KR20230109674A - Fab 고 만노스 당형 - Google Patents

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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 단일클론 항체의 Fab 부분에서의 당화 패턴 및 고 만노스 Fab 당형의 조절된 함량을 갖는 단일클론 항체를 발현하는 미생물의 배양 동안 조절을 위한 방법에 관한 것이다.

Description

FAB 고 만노스 당형
본 발명은 단일클론 항체의 Fab 부분에서의 당화 패턴 및 고 만노스 Fab 당형(glycoform)의 조절된 함량을 갖는 단일클론 항체를 발현하는 미생물의 배양 동안 조절을 위한 방법에 관한 것이다.
단일클론 항체의 중요한 치료 또는 진단 특성은 당화의 번역후 과정과 강하게 관련된다. 글리칸 확인은 분비, 용해도, 수용체 인식, 항원성, 생체 활성 및 약동학에 영향을 줄 수 있기 때문에 중요하다. IgG 항체는 전형적으로 Fc 영역 상에서 당화되지만, 약 20%는 또한 가변 영역에서 비보존성 N-당화 부위를 함유한다(Zhang et al., Drug Discovery Today 21 (2016) 740-765).
IgG의 Fc 영역의 N-연결된 당화는 Fc 부분의 접힘에 영향을 주고 안정성을 증가시키는 것을 포함하는 중요한 구조적 기능을 갖는다(Higel et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 100 (2016) 94-100). Fc-연결 글리칸은 단백질의 3차원 구조를 변화시킴으로써 항체의 작동체(effector) 기능에 영향을 미치며, 이에 의해 Fc-γ-수용체에 결합한다.
하지만, 가변 영역에서 당화의 역할은 그렇게 명확하지 않다. Zhang et al.(상기)은 대부분의 V-영역 당화 부위가 용매-노출 루프(solvent-exposed loop) 상에 위치하고 내인성 렉틴에 쉽게 접근할 수 있음을 제안한다. 전형적으로 완전히 가공된 시알릴화된 글리칸을 함유하지만, GlcNAc 잔기를 이등분하는 빈도가 높으며, 일부 올리고만노스 글리칸이 또한 CDR 항원-결합 영역에서 발견되었다. 이들 올리고만노스 글리칸은 선천성 면역계의 렉틴 도메인에 결합하여 이들의 신호전달 기능을 차단함으로써 병리학적 과정에 기여하는 것으로 가정되었다.
전형적으로, Fab의 글리칸은, 갈락토실화되고 Fc 글리칸과 대조적으로 고도로 시알릴화된 바이안테너리(biantennary) 복합-유형 구조로서 기재되었다. 이들 올리고당의 기능은 완전히 밝혀지지 않았지만, 가변 영역의 당화가 항원 결합에 양성, 중성 또는 음성 영향을 미칠 수 있다는 제안이 있다(Biermann et al., Lupus 25 (2016) 934-942 and Jefferis, Nature 8 (2009) 226-234).
마찬가지로, N-당화와 약동학(PK) 간의 관계를 조사하기 위한 다양한 연구가 실시되었으나, 이러한 연구 결과는 대체로 부합하지 않다. Millward et al., Biologicals 36 (2008) 41-47은 가변 영역 내 당화를 갖지 않는 항체로부터, 또는 Fc 당화 부위에서 복합 유형이 풍부한 항체 또는 고 만노스 유형의 올리고당이 풍부한 항체 사이에서 가변 영역 내 당화된 항체의 제거율에서 유의한 차이가 없음을 발견하였고, 따라서 당화가 단일항체 IgG1 항체의 약동학적 거동에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않음을 암시한다. Finke & Banks., UW Tacoma Digital Commons, SIAS Faculty Digital Publications(https://digitalcommons.tacoma.uw.edu/ias_pub/825)는 Fab 당화의 생물학적 역할 및 치료적 결과가 IgG 작동체 기능에 대한 Fc 글리칸의 비교적 잘 특성화된 구조-기능 관계보다 훨씬 더 둔감하다는 점에 주목한다. 이들은 다수 연구의 평가로부터 IgG 약물의 생물학적 특성 및 치료 메트릭(metrics)에 대한 주어진 Fab 글리칸의 효과를 예측하기 어렵다는 결론을 내린다. Van de Bovenkamp et al., J.Immunology 196 (2016) 1435-1441은 항체의 안정성, 반감기 및 결합 특성에 상당한 영향을 미치면서, IgG Fab 당화는 중요한 - 하지만, 잘 이해되지 않는 - 과정이라고 결론내렸다.
mAb 당화는 복잡하기에, 따라서 정확하고 재현가능한 글리코프로파일링(glycoprofiling)은 특히 Fc 및 Fab 부위에서 당형 충실도를 조절하는 것을 수반할 때 문제가 될 수 있다. 당화 패턴은 상이한 발현 시스템, 배양 조건, 공정 및 제조 규모에 따라 변할 수 있고, 원하는 당화 패턴을 수득하고 유지하기 위해 이들의 최적화가 요구된다. 세포 성장, 세포 대사, IgG 합성 및 당화 사이의 상호작용을을 이해하고, 이들 인자가 대사 수준에서 상이한 세포주 및 배지 조성물 사이에 어떻게 가변되는지를 이해하면 생물공정 최적화에 도움이 될 것이다.
Tachibana et al., Cytotechnology 16 (1994) 151-157은 폐 선암종에 특이적이고 이의 독특한 특징이 경쇄의 초가변 영역에서의 N-당화인 칸디다 시토크롬(Candida cytochrome) C에 교차-반응성인 C5TN 세포에 의해 생성된 항체를 연구 대상으로 하였다. 그들은 포도당 제한 조건에서, 정상보다 작은 당형보다 생성됨에 따라 세포가 단백질을 완전히 당화시킬 수 없음을 발견하였다. 따라서, 저자들은 기존의 회분식 배양보다 지속적인 관류 배양을 권고하였다.
Hossler et al., Glycobiology (2009) 19(9) 936-949는 세포 배지 및 공정 효과로부터 발생하는 변수들과 단백질 당화의 제어 사이의 복잡한 관계를 기술하며, Ehret et al., Biotechnol & Bioeng (2019) 116 816-830은 세포 배양 배지가 단백질 당화에 미치는 영향을 기술한다.
Fan et al., Biotech & Bioeng (2015) 112(3) 521-535는, 2개의 화학적으로 규정된 독점적 배지를 갖는 CHO 세포에 대한 유가식 공정에서, 포도당과 아미노산 농도의 균형이 세포 성장, IgG 역가 및 Fc 위치 N-당화에 중요하고, 따라서 더 빠른 세포 성장, 생존가능 세포에 대한 더 높은 적분 및 IgG 생성 - 및 더 성숙한 당단백질-이 배양에서 더 균형잡힌 아미노산 농도 및 더 높은 포도당 소비의 결과로서 수득될 수 있음을 발견하였다. 저자들은 Fc 당화에 대한 배지 및 공정 최적화의 효과는 사례마다 그리고 골지 상주 단백질의 단백질 처리율, 세포 대사 및 발현 및 활성의 상호작용으로부터 이해되어야 한다고 결정하였다.
Huang et al., Anal. Biochem. 349 (2006) 197-207은 항-Aß-IgG1 단일클론 항체의 항체 제거에 대한 당화의 효과를 분석하였고, N-아세틸 글루코사민 종결 바이안테너리 복합 유형 글리칸의 빠른 제거를 발견하였다.
St Amand et al., Biotechnol Bioeng (2014) 111(10) 1957-70은 배지 보충제로 사용될 때 망간, 갈락토오스 및 암모니아 각각이 특정 글리칸 및 글리칸 분포에 유의적 영향을 미친다는 것을 발견하였다.
EP 1960428은 인간에서 존재하는 β-아밀로이드 플라크를 제거하고 새로운 β-아밀로이드 플라크의 형성을 방지하기 위해, 가변 영역에서 당화를 갖는 아밀로이드 베타에 대한 항체에 관한 것이다. VH 영역에서의 당화는 코어 푸코실화를 갖지 않는 바이안테너리 복합 유형; 바이안테너리 하이브리드 유형; 또는 2차 올리고만노스 유형의 당 구조로부터 선택되며, 이때 하이브리드 및 올리고만노스 구조는 소량으로 간주되고, 조합되어 조성물의 25% 이하로 존재한다. 올리고만노스 당 구조는 전형적인 N-연결된 코어 구조의 만노스 단위를 포함하여 Man4, Man5 또는 Man6 하위단위를 함유하는 것을 특징으로 한다. 항체 당형에서 상대적으로 높은 만노스 함량을 조절하기 위한 필요 또는 방법에 대한 개시는 없다.
본 발명은 상기 고려사항에 비추어 고안된 것이다.
본 발명은 항체의 Fab 영역 내의 N-당화 부위에서 특정 당형인 고 만노스 당형의 상대적인 함량이 조절되는 단일클론 항체 조성물에 관한 것이다. 이러한 항체 조성물을 사용한 질병의 진단 및 치료 방법, 그리고 이러한 항체 조성물의 의학적 사용이 제공될 뿐만 아니라 이러한 항체 조성물의 제조 방법 및 이에 의해 생성된 항체 조성물이 또한 제공된다.
다음은 가장 넓은 의미에서 본 발명의 양태들이다. 본 발명의 특징들의 특성이 보다 가깝게 정의되는 대안적인 및 바람직한 구현예들이 상세한 설명에 이어진다.
하기의 개시 전반에 걸쳐, 간결함을 위해, 용어 "항체"는 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 단일클론 항체, 다중클론 항체, 이중-특이적 항체를 포함하는 다중특이적 항체, 및 항체 단편(이하 정의됨)을 포괄하는 데 사용될 것이다.
이의 제1 양태에서, 본 발명은 이의 Fab 영역(들)에서 N-당화를 갖는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 이때 상기 조성물 내 당화된 Fab의 총량에 대해 조성물 내 Fab 영역의 약 20% 이하가 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 항체의 재조합 생성 동안 및/또는 후에 수득가능한 세포 배양 상청액일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 항체가 투여된 동물의 순환으로부터 상기 항체가 제거되는 속도를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항체를 포함하는 조성물 중 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적인 함량을 조절하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물 중 포함된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적 함량을 조절하는 방법을 고안하며, 상기 방법은 발효의 생성기(production phase)의 전부 또는 일부에 걸쳐 상기 단일클론 항체를 발현하는 진핵 세포의 내부에서 발효에 의해 당화된 단일클론 항체를 생성하는데 사용되는 배양 배지 중 포도당의 농도를 최적화하는 단계를 포함한다.
생성기의 전부 또는 일부 동안 배양 배지에서 진핵 세포를 위한 탄수화물 공급원의 농도를 최적화하는 단계는 발효로부터 생성된 고 만노스 Fab 당형태의 원하는 상대적 함량과 상관되는 생성기의 전부 또는 일부 동안 배양 배지에서 탄수화물 공급원의 평균 농도를 유지하는 것을 포함한다.
상기 방법은 배양 배지로부터 단일클론 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서, "상대적인" 함량은 조성물 내 단일클론 항체의 모든 다른 Fab 당형의 함량과 관련하여 조성물 내 고 만노스 Fab 당형의 함량을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물에서, 상기 고 만노스 Fab 당형은 단일 클론 항체의 총 Fab 당형의 약 20% 이하를 구성한다. 따라서, 본 발명은 단일클론 항체 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 N-연결된 당화 Fab 영역(들)을 포함하며, 이때 N-연결된 당화 Fab 영역(들)의 약 20% 이하가 N-연결된 고 만노스 당형이다.
본 발명의 방법들에서, 상기 조성물 중 단일클론 항체의 Fab 고 만노스 당형의 약 20% 이하를 달성하기 위해, 포도당은 탄수화물 공급원이고, 포도당의 농도는 단일클론 항체의 재조합 생성에서 평균 포도당 농도(임의로 생성기의 -7 내지 0일에 걸쳐 계산된 평균을 가짐)가 약 0.50 g/L 내지 약 18.00 g/L, 바람직하게는 약 1.50 g/L 내지 약 14.00 g/L, 및 더 바람직하게는 약 2.00 g/L 내지 약 12.50 g/L이도록 최적화된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 제시된 방법에 의해 수득가능한 단일클론 항체 조성물을 제공한다. 상기 단일클론 항체 조성물은 세포 배양 상청액일 수 있거나, 또는 약학적 조성물일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 질병을 앓고 있는 환자에게 이의 Fab 영역(들)에 N-당화를 갖는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질병의 치료 방법을 제공하고, 이때 상기 조성물 내 N-당화된 Fab 영역들의 총량에 대해 상기 조성물 내 Fab 영역의 약 20% 이하는 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는다.
추가의 양태에서, 본 발명은 이의 Fab 영역(들)에서 N-당화를 갖는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 이때 질병을 앓고 있는 개체에서 상기 질병을 치료하는데 사용하기 위해 상기 조성물 내 N-당화된 Fab 영역들의 총량에 대해 조성물 내 Fab 영역의 약 20% 이하가 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는다.
또한, 본 발명은 이의 Fab 영역(들)에서 N-당화를 갖는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 이때 질병을 진단하는데 사용하기 위해 상기 조성물 내 N-당화된 Fab 영역들의 총량에 대해 조성물 내 Fab 영역의 약 20% 이하가 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는다.
상기 양태들에서, 상기 질병은, 예를 들어, 치매, 알츠하이머병, 운동 신경병증, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 스크래피, HIV-관련 치매, 크로이츠펠트-야콥병(CJD), 유전성 뇌 출혈, 다운 증후군 및 노화와 관련된 신경 장애; 및 전이성 직장암, 전이성 비-소세포 폐암, 난소암 및 두경부암과 같은 암일 수 있다.
도 1 Fab 당화 종. 상기 종은 Fab 하이브리드 만노스(하이브리드 만) 합계, Fab 시알릴화(시알) 합계, Fab 갈락토실화(갈락) 합계, Fab 고 만노스(고 만) 및 Fab 만노스(만)로서 여러 합계 매개변수로 합산된다.
도 2: -7일 내지 0일 동안의 평균 포도당 농도에 대한 면적% Fab 고 만노스[g/L]로 나타낸, Fab 고 만노스 생성에 대한 포도당의 영향. 표시된 해당 프로젝트의 모든 대표적인 실행으로부터 입수 가능한 데이터(포도당 변화에 대해 전용인 실행뿐만 아니라). 발효 실행은 규모, 로슈(Roche) 생산지 및 작은 공정 변화(예컨대, 교반, 통기, 세포 은행, 세포 연령)에 있어서 가변된다. 포도당 용액은 필요에 따라 볼루스(bolus) 또는 연속 첨가를 통해 첨가된다.
도 3a 및 도 3b: Fab 고 만노스 생성에 대한 포도당의 영향. -7일 내지 0일 동안의 평균 포도당 농도에 대한 면적%에서 합계(Fab 만노스 5, 6 및 7) 및 상기 합계의 3 부분으로서의[g/L] Fab 고 만노스(도 3a). 상이한 포도당 평균 수준의 비교. 포도당 변화에 전용인 하나의 실험 설정, 모든 다른 매개변수들은 일정하게 유지된다. 포도당은 볼루스 첨가를 통해 매일 요구에 따라 첨가된다. 추가적으로, 도 3b에서, 포도당 평균의 계산이 설명된다: 상기 계산은 볼루스 첨가 전에 샘플들로부터 매일 측정된 포도당 농도 및 볼루스 첨가 후에 계산된 포도당 농도에 기초하여 실시한다.
도 4a 및 도 4b: 임상 연구에서 이전 방법(G3 공정/고만노스 고)으로 생성된 간테네루맙과 본 발명의 방법에 따라 생성된 간테네루맙(G4 공정/고만노스 저)의 약동학 비교. 도 4a는 선형 배율이고, 도 4b는 반-대수 배율이다.
도 5: 총 간테네루맙(즉, 물질 내 모든 간테네루맙 종의 합) 및 Man5/Man6 Fab 글리칸을 갖는 간테네루맙의 혈장 농도를 간테네루맙을 랫트에 정맥내 투여(15 mg/kg)한 후 결정하였다(간테네루맙 Man5/Man6 Fab 글리칸 혈장 농도의 결정에 대해서는, 실시예 4/랫트, 정맥내 간테네루맙 주사 연구 3을 참조).
도 6a 및 도 6b: 본원의 방법(고만노스 저/G4 공정)에 따라 생성된 간테네루맙 중 Fab 당형%. Man5, Man6, Man7 및 Man8 함량의 비교는 상이한 방법(고만노스 고/G3 공정)에 의해 생성된 간테네루맙으로 이루어질 수 있다 - 도 6b. 대량 데이터가 표시된다(여러 정제 단계에 의해 완전히 정제됨).
도 7: 본원의 방법(G4 공정)에 따라 생성된 간테네루맙과 이전 방법들(G1, G2 또는 G3 공정)에 따라 생성된 간테네루맙으로 수득된 결과를 비교하는 약동학적 데이터. 대량 샘플의 데이터(여러 정제 단계에 의해 완전히 정제됨). Fab 당형의 고 만노스 데이타.
도 8a 및 도 8b: 래트에서의 제거는 당화된 간테네루맙의 Man5 Fc 당형이 래트에 투여될 때 영향을 받지 않는 반면(도 80a, 패널 B), Fab 당화에서의 Man5 및 Man6 수준은 신속한 제거를 발생시킨다(도 8b, 패널 C 및 패널 D). G2 공정-제조된 물질을 이용한 PK 래트 연구로부터의 데이터.
도 9: 당형의 백분율이 계산될 수 있는 Fab 글리칸 피크를 예시하는 크로마토그램.
정의
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 먼저 특정 용어들이 정의된다.
본 발명이 추가로 설명되기 전에, 본 발명은 물론 달라질 수 있는 바와 같이 설명된 특정 구현예들에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예들을 설명하기 위한 목적이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하려는 의도가 아님을 또한 이해해야 한다.
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어들은 해당 분야의 용어들에 대해 통상적으로 기재되는 의미를 가져야 한다. 하지만, 상기 용어들의 의미와 범위는 명확해야 하며, 임의의 잠재되어 있는 모호성이 있는 경우, 본원에 제공된 정의는 사전적 또는 외재적 정의에 우선한다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 균등한 임의의 방법들 및 재료들은 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있으나, 바람직한 방법들 및 재료들이 현재 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물은 이와 관련하여 간행물이 인용되는 방법 및/또는 재료를 개시하고 기재하기 위해 본원에 원용된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명백하게 달리 명시하지 않는 한 하한 단위의 10분의 1까지, 해당 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 중간 값 및 언급된 범위 안의 임의의 다른 언급된 또는 중간 값이 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 명시된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계치에 따라 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우에, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외하는 범위도 본 발명에 포함된다.
유의할 점은 본원에서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "한(a)", "하나(an)" 및 "그것(the)"이 문맥에서 달리 명백하게 명시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 것이다. 청구항들은 임의의 선택적인 요소를 배제하도록 초안될 수 있다는 것을 추가로 유념해야 한다. 이와 같이, 상기 진술은 청구항 요소의 인용과 관련하여 "단독", "유일" 등의 배타적 용어의 사용 또는 "소극적" 제한의 사용에 대한 선행 근거로 작용하기 위한 것이다.
명료함을 위해 별도의 구현예들의 맥락에서 기재된 본 발명의 특정한 특징들은 단일 구현예와 조합하여 제공될 수도 있음을 이해해야 한다. 이와 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 맥락에서 기재된 본 발명의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로도 제공될 수 있다. 본 발명에 속한 구현예들의 모든 조합은 본 발명에 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 구현예들 및 이의 요소들의 모든 하위-조합들은 또한 본 발명에 의해 구체적으로 수용되고, 각각의 그리고 모든 그러한 하위-조합이 본원에 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 이의 공개를 위해서만 제공된다. 본원에서는 본 발명이 종래 발명에 의해 이러한 간행물에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않는다. 추가로, 제공된 공개 날짜는 독립적으로 확인될 필요가 있는 실제 공개 날짜와 상이할 수 있다.
용어 "항-인간 A-베타 항체" 및 "인간 A-베타에 특이적으로 결합하는 항체"는 항체가 A-베타 펩티드를 표적화하는 데에 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 표적에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 인간 A-베타 펩티드는 여러 천연 발생 형태를 가지며, 이에 의해 인간 형태는 Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43으로 지칭됨에 유의한다. 가장 두드러진 형태는 Aβ42이다. 용어 "항-인간 A-베타 항체" 및 "인간 A-베타에 특이적으로 결합하는 항체"는 또한 인간 A-베타 폴리펩티드의 단축된 단편에 결합하는 항체를 포함한다. A-베타 펩티드는 아밀로이드-베타 또는 Aβ 펩티드로도 공지되어 있으며, 이들 펩티드는 알츠하이머병을 가진 개체의 뇌에서 아밀로이드 플라크의 주요 구성 성분이다.
본원에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중-특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하는, 다양한 항체 구조를 포괄한다. "단리된" 항체는 이의 자연 환경의 구성요소에서 분리된 항체이다. 일부 구현예들에서, 항체는 예를 들어, 전기영동의(예컨대, SDS-PAGE, 등전초점조절(IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도를 초과하여 정제된다. 항체 순도를 평가하는 방법들을 검토하려면, 예컨대, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
“항체 단편"은 원형 항체가 결합하는 항원에 결합하는 원형 항체의 일부를 포함하는 원형 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab’)2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자(예컨대, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"면적%", "면적% Fab" 또는 "% Fab 영역"은, 예컨대, 분리된 글리칸의 크로마토그램으로부터 계산된 각각의 당형(즉, 고 만노스 글리칸 또는 다른 당형)의 백분율을 지칭한다. 도 9는 이러한 크로마토그램을 도시한다. M5-M7 Fab 당형의 백분율을 계산하기 위해, 기준선을, 예컨대, 도 9에서 5 내지 39분으로 그린 다음, 상기 기준선을 갖는 곡선 아래의 면적을 계산한다(A1). 그런 다음, 피크 M5-M7의 면적을 A1으로 나누고 100을 곱하여 퍼센트 M5-M7(면적% 또는 %)을 수득한다. 이러한 방식으로, 조성물 중 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는 당화된 Fab의 총량을 계산한다 - 예컨대, N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는 조성물 중 Fab 영역의 약 20% 이하이다.
