JP6882339B2 - ペルアセチルガラクトースを使った組換えタンパク質のタンパク質ガラクトシル化プロファイルを改変する方法 - Google Patents
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Description
灰色の円:ガラクトース;濃灰色の三角:フコース;濃灰色のひし形:シアル酸)
培地には、培養中の細胞の要求に応じて、追加の成分、例えば糖類、ビタミン類、ホルモンおよび成長因子を補足することができる。好ましくは、培地は動物成分不含であり;それらは無血清および/または無タンパクであることができる。本発明のある態様では、培養の開始時点で、および/またはフェドバッチ方式もしくは連続方式において、培地にペルアセチルガラクトースが補給される。ペルアセチルガラクトース補給剤の添加は、測定された中間グリコシル化プロファイル(例えば中間ガラクトシル化プロファイル/レベル)に基づくことができる。前記培養中の添加は、ペルアセチルガラクトース化合物のみからなるフィードによって、または他の成分の中にペルアセチルガラクトース化合物の補給剤を含むフィードによって成しえる。
I.細胞、細胞繁殖および細胞増殖
1) 細胞
第一のアッセイは、CHO細胞系:IgG1 mAb1を発現するCHO-S細胞(本明細書中「細胞mAb1」または「mAb1細胞」と称する)において生産された抗体を使って実施した。「mAb1」は可溶性タンパク質に対して向けられた完全ヒトモノクローナル抗体である。それの等電点(pI)は約8.20-8.30である。
細胞の繁殖は細胞増殖に適した培地中で試験管内で実施した。フェドバッチ式のアッセイは少なくとも一週間の増殖後に開始した。
mAb1を発現している細胞は0.3×106細胞/mL(ミリリットル)で播種し、一方mAb2を発現している細胞は0.2×106細胞/mL(ミリリットル)で播種した。
全てのアッセイはフェドバッチ培養において実施した。
実施例1〜3に関して:無血清の既知組成(化学的に定義された)培地を使用した。それはそのまま使用するか、またはそれに種々の濃度(播種前0〜200μM)でα-またはβ-2-F-ペルアセチルガラクトース(本明細書中α-またはβ-2-pGal;Biosynth & AX Molecules)を補足した。図1,2,3および4に指摘された濃度は、播種直前の0日目の培地中のα-またはβ-2F-pGalの濃度である。培地に、規則的な方式で、既知組成のフィード培地と、グルコースレベルを>0〜約8 g/Lの範囲内に維持するためにグルコースを補給した(フィードは3、5、7、10および12日目に実施した)。
DWP実験の場合、生存細胞密度と生存率はGuava easyCyte(登録商標)フローサイトメーターを使って測定した。抗体力価はforteBIO Octet(登録商標)を使って測定した。
TubeSpin実験の場合、生存細胞密度と生存率はViCell(登録商標)を使って測定した。抗体力価はBiacore(登録商標)を使って測定した。
材料と方法の項目に記載した通りに細胞を培養し、結果を分析した。本発明にかかる対照(または対照条件)はペルアセチルガラクトース非存在下で増殖させた細胞に該当することに注意。
経過時間の関数としての生存細胞密度と生存率、並びにフェドバッチ培養の終点での抗体力価が図1(α-2F-pGal)と図2(β-2F-pGal)に示される。30μMまでの濃度では、α-2F-pGalとβ-2F-pGalの両方とも培養の終了時点まで細胞増殖に全く影響を与えない(図1Aと1B;図2Aと2B)。約60μM以上の濃度では、2化合物とも細胞増殖にネガティブな影響を及ぼした。並行して、60μMまでの濃度では、10日目(データは示していない)または14日目(図1Cと2C)のいずれかにおける力価傾向を区別できない。図1Cと2Cに示す通り、60μMまでの2F-pGal培地濃度でのタンパク質力価は、10日目と14日目において、対照のタンパク質力価より高く保持された。60μMでは、増殖細胞の減少が力価に明白な影響を及ぼさなかった。しかしながら、高濃度では、細胞数の減少が力価に反映され、対照に比較して約1.2倍数だけ減少した。増殖と力価に対する影響は、この抗体では約60μMまで許容されると考えられる。
