JP2017511137A - 抗体の糖含量の調節を通じた抗体の製造方法 - Google Patents

抗体の糖含量の調節を通じた抗体の製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む培地で抗体発現細胞を培養する段階を含む、糖鎖含量が調節された抗体の製造方法、抗体の糖含量を目標とする含量に調節し、高品質の抗体集団（population of antibodies）を製造する方法、及び上記方法で製造された抗体集団に関する。また、グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む培地で抗体発現細胞を培養する段階を含む、抗体の糖鎖含量を調節する方法に関する。併せて、本発明は、グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む、抗体の糖鎖含量を調節する培地に関する。本発明に係る抗体の製造方法を利用すれば、抗体の糖鎖含量を調節し、目的とする高品質の抗体集団を一貫して製造することができる。また、バイオシミラー開発の面でも、本発明による方法で抗体の糖鎖含量を調節することにより、対照薬と同等性を高めた品質を有する抗体を製造することができ、これを培地組成物を通じて調節することにより調節方法が簡単になり、時間的及び経済的な面において効用性が高く、抗体製造の分野において広く使用することができる。

Description

本発明は、グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む培地で抗体発現細胞を培養する段階を含む、糖鎖含量が調節された抗体の製造方法、抗体の糖含量を目標とする含量に調節し、高品質の抗体集団（population of antibodies）を製造する方法、及び上記方法で製造された抗体集団に関する。また、グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む培地で抗体発現細胞を培養する段階を含む、抗体の糖鎖含量を調節する方法に関する。併せて、本発明は、抗体の糖鎖含量調節用添加物としてグリセロールを含む、抗体の糖鎖含量調節用培地組成物に関する。
最近の組換えタンパク質医薬品市場では、抗体治療剤、即ち、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）とＦｃ融合タンパク質が大勢を占めている。
このような抗体関連薬物の治療効能は、目的細胞の信号伝達体系を阻害し、細胞死滅（apoptosis）を直接誘導したり、ＡＤＣＣ（Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity）またはＣＤＣ（Complement Dependent Cytotoxicity）のような間接免疫メカニズムを通じて誘導することができるが、このような二つの間接免疫メカニズムを抗体の「エフェクター機能（effector functions）」と称する。新規抗体だけでなく、バイオベター、バイオシミラーの分野でもエフェクター機能は重要な問題であるため、機能の最適化、あるいはエフェクター機能のｉｎ−ｖｉｔｒｏの類似性確保のための研究が継続的に行われている。
抗体のＣＤＣに影響を与えるものは、Ｆｃ部分のガラクトシル化（galactosylation）であり、ガラクトシル化メカニズムにおいてガラクトース（Galactose）は、グリコシル化連鎖反応（glycosylation chain reaction）のbuilding blockであり、ガラクトシルトランスフェラーゼ（galactosyltransferase）によってＮ−アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）糖の後に結合し、ウリジン（uridine）はウリジンリン酸化酵素（uridine kinase）によりＵＴＰ（uridine triphosphate）に転換された後、ガラクトース-１-リン酸（galactose-1-P）と結合してガラクトシル化前駆体であるＵＤＰ−ガラクトース（UDP-galactose）となる。マンガン（Manganese、Mn2+）は、ガラクトシルトランスフェラーゼの補酵素（cofactor）であり、酵素の性能を向上させる役割を果たす。
抗体のＡＤＣＣを向上させるための研究は、抗体のＦｃ領域自体のエンジニアリングとＦｃ領域の糖鎖の改変に大別される。本発明者らは、後者のＦｃ領域の糖鎖の改変を重点的に研究し、糖含量を調節しようと試みた。多国籍製薬会社及び先進バイオ企業は糖鎖の改変技術を活用して、エフェクター機能及び持続性が向上した次世代バージョンを発売することで、継続的に市場を占有する努力をしているのに対し、同種業界の後発企業はバイオシミラー時代に歩調を合わせ、オリジナル製品と物理化学的特性だけでなく、糖鎖までも類似したバイオシミラー製品の製造に努力を注いでいる。糖鎖の成分及び構造が治療効果と人体内の滞留時間、薬理活性及び免疫反応などに大きな影響を及ぼすことがその理由として挙げられる。よって、バイオシミラー製品を開発しようとする企業は、オリジナル製品の糖鎖構造と可能な限り類似したものを製造し、同等の治療効果と安定性を有し、免疫反応などの副作用が減少した製品の研究を盛んに行っている。
既にいくつかの文献では、組換え抗体のＦｃ領域の糖鎖コアフコシル化（core fucosylation）がＡＤＣＣに重要な影響を与えると報告されており、多くの研究者がコアフコシル化を調節する方法に関する研究を行っているが、その代表的な研究成果は次の通りである。
フコシル化経路（fucosylation pathway）の前駆体（building block）であるＧＤＰ−フコース（GDP-fucose）の生合成過程及び抗体のコアフコシル化に直接関連する酵素や前駆体については、図１（非特許文献１）に示した通りである。このようなフコシル化と直接関連付けられている酵素や前駆体の合成を阻害させることにより、コアフコシル化を調節する方法が研究されてきた。
代表的なコアフコシル化関連の酵素遺伝子としては、ＧＭＤ（GDP-mannose 4、6-dehyratase）遺伝子とＦＵＴ８（Alpha-1,6-fucosyltransferase）遺伝子が知られており、これらの二つの遺伝子の発現を低下させたり、遺伝子レベルでＦＵＴ８ノックアウトさせたＣＨＯ宿主（CHO host）を作製し、フコシル化を調節する方法が紹介されている（非特許文献２）。
コアフコシル化を抑制させる他の方法としては、グリコシル化経路上でグリコシダーゼ（glycosidase）類の阻害剤を添加する方法がある（図２、 非特許文献３）。即ち、糖タンパク質が細胞内の小胞体（ER）からゴルジ体（Golgi）に移動しながらグルコシダーゼとマンノシダーゼ（mannosidase）により、高マンノーストリミング（high mannose trimming）の過程を経るが、この時、キフネシン（Kifunensine）のようなα−マンノシターゼＩ阻害剤（alpha‐mannosidase I inhibitor）を添加してオリゴマンノース型（oligo‐mannose type）の糖タンパク質を作ることによって、フコシル化を抑制する。この方法は細胞株の構築などの遺伝子レベルの調節方法よりも簡単で、時間及びコストの面においても有利である。
また、フコシル化の他の調節方法としては、培養工程で浸透圧を調節することにより、ＹＢ２／０細胞株で浸透圧が高いほど脱フコシル化レベル（defucosylation level）（deFuc%）を減少させられる方法（非特許文献４）が開示されており、ＣＨＯ細胞株の場合、浸透圧が高く、培養期間が長くなるにつれてマンノース５グリコフォーム（mannose 5 glycoform）が増加（非特許文献５）するという報告がある。マンノース５グリコフォームの増加は、脱フコシル化レベルが増加することを意味するものである。
一方、アボット（Ａｂｂｏｔｔ）社のアダリムマブ（adalimumab）特許（ 特許文献１及び 特許文献２）には、マンガンとガラクトースを用いた抗体の糖鎖調節に関する内容が開示されており、ウリジンの場合、ガラクトース化関連の既に公知となった文献はあるが、糖鎖調節においては、所望の目標含量で抗体を製造することに依然として困難があった。
ＵＳ ２０１２／０２７６６３１号公報 ＷＯ ２０１２／１４９１９７号公報
Sawa et al., 「Glycoproteomic probes for fluorescent imaging of fucosylated glycans in vivo」, PNAS, 2006, p12372 YAMANE-OHNUKI et al., 「Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells:an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity.」, BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING,2004年,p614〜622 Hossler et al., 「Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture 」, Glycobiology,2009,p939 Yoshinobu et al., Cytotechnology, 2012, p249 〜265 Efren Pacis et al., BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING,2011,p1078〜1088 Rodriguez et al., 2005,Chi-Hsien Liu 2007