"평균 포도당 농도"는 배양 공정의 길이 또는 길이의 일부에 걸친 배양 배지 중의 포도당 농도의 평균을 지칭한다. 상기 평균은 다음과 같은 식들을 이용하여 계산할 수 있다. 세포에 의한 포도당 소비 및 배지에의 첨가, 적절한 초기 배지 내의 포도당 농도, 및 발효 기간 또는 이의 일부는 모두 평균 포도당 농도의 결정에 고려한다. 평균 포도당 농도는 일상적인, 예컨대, 배양 공정에 걸친 포도당 농도의 측정 및 이로부터의 계산에 의해 결정할 수 있거나, 동일하거나 유사한 조건하에서 이전의 발효 실행으로부터 추정하고 그에 따라 설정할 수 있다. 하기 기재된 Fab 영역(들)에서 포도당 농도와 고 만노스 구조를 갖는 항체의 생성 사이의 연관성은 발효 실행을 위한 평균 포도당 농도의 선택을 알려줄 수 있다. 포도당 농도는 본 개시 내에서 g/L로 주어지며, 이는 순수 포도당을 의미하고 포도당 일수화물 등을 의미하지 않는다.
본원에서 사용되는 "바이오매스"는 배양 배지에서 배양된 세포의 양 또는 중량을 지칭한다. 바이오매스는 생존 세포 밀도, 총 세포 밀도, 세포 시간 적분(생존 및 총 세포 밀도에 대해), 세포 부피 시간 적분(생존 및 총 세포 밀도에 대해), 패킹된 세포 부피, 건조 중량 또는 습윤 중량을 결정함으로써 직접적으로 또는 간접적으로 측정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생물반응기"는 포유류 세포 배양물의 성장에 사용되는 임의의 용기를 지칭한다. 전형적으로, 생물반응기는 적어도 0.25리터일 것이고, 1, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000리터 이상, 또는 그 사이의 임의의 부피일 수 있다. pH, 용존 산소 및 온도를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 생물반응기의 내부 조건은 일반적으로 배양 기간 동안 제어가능하다. 생물반응기는 유리, 플라스틱 또는 금속 또는 이의 조합을 포함하는, 본 발명의 배양 조건하에 배지 내에 현탁된 포유류 세포 배양물을 유지하기에 적합한 임의의 재료로 구성될 수 있다. 생물반응기는 다중 또는 단일 사용, 재사용, 일회용 또는 재활용이 가능할 수 있다.
본원에서 사용되는 "탄수화물 공급원"은 배양물에서 진핵 세포의 성장에 필요한 에너지이다. 전형적으로 탄수화물 공급원은 포도당, 갈락토스, 프럭토스 및 만노스로부터 선택되는 단당류이지만, 또한 적절한 배양 배지가 선택되는 경우 말토스 또는 전분과 같은 다당류일 수 있다.
"세포" 및 "세포주"는 본원에서 함께 사용되며 이러한 모든 명칭은 자손을 포함한다.
본원에서 사용되는 "세포 밀도"는 주어진 부피의 배지 내에 존재하는 세포의 수를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "세포 생존율"은 주어진 세트의 배양 조건 또는 실험적 변형하에서 생존할 수 있는 배양 중 세포의 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 용어는 또한 그 당시 배양물에서 살아있는 세포 또는 죽은 세포의 총 수와 관련하여 특정 시간에 살아있는 세포의 부분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 약물 "제거율"은 특정 기간에 걸쳐 약물이 제거된 혈장의 체적이다. 따라서, 약물 제거율에 대한 측정 단위는 부피/시간 또는, 체중으로 표준화될 때, 부피/시간/체중이다.
본원에서 사용되는 "연속 공급"은 배양의 전체 또는 일부 기간에 걸쳐 세포 배양 배지에 지속적으로 영양분을 제공하는 것을 의미한다. 첨가되는 사료의 양 및 조성은 배양 중에 필요에 따라 조절할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "배양물" 및 "세포 배양물"은 세포군의 생존 및/또는 성장에 적합한 조건하에서 배지에 현탁된 세포군을 지칭한다. 이들 용어는 그 안에 현탁된 배지 및 세포군의 조합에도 적용될 것이다.
"배양 조건" 및 "발효 조건"은 본원에서 함께 사용되며, 성공적인 세포 배양 및 당단백질 생성을 달성하기 위해 만족되어야 하는 조건이다. 전형적으로, 이들 조건은 적절한 배지의 제공뿐만 아니라, 예컨대, 약 37°C이어야 하는 온도의 제어를 포함하지만, 또한 배양 동안의 온도 이동(예컨대, 37°C 내지 34°C) 및 통상적으로 6.8 내지 7.2인 pH뿐만 아니라 산소 및 이산화탄소의 제공을 포함할 수 있다. 이러한 조건은 또한 세포가 배양되는 방식, 예컨대, 진탕기 또는 로봇 배양을 포함한다.
농도, 양 또는 측정과 관련하여 사용될 때 "매일"은 24시간의 단일 기간을 지칭한다. 따라서, 매일 측정은, 예컨대, 원소의 농도가 24시간의 기간에 한 번 측정되는 것을 의미한다. 예컨대, 배양물에 첨가된 요소의 일일 양은 24시간의 기간에 상기 요소의 첨가의 총합이며, 단일 또는 다중 첨가를 포함할 수 있다.
작용제, 예컨대, 약학적 조성물의 "유효량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는 데 필요한 투여량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 항-A-베타 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230에서 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 하지만, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447), 또는 C-말단 글리신(Gly446) 및 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-A-베타 항체는 IgG1 동형이고 서열번호 9의 불변 중쇄 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 이는 C-말단 리신(Lys447)이 없는 서열번호 9의 불변 중쇄 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 이는 C-말단 리신(Lys447) 및 C-말단 글리신(Gly446)이 없는 서열번호 9의 불변 중쇄 도메인을 포함한다.　본원에서 달리 특정되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242에 기재된, EU 색인으로도 지칭되는, EU 넘버링 체계에 따른다.　
본원에 사용된 "유가식 배양"은 배양 과정의 시작 시에 또는 그 이후에 배양물에 추가 성분이 제공되는 세포 배양 방법을 지칭한다. 유가식 배양은 일반적으로 특정 시점에서 중단되고 배지의 세포 및/또는 성분이 회수되고 임의적으로 정제된다.
당단백질과 관련하여 본원에 사용된 "갈락토실화된"은 G1 및 G2 당구조를 생성하는 하나 이상의 갈락토스 잔기를 포함하는 당단백질을 지칭한다.
"글리칸"은 다당류 또는 단당류 모이어티를 지칭한다: 포도당(Glc), 갈락토스(Gal) 만노스(Man), 푸코스(Fuc), N-아세틸갈락토사민(GalNAc), N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산(예컨대, N-아세틸뉴라민산(NANA 또는 NeuNAc, 이때 Neu는 뉴라민산임). 당 군의 처리는 ER의 내강에서 병진적으로 발생하고, N-연결된 당단백질에 대해 골지체에서 계속된다. 본원의 Aβ-글리칸은 하나 또는 둘 모두의 항원 결합 부위의 중쇄의 가변 영역 내 위치 52에서 아스파라긴(Asn)의 아미드 질소에서 N-당화된다.
모든 N-연결된 올리고당/다당류는 Man3GlcNAc2의 공통적인 "오당류 코어"를 갖는다. 오탄류 코어는 또한 "트리만노스(trimannose) 코어"로 지칭된다.
N-글리칸은 오당류 코어 구조에 첨가되는 GlcNAc, Gal, GalNAc, NANA 및 Fuc와 같은 말초 당을 포함하는 분지(안테나로도 불림)의 존재 및/또는 수에 있어서 서로 상이하다. 임의적으로, 이러한 구조는 또한 코어 푸코스 분자 및/또는 코어 자일로스 분자를 함유할 수 있다. 표준 당생물학 명명법의 검토를 위해, Essentials of Glycobiology Varki et al., CSHL Press (1999)을 참조한다.
N-글리칸은 이들의 분지형 구성성분(예컨대, 올리고만노스-유형, 복합체 또는 하이브리드)에 따라 분류된다. 항기 코어 상에 하나 이상의 말단 Gal 잔기를 갖는 갈락토실화 종은 G0, G1 및 G2 종을 포함한다. 올리고만노스 N-글리칸은 본원에서 "만노스-유형" 또는 "고-만노스 유형"으로 분류될 수 있다. 고-만노스 유형 N-글리칸은 글리칸 당 5개 이상의 만노스 잔기(코어를 형성하는 임의의 것을 포함), 예컨대, M5, M6 또는 M7을 갖는다. 단지 3 또는 4개의 만노스 잔기, 예컨대, M3 또는 M4가 존재하는 경우, 글리칸은 만노스-유형이다. 복합-유형 N-글리칸은 전형적으로 오당류 코어의 1,3-만노스 아암(arm)에 부착된 적어도 하나의 GlcNAc 및 1,6 만노스 아암에 부착된 적어도 하나의 GlcNAc를 갖는다. 복합-유형 N-글리칸은 또한 NANA 또는 다른 시알산 유도체로 임의적으로 변형되는 Gal 또는 GalNAc 잔기를 가질 수 있다. 복합-유형 N-글리칸은 또한 "이등분" GlcNAc, 및 코어 Fuc를 포함하는 사슬내 치환을 가질 수 있다. 그렇지 않으면, 또는 추가적으로, 이들은 또한 오당류 코어 상에 다수의 안테나를 가질 수 있고, 따라서 "다중 안테나형 글리칸"으로도 지칭된다. 하이브리드형 N-글리칸은 오당류 코어의 1,3 만노스 어암 상에 적어도 하나의 GlcNAc 및 상기 코어의 1,6 만노스 아암 상에 하나 이상의 만노스를 포함한다. 말단 시알산 잔기가 또한 존재할 수 있다. 따라서, 하이브리드 만노스 종은 hM3, hM4, hM3G1, hM4G1, hM5G1, hM5G1S1, hM4G1S1 및 hM3G1S1을 포함한다. 시알릴화된 종은 G1S1, G2S1, G2S2 및 3개의 하이브리드 만노스 종 hM5G1S1, hM4G1S1 및 hM3G1S1을 포함하는 종과 같은 하나 이상의 말단 시알산 잔기를 포함한다.
올리고만노스 구조(고-만노스 유형)는 "M5", "Man5" 또는 "Man5 글리칸"; "M6", "Man6" 또는 "Man6 글리칸"; "M7", "Man7" 또는 "Man7 글리칸"; "M8", "Man8" 또는 "Man8 글리칸" 및 "M9", "Man9" 또는 "Man9 글리칸"을 포함한다. "고 만노스"는 만노실화, 또는 만노실화된 N-글리칸의 양 또는 수준을 지칭하며, 예를 들어, Man5, Man6, Man7, Man8 및 Man9를 포함한다. 본 발명에서, "고 만노스"는 Man5, Man6 및 Man7 당형을 포함하는 하나 또는 혼합물을 포함하는 것으로 의도되지만, 미량의 Man8 또는 Man9가 또한 존재할 수 있다. 코어 구조의 임의의 형성 부분을 포함하여, 글리칸 내의 모든 만노스 잔기가 계수된다.
"당단백질"은 적어도 하나의 글리칸 모이어티를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
용어 "당형"은 단백질의 동형, 예컨대, 부착된 글리칸(들)의 수 및/또는 유형에 대해서만 상이한 항체를 지칭한다. 당단백질은 종종 다수의 상이한 당형으로 구성된다. "고 만노스 당형"은 하나 또는 둘 모두의 Fab 영역에서 N-연결된 글리칸이 "고 만노스" 함량을 갖는, 즉 Man5, Man6 및 Man7(임의적으로 미량의 Man8을 가짐) 글리칸 중 하나 또는 혼합물을 포함하는 항체이다. 본 발명에 포함된 것은, 예컨대, 상이한 당분석 방법을 사용하여 확인된 이러한 고 만노스 당형의 변이체이다.
용어 G1, G2, G3 및 G4는 고 만노스 형태의 간테네루맙의 더 많은 양 및 더 적은 양의 생성을 위한 공정 버전을 기재하기 위해 본원에서 사용된다. G2 및 G3 공정은 "고 만노스 고" 공정 버전이다 - 즉, 더 많은 양의 고 만노스 버전, 예를 들어, 완전 정제된 물질에 대해 최대 8% Fab 고 만노스가 생성되고, G1 및 G4 공정은 "고 만노스 저" 공정 버전이다 - 즉, 더 적은 양의 고 만노스 버전이, 예를 들어, 완전 정제된 물질에 대해 0 내지 8% Fab 고 만노스로부터 생성된다. 본원에 기재된 방법은 G4 공정이다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 본원에서 함께 사용되며, 당단백질을 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 나타낸다. 이들은 외인성 핵산이 도입된 세포를 말하며, 이러한 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 계대 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모체 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
"배지", "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 본원에서 함께 사용되며, 포유류 세포의 성장 및 이로부터의 당단백질 생성을 지속시키는 영양소를 함유하는 용액을 지칭한다. 전형적으로, 상기 용액은 최소 성장 및/또는 생존을 위해 세포에 필요한 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질 및 미량 원소를 제공한다. 상기 용액은 또한 호르몬 및/또는 기타 성장 인자, 나트륨, 염화물, 칼슘, 마그네슘 및 인산염과 같은 특정 이온, 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소, 아미노산, 지질 및/또는 포도당 또는 기타 에너지원을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 최소 비율 이상으로 성장 및/또는 생존을 향상시키는 보조 성분을 함유한다. 배지는 유리하게는 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제형화된다. 배지는 환원된 혈청 또는 무혈청 배지일 수 있고, 즉 상기 배지는 약 1-5% 혈청을 함유하거나, 또는 상기 배지에 본질적으로 임의의 포유류 혈청(예컨대, 소 태아 혈청)이 없을 때의 각각의 배지이다. 혈청이 "본질적으로 없는"은 배지가 0-5% 혈청, 바람직하게는 약 0-1% 혈청, 가장 바람직하게는 약 0-0.1% 혈청을 포함하는 것을 의미한다. 무혈청 한정 배지가 사용될 수 있고, 이때 배지의 성분들 각각의 아이덴티디 및 농도가 공지되어 있다. 배지는 무단백질 배지일 수 있고, 즉 이는 단백질을 함유하지 않지만, 예컨대, 식물 가수분해물로부터의 정의되지 않은 펩티드를 함유할 것이다. 배지는 인간 혈청 알부민 및 인간 트랜스페린을 포함할 수 있지만, 잠재적으로 동물-유래된 인슐린 및 지질, 또는 인간 혈청 알부민, 인간 트랜스페린, 인간 인슐린 및 화학적으로 규정된 지질을 함유하는 배지를 포함할 수 있다. 대안적으로, 배지는 화학적으로 규정된 배지, 즉 모든 물질이 규정되고 규정된 농도로 존재하는 배지일 수 있다. 이들 배지는 단지 재조합 단백질 및/또는 호르몬 또는 단백질-무함유의 화학적으로 규정된 배지만을 함유할 수 있고, 즉 요구되는 경우 단지 저분자량 성분 및 합성 펩티드/호르몬을 함유할 수 있다. 화학적으로 규정된 배지는 또한 임의의 단백질이 완전히 없을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 예컨대, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 예컨대, 자연 발생적 돌연변이 또는 단일클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "단일클론(monoclonal)"은 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 그리고 인간 면역 글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자삽입 동물을 이용하는 방법들을 포함하여(하지만 이에 제한되지는 않음) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 방법 및 단일클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.
"단일-당화(mono-glycosylated) 항체"는 개별 항체 분자의 하나의 중쇄(VH) 영역 내에 N-당화를 포함하는 항체이다. 이러한 항체는, 예컨대, 간테네루맙일 수 있다. 예를 들어, 간테네루맙의 단일-당화 형태는 하기 논의되는 바와 같이, 중쇄의 하나의 가변 영역, 예컨대, 위치 Asn 52 상에 당화를 포함한다. 이러한 단일-당화 항체는 또한 Fc 부분, 예컨대, Asn 306의 잘 보존된 당화 부위에 당화를 포함할 수 있다.
"이중-당화 항체"는 중쇄(VH)-영역의 둘 모두의 가변 영역 상에 N-당화를 포함한다. 예를 들어, 간테네루맙의 이중-당화 형태는 하기 논의되는 바와 같이, 중쇄의 둘 모두의 가변 영역, 예컨대, 위치 Asn 52 상에 N-당화를 포함한다. 이러한 이중-당화 항체는 또한 Fc 부분, 예컨대, Asn 306의 잘 보존된 당화 부위에 당화를 포함할 수 있다.
하기의 개시는 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는 조성물 중 Fab 영역의 백분율에 관한 것이다. 이는 제제 내의 총 N-당화된 Fab 영역에 대한, 원하는 구조를 갖는 Fab 영역의 비율을 지칭한다. Fab 영역은 조성물에 포함된 단일클론 항체의 일부를 형성할 수 있으며, 이는 단일- 또는 이중-당화될 수 있거나, 또는 상기 조성물은 Fab 영역 그 자체일 수 있다. 따라서, 조성물 중 약 20%의 Fab 영역이 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는다면, 제제 중 나머지 80%의 Fab 영역은 고 만노스 글리칸 이외의 구조를 갖는 Fab 영역(들)에서 N-연결된 당화를 갖는 당형이고, 이때 상기 구조의 성질은 본 개시에 중요하지 않다. 제제 중 각각의 당형(예컨대, 고 만노스 또는 고 만노스 이외의 것)의 백분율은, 예컨대, 생성된 글리칸의 크로마토그램으로부터 계산할 수 있다. 도 9는 이러한 크로마토그램을 도시한다. 도 9로부터 M5-M7 당형의 백분율을 계산하기 위해, 기준선을 5 내지 39분(즉, 최대 용출 시간)으로 그린 다음, 상기 기준선을 갖는 곡선 아래의 면적을 계산한다(A1). 그런 다음, 피크 M5-M7의 면적을 A1으로 나누고 100을 곱하여 퍼센트 M5-M7을 수득한다.
본원에 사용될 때 "관류 배양"은 많은 수의 생존 세포를 보유하면서 새로운 배지의 지속적인 공급 및 소비된 배지 및 생성물의 제거를 포함하는 세포 배양 공정을 지칭한다. 세포는 관류 배양 동안 제거되지 않는다. 세포를 배양물 중에 유지하면서 소모된 배지를 제거하는 것은 교대 접선-유동 여과(ATF) 및 표준 접선-유동 여과(TFF)를 사용하여 실시할 수 있거나, 또는 세포는 생물반응기 내의 기질에 결합시킴으로써 보유할 수 있다.
용어 "약학적 조성물"이란 내부에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 제재를 지칭하며, 제제가 투여되는 대상체에게 허용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.
“약학적으로 허용가능한 담체”는 활성 성분 이외에 약학적 제제 또는 조성물 안에 있는 성분을 말하며, 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 "단백질"은 개별 단위로서 기능하는 하나 이상의 폴리펩티드를 지칭한다. 단백질이 기능하기 위해 단지 하나의 폴리펩티드를 포함할 때, 용어 폴리펩티드 및 단백질은 함께 사용된다.
본원에 사용되는 "분할"은 또한 세포의 계대 또는 계대 배양으로서 공지되어 있다. 이는 적은 수의 세포를 새로운 배지로 전달하는 것을 포함하며, 이에 의해 분열 세포는 새로운 배지를 씨딩한다. 현탁 배양물에서, 소수의 세포를 함유하는 소량의 배양물을 더 큰 부피의 신선한 배지로 희석시킨다.
본원에 사용되는 "치료적"은 질병을 치료하려는 의도로 질병을 치료하는 것에 관한 것이다. 치료 항체는 특정 세포 또는 분자에 대한 내인성 면역 반응을 활성화, 억제 또는 변경할 수 있다. 치료 단일클론 항체는 자가면역, 심혈관 및 감염성 질병, 암 및 염증과 같은 질병의 치료를 위해 사용한다.
본원에서는 다음과 같은 약어가 사용된다:
Aβ A-베타 펩티드
ADCC 항체 의존성 세포 세포독성
AUC 곡선 아래 면적
CDC 보체 의존성 세포독성
CDR 상보성 결정 영역
Complex-F GlcNAc GlcNAc Man3 GlcNAc2 Gal0-2
Core GlcNAc2 Man3
Cmax 약물 투여 후 최대 혈청 농도
CTI 셀 시간 적분
ECLIA 전기화학발광 면역검정
ELISA 효소 결합 면역흡착 검정
Fab 항원 결합 단편
Fc 단편 결정화 영역
FR 프레임워크 영역
Fuc L-푸코오스
G0 GlcNAc Fuc GlcNAc Man3 GlcNAc2
G0-F GlcNAc GlcNAc Man3 GlcNAc2
G1 GlcNAc Fuc GlcNAc Man3 GlcNAc2 Gal
G1-F GlcNAc GlcNAc Man3 GlcNAc2 Gal
G2 GlcNAc Fuc GlcNAc Man3 GlcNAc2 Gal2
G2 1SA GlcNAc Fuc GlcNAc Man3 GlcNAc2 Gal2 NANA1
Gal D-갈락토오스
GlcNAc N-아세틸글루코사민
HILIC 친수성 상호작용 크로마토그래피
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
High Mannose GlcNAc2 Man5-7
HVR 초가변 영역
ICP-MS 유도 결합 플라즈마 질량 분석법
i.v. 정맥내
LDH 젖산 탈수소효소
mAb 단일클론 항체
Man D-만노스
Man5/M5 GlcNAc2 Man5
Man6/M6 GlcNAc2 Man6
Man7/M7 GlcNAc2 Man7
Man8/M8 GlcNAc2 Man8
MCB 마스터 세포 은행
NANA N-아세틸뉴라민산
PSB 기본 종자 은행
RSME 평균 제곱근 오차
s.c. 피하
UHPLC 초고성능 액체 크로마토그래피
Vss 평균 겉보기 분포 부피
WCB 작업용 세포 은행
본 발명의 원리들을 예시하는 구현예들 및 실험들이 이제 첨부된 도면들을 참조하여 논의될 것이다.