CGE-LIF分析により得られたグリコシル化プロファイルが図3に示される(β-2F-pGalに関して図3Aと3B)。得られたデータは、α−2F-pGalとβ-2F-pGalの両方とも抗体のグリコシル化を改変でき、特に、マンノシル化、非フコシル化およびフコシル化糖型に影響を与えることなく、ガラクトシル化グリカンを減少させることができた。特に、対照タンパク質は10%ガラクトシル化N−オリゴ糖であり、一方で30、60、120および200μMのα−2F-pGalを含む培地中で細胞培養することにより得られたタンパク質は、それぞれ8.3、6.8、6.0および4.8%のガラクトシル化N−オリゴ糖を含んだ(データは示していない)。対照に比較したガラクトシル化N−オリゴ糖の絶対的変化は、30、60、120および200μMのα-2F-pGal濃度についてそれぞれ1.3、2.8、3.5および4.8%であった(それらの変化は対照に比較してそれぞれ17%、32%、40%および52%の相対減少率に相当する)。30、60、120および200μMのα-2F-pGalの場合、G1Fに関しては、対照に比較したガラクトシル化N−オリゴ糖の絶対的変化はそれぞれ、1.1、2.5、3.1および4.4%であり;G2Fに関しては、絶対的変化はそれぞれ0.2、0.3、0.35および0.4%であった。
30μM以下のα-およびβ-2F-pGal培地濃度は、細胞密度、細胞生存能力およびタンパク質力価に影響を与えない。しかしながら、30μM以下では、α-2F-pGalとβ-2F-pGalのどちらもガラクトシル化に対して有意な阻害作用を持たない。よって30μM以下では、α−2F-pGalとβ−2F-pGalのどちらも優良なガラクトシル化阻害剤ではない。濃度が30μMより高い場合、ガラクトシル化に対して有意な阻害作用が観察される。それにもかかわらず、特に60μMより高い濃度では、細胞密度、細胞生存能力およびタンパク質力価がネガティブな影響を受ける。30μM〜60μMの濃度範囲は、細胞密度、細胞生存能力、タンパク質力価およびガラクトシル化阻害を考慮に入れると最適濃度範囲であるように見える。実施例1は、α-またはβ-2F-pGalのいずれか一方が、マンノシル化とフコシル化に何ら影響を与えずにガラクトシル化を特異的に阻害することを示す。
実施例2.1−予備評価
生存細胞密度と生存率
フェドバッチ培養での経過時間の関数としての生存細胞密度と生存能力、並びに該培養の終了時の抗体力価を図4(α-2F-pGal)および図5(β-2F-pGal)に示す。試験した濃度、すなわち30、60および90μMのいずれかにおいて、α-2F-pGalは培養終了時まで細胞増殖と抗体力価にネガティブな影響を及ぼさなかった:それらの数値は対照に比較して一定であった。β-2-F-pGalについても同様な結果が観察されたが、この場合は1つの濃度だけを試験した(すなわち60μM)。
グリコシル化プロファイルは図6に示される(α-2F-pGalについては図6Aと6B)。得られたデータは、DWP実験で得られた結果を確証する:α-2F-pGalとβ-2F-pGalの両方とも、マンノシル化、非フコシル化およびフコシル化糖型に影響を与えずに、抗体のグリコシル化を改変することができ、特にガラクトシル化グリカンを減少させることができた。図6Aと6Bから、α-2F-pGalの存在下で生産されたタンパク質のグリコシル化プロファイルに絶対的変化を認めることができる。これはガラクトシル化の有意な減少をもたらした。ガラクトシル化N−オリゴ糖に関しては、対照に比較した絶対的変化は、30、60および90μMのα-2F-pGal培地濃度についてそれぞれ2.0、4.61、4.5%であった(それらの変化は対照に比較して約16%、37%および36%の相対的減少に相当する)。G1Fに関しては、対照に比較した絶対的変化は、30μM、60μMおよび90μMのα-2F-pGal培地濃度についてそれぞれ0.11、0.27、0.33%であった。
生存細胞密度と生存能力
図7Aは、培地中30μM、60μMおよび90μMのα-2F-p-ガラクトース濃度での細胞系1培養物の生存細胞密度を示す。対照培養は7日目に最大密度に達し、19.5×106生存細胞/mLまで増大した。α−ガラクトース類似体の補給は、培養の初期(第一相)の増殖阻害効果を全く示さなかった。それにもかかわらず、細胞密度は30μMと90μMの濃度でのα−ガラクトース誘導体の濃度について培養の10日目から終了時まで、わずかに低かった。14日目に、対照培養が11.5×106生存細胞/mLの密度で採取された。補足された培養物は8.4〜9.9×106生存細胞/mLの範囲内であった。60μMのβ-2F-ペルアセチルガラクトースを用いた実験は、7日目に12.8×106生存細胞/mLの最少ピークを示した。しかしながら、このデータは対照と同等であることを示した。
