수록 미첨가군 대비 비푸코실화 증진 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
이번 신공정의 망간, 갈락토즈 및 우리딘 첨가 조건 실험을 통하여 항체의 갈락토실화에 가장 중요한 인자는 망간임을 확인하였으며, 갈락토즈를 우리딘으로 대체하였을 때 갈락토실화와 비푸코실화 측면에서 개선될 수 있음을 확인하였다.
이후 실험에서는 바이오 시밀러 개발 관점에서 상용 의약품인 대조약(Herceptin®)과의 갈락토실화/비푸코실화 동등성을 높이기 위해 망간, 우리딘 및 글리세롤 혼합 첨가 조건들을 적용하여 실험해보았다.
1-6. 글리세롤 첨가에 따른 당쇄 변화 플라스크 배양 실험
본 실험에서는 망간과 갈락토즈 외에 추가로 비푸코실화 유도 첨가물 선별 실험을 통하여 선택된 글리세롤(glycerol, Gcr)을 농도별로 첨가하여 그 효과를 확인하였다.
글리세롤은 항-응결제(anti-freezing agent) 및 단백질 안정화제로 많이 알려진 물질로 재조합 단백질의 발현량 증과 관련 내용이 언급되거나 시알산 함량을 증가시킨다는 문헌(Rodriguez et al. 2005, Chi-Hsien Liu 2007)이 있었을 뿐, 이외에 본 발명과 관련된 항체의 비푸코실화 관점에서는 어떠한 언급도 없었다.
이에 글리세롤이 항체의 비푸코실화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험을 진행하였으며 구체적으로, 글리세롤 첨가량을 0, 0.5, 1 또는 2 %(v/v)로 첨가하여 글리세롤 첨가와 비푸코실화 함량을 측정하였다.
상기 실험을 진행한 조건은 하기 표 3과 같다.
비푸코실화 첨가물인 글리세롤 첨가 플라스크 배양 실험 조건
실험군 본배양 배지 (A) 유가 배지 (B)
M(40), Gal(2), Gcr(0) Media A + Galactose 2g/L+ 40μM Mn2 + Feed C + Galactose 2g/L+ 40μM Mn2 +
M(40), Gal(2), Gcr(0.5) Media A + Galactose 2g/L+ 40μM Mn2 + + 0.5 % glycerol Feed C + Galactose 2g/L+ 40μM Mn2 +
M(40), Gal(2), Gcr(1.0) Media A + Galactose 2g/L+ 40μM Mn2 + + 1 % glycerol Feed C + Galactose 2g/L+ 40μM Mn2 +
M(40), Gal(2), Gcr(2.0) Media A + Galactose 2g/L+ 40μM Mn2 + + 2 % glycerol Feed C + Galactose 2g/L+ 40μM Mn2 +
글리세롤 첨가 농도에 따른 세포 성장 profile과 세포 생존율 profile을 측정하였다. 그 결과 도 15에서 확인할 수 있듯이 글리세롤 첨가 및 미첨가 조건에서 세포 성장과 세포 생존율은 유사한 것을 확인하였다. 세포 생존율은 배양 최종일에 미첨가 조건 대비 약간 낮은 경향성을 확인할 수 있었다.
또한 최종 항체 발현량을 측정한 결과 도 16에서 확인할 수 있듯이 글리세롤 첨가 농도가 증가할수록 미첨가 조건 대비 높아지는 것을 확인하였으며, 2.0% 첨가 조건의 발현량이 1.1배 이상으로 가장 높은 상대 함량비를 기록하였다.
1-7. 항체의 당쇄 함량 분석
상기 표 3의 조건으로 글리세롤 첨가 조건 농도에 따른 갈락토실화 및 비푸코실화 당쇄 함량을 측정하였다.
그 결과 도 17에서 확인할 수 있듯이 글리세롤 첨가 농도가 증가함에 따라 갈락토실화는 경미하게 감소하는 현상을 보이긴 했으나, 갈락토실화 항체 함량이 모두 40% 이상으로 유지되어 큰 영향을 주진 못했으며(도 17 (A)), 비푸코실화 효과 측면에서는 글리세롤 첨가 농도가 증가함에 따라 대조군(미첨가) 대비 비푸코실화 항체 함량이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 17 (B)).