1. Fab 구성
이러한 양태에 따라서, 본 발명은 이의 Fab 영역(들)에서 N-당화를 갖는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 이때 상기 조성물 내 당화된 Fab의 총량에 대해 조성물 내 Fab 영역의 약 20% 이하가 이의 Fab 영역(들)에서 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는다. 상기 조성물은 세포 배양 상청액 또는 약학적 조성물 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단일클론 항체를 포함하거나, 함유하거나, 또는 이들로 이루어질 수 있다. 상기 조성물에서, 단일클론 항체는 상이한 특이성을 갖는 항체가 전형적으로 존재하지 않는다는 점에서 실질적으로 순수하다. 단일클론 항체 이외의 성분이 또한 하기에 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이 조성물 내에 존재할 수 있다.
하기의 구절은 또한 본 발명의 추가적인 양태의 방법에 의해 생성된 항체 조성물과 관련된다.
본 발명의 이러한 양태의 바람직한 구현예에서, 단일클론 항체를 포함하는 조성물에서, N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는 Fab 영역의 백분율은 약 0-20%, 더 바람직하게는 약 0-15% 또는 약 0-12%, 보다 더 바람직하게는 약 0-10%이다. 상기 언급된 바와 같이, N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는 Fab 영역의 이러한 백분율은 전체 N-연결된 당화 Fab 영역에 대한 것이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 조성물에서, N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는 Fab 영역의 백분율은 약 15% 이하, 바람직하게는 약 12% 이하, 보다 더 바람직하게는 약 10% 이하이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 조성물에서 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는 Fab 영역의 백분율은 약 2% 초과, 보다 더 바람직하게는 약 4% 초과이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 단일클론 항체를 포함하는 조성물에서, N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는 Fab 영역의 백분율은 약 2-20%, 또는 약 2-15%, 또는 약 2-12% 또는 약 2-10% 또는 약 4-20%, 약 4-15%, 약 4-12% 또는 약 4-10%이다.
본 발명의 이러한 양태에서, 단일클론 항체를 포함하는 조성물 중 약 20% 이하의 Fab 영역이 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는다. 고 만노스 글리칸은 총 5 내지 9개의 만노스 잔기를 갖는 글리칸일 수 있다. 본원에서 사용된 "전체"는 코어 구조의 일부를 형성하는 만노스 잔기(GlcNAc2 Man3)를 포함한다. 고 만노스 글리칸은 총 5 내지 9개의 만노스 잔기를 갖는 임의의 2개 이상의 글리칸 중 하나 또는 혼합물일 수 있다. 즉, 단일클론 항체를 포함하는 조성물은 5개의 만노스 잔기를 갖는 고 만노스 글리칸을 갖는 다수의 Fab 영역, 6개의 만노스 잔기를 갖는 고 만노스 글리칸을 갖는 다수의 Fab 영역, 7개의 만노스 잔기를 갖는 고 만노스 글리칸을 갖는 다수의 Fab 영역, 8개의 만노스 잔기를 갖는 고 만노스 글리칸을 갖는 다수의 Fab 영역, 및/또는 9개의 만노스 잔기를 갖는 고 만노스 글리칸을 갖는 다수의 Fab 영역을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 8 또는 9개의 만노스 당형이 존재하지 않을 수 있다. 딘일클론 항체를 포함하는 조성물 중 각각의 고 만노스 당형(즉, M5, M6, M7, M8 및 M9)의 수는, 조성물 중의 고 만노스 Fab 영역의 상대 함량, 즉 조성물 중의 당화된 Fab 영역의 총 수에 대한 함량이 약 20% 이하인 한, 본 발명에 중요하지 않다.
따라서, 전형적으로 고 만노스 글리칸은 GlcNAc2 Man3 코어에 부착된 2 내지 6개의 만노스 잔기를 갖는다. 따라서, 고 만노스 글리칸은 Man5(GlcNAc2 Man5); Man6(GlcNAc2 Man6); Man7(GlcNAc2 Man7); Man8(GlcNAc2 Man8) 또는 Man9(GlcNAc2 Man9)일 수 있다. 본 개시의 고 만노스 글리칸은 Man5, Man6, Man7, Man8 및 Man9 당형 중 하나 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 고 만노스 글리칸은 Man5, Man6 및 Man7 당형의 하나 또는 혼합물이다. 전형적으로, Man5, Man6 및 Man7 당형의 각각은 고 만노스 글리칸 조성물에 존재한다. 이들 당형은 도 1에 도시되어 있다. 무시할 수 있는 양(즉, 0.1% 이하)의 Man8 또는 Man9 당형이 존재할 수 있다. 전형적으로, Man8 및 Man9 중 어느 것도 이러한 구현예에서 임의의 유의적인 양으로 존재하지 않는다.
조성물 중 단일클론 항체의 당화된 Fab 영역 내 고 만노스 당형의 총합이 약 20% 이하 또는 상기 제시된 백분율 범위 내에 있는 한, 상기 조성물 중 단일클론 항체의 당화된 Fab 영역 중의 각각의 고 만노스 당형, 예컨대, Man5, Man6 및 Man7 각각의 상대적인 양은 중요하지 않다. 따라서, 본 발명은 Man5, Man6 또는 Man7 중 하나 이상을 포함하는 약 0-10%, 약 0-12%, 약 0-15% 또는 약 0-20%의 Fab 고 만노스 글리칸, 바람직하게는 Man5, Man6 또는 Man7 중 하나 이상을 포함하는 약 2-10%, 약 2-12%, 약 2-15% 또는 약 2-20% 또는 약 4-10%, 약 4-12%, 약 4-15% 또는 약 4-20%의 Fab 고 만노스 글리칸으로부터의 단일클론 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 점에서 "하나 이상"은 Man5, Man6 및 Man7 중 1개, 2개 또는 3개를 의미하며, 이때 조합은 Man5 및 Man6, Man5 및 Man7, Man6 및 Man7 또는 Man5, Man6 및 Man7일 수 있다.
본 발명의 이러한 양태에서, Fab 영역 내 N-연결된 당화의 80% 미만, 바람직하게는 약 85% 미만, 약 88% 또는 약 90%, 더 바람직하게는 약 80% 내지 약 98%, 약 85% 내지 약 98%, 약 88% 내지 약 98% 또는 약 90% 내지 약 98%, 또는 약 80% 내지 약 96%, 약 85% 내지 약 96%, 약 88% 내지 약 96% 또는 약 90% 내지 약 96%는 고만노스 이외의 글리칸 구조를 포함하고, 갈락토실화, 시알릴화, 하이브리드 만노스 또는 만노스-유형 구조로부터 선택된다. 조성물은 임의의 N-연결된 당화를 함유하지 않는 항체를 소량%, 예컨대, 약 5% 미만으로 함유할 수 있다.
하이브리드 만노스 또는 만노스/만노스-유형 구조는 상기 기재된 고 만노스 당형을 포함하지 않는다. "미확인된" 글리칸 형태가 또한 존재할 수 있다. 고 만노스가 아닌 당형의 정확한 본질이 본 발명에 필수적인 것은 아니다. 전형적으로, 그러한 당형 구조는 G1, G2, G1S1, G2S1, G2S2, hM3G1, hM4G1, hM5G1, hM3, hM4, hM4G1S1, hM3G1S1, hM5G1S1, M3 및 M4를 포함한다. 이들 구조는 도 1에 도시되어 있다. 바람직한 구현예에서, 단일클론 항체를 포함하는 조성물 중 80% 미만의 Fab 영역은 갈락토실화 및 시알릴화로부터 선택되는 N-연결된 글리칸 구조를 갖는다. 특히 바람직한 이러한 구조는 G1, G2, G1S1, G2S1, G2S2, hM3G1S1, hM4G1S1 및 hM5G1S1을 포함한다. 본 발명은 이의 Fab 영역(들)에 N-당화를 갖는 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체 조성물을 고려하는데, 이때 조성물 내의 당화된 Fab 영역의 총량에 대해, 조성물 내의 약 20% 이하의 Fab 영역이 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖고 조성물 내의 약 80% 이상의 Fab 영역이 N-연결된 갈락토실화된, 시알릴화된, 하이브리드 만노스 또는 만노스 글리칸을 갖는다. 고 만노스, 갈락토실화, 시알릴화, 하이브리드 만노스 및 만노스/만노스-유형 글리칸의 구조는 본원에 기재된 구조 중 임의의 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 이러한 양태에서, 단일클론 항체는 항원 상의 단일 에피토프를 특이적으로 표적화하는 항체의 균질한 집단이다. 단일클론 항체는 이의 Fab 영역(들)에서 N-당화된다. 일반적으로 공지된 바와 같이, 단일클론 항체는 하나의 Fc 단편 및 2개의 Fab 단편으로 구성된다. 본 발명의 이러한 양태의 조성물 중 단일클론 항체는 항원 결합 단편 중 하나 또는 둘 모두에서 N-당화를 가질 수 있으며, 즉 상기 항체는 단일-당화 또는 이중-당화될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 단일클론 항체는 이중-당화되고, 즉 이는 항원 결합 단편(Fab 영역) 둘 모두에서 N-당화되고, 다른 구현예에서 조성물 중 단일클론 항체는 단일-당화되고, 즉 이는 항원 결합 단편(Fab 영역) 중 하나에서만 N-당화된다. 본 발명의 조성물은 실질적으로 순수한 단일-당화된, 실질적으로 순수한 이중-당화된 또는 단일- 및 이중-당화된 항체의 혼합물을 함유할 수 있다.
N-당화가 존재하는 Fab 영역 내의 부위는 조성물 중 단일클론 항체에 의존할 것이다. N-당화는 전형적으로 중쇄(VH) 영역의 가변 영역 내 아스파라긴(Asn)에서 발생한다. 잠재적인 당화 부위는 항체의 중쇄(들)의 아미노산 서열에서 Asn-X-Ser/Thr 모티프를 포함하고, 본 발명의 조성물에 포함된 단일클론 항체는 자연적으로 이러한 당호 부위를 함유할 수 있거나, 또는 이러한 당화 부위를 도입하여 항체 다양화에 기여하도록 조작될 수 있다.
본 발명의 이러한 양태의 조성물에 포함되는 단일클론 항체는 치료 또는 진단 항체, 바람직하게는 치료용 단일클론 항체일 수 있다. 추가의 구현예에서, 상기 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다.
특정 구현예들에서, 본원에서 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예컨대, US 4,816,567호; 및 Morrison, et al., P.N.A.S. 81 (1984) 6851-6855에 기재되어 있다. 일 예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예컨대, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 또는 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 분류 또는 하위분류가 모 항체의 분류로부터 변화되어 있는 “분류 전환된” 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구현예들에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 비-인간 모 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 또는 그 이상의 가변적 도메인을 포함하는데, HVR들, 예컨대, CDR들(또는 이의 부분들)은 비-인간 항체로부터 유도되고, FR들(또는 이의 부분들)은 인간 항체 서열로부터 유도된다. 인간화 항체는 임의적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 구현예들에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는 비-인간 항체(예컨대, HVR 잔기가 유도된 항체)의 대응 잔기로 대체되어, 예컨대, 항체 특이성 또는 친화도가 복원 또는 개선된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예컨대 Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되고, 예컨대 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제5,821,337호, 7,527,791호, 6,982,321호, 및 7,087,409호; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)(특이성 결정 영역(SDR) 이식을 기재함); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(“표면 노출 잔기 변형(resurfacing)”을 기재함); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)(“FR 셔플링(shuffling)”을 기재함); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(FR 셔플링에 대한 “유도된 선택” 접근법을 기재함)에 추가로 기재되어 있다.
인간화를 위해 사용할 수 있는 인간 프레임워크 영역은 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: "최적 맞춤(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예컨대, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)을 참조); 특정 하위군의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예컨대, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)을 참조); 인간 성숙(체세포적으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예컨대, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)을 참조); 및 FR 라이브러리 선별로부터 유래된 프레임워크 영역(예컨대, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)을 참조).
특정 구현예들에서, 본원에서 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 해당 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 공격에 반응하여 원형 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 원형 항체를 생성하도록 변형된 형질전환 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 일반적으로 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하는, 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합된, 인간 면역글로불린 유전자좌의 전체 또는 일부를 포함한다. 이러한 유전자삽입 마우스에서 상기 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화되어 있다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법을 검토하려면, LLonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조한다. 또한, 예컨대, 미국 특허 제6,075,181호 및 6,150,584호에서는 제노마우스(XENOMOUSE)TM 기술을 설명하고; 미국 특허 제5,770,429호에서는 휴맵(HuMab)® 기술을 설명하고; 미국 특허 제7,041,870호에서는 K-M 마우스(MOUSE)® 기술을 설명하고, 그리고 미국 공개특허출원 US 2007/0061900에서는 벨로시마우스(VelociMouse)® 기술을 설명한다. 이러한 동물에 의해 생성된 원형 항체로부터 얻은 인간 가변 영역은 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 결합시킴으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 하이브리도마 기반 방법으로도 만들 수 있다. 인간 단일클론 항체를 만들기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 설명된 바 있다. (예컨대, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)을 참조한다.) 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에 더 상세히 기재된다. 또 다른 방법에는, 예를 들어, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생성 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마 설명)에 기재된 방법들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술(Trioma 기술)은 또한 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한, 인간-유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 그런 다음 이러한 가변 도메인 서열은 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다.
본 발명의 이러한 양태의 조성물은 전형적으로 전체 항체를 함유하지만, 본 발명은 또한 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 단일-사슬 Fab(scFab); 단일-사슬 가변 단편(scFv) 및 단일 도메인 항체(dAb)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 항체 단편, 뿐만 아니라 바이오시밀러로 확장된다.
특정 구현예들에서, 본원에 제공된 항체는 Fab N-당화 부위를 포함하는 항체 단편이다. 용어 "항체 단편"은 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 원형 항체의 일부를 포함하는 원형 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 단일-사슬 Fab(scFab); 단일-사슬 가변 단편(scFv) 및 단일 도메인 항체(dAb)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편들에 대한 검토는, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)를 참조한다.
일 구현예에서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab’, Fab’-SH 또는 F(ab’)2 단편, 특히, Fab 단편이다. 원형 항체들의 파파인 분해는 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(각각 VH 및 VL) 및 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1) 또한 함유하는 2개의 동일한 항원-결합 단편들, 소위 “Fab” 단편들을 생성한다. 따라서 용어 "Fab 단편"은 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. Fab’ 단편"은 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하여 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 잔기들의 부가에 의해, Fab 단편과 상이하다. Fab’-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab’ 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위(2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab’)2 단편을 생성한다. 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 관한 논의를 위해, U.S. 특허 제5,869,046호를 참조한다.
다른 구현예에서, 항체 단편은 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디이다. 디아바디는 2가 또는 이중 특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위가 있는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디가 또한 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 기재되어 있다.
추가의 구현예에서, 항체 단편은 단일 사슬 Fab 단편이다. "단일 사슬 Fab 단편"또는 "scFab"은 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 중쇄 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 연결기로 구성된 폴리펩티드로서, 이때 상기 항체 도메인 및 상기 연결기는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음 순서 중 하나를 갖는다: a) VH-CH1-연결기-VL-CL, b) VL-CL-연결기-VH-CH1, c) VH-CL-연결기-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-연결기-VH-CL. 특히, 상기 연결기는 최소 30개 아미노산, 바람직하게는 32개 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일 사슬 Fab 단편은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 자연 이황화 결합을 통해 안정화된다. 또한, 이들 단일 사슬 Fab 단편들은(예컨대, 카바트(Kabat) 넘버링에 따라 가변 중쇄에서 위치 44 및 가변 경쇄에서 위치 100) 시스테인 잔기의 삽입을 통한 사슬간 이황화 결합의 생성에 의해 추가로 안정화 될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 항체 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다. “단일 사슬 가변 단편” 또는 “scFv”는 연결기에 의해 연결된, 항체의 중쇄(VH)와 경쇄(VL)의 가변 도메인의 융합 단백질이다. 특히, 연결기는 10 내지 25개 아미노산의 짧은 폴리펩티드이고, 통상적으로 유연성을 위한 글리신뿐만 아니라 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, 그리고 VH의 N 말단을 VL의 C 말단과 연결하거나 또는 그 반대일 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거와 연결기의 도입에도 불구하고 원래 항체의 특이성을 유지한다. ScFv 단편에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Pl
Figure pct00001
ckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)를 참조한다; 또한, WO 93/16185; 및 U.S. 특허 번호 5,571,894와 5,587,458을 참조한다.
다른 구현예에서, 상기 항체 단편은 단일 도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예들에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예컨대, 미국 특허 제6,248,516호 B1을 참조).
본 개시에서, 항체 단편은 원형 항체 이외의 것이고, Fab N-당화 부위를 포함하고, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 원형 항체의 일부를 포함한다.
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 원형 항체의 단백질분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예컨대, CHO)에 의한 재조합 제조를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다.
특정한 구현예들에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예컨대, 이중-특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위, 다시 말하면, 상이한 항원 상에서 상이한 에피토프 또는 동일한 항원 상에서 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 구현예들에서, 결합 특이성 중에서 하나는 인간 A-베타에 대한 것이고, 다른 특이성은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예들에서, 다른 특이성은 EP 3356400에 기재된 바와 같이 트랜스페린 수용체에 대한 것이다. 이러한 항체는 알츠하이머병의 진단 또는 치료에 유용하다. 일 구현예에서, 인간 A-베타에 대한 결합 특이성은 간테네루맙 또는 이의 일부에 의해 제공된다. 특정 구현예들에서, 이중-특이적 항체는 A-베타 상에 2개(또는 그 이상)의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다중특이적(예컨대, 이중-특이적) 항체는 또한, 세포독성 작용제 또는 세포를, A-베타를 발현하는 세포로 위치화하는 데 이용할 수 있다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조할 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시 발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)을 참조), 및 "구멍 내 돌기(knob-in-hole)" 공학(예컨대, 미국 특허 제5,731,168호 및 Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)을 참조)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과를 가공하고(예컨대, WO 2009/089004를 참조); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교 결합하고(예컨대, 미국 특허 제 4,676,980호 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)을 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중-특이적 항체를 형성하고(예컨대, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 및 WO 2011/034605를 참조); 경쇄 쌍형성 오류 문제를 우회하기 위한 일반적인 경쇄 기술 사용하고(예컨대, WO 98/50431을 참조); 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술을 사용하고(예컨대, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)을 참조); 단일 사슬 Fv(sFv) 이량체 사용하며(예컨대, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)을 참조); 및, 예컨대, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에 기재된 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들어진다.
이중-특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 A-베타 상에 입체형태적 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위뿐만 아니라 A-베타의 다른 상이한 항원 또는 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 “이중 작용 FAb” 또는 “DAF”를 포함한다(예컨대, US 2008/0069820 및 WO 2015/095539를 참조).
본 발명은 이의 Fab 영역(들)에서 당화를 갖는 임의의 단일클론 항체, 특히 치료 항체에 관한 것이다.
치료 항체는 VH 영역의 Asn 99에 N-글리칸을 함유하는, VH CDR2 내 N-당화 부위를 갖는 세툭시맙; VH CDR2 내 N-당화 부위를 갖는 솔라네주맙; 및 VH 영역의 Asn 52에 N-글리칸을 함유하는 간테네루맙과 같은 인간 A-베타 항체를 포함한다.
솔라네주맙은 Aβ 펩티드의 중간-도메인에 대해 지시된 인간화 단일클론 IgG1 항체이다. 이는 소섬유가 아닌 가용성 단량체 Aβ를 인식한다.
세툭시맙은 전이성 결장직장암, 전이성 비-소세포폐암 및 두경부암의 치료에 사용되는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제이다. 이는 상표명 Erbitux™ 하에 유통되는 키메라 단일클론 항체이다.
간테네루맙은 알츠하이머병 치료에서 Aβ 소섬유 상의 입체형태적 에피토프에 나노몰 미만의 친화성으로 결합하도록 설계된 완전 인간 IgG1 단일클론 항체이다. 간테네루맙은 또한 RO4909832 및 RG1450로도 공지되어 있다. 간테네루맙은 EP 1960428 B1에 기재되어 있다. 일반적으로, 간테네루맙 IgG-Fc 영역의 중쇄 불변 도메인 2(CH2)는 아스파라긴 306(카바트 시스템에서의 Asn 297에 대응함)에서 올리고당의 공유 부착을 통해 N-당화된다. 또한, 간테네루맙은 VH(Fab) 영역의 CDR2(서열번호 2) 내의 아스파라긴 52에서 N-당화된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 중의 단일클론 항체는 인간 A-베타 항체, 바람직하게는 간테네루맙이다.
간테네루맙의 중쇄는:
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 도메인을 포함한다.