抗体の糖鎖調節を通じてＡＤＣＣ活性を高める技術に関する開発が強く求められている背景の下、本発明者らは、バイオシミラー抗体医薬品の製造の際、精製産物に抗体の糖鎖含量が一定に維持される方法を開発するために、鋭意努力した結果、培養工程の添加物を開発して抗体の糖鎖含量を所望の割合に調節し、高品質または同等性が確保された抗体集団を一貫して製造する方法を開発し、本発明を完成した。
具体的には、本発明者らは、組換え抗体の生産において、培養工程に添加物及び条件を調節して抗体の糖鎖含量（ガラクトシル化、非フコシル化）を調節する方法をにより抗体のＡＤＣＣ活性を高めようとした結果、グリセロールが非フコシル化レベル（fucosylation level）を高め、バイオシミラーの開発の際に、対照薬と類似したレベルに高めることができることを確認した。また、添加物としてグリセロール、マンガン及びウリジンを利用することができることを確認し、他の培地を使用する旧工程及び新たに最適化された工程においても類似の効果があることを確認することにより、上記添加物及び条件が、抗体の糖鎖含量を調節して抗体を製造する方法として広く活用され得ることを確認した。
本発明の一つの目的は、グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む培地で抗体発現細胞を培養する段階を含む、糖鎖含量が調節された抗体の製造方法を提供することにある。
本発明の他の一つの目的は、前記の方法で製造され、糖鎖含量が調節された抗体集団を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む培地で抗体発現細胞を培養する段階を含む、抗体の糖鎖含量を調節する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む、抗体の糖鎖含量調節用培地組成物を提供することにある。
本発明に係る抗体の製造方法を利用すれば、抗体の糖鎖含量を調節して目的とする 高品質の抗体集団を一貫して製造することができる。また、バイオシミラーの開発の面でも、本発明による方法で抗体の糖鎖含量を調節することにより、対照薬との同等性を高めた高品質の抗体を製造することができ、これを培地組成物で調節することにより調節方法が容易となり、時間的及び経済的な面で効用性が高く抗体製造の分野において広く用いることができる。
フコシル化経路（fucosylation pathway）の前駆体（building block）であるＧＤＰ−フコース（GDP-fucose）の生合成過程及び抗体のコアフコシル化に直接関連する酵素や前駆体に関する模式図である。 グリコシル化経路（glycosylation pathway）を開示した模式図である。 非フコシル化誘導添加物条件の実験細胞成長曲線を測定した図である。 非フコシル化誘導添加物条件の実験細胞生存率を測定した図である。 非フコシル化誘導添加物条件の実験の最終発現量を測定した図である。 非フコシル化誘導添加物条件の実験で生産された抗体のガラクトシル化グリコフォーム（glycoform）の相対含量をグラフで表した図である。 非フコシル化誘導添加物条件の実験で生産された抗体の非フコシル化（afucosylation）グリコフォームの相対含量をグラフで表した図である。 未添加条件である対照群（Control）に比べたガラクトシル化及び非フコシル化抗体の増減の程度を比較分析した結果をグラフで表した図である。 マンガン（Ｍ）、ガラクトース、ウリジン（Urd）の個別または混合添加条件の実験において、細胞成長曲線を測定した図である。 マンガン（Ｍ）、ガラクトース、ウリジン（Urd）の個別または混合添加条件の実験において、細胞生存率を測定した図である。 マンガン（Ｍ）、ガラクトース、ウリジン（Urd）の個別または混合添加条件の実験において、最終発現量を測定した図である。 マンガン（Ｍ）、ガラクトース、ウリジン（Urd）の個別または混合添加条件の実験において、ガラクトシル化の含量を計算して示したグラフである。 マンガン（Ｍ）、ガラクトース、ウリジン（Urd）の個別または混合添加条件の実験において、非フコシル化含量を計算して示したグラフである。 未添加条件である対照群（Control）に比べたガラクトシル化及び非フコシル化抗体の増減の程度を比較分析した結果をグラフで表した図である。 グリセロール添加濃度による（Ａ）細胞成長曲線と（Ｂ）細胞生存率を測定した結果をグラフで表した図である。 グリセロール添加濃度による最終抗体発現量を測定した図である。 グリセロール添加濃度による糖鎖含量分析の結果として（Ａ）ガラクトシル化及び（Ｂ）非フコシル化糖鎖含量を測定した図である。 新工程のガラクトシル化及び非フコシル化同時誘導のための添加物の混合フラスコ培養実験において、（Ａ）細胞成長曲線と（Ｂ）細胞生存率を測定した結果をグラフで表した図である。 新工程のガラクトシル化及び非フコシル化同時誘導のための添加物の混合フラスコ培養実験において、最終抗体発現量を測定した図である。 新工程のガラクトシル化及び非フコシル化同時誘導のための添加物の混合フラスコ培養実験において、糖鎖含量分析の結果として（Ａ）ガラクトシル化及び（Ｂ）非フコシル化糖鎖含量を測定した図である。 新工程のガラクトシル化及び非フコシル化同時誘導のための添加物の混合フラスコ培養実験において、糖鎖含量分析の結果としてガラクトシル化／非フコシル化の差（percent change）を測定した図である。 グリセロール添加濃度によるバイオリアクター（Bioreactor）培養実験の（Ａ）細胞成長曲線と（Ｂ）細胞生存率を測定した結果をグラフで表した図である。 グリセロール添加濃度によるバイオリアクター培養実験の最終抗体発現量を測定した図である。 グリセロール添加濃度によるバイオリアクター培養実験の糖鎖含量分析の結果として（Ａ）ガラクトシル化及び（Ｂ）非フコシル化糖鎖含量を測定した図である。 グリセロール添加濃度によるバイオリアクター培養実験の糖鎖含量分析の結果としてガラクトシル化／非フコシル化の差（percent change）を測定した図である。 新工程添加物の最終選定及び３つのバッチ（3 batches）バイオリアクター実験の（Ａ）細胞成長曲線と（Ｂ）細胞生存率を測定した結果をグラフで表した図である。 新工程添加物の最終選定及び３つのバッチ（3 batches）バイオリアクター実験の最終抗体発現量を測定した図である。 新工程添加物の最終選定及び３つのバッチ（3 batches）バイオリアクター実験の糖鎖含量分析の結果として（Ａ）ガラクトシル化及び（Ｂ）非フコシル化糖鎖含量を測定した図である。 新工程添加物の最終選定及び３つのバッチ（3 batches）バイオリアクター実験の糖鎖含量分析の結果としてガラクトシル化／非フコシル化の差（percent change）を測定した図である。 添加物構成の旧工程（臨床第１相工程）の適用効果を確認する実験の（Ａ）細胞成長曲線と（Ｂ）細胞生存率を測定した結果をグラフで表した図である。 添加物構成の旧工程（臨床第１相工程）の適用効果を確認する実験の最終抗体発現量を測定した図である。 添加物構成の旧工程（臨床第１相工程）の適用効果を確認する実験の糖鎖含量分析の結果として（Ａ）ガラクトシル化及び（Ｂ）非フコシル化糖鎖含量を測定した図である。 添加物構成の旧工程（臨床第１相工程）を適用効果を確認する実験の糖鎖含量分析の結果として、対照群に比べたガラクトシル化／非フコシル化の差（percent change）を測定した図である。 添加物構成の旧工程（臨床第１相工程）に比べた添加効果を確認する実験の糖鎖含量分析の結果として、旧工程試料に比べたガラクトシル化／非フコシル化相乗効果を（percent change）を測定した図である。 非フコシル化（afucosylation）誘導添加物の選別のためのフラスコ培養実験における３つのバッチ（3 batches）バイオリアクター実験の糖鎖含量分析の結果として（Ａ）ガラクトシル化及び（Ｂ）非フコシル化糖鎖含量を測定した図である。
上記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、高品質または同等性が確保された抗体集団を一貫して製造することができる方法を提供するものであり、培養培地に添加物を添加して抗体の糖鎖含量を調節して所望の糖鎖含量を有する抗体を含む抗体集団を製造する方法を提供し、特に上記抗体の糖鎖含量の調節は、ガラクトシル化（galactosylation）または非フコシル化（afucosylation）を調節するものであってもよい。
具体的には、本発明は抗体の生産工程において、培養培地にグリセロール、マンガン及びウリジンからなる群から選択された一つ以上の添加物を添加して抗体のガラクトシル化、非フコシル化またはガラクトシル化／非フコシル化含量を調節するものであってもよく、特にグリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む培地で抗体発現細胞を培養する段階を含む、糖鎖含量が調節された抗体の製造方法であってもよい。また、本発明において、培地はグリセロールだけでなく、抗体の糖鎖含量調節用添加物としてマンガン及びウリジンからなる群から選択された一つ以上をさらに含むものであってもよい。
本発明における「抗体」とは、免疫系内において抗原の刺激により作られる物質であり、特定の抗原と特異的に結合してリンパや血液中を流れ、抗原抗体反応を起こす物質を意味する。本発明の抗体は、これに限定されないが、好ましくは、当該分野において通常用いられる治療用抗体を全て含むことができ、より好ましくは、ＨＥＲ−２（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2）を標的とする抗体であるトラスツズマブ（trastuzumab）またはペルツズマブ（pertuzumab）であり、最も好ましくはトラスツズマブ（trastuzumab）である。上記トラスツズマブは、ハーセプチン（Herceptin）とも呼ばれ、乳癌の細胞で主に発現されるＨＥＲ２／ｎｅｕに対する抗体治療薬として知られている、米国のＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社が開発したＨＥＲ２に対するヒト化抗体である。