1-8. 신공정의 갈락토실화 및 비푸코실화 동시 유도를 위한 첨가물 혼합 플라스크 배양 실험
상기 실시예에서 진행된 첨가물 조건 실험들의 결과를 조합하여 최종 제조된 항체 집단이 대조약(Herceptin®)과 가장 유사한 당쇄 함량, 즉 갈락토실화와 비푸코실화 함량을 가질 수 있도록 조절하는 조건을 확인하기 위하여 수행되었다.
이에 본 실험에는 첨가물로 갈락토실화 향상의 주요인자인 망간(M)과 비푸코실화 유도 첨가물인 글리세롤(Gcr), 마지막으로 갈락토즈를 대체하기 위하여 첨가된 갈락토실화와 비푸코실화의 보조인자인 우리딘(Urd)을 사용하였다.
한편, 우리딘의 경우 이전 실험(실시예 1-4)에서 4 mM 농도 이상을 첨가하면 비푸코실화 현상이 있는 반면 성장 저해 현상에 의한 발현량 저하라는 단점을 확인하였다. 이에 본 실험에서는 하기 표 4의 실험 조건과 같이 본 배양 5일차 진행 중에 우리딘을 4 mM 농도로 별도 첨가하여 성장 저해 및 고 만노즈 생성(high mannose form) 증가를 최소화하고자 하였다.
망간(M)의 경우 이전 실험(실시예 1-4)에서 갈락토실화 현상이 가장 큰 것을 확인하였고, 40 내지 120 μM 농도 범위에서 유사한 효과를 확인하였기 때문에 이번 실험에서는 40 μM과 그 이하의 농도를 선정하여 본배양 배지 및 유가 배지에 첨가하였다.
마지막으로 글리세롤은 첨가 농도 실험(실시예 1-6)에서 효과가 확인된 1 %와 2 % 농도로 각각 본배양 배지에만 첨가하였다.
상기와 같은 실험 조건을 정리하면 하기 표 4와 같다.
신공정 갈락토실화 및 비푸코실화 유도를 위한 첨가물 혼합 플라스크 배양 조건
실험군 본배양 배지(A) 우리딘 유가 배지(B)
첨가물 글리세롤
(Gcr, v/v %)
M(40), Galactose(2.0) Galactose 2g/L+
40μM 망간		 n/a n/a Galactose 2g/L+
40μM 망간
M(40), Gcr(1) 40μM 망간 1 % n/a 40μM 망간
M(40), Gcr(1), Urd(4) 40μM 망간 1 % 배양 5일차
4mM 농도 첨가		 40μM 망간
M(40), Gcr(2) 40μM 망간 2 % n/a 40μM 망간
M(40), Gcr(2), Urd(4) 40μM 망간 2 % 배양 5일차
4mM 농도 첨가		 40μM 망간
M(20), Gcr(1) 20μM 망간 1 % n/a 20μM 망간
M(20), Gcr(1), Urd(4) 20μM 망간 1 % 배양 5일차
4mM 농도 첨가		 20μM 망간
M(20), Gcr(2) 20μM 망간 2 % n/a 20μM 망간
M(20), Gcr(2), Urd(4) 20μM 망간 2 % 배양 5일차
4mM 농도 첨가		 20μM 망간
상기 표 4의 조건으로 플라스크 배양하여 세포 성장 profile 및 세포 생존율 profile을 측정한 결과 도 18에서 확인할 수 있듯이, 망간(M) 첨가한 경우에서 세포 성장 profile은 대부분 유사한 경향을 나타내었으나, 글리세롤 첨가한 경우에서는 2% 첨가시 1% 첨가시보다 세포 성장율이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 글리세롤 미첨가 조건(40μM 망간 + 2.0g/L 갈락토즈)과 1% 글리세롤 첨가 조건의 세포 성장 효율(peak cell density)은 유사한 것으로 판단해 볼 때 글리세롤 1% 첨가는 기존 공정의 세포 성장 효율에 영향이 없을 것으로 판단되었다. 우리딘은 본배양 5일차에 첨가해 주어 배양 초반부의 성장 저해 문제는 발생하지 않았으나, 우리딘 첨가 이후 미첨가 조건 대비 세포 생존율 감소 폭이 커지는 것을 확인하였다.