간테네루맙의 경쇄는:
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 간테네루맙의 VH 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 간테네루맙의 VL 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 간테네루맙의 중쇄는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 간테네루맙의 경쇄는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 단일클론 항체는 간테네루맙, 간테네루맙을 포함하는 이중-특이적 항체, 또는 당화된 Fab 영역을 포함하고 항원에 결합하는 능력을 보유하는 간테네루맙의 단편이다. 상기 구현예들에서, 단일클론 항체는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 VH 및 VL CDR 아미노산 서열, 서열번호 7 및 서열번호 8의 VH 및 VL 도메인 아미노산 서열, 또는 서열번호 9 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 조성물 중 VH 당화된 Fab 영역의 총량에 대해 약 20% 이하의 고 만노스 Fab 당형을 포함하고, 이때 상기 당화는 항체의 CDR2 내 Asn52에서의 N-당화이다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공하고; 상기 조성물은 조성물 중 VH 당화된 Fab 영역의 총량에 대해 약 20% 이하의 상기 항체의 고 만노스 Fab 당형을 포함하고, 이때 상기 당화는 서열번호 7의 Asn52에서의 N-당화이다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공하고; 상기 조성물은 조성물 중 VH 당화된 Fab 영역의 총량에 대해 약 20% 이하의 상기 항체의 고 만노스 Fab 당형을 포함하고, 이때 상기 당화는 서열번호 9의 Asn52에서의 N-당화이다.
임의의 또는 모든 상기 양태들에서, 단일클론 항체 간테네루맙은 또한 이의 Fc 영역에서 N-당화될 수 있다.
대안적인 바람직한 구현예에서, 단일클론 항체는 간테네루맙을 포함하는 이중-특이적 항체이다. 이러한 구현예에서, 이중-특이적 항체는 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 추가의 Fab 단편을 포함한다. 이러한 구현예에서, 이중-특이적 항체는:
- 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄;
- 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄;
- 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 Fab 단편; 및
- 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
다양한 연구에서, 치료 또는 진단 단일클론 항체의 Fab 영역에 N-연결된 고 만노스 당형의 상대적 함량과 같은 당화 프로파일의 특성이 약동학(PK)에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 특히, 동물 연구는 Fab 고 만노스 종(high mannose species)의 생체 내에서 빠르게 제거된다는 것을 증명하였다. 이는 도 10에 도시되어 있다.
생체내 mAb의 "제거율"는 mAb에 대한 신체의 "노출"을 결정할 것이고 - 이는 이어서 항체의 약력학적(PD) 효과의 정도를 결정할 것이다. 노출-반응(PK-PD) 관계는 약물이 신체에 미치는 영향의 결과를 결정한다. 이전의 연구는 항체의 Fc 영역에서의 당화가 PK와 관련이 있을 수 있으며, 글리칸의 이의 수용체에 대한 결합이 글리칸-매개 제거 및 조직 분포를 발생시킴을 시사하였다. 생체 내에서 당단백질의 제거에 기인한 글리칸 수용체는 만노스 수용체(ManR) 및 아시알로당단백질 수용체(asaloglycoprotein receptor, ASGPR)를 포함하며, 이들 모두는 탄수화물-특이적 식작용 수용체이다. Liu et al., J. Pharmaceutical Sciences (2015) 104:1866-1884에 보고된 바와 같이, 고의로 말단의 고 만노스 글리칸을 갖도록 제조된 mAb를 갖는 당화된 mAb(단지 Fc 당화만을 가짐)는 혈액으로부터 급속하게 제거되었고 간에 위치화되는 것으로 나타났다.
단일클론 항체, 및 특히 인간 A-베타 항체, 예컨대, 간테네루맙의 VH N-연결된 글리칸에서 만노스의 상대적인 양을 조절함으로써, 본 발명자들은 항체 제거 및 이에 따른 항체의 효과에 대한 신체의 노출을 제어할 수 있다는 것을 입증하였다. 따라서, Fab N-당화 부위(들)에서 특정 당형의 상대적인 양이 조절되는 항체의 균질한 집단의 생성은 일관된 약리학적 프로파일을 갖는 치료제를 발생시킨다. 즉, Fab 당형 분포를 조절하는 것은 항체의 약리학적 프로파일에 영향을 미친다.
본원의 일 구현예에서, 본원의 방법에 따라 생성된 간테네루맙, 특히 약 2-10%, 바람직하게는 약 4-10%의 고 만노스를 갖는 간테네루맙은, 전형적으로 상이한 방법에 따라 생성된, 더 높은 상대적인 양의 고 만노즈 글리칸을 갖는 간테네루맙보다 순환에서 더 오래 머물며 더 우수한 생체이용률을 갖는다. 본원의 실시예들에 예시된 바와 같이, Fab N-당화 부위에서의 고 만노스(M5-M7)의 상대적인 양이, 예컨대, 고 만노스의 상대적인 함량이 약 13%(Man5-7)인 상이한 방법에 따라 생성된 간테네루맙과 비교하여, 본원의 방법에 따라 항체가 생성될 때 약 5 내지 6%인 항체를 사용하여, 간테네루맙의 sc 투여 후 인간에서의 생체이용률의 약 18%의 증가가 달성될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 항체가 투여된 동물의 순환으로부터 상기 항체가 제거되는 속도를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항체를 포함하는 조성물 중 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적인 함량을 조절하는 단계를 포함한다.
다음의 특징들 중 임의의 것 또는 전부는 본 발명의 이러한 양태에서 단독으로 또는 조합하여 취해질 수 있다:
- 동물은 포유동물, 바람직하게는 인간이고; 그리고/또는
- 단일클론 항체는 항 인간 A-베타 항체이고; 그리고/또는
- 단일클론 항체는 간테네루맙 또는 이중-특이적 간테네루맙이고, 바람직하게는 이때 이중-특이적 간테네루맙은 A-베타 및 트랜스페린 수용체에 대한 결합 특이성을 갖고; 그리고/또는
- 항체 조성물 중 고 만노스 당형의 상대적 함량은 약 2-10%, 바람직하게는 4-10% 및 더 바람직하게는 5-9%이고; 그리고/또는
- 항체는 본원에 기재된 방법에 따라 제조되고; 그리고/또는
- 항체의 생체이용률은 전형적으로 상이한 방법에 따라 생성된 약 13%의 고 만노스 당형의 상대적 함량을 갖는 동일한 항체와 비교하여 약 18% 증가한다.
글리칸 1차 구조를 결정하는 기술은 일반적으로 공지되어 있고, 예를 들어, Montreuil, Polysaccharides in Medicinal Applications (1996) 273-327에 상세히 기재되어 있다. 따라서, 세포에 의해 생성된 펩티드의 집단을 단리하고 이에 부착된 글리칸의 구조(들)를 결정하는 것은 당업자에게 일상적인 사항이다. 예를 들어, 효율적인 방법은 (i) 화학적 절단, 예컨대, 가수분해, 아세틸분해, 히드라진분해에 의한, 또는 질소 탈아미노화에 의한 글리코시드 결합의 분할; (ii) 완전 메틸화 이후 가수분해 또는 메탄분해, 및 부분적으로 메틸화된 단당류의 기체-액체 크로마토그래피 및 질량 분광법; 및 (iii) 순차적 분해에 의해 1차 글리칸 구조에 대한 통찰을 또한 제공하는 엑소글리코시다제를 사용하는 단당류 사이의 아노머 결합의 정의를 위해 입수 가능하다. 형광 표지화 및 후속적인 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 예컨대, 정상 HPLC(NP-HPLC), 질량 분광법 및 핵자기 공명(NMR) 분광법, 예컨대, 고자기장 NMR이 또한 1차 글리칸 구조를 결정하는데 사용될 수 있다.
탄수화물 분석을 위한 키트 및 장비가 또한 상업적으로 입수 가능하다. 형광발색단 보조 탄수화물 전기영동(FACE)은 글리코(Glyko. Inc., Novato, California)로부터 입수가능하다. FACE 분석에서, 당접합체는 N-연결된 글리칸에 대해 엔도 H 또는 N-글리카나제(glycannase, PNGase F)를 갖는 펩티드로부터 방출된다. 이어서, 글리칸은 비-구조 판별 방식으로 환원 말단에서 형광발색단으로 표지된다. 그런 다음, 형광발색단 표지된 글리칸은 당류의 전하/질량 비율뿐만 아니라 유체역학적 부피에 기초하여 폴리아크릴아미드 겔에서 분리된다. UV 광 하에서 겔의 이미지를 촬영하고, 표준과 비교하여 이동 거리에 의해 글리칸의 조성을 결정한다. 올리고당은 엑소글리코시다제 분해에 의한 당류의 순차적 제거로 인한 이동을 분석함으로써 이러한 방식으로 서열분석할 수 있다.
본원에 기재된 방법은, 예컨대, 본원에 기재된 것들 이외의 방법에 의해 확인된 당화 변이체의 생성을 포함하고, 단, 이들 변이체는 본원에서 고 만노스의 정의에 속한다.
Fc 및 Fab 당화 둘 모두를 갖는 항체에 대해, N-글리칸의 상대적 분포의 분석은, 예컨대, 엔도글리코시다제 PNGaseF를 사용하여 항체 골격으로부터 Fc 글리칸을 절단하고 한외여과에 의해 단백질로부터 방출된 탄수화물을 분리하는 것을 포함할 수 있다. 이어서, Fab 글리칸은 신속한 PNGaseF 분해에 의해 방출될 수 있고, 또한 한외여과에 의해 단백질로부터 분리될 수 있다. Fc 및 Fab 글리칸은 별도로, 예컨대, 2-아미노벤즈아미드를 사용하여 표지한 후, 형광 검출을 사용하여 HILIC UHPLC(친수성 상호작용 크로마토그래피/초고성능 액체 크로마토그래피)에 의해 분석할 수 있다.
본 발명의 이러한 양태의 조성물에 포함된 단일클론 항체는 전형적으로 또한 이의 Fc 영역에서 N-당화될 것이다. 일반적으로, Fc 당화는 CH2 도메인의 Asn 297(또는 카바트 시스템에서 Asn 297에 대응하는 동등한 보존된 Fc-위치 Asn)에서 발생한다. Fc 영역 내의 글리칸은 전형적으로 복합 바이안테너리 유형이고, 외부 아암 당(outer arm sugar)의 가변 첨가를 갖는 7당류 코어를 포함할 수 있다. 일 예에서, Fc VH 영역에서의 당화는:
(a) 코어 푸코실화가 없는 바이안테너리 복합 유형 구조체;
(b) 바이안테너리 하이브리드 유형; 또는
(c) 바이안테너리 올리고만노스 유형으로부터 선택된다.
Fc 당화의 조절은 선행 기술에 기재되어 있으며, 당업자의 기술 범위 내에 있다.
2. Fab 영역에서 N-연결된 당화를 갖는 Mab의 고-만노스 당형의 생성
바이오제약 산업에서, 유가식(fed-batch) CHO 세포 배양은 IgG 생성을 위해 가장 일반적으로 사용되는 공정이다. Fan et al., Biotechnol. Bioeng. (2015) 112(3) 521-535에 의해 기재된 바와 같이, IgG Fc 영역에서의 아미노산 및 포도당 소비, 세포 성장, 대사, 항체 역가 및 N-당화 패턴은 항상 상류 공정 최적화 동안 주요 관심사이며, 배양물 중 포도당 및 아미노산 농도의 균형은 세포 성장, IgG 역가 및 N-당화에 중요하다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 항체 조성물 중 총 N-연결된 당화된 Fab에 비해 발현된 항체의 생체이용률과 항체의 고 만노스 Fab 당형의 함량 사이에 관계가 있다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 세포의 배양 및 성장 그리고 배양 중 항체의 생성 동안 배양 배지 중 세포에 대한 탄수화물 공급원의 평균 농도를 조절함으로써 항체 글리칸 중 원하는 상대적 고 만노스 함량을 달성할 수 있음을 발견하였다.
재조합 세포의 성장과 생성된 항체의 당화를 위해 포도당과 같은 영양소가 요구되기 때문에, 발효 공정의 일부 또는 전부에 걸쳐 배양 배지 내 포도당의 균형이 매우 중요하다. 예를 들어, 너무 많은 포도당이 존재하는 경우, 세포는 잘 성장할 수 있지만, 생성된 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적 함량은 항체 조성물의 생체이용률에 유해한 영향을 미칠 정도로 높을 수 있다. 다른 예에서, 배양 기간에 걸쳐 포도당의 농도에서 유의한 또는 실질적인 변동을 허용하는 것은 또한 발현된 항체에서 세포 성장 및 상대 글리칸 함량 중 어느 하나 또는 둘 모두에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명자들은 이하의 방법들을 공식화할 때 이러한 요인들을 고려하였다.
Fab 조성물과 관련된 개시에서와 같이, 하기 양태들의 단일클론 항체는 이의 Fab 영역(들)에서 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는다. 하기의 개시 전반에 걸쳐 "고 만노스 Fab 당형"에 대한 언급은 앞서 기재된 Fab 조성물에서와 같이 이렇게 N-연결된 당형에 관한 것이다.
이러한 양태에서, 본 발명은 항체가 투여된 동물의 순환으로부터 상기 항체가 제거되는 속도를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항체를 포함하는 조성물 중 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적인 함량을 조절하는 단계를 포함한다.
이러한 양태에서, 본 발명은 항체가 투여된 동물의 순환에서 당화된 단일클론 항체의 생체이용률을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항체를 포함하는 조성물 중 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적인 함량을 조절하는 단계를 포함한다.
전형적으로, 상기 방법에서, 상기 조절은 항체를 포함하는 조성물 중 당화된 Fab 영역의 총 수에 대해 20% 이하의 고 만노스 Fab 당형의 당화된 단일클론 항체를 발생시킬 것이다.
전형적으로, 본원에 기재된 방법에 따라 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적 함량이 조절되는 항체가, 항체가 투여된 동물의 순환으로부터 제거되는 속도는, 조성물에 포함된 항체에서 고 만노스 Fab 당형의 상대적 함량이 본원에 기재된 방식으로 조절되지 않는 방법에 의해 생성된 동일한 항체와 비교하여, 약 4% 포인트 이상, 바람직하게는 약 5% 포인트 이상 감소된다.
본 발명의 조성물 중 포함된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적 함량을 조절하는 방법은 발효의 생성기의 전부 또는 일부에 걸쳐 상기 단일클론 항체를 발현하는 진핵 세포의 내부에서 발효에 의해 당화된 단일클론 항체를 생성하는데 사용되는 배양 배지 중 진핵 세포에 대한 탄수화물 공급원의 농도를 최적화하는 단계를 포함할 수 있다. 배양 배지 내의 다른 영양소의 농도 또한 최적화될 수 있다.
이러한 방법은 배양 배지로부터 단일클론 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 구현예들에서 및 상기 정의된 바와 같이, "상대적" 함량은 조성물 내 단일클론 항체의 모든 다른 Fab 당형의 함량과 관련하여 고 만노스 Fab 당형의 함량을 의미한다. 당형의 함량은 전형적으로 상기 제시된 바와 같이 백분율로서 표현된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물에서, 상기 고 만노스 Fab 당형은 단일클론 항체의 총 Fab 당형의 약 20% 이하를 구성한다. 이는 바람직한 당형 분포이다.
항체 조성물 그 자체, 즉 상기 방법의 생성물의 특징은 앞 섹션에 기재된 바와 같다. 단일클론 항체 조성물 그 자체의 특징들 중 임의의 것 또는 이들의 혼합물은 본 발명의 이러한 양태의 방법의 생성물에 동등하게 적용 가능하고, 독자는 이때 이의 반복을 아끼기 위해 상기 설명의 섹션을 참조한다.
하기의 설명에서, 포도당은 예시된 탄수화물 공급원이다. 하지만, 포도당, 갈락토스, 프럭토스, 만노스 또는 말토스 중 임의의 것 또는 이들의 조합은 배양물 중의 세포에 대한 탄수화물의 공급원일 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 양태에서, 배양 배지 중의 포도당의 농도는 조성물 중 단일클론 항체의 Fab 고 만노스 당형의 원하는 상대적 함량(원하는 당형 분포)을 달성하기 위해 최적화된다. 일 양태에서, 포도당 농도의 최적화는 배양 배지 내 포도당 농도를 모니터링하고 제어하는 것을 포함한다. 배양 배지 내 포도당 및 임의적으로 하나 이상의 다른 영양소의 농도를 모니터링 및 제어하는 것은 배양 공정 전체에 걸쳐, 또는 배양 공정의 일부 동안 실시할 수 있거나, 또는 필요에 따라 배양 공정의 하나 이상의 단계 동안, 전형적으로 단지 생성기 동안 또는 이의 일부 동안 발생할 수 있다. 대안적인 경우에, 평균 포도당 농도 및 임의적으로 다른 영양소의 농도는 원하는 당형 분포를 달성하기 위해, 예컨대, 초기 발효로부터의 경험에 기초하여 최적화할 수 있다. 그 경우, 발효/생성 공정의 전부 또는 일부를 통한 농도의 모니터링은 필요하지 않을 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 양태에서, 배양 배지 중 포도당의 농도는 원하는, 임의적으로 바람직한, 당형 분포를 달성하기 위해 최적화된다.
상기 양태들에서, 농도는 발효 공정의 전부 또는 일부, 전형적으로 성장 및/또는 생성기의 전부 또는 일부에 걸쳐 최적화된다. 한 경우에, 포도당 농도는 모든 성장기 또는 성장기의 일부에 걸쳐 최적화된다. 한 경우에, 포도당 농도는 생성기의 전부 또는 생성기의 일부에 걸쳐 최적화된다. 한 경우에, 포도당 농도는 성장기의 전부 또는 일부 및 생성기의 전부 또는 일부에 걸쳐 최적화된다.
본 발명의 방법 및/또는 상기 기재된 바람직한 양태들에서, 조성물 중 단일클론 항체의 Fab N-연결된 고 만노스 당형의 약 20% 이하를 달성하기 위해, 단일클론 항체의 생성 중 배양 공정의 생성기에서 배양 배지 중 포도당의 평균 양은 약 0.50 g/L 내지 약 18.00 g/L, 바람직하게는 약 1.50 g/L 내지 약 14.00 g/L, 더 바람직하게는 약 2.00 g/L 내지 약 12.50 g/L이다.
전형적으로, 단일클론 항체 조성물에서 약 2% 내지 약 15%의 상대 Fab 고 만노스 당형 함량을 달성하기 위해, 단일클론 항체의 생성에서, 배양 공정의 생성기 동안 배양 배지 중 포도당의 평균 농도는 약 1.50 g/L 내지 약 14.00 g/L이다.
본원에 기재된 바와 같이, 배양물의 생성기는 5일 내지 약 18일, 예를 들어, 적절하게는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18일일 수 있다. 본 개시에서, 회수일은 0일로 간주되고, 생성기의 일수는 그로부터 역으로 계산한다. 따라서, 14일 과정의 경우, 접종일은 -14일이 될 것이다. 발효의 종결은 생성기이고 항체가 형성되는 시간이기 때문에, 회수로부터 계수하여 평균 포도당 농도에 대한 보다 대표적인 계산을 한다.
이러한 양태에서, 포도당 및 세포 배양 및 성장 및 항체 발현에 필요한 임의의 다른 영양소를 포함하는 영양소 공급물은 본원에 기재된 바와 같이 분할 용량으로 생성기에 걸쳐, 연속 기전 또는 규칙적인 볼루스 공급물을 통해 배지에 제공된다.
상기 방법들에 대해, 포도당의 평균 농도는 세포들에 의한 포도당의 소비를 고려한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물 중 포함된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적 함량을 조절하는 방법을 고안하며, 상기 방법은 발효의 생성기의 동안 상기 단일클론 항체를 발현하는 진핵 세포의 내부에서 발효에 의해 당화된 단일클론 항체를 생성하는데 사용되는 배양 배지 중 포도당의 농도를 최적화하는 단계를 포함한다. 표준 발효 조건하에서, 다른 영양소의 농도 또한 최적화될 수 있다. 배양 배지 중의 포도당 농도는 생성기의 전부 또는 일부 동안 최적화된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 제시된 방법에 의해 수득가능한 단일클론 항체 조성물을 제공한다.
포도당 보충
본 발명의 방법에서, 포도당의 농도는, 임의적으로 배양 기간의 전체 또는 일부에 걸쳐, 예컨대, 생성기의 전체 또는 일부에 걸쳐 배양 배지 중 농도를 모니터링하고 제어함으로써 최적화될 수 있어서, 포도당의 평균 농도는 발현된 항체의 Fab 부분에서 원하는 당형 분포를 발생시킨다.
원하는 고 만노스 당형 분포를 달성하기 위해 요구되는 적절한 농도의 포도당에 대한 경험으로, 포도당의 농도에 대한 모니터링은 요구되지 않을 수 있다. 이러한 상황에서, 초기 배양 배지 및/또는 필요에 따라 배양 기간의 전체 또는 일부에 걸친 공급물 내에 포도당 및 선택적인 다른 성분의 포함 또는 첨가는 원하는 당형 분포를 달성할 것이다.
일 구현예에서, 포도당 농도의 모니터링 및 제어는 생성기 동안, 전형적으로 생성기의 -14일 내지 0일(회수), 예컨대, -13일 내지 0일, -12일 내지 0일, -11일 내지 0일, -10일 내지 0일, -9일 내지 0일, -8일 내지 0일, -7일 내지 0일, -6일 내지 0일, -5일 내지 0일 또는 -4일 내지 0일 동안 실시한다.