本発明において、抗体発現細胞は目的とする抗体を発現する天然型または形質転換細胞を制限なく含む。本発明の目的上、糖鎖含量調節の対象となる抗体を発現する細胞であってもよく、本発明の一実施例では、トラスツズマブを発現するＨＤ２０１細胞株（寄託番号：ＫＣＴＣ １２１６４ＢＰ、寄託日：２０１２／０３／１９、寄託場所：韓国生命工学研究院／微生物資源センター）であってもよい。上記抗体を生成する細胞は、好ましくは動物細胞であり、例えば、中国のハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）またはマウス骨髄腫細胞株（ＮＳＯ）であってもよい。
本発明における「形質転換（transfection）」とは、培養動物細胞にＤＮＡを直接導入して細胞の遺伝形質を変化させる方法であり、一般に、目的とする遺伝子をプラスミドなどの媒介体に入れて導入する方法を用いる。上記形質転換は、当分野の通常の方法によって行うことができ、好ましくはリン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、電気穿孔法、再分布法などであってもよい。
本発明における「抗体集団（a population of antibodies）」とは、糖鎖含量が多様となりうる抗体を含む抗体群を意味し、本発明の目的上、上記抗体集団はガラクトシル化抗体、非フコシル化抗体、ガラクトシル化／非フコシル化抗体を目的とする割合で含む抗体群を意味する。上記抗体集団は一種類の抗体のみを含むか、またはガラクトシル化された抗体もしくはガラクトシル化されていない抗体、及び非フコシル化された抗体もしくは非フコシル化されていない抗体のいずれをも含む抗体群をすべて含む。本発明の目的上、上記の抗体集団は、好ましくは、本発明の製造方法を通じて糖鎖含量の調節された抗体群を意味する。
本発明における糖鎖含量は、ガラクトシル（Galactosylation）含量及び非フコシル（afucosylation）含量からなる群から選択された一つ以上の含量であってもよい。
本発明におけるガラクトシル含量とは、ガラクトースが結合された糖鎖を有する抗体の含量を意味し、非フコシル含量とは、フコシル残基が除去された状態の糖鎖を有する抗体の含量を意味する。ガラクトシル化と非フコシル化は、抗体のＡＤＣＣ及びＣＤＣに大きな影響を与える重要な改変（modification）として広く知られている。
バイオシミラーを開発するためには、品質（糖鎖含量）の面で対照薬と高い同等性を有する結果を製造することが最も重要な開発ポイントの一つである。
本発明者らは、トラスツズマブ（Trastuzumab）の遺伝子を用いて発現収得した組換えタンパク質の対照薬（オリジナル社製）とのＮ−グリカン（N-glycan；ガラクトシル化及び非フコシル化）の類似性を高めるための研究を継続的に行った。トラスツズマブを製造する場合、培養条件に応じてＮ−グリカンの含量、特にガラクトシル含量及び非フコシル含量が相対的に対照薬より低い分布を有することを確認した。特に非フコシル含量は抗体の活性（ADCC）に非常に重要な指標であるため、非フコシル含量を上昇させて対照薬と同等の品質に合わせるための培養工程の添加物の研究を行った。
具体的には、本発明は新工程を開発する過程で生産された抗体のＡＤＣＣ（Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity）活性を測定した結果、対照薬の６０〜８０％レベルのと低いものから始められた。前述したように、ＡＤＣＣ活性に重要な役割を果たす非フコシル化レベル（afucosylation level）をＮ−グリカンの分析を通じて確認した結果、対照薬は８〜１０％の範囲であり、ＨＤ２０１抗体は、５〜７％の範囲に過ぎないことを確認した。これにより、本発明者らはガラクトシル含量と非フコシル含量を増やすために実験を行った。
本発明に先立ち、ガラクトシル化を誘導するために糖前駆体を添加した条件の実験を行った結果、分析結果からガラクトシル化効果は大きくなかったが、非フコシル化含量が高く示されたガラクトース＋マンガン（Ｍｎ２＋）の条件をもとにして、他の条件に変化を与えて糖鎖含量（品質）の変化を確認しようとした。
これにより、本発明の具体的な一実施例では、マンガン（Ｍｎ２＋）とガラクトースを添加した条件に非フコシル化誘導添加物添加条件と、マンガン（Ｍｎ２＋）とガラクトースを添加しない条件に添加物を添加した条件とに分けて実験を行った結果、対照薬とのガラクトシル化レベルを合わせるためには、マンガン（Ｍｎ２＋）とガラクトース両方の原料を添加する必要があることを確認し、グリセロールが非フコシル化に影響を与えることを確認した。グリセロールと非フコシル化現象（afucosylation effect）に関連する技術は、既存に知られていないもので、本発明者らが初めて開発したものである。
グリセロール添加の適正濃度を決定するために、０〜３．０％（ｖ／ｖ）の濃度範囲で実験を行い、グリセロール添加濃度が増加するほど抗体の非フコシル化含量が共に増加することを確認した。特に、相対的に非フコシル含量は高めながら、未添加条件に比べて培養性能は類似する濃度範囲を調べた結果、グリセロール濃度範囲１％〜２％で優れた効果を有することを確認した。
また、本発明の具体的な一実施例では、前記ガラクトースの含量を促進させるための添加物としてマンガンとガラクトース以外に代替可能な物質を探索し、ウリジンを候補として選択して実験を行った。それぞれ三つの原料を単独で添加した条件のうち、マンガン添加条件のＧ０Ｆ比率（ratio）Ｇ１Ｆ比率（ratio）がガラクトース、ウリジン単独添加の条件よりも対照薬に近い値を示したため、マンガンが新工程でガラクトシル化の主要な因子であることを確認することができた。一方、ウリジン単独添加条件の場合、添加濃度が増加するほどガラクトシル含量が増加することを確認することができたが、高濃度添加条件（８ｍＭ）で成長阻害現象及び発現量の低下現象が確認されたため、培養初期に高濃度のウリジンを添加することは、新工程に不適切なものと判断された。非フコシル化の観点からマンガン、ガラクトース、そしてウリジンの三つの原料を比較した結果、マンガンとガラクトースは関連性があまりなく、ウリジンの場合、添加濃度が増加するほど、非フコシル含量が増加することが確認された。
新工程のマンガン、ガラクトース及びウリジン添加条件の実験を通じて、抗体のガラクトシル化の最も重要な因子はマンガンであることを確認し、ガラクトースをウリジンに代替したとき、ガラクトシル化と非フコシル化の面で改善された工程を設計することができる可能性を見出した。したがって、本発明者らは対照薬とガラクトシル化だけでなく、非フコシル化の同等性をも高めるために、マンガン、ウリジン及びグリセロールの混合添加の条件を適用して実験を行った。
本発明の具体的な一実施例では、これまでに行われた添加物条件実験の結果を組み合わせて、抗体（Trastuzumab）が対照薬（Herceptin（登録商標））と最も類似したガラクトシル化とフコシル化パターンとなるように調節するために実験を行った。抗体の糖鎖含量調節用添加物としてガラクトシル化向上の主要因子添加物であるマンガンと非フコシル化誘導添加物であるグリセロール、最終的にはガラクトースを代替することができ、ガラクトシル化と非フコシル化の補助因子添加物であるウリジンを用いて実験を設計した。
ウリジンの場合、高濃度で添加すると非フコシル化を促進するのに対して、成長阻害による発現量が低下するという欠点があることを確認したところ、培養５日目にウリジンを別途に添加して成長阻害及び高マンノース生成（high mannose form）の増加を最小限に抑えることができようにした。
マンガンの場合、ガラクトース化を促進する効果が最も大きいことを確認し、２０〜１２０μＭの濃度範囲で類似した効果を示した。また、グリセロールは、非フコシル化効果が確認された１％〜３％の濃度範囲で添加濃度に比例する効果が確認された。
３つの要素を混合して添加物を処理した結果、ウリジンの場合、ガラクトシル化を向上させる効果が確認され、ガラクトースの代替が可能であると判断され、若干でありながらも非フコシル化を向上させる結果も確認された。一方、フラスコ培養実験において、対照薬（Herceptin H0717）と最も類似した条件は、４０μＭのマンガン＋１％のグリセロールの組み合わせに基づいて、ウリジンを添加（培養５日目）する条件であることが分かった。
一方、バイオリアクター培養実験の結果、本培養の培地に１％よりは２％のグリセロールを添加することが、非フコシル化の観点から対照薬（Herceptin）との類似性が高いことが確認ができた。非フコシル化（％）で対照薬を「１」と見たとき、旧工程試料の非フコシル化の比率は０．４３であり、２％のグリセロール添加の条件は、０．８６で対照薬に比べてやや低いが、旧工程試料より実に２倍増加したことを確認した。
糖鎖調節（galactosylation and afucosylation）改善添加物のバイオリアクターの条件実験の結果から、グリセロール２％を添加したとき、Ｎ−グリカンプロファイル上で旧工程試料に比べた非フコシル比率を高めるのに効果があり、ガラクトシル化の面では、マンガンとウリジンを添加したときにガラクトシル化改善効果が確認された。しかし、対照薬（Herceptin）との完全な同一性を示すのもではないため、グリセロールとウリジンの添加濃度及び方法を変更してみた。