최종 발현량 결과(도 19), 글리세롤 및 우리딘 미첨가 조건(40μM 망간 + 2.0 g/L 갈락토즈) 대비 나머지 조건들은 모두 유사하거나 높은 것을 확인할 수 있었다.
1-9. 항체의 당쇄 함량 분석
상기 표 4의 조건으로 첨가물 혼합 조건에 따른 갈락토실화 및 비푸코실화 당쇄 함량을 측정하였다. 구체적으로, N-글리칸 분석 peak profile의 넓이(area) 값들을 갈락토실화와 비푸코실화 함량으로 수치화하였다.
그 결과 도 20에서 확인할 수 있듯이 40μM 망간 + 1% 글리세롤 조합을 바탕으로 우리딘을 배양 5일차에 첨가한 조건들에서 우리딘 미첨가 조건 대비 갈락토실화 함량 증가를 확인하였다. 비푸코실화 측면에서 4 mM 우리딘 첨가조건들의 경우 미첨가 조건 대비 비푸코실화 함량 증가를 확인하였다. 40μM 망간 + 2% 글리세롤 조합을 바탕으로 우리딘을 배양 5일차에 첨가한 조건들의 우리딘 미첨가 조건 대비 갈락토실화 함량 증가를 확인하였다. 비푸코실화 측면에서 4 mM 우리딘 첨가 조건은 미첨가 조건 대비 비푸코실화 함량이 증가하였다. 특히 글리세롤 첨가량이 높을수록 비푸코실화 함량은 비례해서 높아지는 것을 확인할 수 있었다..
20μM 망간 + 1% 글리세롤 조합을 바탕으로 우리딘을 배양 5일차에 첨가한 조건들에서도 우리딘 미첨가 조건 대비 갈락토실화 함량 증가를 확인하였으며, 비푸코실화 측면에서도 우리딘 미첨가 조건 대비 비푸코실화 함량이 증가된 결과를 확인하였다. 20μM 망간 + 2% 글리세롤 조합을 바탕으로 우리딘을 첨가한 조건에서도 유사한 경향성을 확인하였다.
위 결과들을 종합적으로 판단해 볼 때 신공정에 우리딘을 첨가할 경우 갈락토실화를 향상시키는 효과가 확인되어 갈락토즈의 대체가 가능할 것으로 판단되었으며, 작지만 비푸코실화를 향상시키는 결과도 확인하였다.
신공정에 갈락토즈 만 2.0g/L를 첨가한 조건을 대조군으로 하여 망간, 글리세롤 및 우리딘 첨가에 따른 갈락토실화/ 비푸코실화 차이(percent change)를 확인한 결과 도 21에서 확인할 수 있듯이, 망간을 첨가하면 갈락토실화 효과가 6 ~ 13%까지 높아졌으며, 글리세롤을 첨가하면 비푸코실화 함량이 1.5 ~ 4%까지 상승하는 것을 확인하였다.
실시예 2: 당쇄 조절을 위한 Bioreactor 수준의 첨가물 실험
상기 실시예 1에서 실시한 플라스크 배양 실험 결과를 바탕으로 반응기(bioreactor)를 이용한 항체 당쇄 조절이 가능한지를 확인하고자 하였다.
2-1. 글리세롤 첨가 농도 반응기( Scale up ) 실험
본 실험은 앞선 실시예 1-6의 플라스크 배양 실험 결과와 같이 글리세롤을 첨가한 배양 조건에서 비푸코실화를 증가시키는 효과를 확인하여기 때문이다, 반응기 수준에서 재현성을 확인해보고자 하였다.
글리세롤 첨가 농도는 실시예 1-6과 동일하게 하기 표 5에 개시된 1%와 2%(v/v)를 본배양 배지에만 첨가하도록 하였다. 본배양 배지에 첨가되는 글리세롤은 반응기 본배양 부피인 3.5L 기준으로 농도를 원액(100%)을 희석하여 첨가하였으며, 유가 배지에는 글리세롤을 첨가하지 않았다. 신공정 개발 과정에서 갈락토실화 및 비푸코실화 함량을 대조약(Herceptin®)과 유사한 수준으로 맞추기 위하여 망간, 글리세롤과 같은 첨가물 실험을 진행하게 되었다.