일 구현예에서, 포도당 농도의 모니터링 및 제어는 생성기 동안, 전형적으로 생성기의 -14일 내지 -1, -2, -3, -4 또는 -5일 중 어느 하나, 예컨대, -14일 내지 -1일, -14일 내지 -2일, -14일 내지 -3일, -14일 내지 -4일, -14일 내지 -5일; -13일 내지 -1일, -13일 내지 -2일, -13일 내지 -3일, -13일 내지 -3일, -13일 내지 -4일, -13일 내지 -5일; -12일 내지 -1일, -12일 내지 -2일, -12일 내지 -3일, -12일 내지 -4일, -12일 내지 -5일; -11일 내지 -1일, -11일 내지 -2일, -11일 내지 -3일, -11일 내지 -4일, -11일 내지 -5일; -10일 내지 -1일, -10일 내지 -2일, -10일 내지 -3일, -10일 내지 -4일, -10일 내지 -5일; -9일 내지 -1일, -9일 내지 -2일, -9일 내지 -3일, -9일 내지 -4일, -9일 내지
-5일; -8일 내지 -1일, -8일 내지 -2일, -8일 내지 -3일, -8일 내지 -4일, -8일 내지 -5일; -7일 내지 -1일, -7일 내지 -2일, -7일 내지 -3일, -7일 내지 -4일, -7일 내지 -5일; -6일 내지 -1일, -6일 내지 -2일, -6일 내지 -3일, -6일 내지 -4일, -6일 내지 -5일;
-5일 내지 -1일, -5일 내지 -2일, -5일 내지 -3일, -5일 내지 -4일; 또는 -4일 내지 -1일, -4일 내지 -2일 또는 -4일 내지 -3일에 실시한다.
바람직한 구현예에서, 포도당 농도는 생성기의 -7일 내지 0일에 모니터링 및 제어한다.
바람직한 구현예에서, 배양 배지 중 포도당 농도는 임의적으로 생성기의 -7일 내지 0일의 농도를 모니터링하고 제어함으로써 최적화된다. 포도당 농도 및 임의적으로 다른 영양소의 농도는 매일, 하루에 두 번 또는 원하는 경우 더 자주 모니터링할 수 있다. 대안적으로, 모니터링은 생성기 동안 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 또는 1회 또는 2회 발생할 수 있다. 하나 초과의 영양소가 모니터링되고 있을 때, 이들은 모두 동일하거나 상이한 날에, 동일하거나 상이한 시간에 모니터링될 수 있다.
포도당의 농도를 모니터링하기 위한 방법들이 아래에서 설명된다. 배양 배지 중 포도당 농도의 조절은 전형적으로 배지에 포도당을 첨가함으로써 실시한다. 생성기에 걸쳐 원하는 평균을 달성하기 위해 포도당의 농도를 조절하는 것은, 임의적으로, 배양 배지, 예컨대, 기본 배지 내에 포도당을 포함시킴으로써 그리고/또는 배지에 이의 첨가에 의해, 예컨대, 당업계에서 전형적인 방법 및/또는 하기 기재된 바와 같이 살시한다. 원하는 경우, 다른 영양소의 농도는 당 농도의 모니터링과 동시에, 또는 상이한 시간에 모니터링될 수 있고, 다른 영양소의 농도는 당업계에서 전형적인 방법을 사용하여 원하는 대로 조정한다.
따라서, 본 개시는 본 발명의 조성물에 포함된 당화 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적 함량을 조절하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 발효의 생성기 동안 당화화 단일클론 항체를 발현할 수 있는 진핵 세포를 포함하는 배지에 포도당을 첨가하는 단계를 포함한다.
이러한 양태에서, 포도당은 생성기의 전부 또는 일부 동안, 전형적으로 이의 적어도 -7일 내지 0일에 배지에 첨가할 수 있다. 하기 제시된 바와 같이, 배지에 첨가되는 포도당의 양은 기본 배지 내 포도당의 양, 세포에 의한 포도당의 소비 및 생성된 항체 중 원하는 상대 Fab 고 만노스 함량과 상관되는 생성기의 전부 또는 일부에 걸친 평균 포도당 농도에 의존한다. 이러한 특징은 아래에서 더 자세히 설명한다.
본 개시는 생성기의 전체 또는 일부에 걸친 배양 배지 내 평균 포도당 농도와 생성된 항체 중 상대적 Fab 고 만노스 함량 사이의 상관관계를 보여준다. 따라서, 바람직한 양태에서, 그리고 도 2에 도시된 바와 같이:
- 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형(즉, Man5, Man6 및 Man7)의 원하는 상대적 함량은 약 7%이고, 약 -7일 내지 회수(0일) 사이의 배양 배지 내 포도당의 평균 농도는 약 3.00 g/L 내지 약 6.00 g/L일 수 있고;
- 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형(즉, Man5, Man6 및 Man7)의 원하는 상대적 함량은 약 10.5%이고, 약 -7일 내지 회수(0일) 사이의 배양 배지 내 포도당의 평균 농도는 약 6.00 g/L 내지 약 9.00 g/L일 수 있고;
- 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형(즉, Man5, Man6 및 Man7)의 원하는 상대적 함량은 약 13%이고, 약 -7일 내지 회수(0일) 사이의 배양 배지 내 포도당의 평균 농도는 약 9.00 g/L 내지 약 11.00 g/L일 수 있으며; 그리고
- 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형(즉, Man5, Man6 및 Man7)의 원하는 상대적 함량은 약 15%이고, 약 -7일 내지 회수(0일) 사이의 배양 배지 내 포도당의 평균 농도는 약 11.00 g/L 내지 약 14.00 g/L일 수 있다.
대안적인 양태에서:
- 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형(즉, Man5, Man6 및 Man7)의 원하는 상대적 함량은 약 0-6%이고, 약 -7일 내지 회수(0일) 사이의 배양 배지 내 포도당의 평균 농도는 약 0 g/L 내지 약 3.00 g/L일 수 있고;
- 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형(즉, Man5, Man6 및 Man7)의 원하는 상대적 함량은 약 6-8%이고, 약 -7일 내지 회수(0일) 사이의 배양 배지 내 포도당의 평균 농도는 약 3.00 g/L 내지 약 6.00 g/L일 수 있고;
- 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형(즉, Man5, Man6 및 Man7)의 원하는 상대적 함량은 약 8-10%이고, 약 -7일 내지 회수(0일) 사이의 배양 배지 내 포도당의 평균 농도는 약 4.00 g/L 내지 약 8.00 g/L일 수 있고;
- 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형(즉, Man5, Man6 및 Man7)의 원하는 상대적 함량은 약 10-12%이고, 약 -7일 내지 회수(0일) 사이의 배양 배지 내 포도당의 평균 농도는 약 6.00 g/L 내지 약 10.00 g/L일 수 있으며; 그리고
- 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형(즉, Man5, Man6 및 Man7)의 원하는 상대적 함량은 약 12-15%이고, 약 -7일 내지 회수(0일) 사이의 배양 배지 내 포도당의 평균 농도는 약 9.00 g/L 내지 약 14.00 g/L일 수 있다.
생성기의 전부 또는 일부에 걸쳐 평균 포도당 농도를 달성하기 위해, 배양 배지 중 포도당 농도는, 예컨대, 매일 결정될 수 있고, 결정된 농도에 따라 필요에 따라 배지에 첨가되는 포도당이 필요할 수 있다. 배양하는 동안 포도당이 소비된다. 도 3c에 도시된 바와 같이, 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 원하는 포도당 평균 농도인 5.60 g/L를 위해, 일일 농도가 7.00 g/L가 되도록 배지 내 포도당 농도 측정 후 일정량의 포도당을 배양물에 매일 첨가한다. 원하는 평균 농도를 달성하기 위해 배양물에 첨가되는 포도당의 양은 따라서 측정된 농도에 의존한다. 검출 한계 미만인 포도당 농도는 0 g/L로서 표시될 것이다.
상기 상대적 Fab 고 만노스 함량 및 상관된 평균 포도당 농도는 간테네루맙의 제조 방법에 특히 적용가능하다.
포도당 및 다른 영양소는 전형적으로 배양 배지, 즉 생성기를 위해 단일클론 항체 생성 세포가 이동되는 기본 배지에 존재하거나 첨가될 것이다. 전이는, 예를 들어, 세포의 성장을 위해 맞춤화된 배지로부터일 수 있다. 기본 배지의 정확한 성질은 본 발명에 필수적이지 않다. 화학적으로 정의된 배지는 포유류 세포 배양용 배지를 포함하여 최근에 광범위하게 개발되고 공개되었다. 정의된 배지의 모든 구성 요소는 잘 특성화되어 있으며 이러한 배지에는 혈청 및 가수분해물과 같은 복잡한 첨가제가 함유되어 있지 않다. 전형적으로, 이러한 배지에는 정의된 양의 정제된 성장 인자, 단백질, 지단백질, 및 그렇지 않으면 혈청 또는 추출물 보충제에 의해 제공될 수 있는 기타 물질이 포함된다. 이러한 배지는 생산성이 높은 세포 배양물을 지원하기 위한 유일한 목적으로 생성되었다. 특정 정의된 배지는 저단백질 배지라고 하거나, 또는 저단백질 배지, 인슐린 및 트랜스페린의 전형적인 구성요소가 포함되지 않은 경우 단백질이 없을 수 있다. 그렇지 않으면, 무혈청 배지가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 배지는 일반적으로 혈청 또는 단백질 분획을 함유하지 않지만, 정의되지 않은 구성 요소를 함유할 수 있다.
상업적으로 입수 가능한 배양 배지의 예는 Ham's F10(Sigma)), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium(MEM, 시그마), RPMI-1640(시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 시그마) 및 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)에서 판매하는 화학적으로 정의된 배지 및 보충제 공급을 포함한다. 임의의 이러한 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자); 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 아미노산, 완충액(예컨대, HEPES); 뉴클레오시드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, GENTAMYCIN™), 및 포도당 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 이들 배지 중 임의의 배지는 본원에 기재된 방법을 따르기 위해 필요에 따라 포도당 및 다른 영양소를 첨가하면서 기본 배지로서 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 세포는 세포 배양 및 항체의 성장 및 발현에 전형적으로 필요한 포도당 및 다른 영양소를 포함하는 화학적으로 정의된 배지에서 배양된다.
특정 세포주에 대하여, 이의 농도를 포함하여 배지에 필요한 영양소는, 예를 들어, Mammalian Cell Culture, Mather (Plenum Press: NY 1984); Barnes and Sato, Cell 22 (1980) 649 or Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach M.Butler (IRL Press, 1991)에 기재된 바와 같이 과도한 실험 없이 경험적으로 결정된다. 적합한 배지는 기본 배지 성분, 예컨대, 아미노산, 염, 당 및 비타민과 같은 일부 성분의 농도가 변형된 DMEM/HAM F12 기반 제제를 함유하고, 임의적으로 글리신, 하이포크산틴, 티미딘, 재조합 인간 인슐린, 가수분해된 펩톤, 예컨대, PRIMATONE HS™ 또는 PRIMATONE Rl™(잉글랜드, 셰필드 소재) 또는 등가의 세포 보호제, 예컨대, PLURONIC F68™ 또는 등가의 플루로닉 폴리올 및 항생제, 예컨대, GENTAMYCIN™을 함유한다.
포도당은 볼루스 또는 연속 첨가로서 영양분 공급의 일부로서 발효 과정에 첨가할 수 있다. 전형적으로 본 발명의 방법에서, 3가지 영양소 공급물은 생성기 동안 볼루스에 의해 제공될 것이다. 이러한 볼루스 공급물은 사용되는 세포 및 생성 프로토콜의 요건에 따라 포도당 및 다른 영양소를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 예를 들어, 포도당이 영양분 공급의 일부인 경우, 전형적으로 영양분 공급이 주어진 날에 포도당의 별도의 첨가가 요구되지 않는다. 하나 초과의 볼루스 공급물이 주어지면, 각각의 볼루스 공급물은 동일하거나 상이한 농도의 포도당을 함유할 수 있다. 볼루스 또는 연속 공급물의 부피는 배양물의 필요에 기초하여 결정된다. 이를 실시하기 위한 방법은 당업계에서 일상적이다. 영양 공급물은 배양물이 접종된 동일한 배지로 구성될 수 있거나, 또는 특정 배양물을 위해 구체적으로 조제될 수 있다. 전형적으로, 이러한 영양분 공급물은, 예를 들어, 세포 대사에 의해 세포 배양 배지로부터 고갈되고 바이오매스 생성 및 항체 생성을 보장하기 위해 요구되는 다른 성분들을 함유할 것이다. 이러한 보조 성분은, 예컨대, 호르몬, 성장 인자, 이온, 비타민, 뉴클레오시드, 미량 원소, 아미노산 또는 지질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 포도당은 단일 영양분으로서 발효 공정에 첨가할 수 있다. 보조 성분은 고갈된 영양소를 보충하기 위해 요구되는 바와 같이 조합하여 또는 단독으로, 한 번 또는 일련의 첨가로 첨가할 수 있다.
상기 평균 농축 방법을 사용할 때 세포 배양 배지에 포도당을 첨가하는 빈도 또는 부피 또는 양상은 생성기에 걸친 배양 배지 내 포도당의 평균 농도(원하는 당형 분포를 달성하기 위한)가 유지되는 한 본 발명에 있어서 특별히 중요하지 않다.
포도당은 다른 영양소와 조합으로 또는 별도로 연속 첨가에 의해 발효 공정에 첨가할 수 있다. 연속 공급이 사용되는 경우, 생성기에서 배지에 첨가되는 포도당 및/또는 이들 영양소의 양은 배양에 걸쳐 원하는 평균 농도에 따라 공급 속도 및/또는 부피를 조절함으로써, 예컨대, 매일, 2일마다, 3일마다 등등 또는 24시간의 기간 동안 주기적으로 가변될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 고 만노스 Fab 생성에 영향을 주기 위해 배양물에 첨가될 때, 포도당은 임의의 또는 모든 생성기(n)에서 발효 공정에 첨가할 수 있다. 생성기의 지속 기간은 사용된 배양 방법에 의존할 수 있고 그리고/또는 배지의 접종에 사용된 세포 밀도에 의존할 수 있으며, 예를 들어, 약 1 x 105 내지 약 20 x 105 세포/mL의 접종 세포 밀도는 전형적으로 최대 10-18일의 생성기를 요구할 것이다. 하지만, 더 높은 접종 세포 밀도, 예컨대, 약 21 x 105 내지 약 200 x 105 세포/ml가 사용되는 경우, 생성기의 지속 기간은, 예를 들어, 6 내지 10일로 감소할 수 있다. 높은 접종 세포 밀도는, 예를 들어, 배양의 n-1 단계에서의 강화 공정, 예컨대, 관류 공정에 의해 도달될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 생성기는 접종으로부터 최대 7-18일, 바람직하게는 7-10일 또는 10-18일 또는 14-17일이다.
본 개시에서, 회수일은 0일로 간주되고, 따라서 14일의 생성 공정에 대해, 해당 일들을 역으로 계수하여 접종일은 -14일이 될 것이다. 발효의 종결은 생성기이고 항체가 형성되고 발현되는 시간이기 때문에, 회수로부터 계수하여 평균 포도당 농도에 대한 보다 대표적인 계산을 한다. 따라서, -7일 내지 0일 사이의 평균 포도당 농도의 계산은 배양 기간 및 생성기의 접종 세포 밀도와 무관하다. 본 발명에서, 7일 내지 14일(회수는 14일이고 계수는 "순방향(forward)"임)의 평균의 계산은 -7일 내지 0일의 평균 계산과 동일하며, 이때 회수는 0일이고 계수는 "역으로” 실시한다.
본 발명의 방법의 일 양태에서, 포도당은 생성기 또는 이의 일부에 걸쳐 원하는 평균 포도당 농도를 달성하기 위해 배양 배지에 첨가되어, 단일클론 항체의 고 만노스 당형의 원하는 상대 백분율을 발생시킨다. 평균이 계산되는 생성기의 기간은 배지의 접종에 사용되는 세포 밀도 및 따라서 생성기의 지속기간에 의존할 수 있다. 따라서, 생성기가 짧을 수록, 평균을 산출/유지하는 일들이 또한 단축된다. 예를 들어, 약 1 x 105 내지 약 20 x 105 세포/ml의 접종 세포 밀도 및 10-18일의 생성기에서, 평균 포도당 농도는 전형적으로 -18, -17, -16, -15, -14, -13, -12, -11, -10, -9, -8 또는 -7 중 어느 하나와 0, -1, -2, -3, -4 또는 -5 중 어느 하나의 임의의 조합으로부터 계산한다. 예를 들어, 평균 포도당 농도는 생성기의 -18일 내지 0일, -18일 내지 -1일,
-18일 내지 -2일, -18일 내지 -3일, -18일 내지 -4일, -18일 내지 -5일에 걸쳐; -17일 내지 0일, -17일 내지 -1일, -17일 내지 -2일, -17일 내지 -3일, -17일 내지 -4일, -17일 내지 -5일에 걸쳐; -16일 내지 0일, -16일 내지 -1일, -16일 내지 -2일, -16일 내지 -3일, -16일 내지 -4일, -16일 내지 -5일에 걸쳐; -15일 내지 0일, -15일 내지 -1일, -15일 내지 -2일, -15일 내지 -3일, -15일 내지 -4일, -15일 내지 -5일에 걸쳐; -14일 내지 -0일, -14일 내지 -1일, -14일 내지 -2일, -14일 내지 -3일, -14일 내지 -4일, -14일 내지 -5일에 걸쳐; -13일 내지 0일, -13일 내지 -1일, -13일 내지 -2일, -13일 내지 -3일, -13일 내지 -3일, -13일 내지 -4일, -13일 내지 -5일에 걸쳐; -12일 내지 0일, -12일 내지 -1일, -12일 내지 -2일, -12일 내지 -3일, -12일 내지 -4일, -12일 내지 -5일에 걸쳐; -11일 내지 0일, -11일 내지 -1일, -11일 내지 -2일, -11일 내지 -3일, -11일 내지 -4일, -11일 내지 -5일에 걸쳐; -10일 내지 0일, -10일 내지 -1일, -10일 내지 -2일, -10일 내지 -3일, -10일 내지 -4일, -10일 내지 -5일에 걸쳐; -9일 내지 0일, -9일 내지 -1일, -9일 내지
-2일, -9일 내지 -3일, -9일 내지 -4일, -9일 내지 -5일에 걸쳐; -8일 내지 0일, -8일 내지 -1일, -8일 내지 -2일, -8일 내지 -3일, -8일 내지 -4일, -8일 내지 -5일에 걸쳐; -7일 내지 0일, -7일 내지 -1일, -7일 내지 -2일, -7일 내지 -3일, -7일 내지 -4일, -7일 내지 -5일에 걸쳐 계산한다.
접종 세포 밀도가 약 21 x 105 세포/ml 초과 및 약 200 x 105 세포/ml 이하인 경우, 생성기는 전형적으로 6 내지 10일일 것이고, 평균 포도당 농도는 전형적으로 -9일 내지 0일, -8일 내지 0일 또는 -7일 내지0 일, -9일 내지 -1일, -8일 내지 -1일 또는 -7일 내지 -1일, -9일 내지 -2일, -8일 내지 -2일 또는 -7일 내지 -2일, -9일 내지 -3일, -8일 내지 -3일 또는 -7일 내지 -3일, -8일 내지 -3일 또는 -7일 내지 -3일 또는 -9일 내지 -4일, -8일 내지 -4일 또는 -7일 내지 -4일로부터 계산한다.
바람직한 구현예에서, 세포가 이미 포도당을 함유하는 배지에서 배양되고(즉, 생성기를 위한 기본 배지가 포도당을 함유함), 보충 포도당이 본 발명의 방법에 따라 고 만노스 Fab 생성에 영향을 주기 위해 배양물에 첨가될 때, 포도당은 생성기의 -18일 내지 0일, -17일 내지 0일, -16일 내지 0일, -15일 내지 0일 또는 -14일 내지 0일, -18일 내지 -1일, -17 내지 -1일
-16일 내지 -1일, -15일 내지 -1일 또는 -14일 내지 -1일, -18일 내지 -2일, -17일 내지 -2일, -16일 내지 -2일, -15일 내지 -2일 또는 -14일 내지 -2일, -18일 내지 -3일, -17일 내지 -3일, -16일 내지 -3일, -15일 내지 -3일 또는 -14일 내지 -3일, -18일 내지 -4일, -17일 내지 -4일, -16일 내지 -4일, -15일 내지 -4일 또는 -14일 내지 -4일 또는 -18일 내지 -5일, -17일 내지 -5일, -16일 내지 -5일, -15일 내지 -5일 또는 -14일 내지 -5일 중 임의의 하나 또는 모두에, 바람직하게는 생성기의 -8일 또는 -7일 내지 0일 중 어느 하나 이상 또는 이들의 조합 또는 모두에 발효 과정에 첨가할 수 있다.
본 발명의 방법이 배양 기간에 걸쳐, 전형적으로 생성기의 전부 또는 일부에 걸쳐 배양 배지 내 포도당 농도를 최적화하는 단계를 포함하는 경우, 하나 이상의 다른 영양소, 예컨대, 세포 성장 및 재조합 당단백질 생성에 필요한 아미노산이 기본 배지 및/또는 보충 공급물 중에 존재할 수 있지만, 그 후 상기 방법은 원하는 당형 분포를 달성하기 위해 배양 배지 내 이들 영양소의 농도의 최적화를 필요로 하지 않는다.
더 바람직한 구현예에서, 포도당은 "필요에 따른", 즉 요구되는 Fab 고 만노스의 양에 따라 배양 배지 중 평균 농도(전형적으로 생성기의 약 -7일 내지 회수, 0일)를 유지하기 위해 보충한다. 이러한 대안에서, 포도당의 "필요에 따른"의 첨가는 배양 배지 내 포도당의 측정된 농도가 특정 수준이거나 특정 수준 아래로 떨어질 때 포도당이 보충되는 것을 의미한다. 이러한 양태에서, 배양 배지 내 포도당의 농도는 생성기 전체 또는 일부에 걸쳐 평균 포도당 농도를 달성하도록 모니터링 및 제어되며, 이는 생성되는 단일클론 항체의 Fab 고 만노스 당형의 원하는 상대 함량과 상관된다. 일 구현예에서, 영양분 공급을 함유하는 포도당은 생성기의 -11일, -8일 및 -5일에 제공된다.