まず、グリセロールの場合、添加の効果を高めるために、流加培地（feed media）にも２％のグリセロールを添加してフィーデイング（feeding）を試みた。ウリジンの場合、ガラクトースを代替して添加することにより、ガラクトシル化効果を高めるために添加する濃度を４ｍＭから８ｍＭに高めて添加した。また、ウリジンを添加したスラスコ実験において培養最終日のｐＨを測定した結果、ｐＨ６．９のレベルで示されたため、ウリジン添加後の培養ｐＨをｐＨ６．８からｐＨ６．９に調節した。バイオリアクターでは、ｐＨ ６．８を維持するためにＣＯ２ ガスを供給するので、培養４日目からｐＣＯ２が継続的に増加する傾向があり、培養５日目に１００ｍｍＨｇ以上に急激に増加することを確認したところ、ｐＣＯ２が高ければグリコシル化に否定的な影響を与えるという文献（Kimura R、1997）を参考にして培養５日目に、本培養ｐＨをｐＨ６．９に上げると、ｐＣＯ２の量が減少した。このような事項を反映して新工程の添加物に対する選定として３つのバッチ（3 batches）のすべてに同一に、本培養培地に糖鎖含量調節用（quality improvement）添加物である４０μＭのマンガン（Ｍ）及び２％（ｖ／ｖ）のグリセロール（Ｇｃｒ）を添加し、本培養５日目にウリジン（Ｕｒｄ）８ｍＭを添加して培養を行うように実験を設計した。その結果、４０μＭのマンガンと２％のグリセロールに基づいて、８ｍＭのウリジンを培養５日目に添加する条件で新工程を設計した。また、同様な条件で３つのバッチ（3 batches）のバイオリアクター培養を通じて生産される抗体のグリコシル化含量を確認し、各バッチ別に本培養８日目の試料のＮ−グリカンプロファイルを旧工程と比較した結果、ＨＤ２０１Ｐ−１１０２ ｒｅｆ．（In-house standard）のガラクトシル化（Sum of all oligosaccharide with galactose）（％）は３３．９％であり、新工程の３つのバッチ（3 batche）のガラクトシル化（％）は４１．８〜４２．２％で８％程度に高い数値を示した。また、非フコシル化（Sum of all oligosaccharide without fucose）（％）の場合は、ＨＤ２０１Ｐ−１１０２の試料が３．８％であり、新工程の３つのバッチは９．１〜９．５％で６％程度改善された数値を示した。対照薬（Herceptin）と比較した結果、対照薬（Herceptin Lot.H0717）のガラクトシル化（％）は４３％で新工程３つのバッチのガラクトシル化（％）との差が２％未満であり、非フコシル化（％）は８．９％で新工程との差が２％未満で示されたため、対照薬との同等性の面でその効果を確認することができた。オリゴ−マンノース型（Sum of all oligosaccharide with mannose）の場合、対照薬は１．７％で、新工程のオリゴ−マンノース型（４％）が２％ほど高いことを確認することができた。
さらに新工程で設計した糖鎖含量調節用（Fc N-glycan quality improvement）添加物（マンガン、グリセロール、ウリジン）に対して、小規模のバイオリアクターで旧工程（互いに異なる培地環境）に同時に適用し、グリコシル化プロファイル（galactosylation/afucosylation）が調節されるかを確認した。グリセロールの場合、新工程で本培養の培地と流加培地の両方に２％のグリセロールを添加したが、今回の実験では、グリセロール添加濃度を３％に高めて添加した。バイオリアクター本培養回収試料のうち、旧工程に添加物添加条件と未添加条件のＮ−グリカンプロファイルを比較した結果、ガラクトシル化（％）は添加物添加条件が４３．８％、未添加条件が４３％であり、１％程度増加したことを確認した。非フコシル化（％）の場合は、添加物添加条件が１８．７％、未添加条件が９．１％であり、約２倍増加したことが確認された。また、新工程に添加物添加条件と未添加条件を比較した結果、ガラクトシル化（％）は添加物添加条件が４０．５％、未添加条件が３１．８％であり、８％程度増加した。非フコシル化（％）の場合、添加物添加条件が１４．１％、未添加条件が６．１％であり、旧工程と同様に２倍以上増加したことが確認された。
本発明で開発した糖鎖含量調節用（Fc N-glycan quality improvement）添加物（マンガン、グリセロール、ウリジン）を添加する工程が新工程だけでなく、旧工程にも類似した効果があることが分かった。
ＨＤ２０１抗体のＡＤＣＣ活性の分析は、抗体依存細胞毒性分析試験法ＳＯＰ ［ＨＤ２０１抗体依存細胞毒性分析ａｓｓａｙ ］に基づいて分析を行った。
また、本発明の具体的な一実施例では、本発明の糖鎖含量調節用添加物（マンガン、グリセロール、ウリジン）を添加して製造した抗体のＡＤＣＣ活性を、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性測定法であるｒｅｌａｔｉｖｅ ＡＤＣＣ ａｓｓａｙにより測定した。ＡＤＣＣ活性の基準物質（対照薬）は、現在販売されているオリジナル社製（Herceptin）を使用した。試験結果は、既存の同一なＥＣ５０値を通じたｒｅｌａｔｉｖｅ ＡＤＣＣ％（Ａ）及びＰＬＡ ｓ／ｗで計算されるｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒａｔｉｏを使用したｒｅｌａｔｉｖｅ ＡＤＣＣ ａｃｔｉｖｉｔｙ％（Ｂ）で示し、ＥＣ５０を使用した結果値とＰＬＡを使用した結果値に若干の差はあるが、全体的な傾向は、同一であることが分かった。
小規模の旧工程の場合、添加物添加条件は、対照薬に比べて２１７．５％のＡＤＣＣ活性を示し、未添加条件は、７８．７％で対照薬比低い活性を示した。したがって、糖鎖含量調節用（Fc N-glycan quality improvement）添加物（マンガン、グリセロール、ウリジン）を旧工程に添加する場合、非フコシル化率を二倍まで高めることができ、これによるＡＤＣＣ活性を未添加条件に比べて１００ ％以上向上させることができた。新工程は、添加物添加条件は、対照薬比１３０％のＡＤＣＣ活性を示し、未添加条件は、４２．７％で対照薬比の最も低い活性を示した。新工程は、他の培地を使用している旧工程と同様に糖鎖含量を調節する（Fc N-glycan quality improvement）添加物（マンガン、グリセロール、ウリジン）を添加した場合、非フコシル化率を二倍まで高めることができ、これにより、ＡＤＣＣ活性を未添加条件に比べて８０％以上向上させることができた。
本発明の実施例で確認した通り、本発明の糖鎖含量調節用添加物を利用したトラスツズマブ製造工程を行う場合、抗体の糖鎖含量の調節が十分に可能であることを確認した。特にグリセロールの場合、国内または外国においても非フコシル化現象関連の研究や文献で報告されておらず、本発明者らは上記実験結果に基づいてグリセロールを用いた糖鎖含量の調節による抗体の製造方法を初めて開発した。
本発明において、培養は、抗体発現細胞に応じて適切な温度、培地、気体条件で当業者に公知の方法で行うことができ、回分培養、流加培養、連続式培養またはこれらの組み合わせなど、本発明の抗体の製造方法に適用可能な方法に制限されない。
本発明の製造方法は、（ａ）グリセロール、及びマンガンを含む培地で抗体発現細胞を培養する段階、及び（ｂ）上記（ａ）段階を通じて培養した細胞をウリジンをさらに含む培地で培養する段階を含むものであってもよく、特に、（ｃ）上記（ｂ）段階で培養された細胞をグリセロール及びマンガンを含む流加培地を添加して培養する段階をさらに含むものであってもよい。上記（ａ）段階は、３日〜８日間行われるものであってもよく、本発明の一実施例では、培養５日目にウリジンを処理した。
また、本発明の製造方法は、（ａ）グリセロール、及びマンガンを含む培地に抗体発現細胞を培養する段階、（ｂ）上記（ａ）段階を通じて培養した細胞をウリジンを含む培地で培養する段階、及び（ｃ）グリセロール及びマンガンを含む培地で、流加培養する段階を含むものであってもよい。
一方、上記（ａ）と（ｂ）段階を回分式培養で行われてもよく、上記（ｃ）段階は、流加式培養で行われてもよいが、これに限定されない。
また、本発明の製造方法は、細胞培養液から抗体を精製する段階をさらに含むものであってもよく、抗体を精製する方法は、当業界で周知の様々な方法、例えば、プロテイン Ａ／Ｇカラム、ＨＰＬＣなどの方法を通じて行ってもよい。
本発明の培地は、グリセロールを０〜１０％、あるいは０．１〜５％（ｖ／ｖ）の濃度範囲内で含むものであってもよく、特に０．５〜３％（ｖ／ｖ）の濃度範囲内で含むものであってもよく、また、上記培地はマンガンを０〜２５０μＭ、あるいは１０〜２００μＭの濃度範囲内で含むものであることができ、特に２０〜１２０μＭの濃度範囲内で含むものであってもよい。併せて、上記培地は、ウリジンを０〜２０ｍＭ、または１〜１０ｍＭの濃度の範囲内に含むものであってもよく、特に４〜８ｍＭの濃度範囲内に含むものであってもよい。
特に、本発明の培地は、グリセロールを０．５〜３％（ｖ／ｖ）の濃度範囲内に含み、マンガンを２０〜１２０μＭの濃度範囲内に含み、ウリジンを３〜１０ｍＭの濃度の範囲内に含むものであってもよい。
本発明のマンガンは、人体に無害である限り、形態に限定されないが、例えば、塩化マンガン（Maganese chloride）であってもよい。
本発明において、本発明の培地に含まれる糖鎖含量調節用添加物は、培地の最終濃度を基準にグリセロール（％、ｖ／ｖ）：マンガン（μＭ）の比は０．５：２０、１：２０、２：２０、３ ：２０、０．５：４０、１：４０、２：４０、３：４０、０．５：８０、１：８０、２：８０、３：８０、０．５：１２０、１：１２０、２：１２０または３：１２０であってもよい。また、本発明において、本発明の培地に含まれ、糖鎖含量調節用添加物を構成する培地の最終濃度に基づいて、ウリジンは２〜８ｍＭであってもよい。