상기 반응기 수준의 실험 조건을 정리하면 하기 표 5와 같다.
글리세롤 첨가 농도를 달리한 반응기 실험 조건
실험군 본배양 배지 (A) 유가 배지 (B)
첨가물 글리세롤
(Gcr, v/v %)
대조군 (Control) n/a n/a n/a
글리세롤 (1) 갈락토즈 2 g/L +
40 μM 망간		 1 % 갈락토즈 2 g/L +
40 μM 망간
글리세롤 (2) 갈락토즈 2 g/L +
40 μM 망간		 2 % 갈락토즈 2 g/L +
40 μM 망간
상기 표 5의 조건으로 반응기(bioreactor) 배양하여 세포 성장 profile 및 세포 생존율 profile을 측정한 결과 도 22에서 확인할 수 있듯이, 세포 성장 profile은 글리세롤을 1% 첨가한 조건이 2% 첨가한 조건보다 좋았으며(peak cell density 기준 10% 정도의 차이), 미첨가 조건과 유사하였다.
최종 상대 발현량 결과(도 23), 본배양 최종일 기준으로 미첨가 대조군과 비교하여 글리세롤 첨가군이 최종 상대 발현량이 모두 높은 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 항체의 당쇄 함량 분석
상기 표 5의 조건으로 첨가물 혼합 조건에 따른 갈락토실화 및 비푸코실화 당쇄 함량을 측정하였다. 구체적으로 2 unit(글리세롤 1% 또는 2% 첨가)의 반응기(bioreactor)에서 8일 동안 배양한 회수액에서의 N-글리칸 분석 결과를 갈락토실화 함량(A) 및 비푸코실화 함량(B)로 수치화하였다.
도 24에서 확인할 수 있듯이 반응기 배양 실험 결과 본배양 배지에 글리세롤을 1% 첨가하였을 때 보다 2% 첨가하였을 때 비푸코실화 함량이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 25에서 확인할 수 있듯이 대조군(망간, 갈락토즈 및 글리세롤 미첨가) 대비 갈락토실화/비푸코실화 상대 함량 측정한 결과, 미첨가 대조군 대비하여 첨가물들을 첨가하였을 때 갈락토실화는 12% 이상 증가하였으며 비푸코실화도 1.5%까지 증가하는 긍정적인 효과를 확인하였다. 이러한 비푸코실화 함량 증가 효과는 도 34에서 확인할 수 있듯이 이전 임상 1상 시료의 비푸코실화 함량에 비교하여 2배 가량 증가한 수치이다.
실시예 2-3. 신공정 첨가물 최종 선정 및 3 batches 생물 반응기 실험
상기 실시예 2-2에서 확인한 결과, 글리세롤 2 %를 첨가하였을 때, N-글리칸 profile 상에서 미첨가 조건 대비 비푸코실화 개선 효과가 있었고, 상기 실시예 1에서 확인한 결과 망간과 우리딘을 첨가했을 때 갈락토실화 개선 효과가 있었다. 대조약(Herceptin®)과의 동등성 측면을 고려하여 글리세롤은 본배양 배지와 유가 배지에 각각 첨가하였으며, 우리딘을 배양 5일 차에 8 mM 농도로 첨가하는 조건을 설정하여 3 batches 반복 배양을 진행하였다.
구체적으로는 우선 글리세롤의 경우 이전 실험(실시예 2.1)에서 본배양 배지에만 첨가했었는데 첨가의 효과를 높이기 위하여 유가 배지에도 2% 글리세롤을 첨가하여 feeding 하고자 하였다. 이것은 처음부터 높게 첨가하였을 때 성장 저하의 우려가 있기 때문에 유가 배지에도 2% 글리세롤을 동일하게 첨가하여 feeding에 의한 희석 효과를 없애는 전략으로 접근하였다.