図8Bによれば、96-DWP実験におけるガラクトース類似体のガラクトシル化阻害作用が振盪チューブ実験において確証された。ガラクトシル化の全レベルは30、60および90μMのα-2F-ペルアセチルガラクトースではそれぞれ-2.0、-4.6および-4.6%減少し、60μMβ-2F-ペルアセチルガラクトースでは-5.0%減少した。モノガラクトシル化形は30、60および90μMのα-2F-ペルアセチルガラクトースではそれぞれ-1.9、-4.3および-4.3%変化し、β-類似体の存在下では-4.7%変化した。完全にガラクトシル化された糖型は-0.1〜-0.3%の間で減少した。全体的に、2種のアノマーの性能は同等であった。2F-p-ガラクトースの使用は、別のグリカン種への作用を制限する高特異性のために価値がある。
96 DWPプラットフォームに比較して、スピンチューブプラットフォームの使用は、α-およびβ-2-F-ペルアセチルガラクトース培地濃度(試験範囲:30μMと90μMの間)に関係なく細胞密度、細胞生存能力およびタンパク質力価に関してより安定な結果をもたらした。ガラクトシル化阻害は、30μMと60μMの各α-2F-pGal培地濃度で約2%と4.5%の絶対的変化となり有意であった。よって、90μMのα-2F-pGal培地濃度でのガラクトシル化の絶対的変化が60μMのものと同じに維持されたので、30μM〜60μMの間の濃度範囲が、細胞密度、細胞生存能力、タンパク質力価およびガラクトシル化阻害に対する効果を考慮すると最適な濃度範囲であると思われる。同じ結果がβ-2F-pGal添加でも観察された。
材料と方法の項目に記載したように細胞を培養し、結果を分析した。
生存細胞密度と生存能力
図9Aが明らかに示す通り、30μMと60μMのα-2F-p-ガラクトース培養物の総生存細胞密度は対照のものと同等であり、7日目に11.2×106生存細胞数/mLの最大細胞密度に達した。90μMのレベルはわずかに減少した細胞増殖を生じ、10.0×106生存細胞数/mLでピーク最大になった。全補給剤濃度範囲の生存率は、対照条件と同等であった(図9B)(7日目に約97%細胞生存率)。中間の濃度(30μMと60μM)では、生産性が全体的に未変更のまま維持された(図9C)。例えば7日目に、力価は対照で約730 mg/Lであり、30μMと60μMのα-2F-p-ガラクトースで720 mg/Lであった。同様に、14日目は、力価は対照で約3300 mg/Lであり、30μMと60μMのα-2F-p-ガラクトースでは約3400〜3420 mg/Lであった。最大阻害剤濃度はわずかな力価減少を伴うが、これは有意とは見なされなかった(例:7日目で約670 mg/Lまたは14日目で3200 mg/L)。
図10Aは培地中のα-2F-ペルアセチルガラクトース濃度の関数としての絶対的グリカン変化を示す。細胞系1と同様に、該ガラクトース類似体はガラクトシル化を減少させた。減少は、30μM、60μMおよび90μMそれぞれについて−0.95、-2.05および-1.4%にのぼった(絶対的変化)。その存在は全フコシル化種に対して無視できない影響を与えた(+0.5%)。個々のターミナルガラクトース種を拡大表示した図10Bは、30μM、60μMおよび90μMでそれぞれ、FA2G1について-0.85、-1.85および-1.2%減少を示し、そして-0.09、-0.19および-0.19%のFA2G2度数の小変化を示した。細胞系2培養物のグリカンパターンを定量するのにCGE-LIFよりも2AB-UPLCを使用したことを念頭におくべきである。
実施例3は、どんな抗体(本明細書中ではmAb1とmAb2と示される)および細胞系(本明細書中では細胞mAb1および細胞mAb2と示される)でも、α-およびβ-2F-pGalがマンノシル化とフコシル化に何ら影響を与えずにガラクトシル化を特異的に阻害することを確証する。
生存細胞密度と生存能力
接種前に培地に補給することよりも、3日目、5日目または7日目にガラクトース類似体の添加を開始することを決定した(それぞれβ-2F-pGal-d3、β-2F-pGal-d5およびβ-2F-pGal-d7;表2参照)。細胞系1をこれらの実験に使用した。図11Aは、β-2F-p-ガラクトースが添加時間の関数としての生存細胞密度にどのように影響したかを示す。ピーク細胞密度は7日目に達した。対照とβ-2F-pGal-d3補足培養物との間に有意な相違は全く観察されなかった。それらは共に、それぞれ20.8×106および21.2×106生存細胞/mLでレベルが横ばい状態になった。5日目のフィードが細胞密度を最大に減少させ、18.6×106生存細胞/mLに達した。全体的に、β-2F-p-ガラクトースの存在が、7日目まで細胞増殖に対し限定的変化を誘導したと見なすことができる。培養の第二半期では、細胞密度と生存率(図1B)の両方ともフィード時期と相関性がある。3日目の補給は、培養過程に最も強力に影響を与えた。採取時、細胞密度は9.8×106生存細胞/mLに上った(対照:11.8×106生存細胞/mL)。生存率は対照よりも顕著に早く低下し、60%以下に低下した。