本発明の具体的な一実施例では、本発明の糖鎖含量調節用添加物は、培地の最終濃度を基準にグリセロール（％、ｖ／ｖ）：マンガン（μＭ）：ウリジン（ｍＭ）の比が１．０：４０：８０または２．０：４０：８０の場合に、既存対照薬Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎと類似した程度の糖鎖含量を有することを確認した。
本発明の製造方法は、製造方法で製造された抗体の糖鎖含量がガラクトシル含量が３５〜５０％の範囲内であり、非フコシル含量が８〜２０％の範囲内であるものであってもよい。
もう一つの態様として、本発明は、上記方法で製造された、糖鎖含量が調節された抗体集団を提供する。
上記方法、抗体集団及び糖鎖含量が調節された抗体集団については、上記で説明した通りである。
もう一つの態様として、本発明は、グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む培地で抗体発現細胞を培養する段階を含む、抗体の糖鎖含量を調節する方法を提供し、上記培地は糖鎖含量調節用添加物にマンガン及びウリジンからなる群から選択された一つ以上をさらに含むものであってもよい。
上記糖鎖含量、抗体、抗体発現細胞、培養などは、上記で説明した通りである。
本発明のもう一つの目的は、グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む、抗体の糖鎖含量調節用培地組成物を提供することにある。
上記糖鎖含量、抗体などは、上記で説明した通りである。
本発明の抗体の糖鎖含量調節用培地組成物において、前記抗体の糖鎖含量調節用添加物として、マンガン及びウリジンからなる群から選択された一つ以上をさらに含むものであってもよい。
本発明における「培地」とは、増殖性細胞に栄養を供給する栄養素含有溶液を幅広く意味し、このような溶液は、一般に、細胞が増殖及び／または生存に必要な必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、炭素源、脂質並びに微量元素などを含むが、これに限定されない。上記培地は、培養しようとする細胞の種類に応じて、細胞の生存及び増殖に最適なｐＨ及び塩濃度で製造されることが好ましく、ホルモン及び成長因子をはじめとして増殖及び／または生存を増加させる成分として当業界において広く使用される材料をさらに含むことができる。
また、本発明の培地に抗体の糖鎖含量調節用添加物を除外して含まれる成分は、当業界において抗体産生に広く使用される任意の成分を含むことができ、これは当業者が、当業界の常識または実験によって容易に構成することができる。
本発明の具体的な一実施例では、本培養では、Ｍｅｄｉａ Ａに基づいて添加剤を調整して培養し、流加の培養では、Ｆｅｅｄ Ｃに基づいて添加剤を調節して培養した。
以下、本発明を実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：抗体の糖鎖調節のための添加物の実験
１−１．非フコシル化誘導添加物の選別のためのフラスコ培養実験
ガラクトシル化を誘導するために糖前駆体（glucosamine、N-acetylglucosamine、N-acetylmannosamine、galactose、uridine Manganese(Mn2+)、glycerol）を添加した条件で実験を行った。その結果、図３５の実験データの分析結果から確認できるようにガラクトシル化効果は大きくなかったが、非フコシル化含量が高く示された。上記結果に基づいて、以降の研究でガラクトシル化関連の効果が知られたガラクトース＋マンガン（Ｍｎ２＋）の条件に添加物を併用投与する実験を通じて変化を確認しようとした。また、単独で効果のある因子の発見のためにガラクトース＋マンガン（Ｍｎ２＋）を取り除いた条件を並行して行った。
具体的には、マンガン（Ｍｎ２＋）とガラクトースを添加した条件に非フコシル化誘導添加物を処理した条件と、マンガン（Ｍｎ２＋）とガラクトースを添加していない条件に非フコシル化誘導添加物を処理条件に分けて実験を行った。
ガラクトースは、２００ｇ／Ｌのｓｔｏｃｋを製造して使用し、塩化マンガン・４水（Ｍｎ２＋）は、４０ｍＭｓｔｏｃｋを製造して使用した。本培養の培地（production media）に添加されるマンガンとガラクトースはフラスコ本培養体積である３５ｍＬを基準として濃度を希釈して添加し、流加培地（feed media）は、各条件当り２０ｍＬずつ別途に小分けした後、２０ｍＬの体積を基準としてｓｔｏｃｋを希釈して添加した。
非フコシル化誘導添加物であるグルコサミン（glucosamine）とＮ−アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）は、それぞれ１Ｍ ｓｔｏｃｋを製造して使用し、グリセロールは原液を１００％とみなして体積比（ｖ／ｖ、％）で添加し、ナトリウムブチレート（Sodium butyrate）は、５０ｍＭ ｓｔｏｃｋ、ラクトースは、５０ｇ／Ｌ ｓｔｏｃｋにそれぞれ製造して１／１００に希釈して使用した。キフネシン（Kifunensine）の場合、α−マンノシダーゼＩ阻害剤（alpha-mannosidase Ｉ inhibitor）で非フコシル化効果が既知の物質で１００μｇ／ｍＬの濃度で製造して使用した（Qun Zhou et al., 2008; US 2007 / 0092521 A1）。
上記の実験条件を整理すると、下記の表１の通りである。
１−２．非フコシル化誘導添加物のフラスコ培養実験における細胞培養の結果
非フコシル化誘導添加物の選別のためのフラスコ培養で細胞成長プロファイル、細胞生存率プロファイル、最終発現量プロファイル（titer profile）を測定した。
図３で見られるように、細胞成長プロファイルを測定した結果、マンガンとガラクトース未添加条件（Control）が最も良く、０．５ｍＭのナトリウムブチレートを添加する場合には、成長阻害現象が観察された。
図４で見られるように、細胞生存率プロファイルを測定した結果においても、ナトリウムブチレート添加条件の場合、培養終了時点での生存率が８０％以下と落ち、キフネシン（Kifunensine）１０ｎｇ／ｍＬでマンガンとガラクトースを共に添加した条件では、生存率が培養終了まで７７％まで低下することを確認した。その他の添加物の条件で細胞成長プロファイルと細胞生存率プロファイルは同様の傾向を示した。
一方、非フコシル化誘導添加物条件の実験で対照群（control）に比べ、最終発現量（titer profile）を測定した結果、グルコサミン添加、Ｎ−アセチルグルコサミン添加、またはグリセロール添加の条件で、対照群に比べて１．１倍のレベルに増加することを確認した。一方、ナトリウムブチレートを添加した場合には、発現量が０．８倍と、他の条件に比べて低く、これは上記細胞成長と細胞生存率の減少による発現量の低下に起因するものと判断される。
１−３．抗体の糖鎖含量分析
抗体の糖鎖含量を分析するために抗体Ｎ−グリカン（N-glycan）の分析を行った。具体的には、Ｎ−グリカンの分析は、ＨＤ２０１ Ｎ−グリカン試験法ＳＯＰ［ＨＤ２０１のＮ−グリカンＮＰ−ＵＰＬＣ試験法］により抗体のＰＮＧａｓｅを処理してＮ−グリカン構造体のみを分離して分析を行った。ガラクトシル化と非フコシル化グリコフォームを分析し、それぞれの計算された相対含量をグラフで示した（図６及び図７）。また、さらに、未添加条件である対照群（control）に比べたガラクトシル化及び非フコシル化増減の程度を比較分析した結果もグラフで示した（図８）
その結果、図６〜図８で確認できるように、マンガンとガラクトースを添加した条件と未添加条件との間の最大の差は、ガラクトシル化含量の差であり、両原料を添加した条件で未添加対照群よりガラクトシル化相対含量が大部分高いことを確認することができた。一方、両原料を添加していない場合には、対照群に比べて類似または低いことが確認できた。この結果を見ると、ガラクトシル化含量を高めるためにマンガンとガラクトースの両原料の添加が必要であることを再確認することができた。
１−４．マンガン（Ｍ）、ガラクトース、ウリジン（Ｕｒｄ）の個別または混合添加による抗体の糖鎖変化確認実験
既存の抗体の糖鎖含量調節のための方法（例えば、Ａｂｂｏｔｔ社の特許文献１、特許文献２）としてマンガンとガラクトースを利用する方法が開示されている。本実験では、マンガンとガラクトース以外に、他の物質で両原料に対して代替可能な材料を見出すために実験を行った。
旧工程は、開発の初期に臨床第１相試料の生産のための工程であり、新工程は工程改善により第３相工程を目指して開発された工程である。新工程と旧工程は、本培養の培地と流加培地が異なり、また、本特許の添加物は、新工程開発の過程でオリジナル社製に比べて糖鎖形成パターン、特に非フコシル化含量を類似するように製造し、抗体の活性を増加させようとした。
ガラクトースは、２００ｇ／Ｌ ｓｔｏｃｋを製造して使用し、塩化マンガン・４水（Ｍｎ２＋）は、４０ｍＭ ｓｔｏｃｋを製造して使用した。本培養の培地に添加されるマンガンとガラクトースはフラスコ本培養体積である３５ｍＬを基準として濃度を希釈して添加し、流加培地は、各条件当り２０ｍＬずつ別途に小分けした後、２０ｍＬの体積を基準としてｓｔｏｃｋを希釈して添加した。
実験を行った条件は、下記表２の通りである。
その結果、図９で確認できるように、フラスコ培養の結果、マンガンとガラクトースを添加した条件で細胞成長プロファイルは、大部分類似した傾向を示し、添加物未添加条件（Control）がマンガンのみ４０μＭ添加した条件のｐｅａｋ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙが最も高かった。ウリジン（Ｕｒｄ）添加条件の場合、８ｍＭ濃度の条件で培養初期から成長阻害（growth inhibition）現象を観察することができ、４ｍＭ添加条件の場合、培養後半に細胞濃度の減少幅が大きかった。