우리딘의 경우 망간와 갈락토즈 중 갈락토즈를 대체하여 첨가하는 것으로 갈락토실화 효과를 높이기 위하여 첨가하는 양을 4 mM에서 8 mM로 높여 첨가하였다. 또한 우리딘을 첨가한 플라스크 실험에서 배양 최종일 pH를 측정해본 결과 pH 6.9 수준으로 나타났기 때문에 이번 실험에서는 우리딘 첨가 이후 배양 pH를 pH 6.8에서 pH 6.9로 이동해 주었다. 이것은 pH 가 플라스크와 생물반응기 간 첨가물 농도에 의한 효과 차이를 만드는 원인일 가능성이 있기 때문이다.
반응기에서는 pH 6.8을 유지하기 위하여 배양 4일차부터 pCO2가 지속적으로 증가하는 경향성이 있으며, 배양 5차에 100 mmHg 이상으로 급격하게 증가하였기 때문에 배양 5일차에 본배양 pH를 pH 6.9로 높이면 pCO2양이 감소할 것으로 기대하였다. pCO2가 높으면 글리코실화에 부정적인 영향을 준다는 문헌(Kimura R, 1997)을 참고하였다.
상기 사항을 고려한 실험 조건을 정리하면 하기 표 6과 같다. 하기 조건에 관하여 3 batches 모두 동일하게 본배양 배지(media A)에 당쇄 함량 조절용(quality improvement) 첨가물인 40μM 망간(M) 및 2%(v/v) 글리세롤(Gcr)을 첨가하였으며, 본배양 5일 차에 우리딘(Urd) 8 mM을 첨가하여 배양하도록 실험을 설계하였다.
신공정 첨가물 최종 선정 및 3 batches 생물 반응기 실험 조건
실험군 본배양 배지 Urd 유가 배지
신공정 대조군 Media A n/a Feed B
신공정 batch #1 Media A + Glycerol 2%(v/v) + 40μM 망간 5일차 8 mM 첨가 Feed B + Glycerol 2%(v/v) + 40μM 망간
신공정 batch #2
신공정 batch #3
상기 표 6의 조건으로 반응기(bioreactor) 배양하여 세포 성장 profile 및 세포 생존율 profile을 측정한 결과 도 26에서 확인할 수 있듯이, 세포 성장 profile은 peak cell density 기준으로 18 내지 24 x 106 cells/mL 정도의 분포로 미첨가 대조군 대비 유사한 수준임을 확인하였다.
최종 상대 발현량 결과(도 27), 본배양 최종일 기준으로 미첨가 대조군과 비교하여 1.05 수준으로 약간 높거나 유사한 경향성을 나타냈다.
2-4. 항체의 당쇄 함량 분석
상기 표 6의 40μM 망간과 2% 글리세롤을 바탕으로 8 mM 우리딘을 배양 5일차에 첨가하는 조건으로 신공정 조건으로 동일하게 3 batches 생물 반응기 배양하여 생산한 HD201 항체의 갈락토실화 및 비푸코실화 당쇄 함량을 측정하였다. 구체적으로 각 batch 별로 본배양 8일차 시료의 N-글리칸 profile을 미첨가 대조군과 비교해본 결과 대조군의 갈락토실화(Sum of all oligosaccharide with galactose) %는 31.8%였고, 신공정 3 batches의 갈락토실화 %는 41.8 내지 42.2%로 10% 정도 증가된 수치를 나타내었다. 또한 비푸코실화(Sum of all oligosaccharide without fucose) %의 경우 미첨가 대조군 시료가 6.1%였고, 신공정 3 batches는 9.1 ~ 9.5%로 3% 정도 향상된 수치를 나타내었다.
이를 대조약(Herceptin®)과 비교해본 결과 대조약(Herceptin® Lot.H0717)의 갈락토실화 %는 43%로 신공정 3 batches의 갈락토실화 %와의 차이가 2% 미만이었고, 비푸코실화 % 는 8.9%로 신공정과의 차이가 1% 미만으로 나타났기 때문에 대조약과의 동등성 측면이 현저히 우수해진 효과를 확인할 수 있었다.
2-5. 첨가물 구성의 구공정 적용 효과 확인
상기 실시예들에 의하여 신공정에서 개발한 첨가물 조성(망간, 글리세롤, 우리딘)에 대하여 small scale bioreactor에서 구공정에 적용하여 목적하는 글리코실화 profile(갈락토실화/비푸코실화)이 조절되는지 확인하여, 구공정에서도 첨가물들의 효과가 신공정과 유사하게 나타나는지를 확인하였다.