일 양태에서, 세포는 임의적으로 유가식 공정과 함께 관류 배양에 의해 공정의 전부 또는 일부를 위해 배양한다. 배양 공정을 통한 배지 관류는 평균 포도당 농도가 배양 전체에 걸쳐 최적화된 범위 내로 유지되도록 한다.
예컨대, 포도당 소비 및 첨가의 속도가 이전의 발효 실행에 대한 경험으로부터 공지되어 있기 때문에, 포도당 농도의 모니터링이 요구되지 않으면, 그럼에도 불구하고, 포도당은 요구시 또는 이전에 규정된 요법에 따라 보충할 수 있다.
발효(기본) 배지에 및 각각의 보충/볼루스 공급물에 첨가되는 포도당의 양은, 하나 초과의 보충 공급물이 사용되는 경우, 동일하거나 상이할 수 있다. 전형적으로, 각각의 보충/볼루스 공급물 내 발효 배지에 첨가되는 포도당의 양은 세포의 필요성 및 당시 발효 배지 내 이들 영양소의 측정된 농도에 의존할 것이다.
일 구현예에서, 본 개시는 포도당을 포함하는 세포 배양 배지에서 배양된 진핵 세포로부터 발현된 단일클론 항체의 20% 미만, 예컨대, 약 15%의 Fab 고 만노스 당형의 상대 함량을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
- 포도당을 포함하는 세포 배양 배지에서 진핵 세포를 배양하는 단계;
- 세포 배양의 생성기 동안 매일 세포 배양 배지 내의 포도당 농도를 측정하는 단계; 및
- 상기 첨가 후 약 15 g/L의 포도당 농도를 달성하기 위해 세포 배양 배지에 매일 포도당을 첨가하는 단계를 포함한다.
본원의 일 구현예에서, 예를 들어, 약 9% 이하의 Fab N-연결된 고 만노스 당형의 간테네루맙(상기 기재된 바와 같음)의 상대 농도를 수득하기 위해, 배양 배지 내 포도당의 측정된 농도가 약 2.00 g/L 미만일 때, 약 5.00 g/L의 포도당이 첨가되거나, 또는 배양 배지 내 포도당의 측정된 농도가 약 2.00 g/L 내지 약 5.50 g/L일 때, 약 4.00 g/L의 포도당이 배양 배지에 첨가된다. 전술한 바와 같이, 배지 내의 포도당 농도의 결정은 실시될 필요가 없고, 보충은 이전의 경험에 기초하여 설정된 계획을 따를 수 있다.
도 2 및 도 3a에 도시된 바와 같이, 당화된 Fab 영역의 총 수에 대해, 생성기 -7일 내지 0일에 걸친 평균 포도당 농도와 조성물 중 항체(간테네루맙)에서 N-연결된 고 만노스 Fab 영역의 % 사이의 관계가 있다. 따라서, 도 3a에 도시된 바와 같이, 약 9% 고 만노스 Fab 영역을 수득하기 위해, 포도당은 약 7.00 g/L의 포도당 첨가 후 배지 중 포도당 농도를 달성하기 위해 배양 배지에 매일 첨가되어, 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 배양 배지 중 평균 포도당 농도는 약 4.00 내지 7.00 g/L이다. 약 10.5%의 고 만노스 Fab 영역을 수득하기 위해, 포도당은 약 9.00 g/L의 포도당 첨가 후 배지 중 포도당 농도를 달성하기 위해 배양 배지에 매일 첨가되어, 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 배양 배지 중 평균 포도당 농도는 약 6.00 내지 9.00 g/L이다. 약 13%의 고 만노스 Fab 영역을 수득하기 위해, 포도당은 포도당 첨가 후 배양 배지 중 약 12.00 g/L의 포도당 농도를 달성하기 위해 배양 배지에 매일 첨가되어, 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 배양 배지 중 평균 포도당 농도는 약 9.00 내지 11.00 g/L이다. 약 15%의 고 만노스 Fab 영역을 수득하기 위해, 포도당은 포도당 첨가 후 배지 중 약 15 g/L의 포도당 농도를 달성하기 위해 배양 배지에 매일 첨가되어, 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 배양 배지 중 평균 포도당 농도는 약 11.00 내지 14.00 g/L이다.
따라서, 약 3-10%의 Fab N-연결된 고 만노스 당형의 간테네루맙(상기 기재된 바와 같음)의 상대 농도를 수득하기 위해, 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 배양 배지 중 평균 포도당 농도는 약 0 g/L 내지 약 8.00 g/L일 수 있다.
일 양태에서, 상기 평균 포도당 농도를 사용하여 약 3-10%의 Fab N-연결된 고 만노스 당형의 상대 농도를 수득한다.
특히 바람직한 구현예에서, 단일클론 항체는 간테네루맙 또는 간테네루맙을 포함하는 이중-특이적 항체이다. 이들 구현예들에서, 단일클론 항체는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 바와 같은 VH 및 VL CDR 아미노산 서열, 서열번호 7 및 서열번호 8의 VH 및 VL 도메인 아미노산 서열, 또는 서열번호 9 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖고, 약 5-9%의 Fab N-연결된 고 만노스 당형의 간테네루맙의 상대 농도를 수득하기 위해, 일 양태에서, 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 배양 배지 중 평균 포도당 농도는 약 4.00 g/L 내지 약 6.10 g/L, 바람직하게는 약 4.50 g/L 내지 약 5.60 g/L, 및 더 바람직하게는 약 5.00 g/L일 수 있다.
전형적으로, 생성기 동안 배양 배지 중 포도당의 측정된 농도가 약 2.00 g/L 미만일 때, 약 5.00 g/L의 포도당이 배양 배지에 첨가되거나, 또는 생성기 동안 배양 배지 중 포도당의 측정된 농도가 약 2.00 g/L 내지 약 5.50 g/L일 때, 약 4.00 g/L의 포도당이 배양 배지에 첨가되고, 이때 포도당 첨가는 스톡 용액(500 g/L)으로부터의 것이다. 배지 내 포도당 농도의 측정 및 필요할 때 후속 포도당 첨가는 포도당 농도의 변동을 감소시키거나 제거하기 위한 목적으로 본원에 제시된 빈도로 발생할 수 있다. 전형적으로, 본원에 개략적으로 설명된 바와 같은 포도당 첨가로, 약 0 g/L의 임의의 포도당 측정은 세포에 대한 부정적인 영향을 방지하기 위해 연속 또는 볼루스 첨가에 의해 처리될 것이다. 전술한 바와 같이, 배지 내의 포도당 농도의 결정은 실시될 필요가 없고, 보충은 이전의 경험에 기초하여 설정된 계획을 따를 것이다.
대안적인 구현예에서, 예컨대, 12K(12,000 리터) 발효기에서 배양할 때, 배양 배지 중 포도당의 측정된 농도가 약 4.00 g/L 미만으로 떨어지면 포도당을 배양 배지에 첨가한다. 이는 500 g/L 포도당을 함유하는 원액으로부터, 예컨대, 약 80 L를 첨가함으로써 달성할 수 있다. 포도당 농도를 결정하기 위한 샘플링은 하루에 한 번 또는 두 번 실시할 수 있다.
전형적으로 포도당은 50% 스톡 용액으로서 첨가하고, 요구되는 스톡 용액의 양의 계산을 위한 식은 다음과 같다:
수식 1: V_볼루스[ml] = c_Glc[mg/L] * Vferm[L] / 500 mg/ml
수식 2: M_볼루스[g] = V_볼루스[ml] * 1,224 g/ml　
V_볼루스는 볼루스로서 첨가될 공급물의 체적이고, c_Glc는 발효기에 첨가될 목표 농도이고, Vferm은 발효기 체적이며, M_볼루스는 볼루스로서 첨가될 공급물의 중량이다.
일 예에서, 1.80 g/L에서 측정된 1L 발효기 및 포도당을 사용하여, 따라서 첨가될 약 5.00 g/L의 포도당을 필요로 하는 경우, 첨가되는 포도당의 양/부피/50% 포도당 스톡 용액은 다음과 같이 계산할 수 있다:
V_볼루스[ml]　= 5000 mg/L * 1L/ 500 mg/mL =　10 mL　포도당
M_볼루스[g] = 10 ml　* 1,224 g/ml　=　12,24 g 포도당.
해당 단일클론 항체의 유가식 생성 동안 표준 공급 공정의 일부로서 포도당이 배양 배지에 첨가되는 경우, 배양 배지에 포함된 포도당의 농도 및/또는 생성기에 걸쳐 측정된 평균 포도당 농도에 따라 보충 공급이 추가적으로 요구되거나 요구되지 않을 수 있다. 예를 들어, 표준 볼루스 공급물이 제공되는 날에, 상기 볼루스 공급물의 포도당 부분은 전형적으로 회수하기 위한 배양물에 걸친 평균 포도당 농도가 상기 제시된 바와 같이, 원하는 고 만노스 당형 %에 따라, 원하는 농도로 유지되는 것을 보장하기에 충분한 포도당을 제공할 것이다.
본 발명의 방법은 또한 배양 배지 내 평균 포도당 농도를 모니터링하는 단계를 수반한다. 전형적으로, 배양 배지 중의 포도당 농도는 측정에 의해 모니터링된다. 바람직한 구현예에서, 배양 배지 중 포도당 농도는 보충에 대한 필요성을 결정하기 전에 매일, 2일마다, 3일마다 등, 또는 하루에 2회, 또는 하루에 3회 등으로 측정한다. 가장 바람직하게는, 포도당 농도는 매일 또는 매일 2회 측정한다. 측정은 매 24시간마다 동시에 실시하든지, 또는 각각의 24시간의 기간 동안 상이한 시간(들)에서 실시하든지는 중요하지 않다. 가장 바람직하게는, 상기 측정은 볼루스 공급물(영양분 공급물, 포도당 공급물 등)을 첨가하기 전에 하루에 한 번 실시한다. 모니터링은 단지 배양 배지 내 포도당 농도일 수 있고, 즉 다른 영양소의 농도의 모니터링이 필요하지 않을 수 있거나, 그 반대일 수 있다. 포도당 및 임의적으로 다른 영양소들의 보충은 필요한 경우 배양 배지 내 각각의 영양소 농도의 측정 후에 발생한다.
일 구현예에서, 배양 공정에서 평균 포도당 농도의 계산은 다음 식을 사용하여 실시할 수 있다:
(i) 연속 포도당 첨가 및 볼루스 첨가 전 및 후에 채취한 샘플과의 볼루스 첨가를 위해:
이때, 예컨대, n = 배양 샘플의 수(고려된 -7일 내지 0일의 샘플), i는 합산의 지수(샘플의 인덱싱 수), 및 ai는 샘플 i 내지 n(7일 내지 0일 동안)으로부터의 배양 배지 중 포도당의 측정된 농도(예컨대, g/L)이다. 볼루스 영양분 공급을 함유하는 포도당은 첨가되지 않는다. 전형적으로, 하루에 한 개의 샘플을 취한다.
(ii) 볼루스 첨가 후 샘플을 취하지 않는 볼루스 포도당 첨가의 경우:
이때, 예컨대, n = 배양 샘플의 수(고려된 -7일 내지 0일의 샘플)이고, m은 포도당 또는 영양분 공급물을 통한 포도당 첨가(고려된 -7일 내지 0일의 첨가)의 수이고, i는 샘플의 합산 인덱싱 수이고, k는 포도당 첨가의 수를 인덱싱하는 합산 지수이고, ai는 샘플 i 내지 n(-7일 내지 0일 동안)의 배양 배지 중 포도당의 측정된 농도(예컨대, g/L)이고, ak는 포도당 첨가 k로부터 m(-7일 내지 0일 동안)으로의 포도당 볼러스 첨가 직전에 배양 배지 내 포도당의 측정된 농도(예컨대, g/L)이고, bk는 첨가 k로부터 n(-7일 내지 0일 동안)으로의 배양 배지로의 포도당 첨가(볼러스)이고(예컨대, 첨가 당일에 발효기 부피를 기준으로 g/L), fk는 첨가 k로부터 m(-7일 내지 0일 동안)으로의 영양분 공급물 첨가(볼러스)를 통한 배양 배지로의 포도당 첨가이다(예컨대, 첨가 당일에 발효기 부피를 기준으로 g/L). 전형적으로, 영양분 공급 또는 포도당 볼루스의 첨가 전에 하루에 하나의 샘플을 취한다.
따라서, 본 발명의 방법에서, 배양 배지 중 포도당 농도가 측정되고, 측정된 농도에 따라, 배양 배지 중 포도당 농도가 생성기에 걸쳐 평균 포도당 농도를 달성하기 위해 조정된다. 조절의 양은 생성기에 걸친 평균 포도당 농도에 의존하며, 이는 항체 조성물에서 요구되는 Fab 고 만노스 당형의 상대적인 양에 따라 결정된다.
포도당 농도의 측정은 오프라인, 즉 배양 배지의 샘플에서 발생할 수 있거나, 또는 온라인 또는 인시츄(in situ), 즉 배양물 내에서 직접 발생할 수 있다. 오프라인으로 포도당 농도를 측정하는 방법은 당업자에게 친숙하고, Cedex Bio HT의 사용을 포함할 수 있다. 세포 배양액 샘플을 원심분리하여 세포를 분리하고, Bio HT에서 분석한다. Bio HT 분석은 다음과 같이 작동한다: 포도당은 헥소키나아제(HK)의 존재하에 ATP에 의해 인산화되어 포도당-6-인산염(G-6-P)을 생성하고, 이는 포도당-6-인산염 젖산 탈수소효소(G-6-PDH)의 존재하에 NADH에 의해 산화된다. NADPH 형성 속도는 UV-광도계로 측정하고, 포도당 농도에 정비례한다.
온라인/인시츄로 측정되는 경우, 포도당 농도는 프로브 및 분석 시스템을 사용하여 결정할 수 있어, 온라인 모니터링을 가능하게 한다. 이러한 시스템의 예는 BioPat® Trace(Sartorius) 기술이다.
라만과 같은 분광 방법은 포도당 농도를 측정하기 위해 달리 사용될 수 있거나, 또는 포도당 농도/소비의 추정은, 예컨대, 산소 소비에 기초하여 실시할 수 있다.
배양 배지 내 임의의 다른 영양소의 농도는, 필요한 경우, 또한 배지로부터 제거된 샘플 중에서 또는 배지 그 자체 내에서 직접 결정할 수 있다. 전형적으로, 예를 들어, 아미노산의 농도는, 예컨대, Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 Rapid Separation LC 시스템을 사용하여 또는 라만에 의해 분석할 수 있는 배지의 샘플에서 결정한다.
본 발명의 방법에서, 배양 배지는 측정된 포도당 농도가 특정 한계치 사이일 때 조성물 중 Fab 고 만노스 당형의 원하는 상대량을 달성하는데 필요한 평균 포도당 농도에 따라 포도당을 보충한다.
대안적으로, 일일 포도당 첨가 절차가 채택될 수 있으며, 배양물에 첨가되는 포도당의 양(g/L)은 요구되는 총 당화 Fab에 대한 원하는 % 고 만노스 Fab 및 생성 공정의 -7일 내지 0일에 걸친 평균 포도당 농도에 의존한다.
따라서, 일 예에서:
(a) 포도당은 약 3.00 내지 6.00 g/L의 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 평균 농도를 달성하기 위해 생성기 동안 배양 배지에 매일 첨가되어 대략 7%의 고 만노스 Fab 영역을 수득하고;
(b) 포도당은 약 4.00 내지 7.00 g/L의 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 평균 농도를 달성하기 위해 생성기 동안 배양 배지에 매일 첨가되어 대략 9%의 고 만노스 Fab 영역을 수득하고;
(c) 포도당은 약 6.00 내지 9.00 g/L의 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 평균 농도를 달성하기 위해 생성기 동안 배양 배지에 매일 첨가되어 대략 10.5%의 고 만노스 Fab 영역을 수득하고;
(d) 포도당은 약 9.00 내지 11.00 g/L의 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 평균 농도를 달성하기 위해 생성기 동안 배양 배지에 매일 첨가되어 대략 13%의 고 만노스 Fab 영역을 수득하며; 그리고
(e) 포도당은 약 11.00 내지 14.00 g/L의 생성기의 -7일 내지 0일에 걸친 평균 농도를 달성하기 위해 생성기 동안 배양 배지에 매일 첨가되어 대략 15%의 고 만노스 Fab 영역을 수득한다.
상기는 포도당의 일일 첨가를 요구하지만, 각각의 일일 보충물은 하나 이상의 용량으로 첨가될 수 있거나, 또는 연속 첨가를 통해 첨가될 수 있다.
전형적으로 포도당은 용액 중에서 배양 배지에 첨가된다. 이는 스톡 용액 또는 영양분 공급물일 수 있다. 용액 내 영양소의 농도는, 예컨대, 첨가될 부피에 따라 가변될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다.
일 양태에서, 약 20% 미만의 N-연결된 고 만노스 간테네루맙을 달성하기 위해, 표 1A는 생성기의 -7 내지 0일에 걸쳐(즉, 기본 배지, 공급 배지 및 볼루스 첨가에 존재하는 포도당을 고려하여) 취해진 포도당의 관찰된 평균 농도를 보여준다.
표 1A - 관측 평균
상기 모든 방법에서, 배양물 중의 세포에 의해 발현된 항체가 항-인간 A-베타 항체, 예컨대, 간테네루맙인 것이 가장 바람직하다.결과는 다음과 같다:
1. (예컨대, 도 2 및 도 3a를 참조) 생성기의 -7일 내지 0일에 걸쳐 평균 포도당 농도와 단일클론 항체의 Fab 고 만노스 당형의 상대적인 함량 사이에 강한 상관관계가 있다. 이러한 효과는 작은 규모의 생물반응기에서 큰 규모의 생물반응기로 전달될 수 있다.
2. (예컨대, 도 4 및 도 5를 참조)Fab N-당화 부위에서 특정 당형의 상대적인 양이 조절되는 항체의 균질한 집단의 생성은 일관된 약리학적 프로파일을 갖는 치료제를 발생시킨다.
3. 단일클론 항체의 생체이용률의 약 18%의 증가는 상이한 방법에 따라 제조된 2배의 Man5-7을 포함하는 고 만노스 당형과 비교하여, 본원의 방법에 따라 제조된 약 5 내지 6%의 Man5-7을 포함하는 Fab 고 만노스 당형을 사용하여 달성될 수 있다(도 6b를 참조).
세포, 생성 배지, 방법 등
본 발명의 방법에 따르면, 당화된 단일클론 항체는 진핵 세포에서 생성된다. 세포 배양 및 당화된 단일클론 항체의 발현에 민감한 임의의 진핵 세포가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 전형적으로, 진핵 세포는 포도당-반응성이다. 진핵 세포는 바람직하게는 적절한 영양소 및 성장 인자를 함유하는 배지 내에서 현탁 배양물에 배치될 때 성장 및 생존할 수 있고 전형적으로 관심이 되는 다량의 특정 당화된 단일클론 항체를 발현하고 배양 배지 내로 분비할 수 있는 진핵 세포주이다.
바람직한 구현예에서, 상기 진핵 세포는 포유류 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포이다.
진핵 세포가 포유류 세포일 때, 이는, 예를 들어, NSO 뮤린 골수종 세포주, SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVI 세포주(COS-7, ATCC® CRL 1651); 인간 배아 신장 계통 293S(Graham et al., J.Gen.Virol. 36 (1977) 59); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC® CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol.Reprod. 23 (1980) 243); 원숭이 신장 세포(CVI-76, ATCC® CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC® CRL 1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC® CCL 2): 개의 신장 세포(MDCK, ATCC® CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포(BRL 3A, ATCC® CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC® CCL 75): 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562, ATCC® CCL 5I); 쥐 간세포(HTC, MI.54, Baumann et al., J.Cell Biol., 85 (1980) 1); 및 TR-1 세포(Mather et al., Annals N.Y.Acad.Sci. 383 (1982) 44), PER.C6 세포주(Percivia LLC) 및 하이브리도마 세포주일 수 있다.
중국 햄스터 난소 세포(CHO, Urlaub and Chasin P.N.A.S. 77 (1980) 4216) 또는 PER.C6은 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 세포주이다. 본원에서 사용하기에 적합한 공지된 CHO 유도체는, 예를 들어, CHO/-DHFR(상기 Urlab & Chasin), CHOK1SV(Lonza), CHO-K1 DUC B11(Simonsen and Levinson P.N.A.S. 80 (1983) 2495-2499) 및 DP12 CHO 세포(EP 307,247)를 포함한다.
상기 진핵 세포가 효모 세포인 경우, 이는, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있다.
진핵 세포가 곤충 세포인 경우, 이는, 예를 들어, Sf-9일 수 있다.
중국 햄스터 난소 세포(CHO) 및 마우스 골수종 세포(NS0, SP2/0)는 치료 항체의 생성을 위한 최고의 포유동물 숙주 세포가 되었고, 이러한 세포주의 대부분은 현탁 배양에서 성장하도록 적응되었으며, 반응기 배양, 규모 확장 및 대량 생성에 적합하며, 생산성은 1 내지 8 g/L의 범위이다.