細胞生存率プロファイル（Viability profile、図１０）でもウリジン８ｍＭの添加条件で生存率が急激に減少し、それ以外は類似した傾向を示した。
抗体発現量プロファイル（titer profile）を測定した結果、図１１で確認できるように、マンガン添加の条件は、未添加条件（Control）に比べ相対含量比が０．９〜１．１のレベルであり、ガラクトース添加条件の相対含量比は０．９〜１．０のレベルであった。ウリジン添加条件の場合、添加濃度が高いほど、未添加条件（Control）に比べて発現量の低下現象を確認し、８ｍＭの濃度条件では、未添加条件（Control）に比べて相対含量比が０．３６まで低下することを確認した。これは、細胞の成長阻害に伴う発現量の低下であると判断された。したがって、マンガンの場合、４０μＭ〜１２０μＭの濃度の区間で添加しても工程には影響がないことを確認した。
１−５．抗体の糖鎖含量分析
上記表２の条件、すなわち、マンガン、ガラクトース及びウリジンをそれぞれ濃度別のフラスコに添加して培養した産物の糖鎖含量（glycosylation quality）を確認した。具体的には、ガラクトシル化と非フコシル化グリコフォームを分析し、それぞれの計算された相対含量をグラフで示した（図１２及び図１３）。また、さらに、未添加条件である対照群（control）に比べてガラクトシル化及び非フコシル化の増減の程度を比較分析した結果もグラフで示した（図１４）
ガラクトシル化の含量を計算した結果、図１２で確認できるように、４０μＭのマンガンと２ｇ／Ｌのガラクトースが同時に添加された条件の下で、対照群（未添加条件）に比べて最も高い含量を示し、それぞれ三つの原料を単独で添加した条件の中では、マンガン添加実験群がガラクトース、ウリジン単独添加の実験群よりも高い値を示したため、新工程でマンガンがガラクトシル化の主な因子として機能することが確認できた。一方、ウリジン単独添加条件の場合、添加濃度が増加するほどガラクトシル化の含量が増加することが確認されたが、高濃度添加条件（８ｍＭ）で成長阻害及び発現量の低下現象が確認されたため、培養初期に高濃度のウリジンを添加することは、新工程に不適切なものと判断された。
非フコシル化含量を計算した結果、図１３で確認できるように、マンガン、ガラクトース、そしてウリジンの三つの原料を比較した結果、マンガンとガラクトースは効果がなく、ウリジンの場合、添加濃度が増加するほど、非フコシル化効果が増加することを確認することができた。未添加群に比べてガラクトシル化／非フコシル化の差を確認したグラフ（図１４）でマンガンを添加した場合、未添加群に比べて１０％以上のガラクトシル化増進効果を確認することができ、ウリジン添加濃度が増加するほど未添加群に比べて非フコシル化増進効果があることを確認した。
今回の新工程のマンガン、ガラクトース及びウリジン添加条件の実験を通じて、抗体のガラクトシル化に最も重要な因子となるのはマンガンであることが分かり、がラクトースをウリジンで代替したときにガラクトシル化及び非フコシル化の面で改善されることを確認した。
以降の実験では、バイオシミラーの開発の観点から市販薬である対照薬（Herceptin）とのガラクトシル化／非フコシル化の同等性を高めるために、マンガン、ウリジン、及びグリセロールの混合添加の条件を適用して実験を行った。
１−６．グリセロール添加による糖鎖の変化フラスコ培養実験
本実験では、マンガンとガラクトース以外に、さらに非フコシル化誘導添加物選別の実験を通じて選択されたグリセロール（glycerol、Gcr）を濃度別に添加し、その効果を確認した。
グリセロールは凍結防止剤（anti-freezing agent）及びタンパク質の安定化剤として広く知られている物質であるが、組換えタンパク質の発現量増加との関連が言及されたり、シアル酸含量を増加させる文献（非特許文献６）があるだけで、それ以外に本発明に関連する抗体の非フコシル化の観点では如何なる言及もない。
よって、グリセロールが抗体の非フコシル化に及ぼす影響を確認するために実験を行い、具体的には、グリセロール添加量を０、０．５、１、または２％（ｖ／ｖ）で添加してグリセロール添加と非フコシル化含量を測定した。
上記実験を行った条件は、下記表３の通りである。
グリセロール添加濃度による細胞成長プロファイルと細胞生存率プロファイルを測定した。その結果、図１５で確認できるように、グリセロール添加及び未添加条件で細胞の成長と細胞生存率は、類似していることを確認した。細胞生存率は、培養最終日に未添加条件に比べて若干低い傾向があるを確認することができた。
また、最終抗体発現量を測定した結果、図１６で確認できるように、グリセロール添加濃度が増加するほど、未添加条件に比べて高くなることを確認し、２．０％添加条件の発現量が１．１倍以上で最も高い相対含量比を記録した。
１−７．抗体の糖鎖含量の分析
上記表３の条件でグリセロール添加条件の濃度に応じたガラクトシル化及び非フコシル化糖鎖含量を測定した。
その結果、図１７で確認できるように、グリセロール添加濃度が増加するにつれて、ガラクトシル化は、わずかに減少する現象を示したが、ガラクトシル化抗体の含量がすべて４０％以上に維持され、大きな影響を与えず（図１７（Ａ））、非フコシル化効果の面では、グリセロール添加濃度が増加するにつれて、対照群（未添加）に比べて非フコシル化抗体の含量が顕著に増加することを確認することができた（図１７（Ｂ））。
１−８．新工程のガラクトシル化及び非フコシル化同時誘導のための添加物の混合プフラスコ培養実験
上記実施例で行われた添加物条件実験の結果を組み合わせて最終的に製造された抗体集団が対照薬（Herceptin）と最も類似した糖鎖含量、即ち、ガラクトシル化と非フコシル化含量を有するように調節する条件を確認するために行われた。
そこで、本実験では、添加物としてガラクトシル化向上の主な因子であるマンガン（Ｍ）と非フコシル化誘導添加物であるグリセロール（Gcr）、最後にガラクトースを代替するために添加されたガラクトシル化と非フコシル化の補助因子であるウリジン（Urd）を使用した。
一方、ウリジンの場合、以前の実験（実施例１−４）で４ｍＭの濃度以上を添加すると、非フコシル化現象がある一方、成長阻害現象による発現量の低下という欠点を確認した。そこで、本実験では、下記の表４の実験条件のように、本培養５日目の進行中にウリジンを４ｍＭの濃度で、別途に添加して成長阻害及び高マンノース生成（high mannose form）の増加を最小限にしようとした。
マンガン（Ｍ）の場合、以前の実験（実施例１−４）でガラクトシル化現象が最も大きいことを確認し、４０〜１２０μＭの濃度範囲で類似した効果を確認したため、今回の実験では、４０μＭとそれ以下の濃度を選定し、本培養の培地及び流加培地に添加した。
最後に、グリセロールは、添加濃度の実験（実施例１−６）で効果が確認された１％と２％の濃度で、それぞれ、本培養の培地のみに添加した。
上記のような実験条件を整理すると、下記の表４の通りである。
上記表４の条件でフラスコ培養し、細胞成長プロファイル及び細胞生存率プロファイルを測定した結果、図１８で確認できるように、マンガン（Ｍ）を添加した場合において、細胞成長プロファイルは大部分類似した傾向を示したが、グリセロール添加した場合では、２％添加時に１％添加時より細胞の成長率が低いことを確認することができた。グリセロール未添加条件（４０μＭのマンガン＋ ２．０ｇ／Ｌのガラクトース）と１％のグリセロール添加条件の細胞の成長効率（peak cell density）は、類似したものと判断したとき、グリセロール１％の添加は、既存のプロセスの細胞の成長効率に影響がないと判断された。ウリジンは、本培養５日目に添加し、培養初期の成長阻害の問題は発生しなかったが、ウリジン添加後、未添加条件に比べて細胞生存率の減少幅が大きくなることを確認した。
最終発現量の結果（図１９）、グリセロール、及びウリジン未添加条件（４０μＭのマンガン＋ ２．０ ｇ／Ｌのガラクトース）に比べて残りの条件はすべて類似または高いことを確認することができた。
１−９．抗体の糖鎖含量分析
上記表４の条件で添加物の混合条件に応じたガラクトシル化及び非フコシル化糖鎖含量を測定した。具体的には、Ｎ−グリカン分析ピークプロファイルの広さ（ａｒｅａ）の値をガラクトシル化と非フコシル化含量で数値化した。
その結果、図２０で確認できるように、４０μＭのマンガン＋１％のグリセロールの組み合わせに基づいて、ウリジンを培養５日目に添加した条件でウリジン未添加条件に比べてガラクトシル化の含量の増加を確認した。非フコシル化の面で４ｍＭウリジン添加条件の場合、未添加条件に比べて非フコシル化含量の増加を確認した。４０μＭのマンガン＋２％のグリセロールの組み合わせに基づいて、ウリジンを培養５日目に添加した条件のウリジン未添加条件に比べてガラクトシル化の含量の増加を確認した。非フコシル化の面で４ｍＭウリジン添加の条件は、未添加条件に比べて非フコシル化含量が増加した。特にグリセロール添加量が高ければ高いほど、非フコシル化含量は、比例して高くなることを確認することができた。
２０μＭのマンガン＋１％のグリセロールの組み合わせに基づいて、ウリジンを培養５日目に添加した条件でも、ウリジン未添加条件に比べてガラクトシル化の含量の増加を確認し、非フコシル化の面でもウリジン未添加条件に比べて非フコシル化含量が増加した結果を確認した。２０μＭのマンガン＋２％のグリセロールの組み合わせに基づいて、ウリジンを添加した条件でも同様の傾向を確認した。
上記の結果を総合的に判断すると、新工程のウリジンを添加した場合、ガラクトース化を向上させる効果が確認され、ガラクトースの代替が可能であると判断され、若干でありながらも非フコシル化を向上させる結果も確認した。