글리세롤의 경우 신공정에서는 본배양 배지와 유가 배지에 2 % 농도로 첨가하였으나, 구공정에서는 글리세롤 첨가 농도를 3 %로 높여 첨가함으로써 글리세롤 첨가 농도 증가에 따른 비푸코실화 함량의 증가 효과를 확인하였다. 한편,망간과 우리딘의 경우 신공정에서 개발한 첨가 농도를 동일하게 사용하였다.
구체적으로, small scale의 임상 1상 공정은 본배양 배지(media D)에 당쇄 함량 조절용 첨가물(quality improvement additives)인 40μM 망간(M) 및 3%(v/v) 글리세롤(Gcr)을 첨가하였으며, 유가 배지(Feed A)에도 본배양 배지와 동일한 농도로 망간과 글리세롤을 첨가해 주었다. 신공정의 경우 본배양 배지(media A)와 유가 배지(Feed B)에 당쇄 함량 조절용(quality(Fc N-glycan) improvement) 첨가물인 40μM 망간(M) 및 3%(v/v) 글리세롤(Gcr)을 각각 첨가하였으며, 구공정 및 신공정 모두 본배양 5일차에 우리딘(Urd) 8 mM을 동일하게 첨가하여 배양한 실험군과 당쇄 함량 조절용(quality(Fc N-glycan) improvement) 첨가물을 첨가하지 않은 대조군과의 비교하였다.
상기 실험 조건을 정리하면 하기 표 7과 같다.
첨가물의 신공정 및 구공정 적용 조건
실험군 본배양 배지 Urd 유가 배지
신공정 without Gcr, M, Urd Media A n/a Feed B
신공정 with Gcr(3), M(40), Urd(8) Media A
+ Glycerol 3%(v/v)
+ 40μM 망간		 5일차 8 mM Feed B
+ Glycerol 3%(v/v)
+ 40μM 망간
구공정(P I) without Gcr, M, Urd Media A n/a Feed B
구공정(P I) with Gcr(3), M(40), Urd(8) Media A
+ Glycerol 3%(v/v)
+ 40μM 망간		 5일차 8 mM Feed B
+ Glycerol 3%(v/v)
+ 40μM 망간
상기 표 7의 조건으로 반응기(bioreactor) 배양하여 세포 성장 profile 및 세포 생존율 profile을 측정한 결과 도 30에서 확인할 수 있듯이, 세포 성장 profile상 첨가물 미첨가 신공정과 첨가 신공정의 peak cell density 기준 차이는 24 % 정도로 첨가물 첨가에 의한 세포 성장 저해가 일어나는 것을 확인하였다. 또한, 구공정에서도 동일하게 첨가물 첨가에 따른 성장 저해가 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 첨가물 중 3 % 글리세롤 첨가의 영향으로 해석되며, 기존 실험들에서 글리세롤 첨가 농도가 증가할수록 세포 성장 저해 정도도 증가하는 경향성을 확인하였다.
신공정과 구공정의 세포 성장 profile의 차이는 첨가물 미첨가 구공정과 첨가물 미첨가 신공정의 비교 및 첨가물 첨가 구공정과 첨가물 첨가 신공정의 비교를 통해 확인하였으며, 미첨가 조건들의 peak cell density의 차이는 34% 수준으로 신공정이 cell mass가 큰 것을 확인할 수 있었다. 또한, 첨가물 첨가 조건의 peak cell density 차이는 28 % 수준으로 신공정이 높았다. 구공정의 경우 본배양에서 7일 배양을 수행하였기 때문에 small scale batch 에서도 7일 배양을 수행하였다.
세포 생존율(B)은 첨가물 첨가 조건과 미첨가 조건 모두 배양 종료시에 80% 이상의 생존율을 유지하였으며, 첨가물 미첨가 구공정 조건의 경우 배양 5일차 이후 생존율 감소 속도가 큰 것은 배양 3일차 이후 글루코즈 고갈이 원인으로 판단되었다.