5日目と7日目のフィード添加は、14日目の生存率でそれぞれ78%と90%であった(対照:93%)。図11Cによれば、力価に明確な傾向は提示されなかった。早期の補給は7日目と10日目にわずかな力価増加を誘導したが、培養の後期の生産性を減少させた。対照が2870 mg/Lを与えたのに対し、3日目の補給(β-2F-pGal-d3)は2560 mg/Lを与えた。5日目のβ-2F-p-ガラクトースの添加(β-2F-pGal-d5)は抗体発現に有利に働き、3215 mg/Lを生産した。7日目の添加(β-2F-pGal-d7)は、タンパク質力価をかなり低下させた:2100 mg/L。培地補給に比較して、フィード供給を用いたβ-2F-p-ガラクトースの導入は、細胞の能力に対する有害な作用を制限する。7日目にフィードを開始した時であっても、上清中の最終付加濃度は、上述したように重大な増殖と生産性の減少が認められた培地補給法よりも、相当高いものであった。
β-2F-p-ガラクトースを使ったフィード最適化は、図12Aに示されるようなガラクトシル化糖型の重大な阻害をもたらした。対照では、分泌された抗体の11.5%がガラクトシル化されたものであった。3日目からのフィード添加(β-2F-pGal-d3)は、最強の阻害をもたらした:全ガラクトシル化が−8.5%減少した。5日目(β-2F-pGal-d5)および7日目(β-2F-pGal-d7)にフィードを開始する条件は、それぞれ−7.0%と−4.6%の減少をもたらした。培地補給実験と同様に(培養の開始時点)、β-2F-p-ガラクトースが特異的にガラクトシル化を標的とする。別のグリカン種に対する影響は小さいままであった。3日目、5日目および7日目にフィードを開始した時、モノガラクトシル化種はそれぞれ−8.0%、−6.7%および−4.4%減少し、一方でジガラクトシル化種はそれぞれ−0.41%、−0.33%および−0.19%減少した(図12B)。ガラクトシル化阻害の大きさは補給剤フィードの開始日と相関性があり、よって上清中のβ-2F-p-ガラクトースのレベルと相関性があった。
フィード最適化は、補給剤の効果を更に高めるための優れた方策であると証明された。更に、フィード補給は、添加物の総量を増加させるので、培地補給法と比較して細胞培養性能に対する有害な作用をかなり小さくすることが可能である。
本実施例は、α-およびβ-2F-pGalがマンノシル化とフコシル化に影響を与えずにガラクトシル化を特異的に阻害することを証明する。当業者は、上記実施例の結果から、生産に使用する細胞系にとらわれずに、任意の抗体と任意のタンパク質のガラクトシル化プロファイルを改変するために、および特に補給剤の効果を更に高めるために、α-2F-pGalおよびβ-2F-pGalのいずれか1つを使用できることを理解するだろう。
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Claims (7)
- 改変されたガラクトシル化プロファイルを有する組換えタンパク質の生産方法であって、前記タンパク質を発現する宿主細胞を、α-2-F-ペルアセチルガラクトースまたはβ-2F-ペルアセチルガラクトースから選択されるペルアセチルガラクトースを含む細胞培養培地中で培養することを含む方法。
- 改変されたガラクトシル化プロファイルを有する前記組換えタンパク質を精製することを更に含む、請求項1記載の方法。
- 前記ガラクトシル化のレベルの改変が、前記タンパク質のガラクトシル化レベルの減少である、請求項1又は2記載の方法。
- 前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記組換えタンパク質が、ヒト抗体もしくはその抗原結合性部分、ヒト化抗体もしくはその抗原結合性部分、キメラ抗体もしくはその抗原結合性部分のような抗体もしくはその抗原結合性断片、組換え融合タンパク質、成長因子、ホルモン、またはサイトカインから成る群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 播種前の細胞培養培地中のペルアセチルガラクトースの濃度が約0.1μM〜200μM(0.1μMと200μMを含む)である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 接種後の細胞培養培地中のペルアセチルガラクトースの濃度が約0.08μM〜180μM(0.08μMと180μMを含む)である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
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