新工程にガラクトースのみ２．０ｇ／Ｌを添加した条件を対照群とし、マンガン、グリセロール、及びウリジン添加によるガラクトシル化／非フコシル化の差（percent change）を確認した結果、図２１で確認できるように、マンガンを添加すると、ガラクトシル化効果が６〜１３％まで高くなり、グリセロールを添加すると、非フコシル化含量が１．５〜４％まで上昇することを確認した。
実施例２：糖鎖調節のためのバイオリアクター（Bioreactor）レベルの添加物の実験
前記実施例１で実施したフラスコ培養実験の結果をもとに、バイオリアクター（bioreactor）を用いた抗体糖鎖調節が可能かどうかを確認しようとした。
２−１．グリセロール添加濃度条件別のバイオリアクター（bioreactor）実験
本実験は、上記実施例１−６のフラスコ培養実験結果のように、グリセロールを添加した培養条件で非フコシル化を増加させる効果を確認したため、バイオリアクターのレベルで再現性を確認した。
グリセロール添加濃度は、実施例１−６と同様に下記の表５に開示された１％と２％（ｖ／ｖ）を、本培養の培地のみに添加した。本培養の培地に添加されるグリセロールは、バイオリアクターの本培養体積である３．５Ｌを基準とし、濃度は原液（１００％）を希釈して添加し、流加培地にはグリセロールを添加しなかった。新工程開発の過程で、ガラクトシル化及び非フコシル化含量を対照薬（Herceptin）と類似したレベルに合わせるために、マンガン、グリセロールのような添加物の実験を行った。
前記バイオリアクターレベルの実験条件を整理すると、下記の表５の通りである。
上記表５の条件でバイオリアクター（bioreactor）で培養し、細胞成長プロファイル及び細胞生存率プロファイルを測定した結果、図２２で確認できるように、細胞成長プロファイルはグリセロールを１％添加した条件が２％添加した条件よりも良く（peak cell density基準１０％程度の差）、未添加条件と同様であった。
最終相対発現量の結果（図２３）、本培養の最終日を基準として未添加対照群と比較し、グリセロール添加群が最終相対発現量において、両方とも高いことが確認することができた。
２−２．抗体の糖鎖含量の分析
上記表５の条件で添加物の混合条件に応じたガラクトシル化及び非フコシル化糖鎖含量を測定した。具体的には、２ｕｎｉｔ（グリセロール１％または２％添加）のバイオリアクターで８日間培養した回収液からのＮ−グリカン分析の結果をガラクトシル化含量（Ａ）及び非フコシル化含量（Ｂ）で数値化した。
図２４で確認できるように、バイオリアクター培養実験の結果、本培養の培地にグリセロールを１％添加したときよりも２％添加したとき、非フコシル化含量が増加することを確認した。
また、図２５で確認できるように、対照群（マンガン、ガラクトース及びグリセロール添加していない）に比べてガラクトシル化／非フコシル化相対含量測定した結果、未添加群に比べて、添加物を添加したときガラクトシル化は１２％以上増加し、非フコシル化も１．５％まで増加する肯定的な効果を確認した。このような非フコシル化含量の増加効果は、図３４で確認できるように、以前の臨床第１相試料の非フコシル化含量に比べて約２倍増加した数値である。
実施例２−３．新工程添加物の最終選定及び３つバッチ(3 batches)バイオリアクター実験
前記実施例２−２で確認した結果、グリセロール２％を添加したとき、Ｎ−グリカンプロファイル上で未添加条件に比べて非フコシル化改善効果があり、上記実施例１で確認した結果、マンガンとウリジンを添加した時、ガラクトシル化改善効果があった。対照薬（Herceptin）との同等性の側面を考慮し、グリセロールは、本培養の培地と流加培地にそれぞれ添加し、ウリジンを培養５日目に８ｍＭの濃度で添加する条件を設定し、３つのバッチ(3 batches)繰り返し培養を行った。
具体的には、まず、グリセロールの場合、以前の実験（実施例２−１）において本培養の培地のみに添加したが、添加の効果を高めるために流加培地も２％のグリセロールを添加してフィーデイングした。これは、最初から高く添加したとき、成長低下の恐れがあるため、流加培地にも２％のグリセロールを同様に添加してフィーデイングによる希釈効果をなくす戦略でアプローチした。
ウリジンの場合、マンガンとガラクトースのうち、ガラクトースを代替して添加することにより、ガラクトシル化効果を高めるための添加量を、４ｍＭから８ｍＭに高めて添加した。また、ウリジンを添加したフラスコ実験における培養最終日のｐＨを測定した結果、ｐＨ６．９のレベルが示されたため、今回の実験では、ウリジン添加後の培養ｐＨをｐＨ６．８からｐＨ ６．９に移動した。これは、ｐＨがフラスコとバイオリアクター間において、添加物の濃度による効果の差が生じる原因となる可能性があるためである。
バイオリアクターでは、ｐＨ６．８を維持するために培養４日目からｐＣＯ２が継続的に増加する傾向があり、培養５日目に１００ｍｍＨｇ以上に急激に増加したため、培養５日目に、本培養のｐＨをｐＨ６．９に上げると、ｐＣＯ２の量が減少することが期待された。ｐＣＯ２が高いと、グリコシル化に否定的な影響を与えるという文献（Ｋｉｍｕｒａ Ｒ、１９９７）を参考にした。
上記事項を考慮した実験条件を整理すると、下記の表６の通りである。下記の条件について３つのバッチ(3 batches)にすべて同一に、本培養の培地（media A）に糖鎖含量調節用（quality improvement）添加物である４０μＭのマンガン（Ｍ）及び２％（ｖ／ｖ）グリセロール（Gcr）を添加し、この培養５日目にウリジン（Urd）８ｍＭを添加して培養する実験を設計した。
上記表６の条件でバイオリアクター（bioreactor）で培養し、細胞成長プロファイル及び細胞生存率プロファイルを測定した結果、２６で確認できるように、細胞成長プロファイルは、ｐｅａｋ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙを基準として１８〜２４×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度の分布で未添加対照群に比べて類似レベルであることを確認した。
最終相対発現量の結果（図２７）、本培養の最終日を基準として未添加対照群と比較して１．０５のレベルであり、少し高いか、または類似した傾向を示した。
２−４．抗体の糖鎖含量分析
上記表６の４０μＭのマンガンと２％のグリセロールをもとに、８ｍＭウリジンを培養５日目に添加する条件で、新工程条件で同様に３つのバッチ(3 batches)バイオリアクター培養して生産したＨＤ２０１抗体のガラクトシル化及び非フコシル化糖鎖含量を測定した。具体的には、各バッチ別に本培養８日目の試料のＮ−グリカンプロファイルを未添加対照群と比較した結果、対照群のガラクトシル化（Sum of all oligosaccharide with galactose）（％）は、３１．８％であり、新工程３つのバッチ(3 batches)のガラクトシル化（％）は４１．８から４２．２％に１０％程度増加した数値を示した。また、非フコシル化（Sum of all oligosaccharide without fucose）（％）の場合、未添加対照群試料が６．１％であり、新工程３つのバッチ(3 batches)は９．１〜９．５％で３％程度に改善された数値を示した。
これに対し、対照薬（Herceptin）と比較した結果、対照薬（Herceptin Lot.H0717）のガラクトシル化（％）は４３％で新工程３つのバッチ(3 batches)のガラクトシル化（％）との差が２％未満であり、非フコシル化（％）は８．９％で新工程との差が１％未満で示されたため、対照薬との同等性の面が著しく優れる効果を確認することができた。
２−５．添加物構成の旧工程に適用効果を確認
前記実施形態により新工程で開発した添加物組成（マンガン、グリセロール、ウリジン）に対して小規模のバイオリアクターで旧工程に適用し、目的とするグリコシル化プロファイル（ガラクトシル化／非フコシル化）が調節されることを確認し、旧工程でも添加物の効果が新工程と同様に示されることを確認した。
グリセロールの場合、新工程では、本培養の培地と流加培地に２％の濃度で添加したが、旧工程では、グリセロール添加濃度を３％に高めて添加することにより、グリセロール添加濃度の増加に伴う非フコシル化含量の増加効果を確認した。一方、マンガンとウリジンの場合新工程で開発された添加濃度を同一にして使用した。
具体的には、小規模の臨床第１相工程は、本培養の培地（ｍｅｄｉａ Ｄ）に糖鎖含量調節用添加物（quality improvement additives）である４０μＭのマンガン（Ｍ）及び３％（ｖ／ｖ）グリセロール（Ｇｃｒ）を添加し、流加培地（Ｆｅｅｄ Ａ）にも本培養の培地と同じ濃度でマンガンとグリセロールを添加した。新工程の場合、本培養の培地（ｍｅｄｉａ Ａ）と流加培地（Ｆｅｅｄ Ｃ）に糖鎖含量調節用（Fc N-glycan quality improvement）添加物である４０μＭのマンガン（Ｍ）及び３％（ｖ／ｖ）グリセロール（Ｇｃｒ）をそれぞれ添加し、旧工程と新工程の両方において本培養５日目にウリジン（Ｕｒｄ）８ｍＭを同一に添加して培養した実験群と、糖鎖含量調節用（Fc N-glycan quality improvement）添加物を添加していない対照群とを比較した。
上記の実験条件を整理すると、下記表７の通りである。