최종 상대 발현량 결과(도 31), 구공정은 첨가물 첨가 유무와 관계없이 배양 7일차 회수 기준 유사한 경향성을 나타낸 반면, 신공정의 경우 첨가물 미첨가 조건의 발현량 대비 첨가 조건의 발현량은 13 % 낮은 것을 확인할 수 있었다. 구공정 대비 신공정의 상대 발현량은 1.8로 80% 이상의 생산성이 증가한 것을 확인하였다.
2-6. 항체의 당쇄 함량 분석
상기 표 7의 조건으로 배양하여 생산한 항체의 갈락토실화 및 비푸코실화 당쇄 함량을 측정하였다. 본 실험은 신공정과 구공정에 각각 당쇄 함량 조절용(quality improvement) 첨가물(망간, 글리세롤, 우리딘)을 첨가한 조건과 미첨가 조건 비교를 목적으로 진행되었다.
구체적으로 생물 반응기 배양 시료의 결과물에 대한 글리코실화 함량(glycosylation quality)을 N-글리칸 분석으로 확인한 결과를 갈락토실화 및 비푸코실화 함량을 도식화한 결과이다. 본배양 회수 시료 중 구공정에 첨가물 첨가 조건과 미첨가 조건의 N-글리칸 profile을 비교해본 결과 갈락토실화 함량(%)은 첨가물 첨가 조건이 43.8%, 미첨가 조건이 43%로 1%정도 증가한 것을 확인하였다. 비푸코실화 함량(%)의 경우 첨가물 첨가 조건이 18.7%, 미첨가 조건이 9.1%로 두 배 가량 증가한 것을 확인하였다.
신공정에 첨가물 첨가 조건과 미첨가 조건을 비교해본 결과 갈락토실화 함량%는 첨가물 첨가 조건이 40.5%, 미첨가 조건이 31.8%로 8%정도 증가한 것을 확인하였다. 비푸코실화 함량%의 경우 첨가물 첨가 조건이 14.1%, 미첨가 조건이 6.1%로 구공정과 유사하게 두 배 이상 증가한 것을 확인하였다.
상기 실험 결과는 본 발명의 망간, 글리세롤 및 우리딘으로 이루어진 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물을 첨가하는 공정을 통하여 신공정 뿐만 아니라 서로 다른 배지를 사용하는 구공정에도 유사한 효과가 있음을 확인한 것으로, 해당 첨가물은 배지 제한없이 어느 공정에도 사용될 수 있음을 확인한 것이다.
실시예 3. ADCC 활성 확인
HD201 항체의 ADCC 활성 분석은 항체의존 세포독성 분석 시험법 SOP[HD201 항체의존 세포독성 분석 assay ]에 따라 분석을 수행하였다.
Small scale 구공정 및 신공정에서의 당쇄 함량 조절용(quality(Fc N-glycan) improvement) 첨가물(망간, 글리세롤, 우리딘) 첨가하여 제조한 항체의 ADCC 활성을 In vitro 활성 측정법인 relative ADCC assay를 통하여 측정하였다. ADCC 활성의 기준 물질(대조약)은 현재 판매되고 있는 오리지날 사 제품(Herceptin® H4158B03 150mg)을 사용하였다.
HD201 항체의 ADCC 활성 분석
RUN 샘플 EC50 상대 활성 비율 (by PLA s/w)
EC50(ng/mL) Relative % 활성 비율 상대 비율
1 Herceptin H4158B03 22.6 100.0 n/a 100.0
New Process with quality(Fc N-glycan) improvement additives 20.6 109.7 1.3 130.0
2 Herceptin H4158B03 22.9 100.0 n/a 100.0
Phase I Process with quality(Fc N-glycan) improvement additives 14.5 157.9 2.2 217.5
3 Herceptin H4158B03 18.4 100.0 n/a 100.0
Phase I Process with quality(Fc N-glycan) improvement additives 25.5 72.2 0.8 78.7
4 Herceptin H4158B03 19.7 100.0 n/a 100.0
New Process without quality(Fc N-glycan) improvement additives 32.7 60.2 0.4 42.7
시험 결과는 기존과 동일한 EC50값을 통한 relative ADCC%(A) 및 PLA s/w로 계산되는 relative activity ratio를 사용한 relative ADCC activity%(B)로 나타내었으며, EC50를 사용한 결과값과 PLA를 사용한 결과값에 약간의 차이는 있으나 전체적인 경향성은 동일한 것을 알 수 있었다.