본 발명에서 세포는 CHO 세포, 예컨대, CHOK1 세포인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 사용되는 진핵 세포는 재조합 당화된 단일클론 항체를 생성하기 위해 선택되거나 조작된다. 조작에는 발현될 단일클론 항체를 인코딩하는 하나 이상의 이종 유전자의 도입과 같은 하나 이상의 유전적 변형이 포함된다. 상기 이종 유전자는 상기 세포에서 정상적으로 발현되거나 숙주 세포에 대해 외래인 단일클론 항체를 인코딩할 수 있다. 조작은 추가적으로 또는 대안적으로 하나 이상의 내인성 유전자를 상향 또는 하향 조절하는 것일 수 있다. 종종, 세포는, 예를 들어, 항체를 인코딩하는 유전자의 도입 및/또는 항체를 인코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 제어 요소의 도입에 의해 단일클론 항체를 생성하도록 조작된다. 단일클론 항체 및/또는 제어 요소를 인코딩하는 유전자는 플라스미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터를 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 벡터는 그들이 도입된 숙주 세포 내에서 가능하거나 자율 복제가 가능한 반면, 다른 벡터는 숙주 세포의 유전체 내로 통합될 수 있고, 따라서 숙주 게놈과 함께 복제된다. 다양한 벡터가 공개적으로 입수 가능하며 벡터의 정확한 성질은 본 발명에 필수적인 것이 아니다. 일반적으로, 벡터 성분은 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 프로모터, 및 전사 종결 서열중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 성분들은 WO 97/25428에 기재된 바와 같다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 당화된 단일클론 항체는 상기 기재된 바와 같은 간테네루맙이다.
진핵 세포로부터의 바이오매스 생성 및 당단백질 발현은 발효 조건하에서 세포의 배양에 의해 본 발명의 방법에 따라 달성된다. 바이오매스 생성 및 단일클론 항체의 발현을 위한 세포의 성장에 적합한 임의의 발효 세포 배양 방법 또는 시스템이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 회분식 또는 유가식 또는 관류 배양으로 성장할 수 있으며, 이때 상기 배양은 단일클론 항체의 충분한 발현이 발생한 후에 종결되고, 이 후에 당단백질이 회수되고, 필요한 경우 정제된다. 유가식 배양을 사용하는 경우, 배양물의 공급은 지속적으로 또는 배양 중에 주기적으로 실시할 수 있다. 여러 공급물이 제공될 때, 매일, 격일로, 이틀마다 등, 하루에 한 번 이상 또는 하루에 한 번 미만 등으로 각각의 피드에 대해 동일하거나 상이한 피드 공급 용액으로 제공될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 세포 배양 방법은 유가식이다.
바이오매스 생성 및 당단백질의 생성을 위한 세포의 발효 배양을 위한 반응기, 온도 및 기타 조건, 예컨대, 산소 농도, 이산화탄소 및 pH, 교반, 온도 및 습도가 당업계에 공지되어 있다. 상이한 반응기 용적들이 발효 공정을 통해 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양은 진탕 플라스크 또는 20 L의 생물반응기를 접종하고 약 21일 동안 배양함으로써 확립될 수 있다. 이 후, 세포는 약 3일 동안 80 L의 생물 반응기, 약 3일 동안 400 L의 반응기, 및 약 2일 동안 2,000 L의 반응기로 옮겨질 수 있다(단계 n-1). 항체(n 단계) 생성을 위한 주요 발효는, 예를 들어, 12,000 L의 생물 반응기에서 실시할 수 있다.
선택된 진핵 세포의 배양에 적절한 임의의 조건은 당업계에서 입수가능한 정보를 사용하여 선택할 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 일반적으로 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 조건이며, 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 원하는 경우, 온도 및/또는 pH 및/또는 CO2는 수율을 증가시키고, 그리고/또는 원하는 단일클론 항체 품질의 상대적인 양을 증가시키기 위해 배양 동안 변경할 수 있다.
본 발명은 발효 배양 조건하에서 세포 배양을 제공한다. 이는 전형적으로 세포가 여러 단계 또는 상으로 배양되는 다단계 배양 절차이다. 이러한 바람직한 절차에 따라서, 예컨대, 냉동된 세포 바이알로부터의 발효 배양 공정은 전형적으로 하기와 같이 별도의 3 단계를 수반한다. 즉:
i) 세포 회수를 위한 해동 스트레스 후 및 세포 회수 속도 및 생성 규모에 따라 14일 내지, 예컨대, 60일을 초과하여 지속될 수 있는 세포 배가 시간을 정상화하기 위한, 씨드 트레인. 상기 단계는 진탕 플라스크에서 또는 생물 반응기, 예를 들어, 20L 생물 반응기에서 발생할 수 있다.
ii) n-x 상을 포함하는 성장기, 또는 접종 트레인(inculation train), 이때 x는 전형적으로 1 내지 5, 바람직하게는 1 또는 2 또는 1, 2 또는 3이다. 이들 단계는 또한 세포가 성장 및 바이오매스 생성을 촉진하기에 적합한 배지에 접종되는 성장기(들)로 지칭될 수 있다. 따라서, n-x 단계는 전형적으로 더 큰 배양 양식 및 선택된 화합물의 세척을 위한 배양의 확장을 위한 것이다. n-x 상이 3개의 상, n-1, n-2 및 n-3으로 구성되는 경우, 각각의 상은, 예컨대, 2 내지 8일, 전형적으로 각각 2, 3 또는 4일 동안 지속되며; 그리고
iii) 생성기, 또는 상기 재조합 당단백질의 적절한 양 및/또는 품질의 생성. 상기 단계의 지속 시간은, 예를 들어, 재조합 세포의 특성뿐만 아니라 발현된 당단백질의 양 및/또는 품질에 따라 달라질 수 있다. 전형적으로, 이 단계는 약 11일 내지 약 20일 동안 지속될 것이다. 전형적으로 이 주요 발효기는 12,000 L 생물반응기에서 발생할 것이다. 단백질 및/또는 세포는 생성기 동안 및/또는 생성기의 마지막에 회수될 수 있다. 본 개시에서, 회수는 통상적으로 0일로 지정된다.
전형적으로, 12,000 L 생물반응기에서 생성되는 경우, 회수시 세포는 48-62일 된 것일 것이다.
성장기와 생성기 사이의 기간인 전이기가 또한 포함될 수 있다. 일반적으로 전이기는 배양 조건이 성장에서 생성으로 이동하도록 제어될 수 있는 시간이다. 제어될 수 있는 다양한 세포 배양 매개변수는 온도, 삼투질 농도, 비타민, 아미노산, 당, 펩톤, 암모늄 및 염을 포함한다.
세포는, 예컨대, 새로운 배지의 첨가 또는 기존의 배지에 대한 영양소 보충에 의해 적합한 기간 동안 씨드 트레인 또는 성장기에서 적절하게 유지될 수 있다.
시드 트레인, 성장기 및 생성기 중 임의의 것 또는 전부는 연속적일 수 있거나, 또는 하나의 상으로부터의 세포가, 예컨대, 새로운 배지에서 다음 상을 접종하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법의 일 양태에서, 발현된 단일클론 항체는 세포 배양 상청액으로부터 회수된다. 배양 기간 동안 또는 배양 기간 종료 시, 바람직하게는 생성기에서 발현된 단일클론 항체의 회수는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 발현된 단일클론 항체는 단백질 A 컬럼, 이온 교환 컬럼 정제 및/또는 크기 배제 컬럼 정제와 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 필요에 따라, 예컨대, 세포 배양 상청액으로부터, 단리 및/또는 정제될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 단일클론 항체의 당화 프로파일은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있고 상기 기재된 방법을 사용하여, 또는 예를 들어, N-글리칸의 제거 및 유도체화한 후, 예컨대, 정상(NP) HPLC 분석, 약한 양이온 교환 크로마토그래피(WCX), 모세관 등전위 초점법(cIEF), 크기-배제 크로마토그래피, POROS™ A HPLC 검정, 숙주 세포 단백질 ELISA, DNA 검정 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석할 수 있다. 그러한 정제 단계는 발현된 항체의 당형 함량에 영향을 미치지 않는다.
추가의 양태에서, 본 개시의 단일클론 항체 조성물은 발효로부터 직접 발생되는, 즉, 배양 상청액이다.
3. 치료 방법/치료 및 진단 사용
본원에 제공된 조성물은 약학적 조성물 또는 진단 조성물로서 특히 유용하다. 이러한 조성물은 전형적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
당화 단일클론 항체의 치료 또는 진단 유용성은 본 발명의 조성물에서 변함없이 유지된다. 따라서, 이의 Fab 영역(들)에서 N-당화를 갖는 단일클론 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물 중 Fab 당화 항체의 총량에 대해, 상기 조성물 중 약 20% 이하의 단일클론 항체가 본 발명의 Fab 영역(들)에서 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는 조성물은 이에 대해 조성물 내에 포함된 항체가 적절한 대상체에서의 임의의 장애를 치료하는데 사용할 수 있다.
따라서, 예를 들어, 간테네루맙은 알츠하이머병 환자의 뇌 절편에서 인간 고유 아밀로이드 플라크의 검출에서 진단 시약으로, 또한 아밀로이드생성 및/또는 플라크 형성과 관련된 질병, 예컨대, 치매, 알츠하이머병, 운동 신경병증, 파킨슨병, 아밀로이드성 측삭 경화증(ALS), 스크래피, HIV-관련 치매 및 크로이츠펠트-야콥병, 유전성 뇌출혈, 네덜란드형 아밀로이드증, 다운 증후군 및 노화와 관련된 신경 장애의 예방 또는 치료제로서 공지되어 있고, 그 유용성은 본 발명의 조성물에서 동일하게 유지된다.
따라서, 상기 단일클론 항체는 간테네루맙일 수 있다. 이에 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 단일클론 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드생성 및/또는 플라크 형성과 관련된 질병, 예컨대, 치매, 알츠하이머병, 운동 신경병증, 파킨슨병, 아밀로이드성 측삭 경화증(ALS), 스크래피, HIV-관련 치매 및 크로이츠펠트-야콥병, 유전성 뇌출혈, 네덜란드형 아밀로이드증, 다운 증후군 및 노화와 관련된 신경 장애, 바람직하게는 알츠하이머병을 가진 개체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 조성물은 조성물 내 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 20% 이하의 상기 항체의 고 만노스 당형을 포함하며, 이때 상기 당화는 항체의 CDR2 내 Asn52에서 N-당화된다.
이러한 방법의 바람직한 양태에서, 상기 조성물은 조성물 중 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 15% 또는 약 10% 이하의 상기 항체의 N-연결된 고 만노스 Fab 당형을 포함한다.
대안적인 구현예에서, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드생성 및/또는 플라크 형성과 관련된 질병, 예컨대, 치매, 알츠하이머병, 운동 신경병증, 파킨슨병, 아밀로이드성 측삭 경화증(ALS), 스크래피, HIV-관련 치매 및 크로이츠펠트-야콥병, 유전성 뇌출혈, 네덜란드형 아밀로이드증, 다운 증후군 및 노화와 관련된 신경 장애, 바람직하게는 알츠하이머병을 가진 개체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 조성물은 조성물 내 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 20% 이하의 상기 항체의 고 만노스 당형을 포함하며, 이때 상기 당화는 서열번호 7의 Asn52에서 N-당화된다.
이러한 방법의 바람직한 양태에서, 상기 조성물은 조성물 중 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 15% 또는 약 10% 이하의 상기 항체의 고 만노스 Fab 당형을 포함한다.
대안적인 구현예에서, 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드생성 및/또는 플라크 형성과 관련된 질병, 예컨대, 치매, 알츠하이머병, 운동 신경병증, 파킨슨병, 아밀로이드성 측삭 경화증(ALS), 스크래피, HIV-관련 치매 및 크로이츠펠트-야콥병, 유전성 뇌출혈, 네덜란드형 아밀로이드증, 다운 증후군 및 노화와 관련된 신경 장애, 바람직하게는 알츠하이머병을 가진 개체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 조성물은 조성물 내 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 20% 이하의 상기 항체의 고 만노스 당형을 포함하며, 이때 상기 당화는 서열번호 9의 Asn52에서 N-당화된다.
이러한 방법의 바람직한 양태에서, 상기 조성물은 조성물 중 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 15% 또는 약 10% 이하의 상기 항체의 고 만노스 Fab 당형을 포함한다.
이에 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 아밀로이드생성 및/또는 플라크 형성과 관련된 질병, 예컨대, 치매, 알츠하이머병, 운동 신경병증, 파킨슨병, 아밀로이드성 측삭 경화증(ALS), 스크래피, HIV-관련 치매 및 크로이츠펠트-야콥병, 유전성 뇌출혈, 네덜란드형 아밀로이드증, 다운 증후군 및 노화와 관련된 신경 장애, 바람직하게는 알츠하이머병을 가진 개체를 치료하는 방법에서 사용하기 위해, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 단일클론 항체를 포함하는조성물을 제공하고, 상기 조성물은 조성물 내 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 20% 이하의 상기 항체의 고 만노스 당형을 포함하고, 이때 상기 당화는 항체의 CDR2 내 Asn52에서 N-당화된다.
이러한 방법의 바람직한 양태에서, 상기 조성물은 조성물 중 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 15% 또는 약 10% 이하의 상기 항체의 고 만노스 Fab 당형을 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 아밀로이드생성 및/또는 플라크 형성과 관련된 질병, 예컨대, 치매, 알츠하이머병, 운동 신경병증, 파킨슨병, 아밀로이드성 측삭 경화증(ALS), 스크래피, HIV-관련 치매 및 크로이츠펠트-야콥병, 유전성 뇌출혈, 네덜란드형 아밀로이드증, 다운 증후군 및 노화와 관련된 신경 장애, 바람직하게는 알츠하이머병을 가진 개체를 치료하는 방법에서 사용하기 위해, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 조성물 내 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 20% 이하의 상기 항체의 고 만노스 당형을 포함하고, 이때 상기 당화는 항체의 서열번호 7 내 Asn52에서 N-당화된다.
이러한 방법의 바람직한 양태에서, 상기 조성물은 조성물 중 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 15% 또는 약 10% 이하의 상기 항체의 고 만노스 Fab 당형을 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 아밀로이드생성 및/또는 플라크 형성과 관련된 질병, 예컨대, 치매, 알츠하이머병, 운동 신경병증, 파킨슨병, 아밀로이드성 측삭 경화증(ALS), 스크래피, HIV-관련 치매 및 크로이츠펠트-야콥병, 유전성 뇌출혈, 네덜란드형 아밀로이드증, 다운 증후군 및 노화와 관련된 신경 장애, 바람직하게는 알츠하이머병을 가진 개체를 치료하는 방법에서 사용하기 위해, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 조성물 내 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 20% 이하의 상기 항체의 고 만노스 당형을 포함하고, 이때 상기 당화는 항체의 서열번호 9 내 Asn52에서 N-당화된다.
이러한 방법의 바람직한 양태에서, 상기 조성물은 조성물 중 VH 당화된 항체의 총량에 대해 약 15% 또는 약 10% 이하의 상기 항체의 고 만노스 Fab 당형을 포함한다.
임의의 또는 모든 상기 양태들에서, 단일클론 항체 간테네루맙은 또한 이의 Fc 영역에서 N-당화될 수 있다.
전형적으로, 개체는 인간이다. 알츠하이머병의 진단은 이 진단에 대한 NINCDS/ADRDA(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke/Alzheimer's Disease and Related Disorders Association) 기준에 기초한다.
본 발명에 따른 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 예시적인 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입을 포함한다. 특정 양태들에서, 조성물은 경구 투여될 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 투여의 경로/방식은 원하는 결과에 따라 가변될 것이다.
본 발명의 조성물의 공동-요법이 또한 고려된다. 따라서, 알츠하이머병의 경우, 메만틴, 도네프레질, 리바스티그민 또는 갈란타민과 같은 승인된 약제와의 공동 요법이 예상된다.
투여 형태 및 요법은 최적의 원하는 반응을 제공하도록 조정될 수 있고, 치료될 상태의 유형 및 중증도에 따라 가변될 것이다. 또한, 임의의 특정 대상체에 대해, 특정 용량 요법은 조성물의 투여를 투여 또는 감독하는 사람의 개인적 필요성 및 전문적 판단에 따라 시간에 걸쳐 조정될 수 있다. 투여 형태 및 요법은 그 자체로 본 발명의 일부를 형성하지 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명은 단일클론 항체 또는 이의 일부 또는 단편을 포함하는 조성물의 제거율을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 조성물 중 고 만노스 Fab 당형의 상대적인 함량을 조절하는 단계를 포함한다.
전형적으로, 본 발명자들은 항체 조성물에서 높은 만노스 Fab 당형의 상대적인 함량을 감소시키는 것이 인간에서 AUC의 증가를 발생시킨다는 것을 발견하였다. 따라서, 이러한 양태에 따라, 단일클론 항체 또는 이의 부분들 또는 단편들을 포함하는 조성물의 AUC를 적어도 약 5% 포인트, 예를 들어, 6 내지 11% 포인트 증가로 증가시키는 방법은 조성물 내 고 만노스 Fab 당형의 상대적인 함량을 조절함으로써 제공된다.
항체 조성물 중 고 만노스 Fab 당형의 상대적인 함량을 조절하는 방법은 상기 기재된 바와 같다.
특정 형태로 표현되거나 또는 개시된 기능을 실시하기 위한 수단, 또는 개시된 결과를 달성하기 위한 방법 또는 공정의 관점에서 적절하게 표현된 전술한 설명 또는 하기의 청구범위, 또는 첨부된 도면들에 개시된 특징들은 개별적으로 또는 이러한 특징들의 임의의 조합으로 본 발명을 다양한 형태로 실현하는 데 활용된다.
본 발명이 위에서 설명된 예시적인 구현예들과 함께 설명되었지만, 많은 동등한 수정들 및 변형들이 본 개시가 주어질 때 당업자에게 명백할 것이다. 이에 따라, 전술한 본 발명의 예시적인 구현예들은 예시적이고 제한적인 것이 아닌 것으로 간주된다. 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 설명된 구현예들에 대한 다양한 변경이 이루어질 수 있다.
의심을 피하기 위해, 본원에 제공된 임의의 이론적 설명은 독자의 이해를 향상시키기 위한 목적으로 제공된다. 본 발명자는 이러한 이론적 설명 중 어느 것에도 구속되기를 원하지 않는다.
본원에 사용된 섹션 제목은 구성 목적으로만 사용되며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 양태 및 구현예들은 이제 첨부된 도면을 참조하여 예로서 설명될 것이다. 추가적인 양태 및 구현예들은 당업자에게 명백할 것이다. 이 본문에 언급된 모든 문서는 본원에 원용된다.
실시예
실시된 실험들 및 달성된 결과들을 포함하는 다음의 실시예들은 단지 예시적인 목적들을 위해 제공되며, 그러한 청구항들이 부여되는 등가물들의 전체 범위와 함께 모든 가능한 구현예들을 포함하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
재료 및 화학 물질
세포주
하기 기재된 연구에서, 본 발명자들은 간테네루맙을 생성하는 재조합 CHO-K1 세포주를 사용하였다. 생성된 항체는 Fc 및 Fab 영역 둘 모두에서 당화된다. 상기 세포주는 독점적인 화학적으로 규정된 무단백질 배지를 사용하여 유가식 모드로 배양하였다.
공정내 제어 - 세포 성장 및 대사산물의 분석
세포 성장 및 생존율은 자동화된 CedexHiRes 장치(Roche Innovatis, Bielefeld, Germany)를 사용하여 분석하였다. 생성물의 역가 및 대사산물인 포도당, 락테이트 및 암모늄의 정량화를 위해, 세포 배양액을 원심분리하여 세포를 분리하고, Cedex Bio HT 시스템(Roche, Mannheim, Germany)을 사용하여 분석하였다. 포도당 Bio HT 검정을 위한 시험 원리는 다음과 같이 작동한다: 포도당은 헥소키나아제(HK)의 존재하에 ATP에 의해 인산화되어 포도당-6-인산염(G-6-P)을 생성하고, 이는 포도당-6-인산염 젖산 탈수소효소(G-6-PDH)의 존재하에 NADH에 의해 산화된다. NADPH 형성 속도는 UV-광도계로 측정하고, 포도당 농도에 정비례한다.
공정내 제어 - 아미노산
유리 아미노산 농도는 UltiMate 3000 RSLC(급속 분리(Rapid Separation, RS) HPLC)를 사용하여 무세포 배양 상청액에서 검출하였다.
당화 종 분석
초기에 회수된 세포 배양액은 세포를 분리하고 세포 무함유 상청액을 수득하기 위해 원심분리해야 한다. 특정 생성물 품질 속성의 분석 전에 주요 불순물을 분리하기 위해, 단백질 A 단계를 실시하였다:
Fc-함유 항체 또는 항체-관련 분자는 Tecan Freedom EVO® 액체 처리 워크스테이션, 데크 크기 150 cm, 및 96 어레이 포맷의 Atoll MediaScout® RoboColumn 기술을 사용하여 단백질 A 친화성으로 정제된다(예컨대, MabSelect SuRe, GE Healthcare). 모든 단계에서 ≤ 5 μl/s의 느린 피펫팅 속도가 적용된다. 간략하게, RoboColumns(로보컬럼, 칼럼 부피 (CV) 200 μl, 내부 치수 10 mm 베드 높이 및 5 mm 내부 직경)을 2 CV의 재생 완충액(0.2 M NaOH)으로 예비-세정하였다. 5분간의 인큐베이션 후, 로보컬럼을 10 CV 평형화 완충액(0.025 M NaCl, 0.025 M Tris, pH 7.2)으로 컨디셔닝하였다. 조절된 로보컬럼은 컬럼 당 최대 4 mg 단백질로 로딩된다(회수된 세포 배양액(HCCF)의 로드-부피는 이에 따라 조정됨). 4 CV 평형화 완충액으로 세척한 후, 결합된 단백질을 4 CV 용출 완충액(0.05 M 아세테이트, pH 3.7)으로 용출하였다. 용출액의 pH를 1 M Tris, pH 11의 첨가에 의해 즉시 중화시켰다. 280 nm에서의 흡광도를 Tecan Infinite M200 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 로보컬럼을 3 CV 평형화 완충액으로 헹군 후, 2 CV의 재생 완충액으로 재생시키고, 10분간 인큐베이션하였다. 마지막으로, 로보컬럼을 4°C에서 저장하기 위해 5 CV 평형화 완충액 및 4 CV의 20% 에탄올로 플러싱하였다.