上記表７の条件でバイオリアクター（bioreactor）培養して細胞成長プロファイル及び細胞生存率プロファイルを測定した結果、図３０で確認できるように、細胞成長プロファイル上の添加物未添加の新工程と添加の新工程のｐｅａｋ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ基準の差は２４％程度であり、添加物の添加による細胞成長阻害が起こることが確認された。また、旧工程でも同様に添加物の添加による成長阻害が起こることを確認することができた。これは、添加物のうち３％のグリセロールの添加が影響するものと解釈され、既存の実験においてグリセロール添加濃度が増加するほど、細胞の成長阻害程度も増加する傾向があることが分かる。
新工程と旧工程の細胞成長プロファイルの差は、添加物未添加の旧工程と新工程との比較、及び添加物添加の旧工程と新工程との比較によって確認することができ、未添加条件のｐｅａｋ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙの差は３４％レベルで新工程のほうがｃｅｌｌ ｍａｓｓが大きいことを確認することができた。また、添加物添加条件のｐｅａｋ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙの差は２８％レベルで新工程のほうが高かった。旧工程は本培養で７日間培養を行ったため、小規模のバッチにおいても７日間培養を行った。
細胞生存率（Ｂ）は、添加物添加条件と未添加条件の両方において、培養終了時に８０％以上の生存率を維持し、添加物が未添加の旧工程条件の培養５日目以降の生存率が大きく減少するのは、培養３日目以降グルコースの枯渇が原因であると判断される。
最終相対発現量の結果（図３１）、旧工程では添加物の添加有無にかかわらず、培養７日目の回収レベルと同様な傾向を示したのに対し、新工程では添加物未添加条件の発現量に比べ、添加条件の発現量は１３％低いことが確認された。旧工程に比べ新工程の相対発現量は１．８であり、８０％以上の生産性が増加したことを確認した。
２−６．抗体の糖鎖含量分析
上記表７の条件で培養して生産した抗体のガラクトシル化及び非フコシル化糖鎖含量を測定した。本実験は、新工程と旧工程にそれぞれ糖鎖含量調節用（quality improvement）添加物（マンガン、グリセロール、ウリジン）を添加した条件と未添加条件の比較を目的として行われた。
具体的には、バイオリアクター培養試料の結果物に対するグリコシル化含量（glycosylation quality）をＮ−グリカンの分析で確認した結果をガラクトシル化及び非フコシル化含量で図式化した結果である。本培養回収試料のうち、旧工程に添加物添加条件と未添加条件のＮ−グリカンプロファイルを比較したところ、ガラクトシル化含量（％）は、添加物添加条件が４３．８％、未添加条件が４３％で１％程度増加したことが確認された。非フコシル化含量（％）の場合は、添加物添加条件が１８．７％、未添加条件が９．１％で約２倍程度に増加したことを確認した。
新工程において添加物添加条件と未添加条件を比較した結果、ガラクトシル化含量（％）は添加物添加条件が４０．５％、未添加条件が３１．８％であり、８％程度増加したことが確認された。非フコシル化含量（％）の場合は、添加物添加条件が１４．１％、未添加条件が６．１％であり、旧工程と類似して二倍以上増加したことを確認した。
上記実験結果は、本発明のマンガン、グリセロール、及びウリジンからなる抗体の糖鎖含量調節用添加物を添加する工程を通じて新工程だけでなく、互いに異なる培地を使用する旧工程にも類似した効果があることを確認したものであり、該当添加物は培地の制限なく、いずれの工程にも使用できることを確認したものである。
実施例３．ＡＤＣＣ活性の確認
ＨＤ２０１抗体のＡＤＣＣ活性の分析は、抗体依存細胞毒性分析試験法ＳＯＰ ［ＨＤ２０１抗体依存細胞毒性分析ａｓｓａｙ］により分析を行った。
小規模の旧工程及び新工程における糖鎖含量調節用（Fc N-glycan quality improvement）添加物（マンガン、グリセロール、ウリジン）を添加して製造した抗体のＡＤＣＣ活性をＩｎ ｖｉｔｒｏ活性測定法であるｒｅｌａｔｉｖｅ ＡＤＣＣ ａｓｓａｙにより測定した。ＡＤＣＣ活性の基準物質（対照薬）は、現在販売されているオリジナル社製品（Herceptin H4158B03 150mg）を使用した。
試験結果は、従来と同一なＥＣ５０値を通じたｒｅｌａｔｉｖｅ ＡＤＣＣ％（Ａ）及びＰＬＡ ｓ／ｗで計算されるｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒａｔｉｏを用いたｒｅｌａｔｉｖｅ ＡＤＣＣ ａｃｔｉｖｉｔｙ％（Ｂ）で示し、ＥＣ５０を用いた結果の値とＰＬＡを用いた結果の値に若干の差はあるが、全体的な傾向は同様であることが分かった。
小規模な旧工程の場合、添加物添加条件では対照薬に比べて２１７．５％のＡＤＣＣ活性を示し、未添加条件では７８．７％で対照薬に比べて低い活性を示した。したがって、糖鎖含量調節用（Fc N-glycan quality improvement）添加物（マンガン、グリセロール、ウリジン）を旧工程に添加する場合、非フコシル化の比率を二倍にまで高めることができ、これによるＡＤＣＣ活性を未添加条件に比べて１００％以上向上させることができた。新工程は、添加物添加条件は、対照薬に比べて１３０％のＡＤＣＣ活性を示し、未添加条件は、４２．７％で対照薬に比べて最も低い活性を示した。新工程は、他の培地を使用する旧工程と同様に糖鎖含量調節用（Fc N-glycan quality improvement）添加物（マンガン、グリセロール、ウリジン）を添加した場合、非フコシル化の比率を二倍にまで高めることができ、これによりＡＤＣＣ活性を未添加条件に比べて８０％以上向上させることができた。
上記結果をまとめると、本発明において、グリセロールを利用して抗体の非フコシル化含量を増進させることが初めて見出され、これを含み、マンガンとウリジンを用いて抗体の糖鎖含量を調節する工程を開発することができたこを確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形で実施されることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出される全ての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (20)

  1. グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む培地で抗体発現細胞を培養する段階を含む、糖鎖含量が調節された抗体の製造方法。
  2. 前記培地は、抗体の糖鎖含量調節用添加物として、マンガン及びウリジンからなる群から選択された一つ以上をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記糖鎖含量は、ガラクトシル（galactosylation）含量及び非フコシル（afucosylation）含量からなる群から選択された一つ以上の含量である、請求項１に記載の製造方法。
  4. 前記抗体は、トラスツズマブ（Trastzumab）である、請求項１に記載の製造方法。
  5. 前記培養は、本培養段階及び流加培養段階からなる、請求項１に記載の製造方法。
  6. 前記製造方法は、
    （ａ）グリセロール及びマンガンを含む培地で抗体発現細胞を培養する段階、 及び
    （ｂ）上記（ａ）段階を通じて培養した細胞をウリジンをさらに含む培地で培養する段階を含む、請求項１に記載の製造方法。
  7. 前記（ａ）段階は、３日〜８日間行われる、請求項６に記載の製造方法。
  8. （ｃ）前記（ｂ）段階で培養された細胞をグリセロール及びマンガンを含む流加培地を添加して培養する段階をさらに含む、請求項６に記載の製造方法。
  9. 前記（ｃ）培養する段階は、流加培養である、請求項８に記載の製造方法。
  10. 前記培地は、グリセロールを０．１〜５％（ｖ／ｖ）の濃度で含む、請求項１に記載の製造方法。
  11. 前記培地は、マンガンを１０〜２００μＭの濃度で含むか、またはウリジンを１〜１０ｍＭの濃度で含む、請求項２に記載の製造方法。
  12. 前記マンガンは塩化マンガン（manganese chloride）である、請求項２に記載の製造方法。
  13. 前記製造方法で製造された抗体の糖鎖含量は、ガラクトシル含量が３５〜５０％の範囲内であり、非フコシル含量が８〜２０％の範囲内である、請求項１に記載の製造方法。
  14. （ａ）グリセロール及びマンガンを含む培地で抗体発現細胞を培養する段階、
    （ｂ）上記（ａ）段階を通じて培養した細胞をウリジンを含む培地で培養する段階、、及び
    （ｃ）グリセロール及びマンガンを含む培地で流加培養する段階を含む、糖鎖含量が調節された抗体の製造方法。
  15. 前記培地は、グリセロールを０．５〜３％（ｖ／ｖ）の濃度範囲内で含み、マンガンを２０〜１２０μＭの濃度範囲内で含み、ウリジンを３〜１０ｍＭの濃度範囲内で含む、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 請求項１〜１５のいずれか１項の方法で製造された、糖鎖含量が調節された抗体集団。
  17. グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む培地で抗体発現細胞を培養する段階を含む、抗体の糖鎖含量を調節する方法。
  18. 前記培地は、抗体の糖鎖含量調節用添加物として、マンガン及びウリジンからなる群から選択された一つ以上をさらに含む、請求項１７に記載の抗体の糖鎖含量を調節する方法。
  19. グリセロールを抗体の糖鎖含量調節用添加物として含む、抗体の糖鎖含量調節用培地組成物。
  20. 前記抗体の糖鎖含量調節用添加物は、マンガン及びウリジンからなる群から選択された一つ以上をさらに含む、請求項１９に記載の抗体の糖鎖含量調節用培地組成物。

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