Small scale 구공정의 경우 첨가물 첨가 조건은 대조약 대비 217.5%의 ADCC 활성을 나타내었으며, 미첨가 조건은 78.7%로 대조약 대비 낮을 활성을 나타내었다. 따라서 당쇄 함량 조절용(quality(Fc N-glycan) improvement) 첨가물(망간, 글리세롤, 우리딘)를 구공정에 첨가할 경우 비푸코실화 비율을 두 배까지 높일 수 있으며, 이로 인한 ADCC 활성을 미첨가 조건 대비 100% 이상 향상시킬 수 있었다. 신공정은 첨가물 첨가 조건은 대조약 대비 130%의 ADCC 활성을 나타내었으며, 미첨가 조건은 42.7%로 대조약 대비 가장 낮은 활성을 나타내었다. 신공정은 다른 배지를 사용하는 구공정에서와 마찬가지로 당쇄 함량 조절용(quality(Fc N-glycan) improvement) 첨가물(망간, 글리세롤, 우리딘)를 첨가할 경우 비푸코실화 비율을 두 배까지 높일 수 있으며, 이로 통해 ADCC 활성을 미첨가 조건 대비 80% 이상 향상시킬 수 있었다.
상기 결과를 종합하면, 본 발명에서 글리세롤을 이용하여 항체의 비푸코실화 함량을 증진시킬 수 있음을 최초로 확인하였으며, 이를 포함하여 망간과 우리딘을 이용하여 항체의 당쇄 함량을 조절하는 공정을 개발한 것임을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (20)

  1. 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 당쇄 함량이 조절된 항체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 망간 및 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 당쇄 함량은 갈락토실(galactosylation) 함량 및 비푸코실(afucosylation) 함량으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 함량인 것인, 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 트라스투주맙(Trastzumab)인 것인, 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양은 본배양 단계 및 유가 배양 단계로 이루어지는 것인, 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제조 방법은
    (a) 글리세롤 및 망간을 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계; 및,
    (b) 상기 (a) 단계를 통해 배양한 세포를 우리딘을 추가로 포함하는 배지로 배양하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (a) 단계는 3일 내지 7일 동안 이루어지는 것인, 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 세포를 글리세롤 및 망간을 포함하는 배지에 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 (c) 배양하는 단계는 유가 배양인 것인, 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 배지는 글리세롤을 0.1 내지 5 %(v/v) 농도로 포함된 것인, 제조 방법.
  11. 제2항에 있어서, 상기 배지는 망간은 10 내지 200 μM 농도로 포함하거나, 우리딘은 1 내지 10 mM 농도로 포함하는 것인, 제조 방법.
  12. 제2항에 있어서, 상기 망간은 염화망간(manganese chloride)인 것인, 제조 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 제조 방법에 의해 제조된 항체의 당쇄 함량은 갈락토실 함량이 35 내지 50 % 범위 내이고, 비푸코실 함량이 8 내지 20 % 범위 내인 것인, 제조 방법.
  14. (a) 글리세롤 및 망간을 포함하는 배지에 항체 발현 세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계 통해 배양한 세포를 우리딘을 포함하는 배지로 배양하는 단계; 및
    (c) 글리세롤 및 망간을 포함하는 배지로 유가 배양하는 단계를 포함하는, 당쇄 함량이 조절된 항체의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 배지는 글리세롤을 0.5 내지 3 %(v/v) 농도 범위 내로 포함하고, 망간을 20 내지 120 μM 농도 범위 내로 포함하고, 우리딘을 3 내지 10 mM 농도 범위 내로 포함하는 것인, 제조 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 당쇄 함량이 조절된 항체 집단.
  17. 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는 배지에서 항체 발현 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 당쇄 함량을 조절하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 배지는 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 망간 및 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 항체 당쇄 함량을 조절하는 방법.
  19. 글리세롤을 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물로 포함하는, 항체 당쇄 함량 조절용 배지 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항체 당쇄 함량 조절용 첨가물은 망간 및 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 항체 당쇄 함량 조절용 배지.
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