샘플은 달리 또는 추가로 완전히 정제될 수 있다(대량 샘플). 항체 또는 이의 일부의 정제 방법은 수득된 % 당형에 어떠한 유의한 영향을 미칠 것으로 예상되지 않지만, 사용되는 정제 단계의 수에 의존할 수 있다. 본원의 실시예 1 및 실시예 2 및 도 2-도 3b에서 당형%는 단백질 A 정제된 분획으로부터 결정된다. 실시예 3 및 실시예 4 및 도 4a 내지 도 8b에 언급된 값은 완전히 정제된 샘플(대량 샘플)로부터 수득된다. 정제는 여러 정제 단계를 통해 실시하였다.
본원에 사용된 항체에 대해 구현된 N-글리칸의 상대적인 분포에 대한 분석은 다음과 같이 설명될 수 있다: 제1 단계에서, Fc 글리칸은 엔도글리코시다제 PNGaseF에 의해 항체 골격으로부터 절단한다. 방출된 Fc 글리칸은 한외여과를 통해 단백질로부터 분리하고 수집한다. 단백질 샘플 재완충 후, Fab 글리칸은 "급속 PNGaseF" 분해에 의해 방출된 다음 한외여과를 통해 단백질로부터 분리한다. 이어서, Fc 및 Fab 글리칸을 별도로 2-AB(2-아미노벤즈아미드)로 표지하고, 과량의 표지를 제거한다. 마지막으로, Fc 및 Fab 글리칸을 독립적으로 형광 검출을 갖는 HILIC(친수성 상호작용 크로마토그래피)-UHPLC(초고성능 액체 크로마토그래피)에 의해 분석하였다.　
제제 중 각각의 당형(즉, 고 만노스 또는 기타 당형)의 백분율은, 예컨대, 생성된 글리칸의 크로마토그램으로부터 계산할 수 있다. 도 9는 이러한 크로마토그램을 도시한다. M5-M7 당형의 백분율을 계산하기 위해, 기준선을, 예컨대, 도 9에서 5 내지 39분으로 그린 다음, 상기 기준선을 갖는 곡선 아래의 면적을 계산한다(A1). 그런 다음, 피크 M5-M7의 면적을 A1으로 나누고 100을 곱하여 퍼센트 M5-M7을 수득하고 백분율 값(%) 또는 면적%을 수득한다.
실시예 1
당 첨가의 변화에 의한 Fab 당화의 조절
도 2에는 대표적인 실행의 모든 데이터가 표시되어 있다. 데이터는 상이한 규모(0,25L, 2L, 100L, 400L 및 12,000L)로 발효 실행으로부터 수집한다. 발효는 발효 공정의 최적화 및 재료 공급과 같은 상이한 목적을 위해 실시하고, 특히 포도당 영향의 평가에 전용이지 않다. 공정 경험(예컨대, 교반, 통기, 세포 은행, 세포 노화)에 따라 무시될 수 있는 사소한 변형과는 별도로, 상기 매개변수들은 포도당 첨가와는 별도로 모든 실행에 대해 동일하다.
포도당은 공정에 첨가된 포도당의 총량을 변화시키기 위해 상이한 방식으로 첨가하였다. 포도당 용액의 연속적인 첨가를 사용하는 경우, 첨가는 펌프 및 스케일을 통해 구현된다. 첨가율은 배지에서 포도당의 측정에 따라 매일 조정하며, 측정은 외부적일 수 있거나 배지에서 직접 발생할 수 있다. 직접 측정 방법, 즉 배지 자체에서의 방법은 배양물 내 포도당 수준을 내부적으로 측정하는 포도당 프로브의 사용을 포함하거나, 또는 오프 가스 분석을 통한 세포의 산소 소비에 기초한다.
대안적으로, 포도당은, 예컨대, Cedex Bio HT 장치를 사용하여 외부 측정에 기초하여 볼루스 첨가로서 첨가한다. 특정 부피의 50% 포도당 용액(500 g/L)을 특정 규칙에 기초하여 직접 첨가하는데, 예컨대, 측정된 포도당 농도가 세포 배양물에서 5 g/L 포도당 미만으로 떨어지면 6 g/L 포도당을 첨가한다.
연속 공정에서의 첨가율을 변화시킴으로써(예컨대, 0.5 내지 0.7 g/h) 또는 볼루스 첨가에서의 포도당의 양을, 예컨대, 배양 배지 중의 포도당의 측정된 농도에 따라 변경시킴으로써(예컨대, 포도당 수준이 4 g/L 미만일 때 4 g/L 포도당을 첨가하거나, 또는 포도당 수준이 4 g/L 미만일 때 6 g/L을 첨가함), 생성기에 걸쳐 원하는 평균을 달성하기 위해 공정에 걸쳐 세포 배양물에 첨가되는 포도당의 양을 변화시킬 수 있다.
결과는 도 2에 나타난다. -7일 내지 0일의 포도당 평균 농도와 상대적 Fab 고 만노스 수준 간에는 강한 상관관계가 있다.
실시예 1은 임의의 스케일에서, 발효 -7일 내지 0일에 걸쳐 배양 배지 중 평균 포도당 농도를 증가시키는 것이 당화된 항체/Fab 영역의 총량에 비해 세포에 의해 발현된 항체/Fab 영역의 고 만노스 당형의 백분율의 증가를 발생시킨다는 것을 입증한다.
실시예 2
당 첨가의 변화에 의한 Fab 당화의 조절
전용 실험에서 실시예 1의 결과를 확인하기 위해, 1L 생물반응기에서의 실험을 본 개시의 방법을 사용하여 실시하였다. 배양은 Fc 및 Fab 당화를 갖는 항체를 생성하는 CHO-K1 세포주를 사용하여 실시하였다. 발효는 간테네루맙에 대한 유가식 표준 공정으로 실시하였고 포도당을 함유하는 화학적으로 규정된 표준 배지를 사용하였다. 회수를 0일에 실시하고, 당형 분포를 원심분리 및 단백질 A 정제 샘플로부터 분석하였다.
유일한 변화는 포도당 첨가 전략이었다. 공정 경험(예컨대, 교반, 통기, 세포 은행, 세포 노화)에 따라 무시될 수 있는 사소한 변형과는 별도로, 상기 매개변수들은 포도당 첨가와는 별도로 모든 실행에 대해 동일하다.
생성기의 -10일부터 Cedex Bio HT를 사용하여 포도당 농도를 매일 측정하였다. 측정 후, 500 g/L 포도당 용액을 매일 각 생물반응기에 첨가하고, 농도의 변화를 첨가하였다:
- 포도당 용액을 7 g/L의 일일 농도로 첨가하고;
- 포도당 용액을 9 g/L의 일일 농도로 첨가하고;
- 포도당 용액을 12 g/L의 일일 농도로 첨가하거나; 또는
- 포도당 용액을 15 g/L의 일일 농도로 첨가한다.
포도당 첨가에 대한 계산은 일일 측정에 기초하였다.
생성기의 전부 또는 일부에 걸친 배양물 중 -7일 내지 0일의 평균 포도당 농도(본원의 식으로 계산됨)와 발현된 항체의 Fab 고 만노스 당형의 상대적 함량 사이에는 강한 상관관계가 있다.
결과는 생성기 -7일 내지 0일의 평균 포도당 농도와 단일클론 항체의 Fab 고 만노스 당형의 생성 사이의 상관관계를 명확하게 보여주는 도 3a에 제시된다. 도 3b에서 Fab 고 만노스 합계는 만노스 5, 6 및 7의 부분으로 분리된다. Fab 고 만노오스의 합계의 모든 별개의 부분은 반응기에서의 포도당 평균 수준에 대해 동일한 경향 및 의존성을 나타낸다. 도 3c에서는 -7일에서 0일까지의 평균 포도당 수준의 계산에 대해 설명한다. 계산은 포도당 첨가 전에 채취한 샘플로부터 배양물 중의 매일 측정된 포도당 농도 및 볼루스 첨가 후 배양물 중의 계산된 포도당 농도(첨가 전의 측정된 값 및 포도당 첨가량으로부터 계산됨)에 기초한다.
결과(도 3a를 참조):
- 7 g/L의 포도당 첨가
Figure pct00005
-7일 내지 0일의 포도당 평균은 5.7 g/L임 약 9%의 Fab 고 만노스
- 9 g/L의 포도당 첨가 -7일 내지 0일의 포도당 평균은 7.4 g/L임 약 10.5%의 Fab 고 만노스
- 12 g/L의 포도당 첨가 -7일 내지 0일의 포도당 평균은 10.6 g/L임 약 13%의 Fab 고 만노스
- 15 g/L의 포도당 첨가 -7일 내지 0일의 포도당 평균은 12.4 g/L임 약 15%의 Fab 고 만노스
실시예 2는 일일 포도당 첨가의 증가 및 이에 따른 -7일 내지 0일의 포도당 평균 수준의 증가를 통해, 글리칸에서 특히 Man5 및 Man6의 양에서 Fab 고 만노스 당형의 비율을 증가시키고, Man7의 양에서 더 적은 정도로 증가시키는 항체의 고 만노스 당형의 생성에 대한 상이한 포도당 첨가 요법의 효과를 보여준다.
실시예 3
간테네루맙의 약물동태학
임상 연구: 피하 간테네루맙 주사, 연구 1
간테네루맙은 본 발명의 방법에 따라 생성되었다(이하 G4 공정). G4 공정으로부터 생성된 각각의 Fab 당형의 백분율은 도 6a/도 6b에 나타낸 바와 같고, G3 공정으로부터 생성된 Fab 당형과 비교할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, G3 공정은 동일한 항체에서 높은 만노스 함량(예컨대, 8% 초과의 높은 만노스 당형)을 생성하기 위한 이전의 공정이며, 본원에 기재된 공정이 아니다. 따라서, G3 공정으로부터 생성된 고 만노스 당형은 참조 생성물로서 작용한다.
G4 공정 및 G3 공정으로부터 생성된 간테네루맙 당형의 약동학을 임상 연구에서 비교하였다. 상기 연구는 건강한 지원자를 대상으로 한 다기관, 무작위, 개방-표지, 단일-용량, 병렬 군 연구였다.
s.c. 투여 후, G3 및 G4 공정에 의해 생성된 물질에 대해 각각 95.5시간 및 110시간의 중간 시간에 도달된 피크 혈장 농도로 간테네루맙을 천천히 흡수하였다. AUC 0-inf에 의한 혈장 노출은 G3 공정에 의해 생성된 600 mg의 간테네루맙과 비교하여 G4 공정에 의해 생성된 600 mg의 sc 투여 후에 대략 1.18 배 더 높은 반면, Cmax 결과는 유사하였다(G4 공정에 의해 생성된 간테네루맙의 투여 후에 5.1% 더 높음)(또한 도 7을 참조). 약동학적 매개변수는 WinNonIn 버전 6.3(Pharsight, Mountain View, CA, USA)을 사용하여 표준 비구획 분석(NCA) 방법에 따라 유도하였다. 통계분석은 무작위화시 PK 매개변수(대수 배율)를 종속변수로 하고 "치료", "연구기관", "성별" 및 "체중 분류"의 독립적 고정 인자를 갖는 선형 모델로 실시하였다.
도 4a 및 도 4b는 또한 G3 공정의 생성물 및 본 발명에 따라 제조된 당형(즉, G4 공정) 사이의 주요 차이가 간테네루맙의 투여 후 첫 288시간에 발생함을 보여준다. 12.7% Man5-7을 포함하는 G3 공정의 생성물에 비해, 5.2% Man5-7을 포함하는, 본원의 방법에 따라 제조된 G4 공정의 생성물을 사용하여 약 18%의 생체이용률의 증가가 달성될 수 있다(도 7을 참조).
래트, 피하 간테네루맙 주사, 연구 2
12마리의 래트(군당 n=6)는 수컷 위스타 래트의 2개의 병렬 군에 대해 20 mg/kg의 공칭 용량으로 피하(목 영역) 단일 용량으로 G4 공정에 의해 생성된 물질(5.2% 만노스 5-7) 및 G3 공정에 의해 생성된 물질(12.7% Man5-Man7)을 각각 투여받았다. 각 동물로부터 4주에 걸쳐 일련의 혈액 샘플을 수집하였다. 위스타 래트 K3-EDTA 혈장 샘플 중의 간테네루맙의 농도를 코바스(Cobas) e411 기기를 사용하여 인간 Ig/FabCH1/카파 도메인에 특이적인 적격 ECLIA 방법으로 분석하였다. 간략하게, 간테네루맙, 제1 검출 항체 mAbHFab(카파)M-1.7.10-IgG-Bi, 제2 검출 항체 mAbHFabCH1M1.19.31-IgGRu, 및 SA-비드의 시험 샘플을 검출 용기에 단계적으로 첨가하고, 각각의 단계에서 9분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, SA-비드-결합된 복합체는 SA-비드들의 카운트를 반복적으로 넘버링하는 측정 셀에 의해 검출한다. 카운트는 시험 샘플 중 분석물 농도에 비례한다.
약동학적 평가는 비구획 분석으로 실시하였다. G4 공정-생성된 물질에 대한 평균 용량-표준화된 AUC (0-last)는 더 높았고, G3 공정-생성된 물질의 약 228%를 차지하였다(도 7). 또한, Cmax는 고 만노스 고 물질에 비해 고 만노스 저 물질에서 44% 더 높았다. 이들 데이터는 G4 공정-생성된 간테네루맙이 순환에서 더 오래 머무른다는 것, 즉 감소된 제거율을 갖고 G3 공정-생성된 간테네루맙보다 더 우수한 생체이용률을 갖는다는 것을 추가로 입증한다.
래트, 정맥내 간테네루맙 주사, 연구 3
추가로, Man5/Man6 Fab 글리칸을 갖는 총 간테네루맙 및 간테네루맙의 혈장 농도를 간테네루맙을 래트에 정맥내 투여(15 mg/kg)한 후에 결정하였다. 간테네루맙 농도를 ELISA로 분석하였다. 또한, 글리칸 결정을 위해, 간테네루맙은 투여 후 다양한 시간에 면역친화성 정제에 의해 혈장으로부터 추출하였다. 추출된 간테네루맙의 글리칸 조성은 LC-MS 방법으로 결정하였다. 수득한 간테네루맙 Man5/Man6 글리칸(FHMG)의 합계를 이용하는 HMGant = 2 x (FHMG-(FHMG x FHMG)) + (FHMG x FHMG)에 따른 고 만노스 글리칸의 통계적 분포를 가정하여 적어도 하나의 Man5/Man6 글리칸(HMGant)을 함유하는 간테네루맙의 분획을 추정하였다. 적어도 하나의 Man5/Man6 글리칸을 갖는 간테네루맙의 농도는 ELISA로부터의 총 간테네루맙 농도에 HMGant를 곱하여 계산하였다.
도 5에 표시된 결과는 순환으로부터 간테네루맙 Man5/Man6 글리칸의 급속한 손실을 나타내며, 따라서 이들은 투여 후 24시간까지 더 이상 검출되지 않았다.
랫트: 정맥내 간테네루맙 주사, 연구 4
28마리의 랫트(군당 n=13-14)는 G4 공정-생성된 물질(5.4% 만노스 5-7) 및 G3 공정-생성된 물질(12.7% Man5-Man7)을 각각 수컷 위스타 랫트의 2개의 병렬 군에 20 mg/kg의 공칭 용량으로 정맥내 투여하였다. 각 동물로부터 4주에 걸쳐 일련의 혈액 샘플을 수집하였다. 위스타 래트 K3-EDTA 혈장 샘플 중의 간테네루맙의 농도를 코바스(Cobas) e411 기기를 사용하여 인간 Ig/FabCH1/카파 도메인에 특이적인 적격 ECLIA 방법으로 분석하였다. 간략하게, 간테네루맙, 제1 검출 항체 mAbHFab(카파)M-1.7.10-IgG-Bi, 제2 검출 항체 mAbHFabCH1M1.19.31-IgGRu, 및 SA-비드의 시험 샘플을 검출 용기에 단계적으로 첨가하고, 각각의 단계에서 9분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, SA-비드-결합된 복합체는 SA-비드들의 카운트를 반복적으로 넘버링하는 측정 셀에 의해 검출한다. 카운트는 시험 샘플 중 분석물 농도에 비례한다.
약동학적 평가는 비구획 분석으로 실시하였다. G4 공정-생성된 물질에 대한 평균 용량-표준화된 AUC(0-last)는 더 높았고, G3 공정-생성된 물질의 약 136%를 차지하였으며(도 7), G4 공정-생성된 물질에 대한 평균 제거율(15.1 ml/일/kg)은 G3 공정-생성된 물질의 68%를 차지하였다(22.2 ml/일/kg). 평균 겉보기 부피의 분포(Vss)는 G3 공정-생성된 물질 및 G4 공정-생성된 물질에 대해 각각 329 및 255 ml/kg이었다(도 7). 이러한 데이터는 고만노스 저(highmannose low) 간테네루맙이 순환에서 더 오래 머물며 고만노스 고 간테네루맙보다 더 우수한 생체이용률을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 4
랫트: 정맥내 간테네루맙 주사, 연구 5
G1 및 G2 공정에 의해 생성된 물질은 이전 생성 공정(본 공정은 본 발명의 방법과 상이하고 G3 방법과 상이함)에 의해 생성된 간테네루맙을 나타낸다. Man5 + Man6 함량은 G1 공정-생성된 물질에서 8% 미만, 전형적으로 약 3.1%인 반면, G2 공정-생성된 물질에서 8% 초과, 전형적으로 약 10%이다. 글리칸 조성물은 면역침전 후 혈장 샘플로부터 추출된 간테네루맙의 분해 후 LC-MS에 의해 분석하였다.
28마리의 래트에게 G1 또는 G2 공정(군당 n=14)에 의해 생성된 물질을 수컷 위스타 래트의 2개의 병렬 군에 대해 6 mg/kg의 공칭 용량으로 정맥내 투여하였다. 각 동물로부터 4주에 걸쳐 일련의 혈액 샘플을 수집하였다. 위스타 래트 혈장 샘플 중의 간테네루맙의 농도를 ELISA로 분석하였다. 약동학적 평가는 비구획 방식으로 실시하였다.
G2 공정-생성된 물질에 대한 AUC 0-inf는 더 낮았고, G1 공정-생성된 물질의 약 80%를 차지하였다. Cmax는 또한 더 낮았으며(도 7을 참조), 이는 Man5+Man6 함량이 항체에서 더 낮을 때 더 우수한 생체이용률을 입증한다.
Fc/Fab 당화가 간테네루맙 제거율에 미치는 효과
단일 용량 PK 연구를 래트에서 실시하였다. 래트의 병렬 군은 단일 용량의 간테네루맙(G2 공정-생성)를 투여하였다. 샘플을 투약 후 24시간 또는 48시간까지 수집하였다. 간테네루맙은 면역침강법에 의해 혈장으로부터 추출하였고, 글리칸 조성은 추출물의 분해 후 LC-MS에 의해 분석하였다.
도 8b는 투여 후 최대 48시간 후에 측정가능한 간테네루맙의 특정 당형(G2 공정에 의해 생성됨)의 백분율을 나타내며, 이는 Man5 및 Man6 Fab 당형의 매우 빠른 제거율을 입증한다. 이와 반대로, 도 8a에서 볼 수 있는 바와 같이, G2 공정 생성된 물질 내 Fc 당구조는 개별 당형의 제거율에 영향을 미치지 않는다.
다음의 서열들이 본 개시에서 참조된다:
서열번호 1 = 간테네루맙 VH CDR1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
서열번호 2 = 간테네루맙 VH CDR2
Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
서열번호 3 = 간테네루맙 VH CDR3
Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Val
서열번호 4 = 간테네루맙 VL CDR1
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
서열번호 5 = 간테네루맙 VL CDR2
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
서열번호 6 = 간테네루맙 VL CDR3
Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile
서열번호 7 = 간테네루맙 VH 도메인
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
서열번호 8 = 간테네루맙 VL 도메인
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
서열번호 9 = 간테네루맙 중쇄
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
서열번호 10 = 간테네루맙 경쇄
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
서열번호 11 = 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 항체에 대한 중쇄 Fab 단편
Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Ccy Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
서열번호 12 = 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 항체에 대한 경쇄
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
SEQUENCE LISTING <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> FAB HIGH MANNOSE GLYCOFORMS <130> 007976111 <140> PCT/EP2021/080692 <141> 2021-11-04 <150> EP 20207804.4 <151> 2020-11-16 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gantenerumab VH CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gantenerumab VH CDR2 <400> 2 Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gantenerumab VH CDR3 <400> 3 Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Val <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gantenerumab VL CDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gantenerumab VL CDR2 <400> 5 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gantenerumab VL CDR3 <400> 6 Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile 1 5 <210> 7 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gantenerumab VH domain <400> 7 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gantenerumab VL domain <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 9 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gantenerumab Heavy Chain <400> 9 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 10 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gantenerumab Light Chain <400> 10 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 11 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Fab fragment for antibody binding to human transferrin receptor <400> 11 Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr 1 5 10 15 Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser 50 55 60 Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr 85 90 95 Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro 115 120 125 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Val Val Cys Cys Tyr Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 145 150 155 160 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 165 170 175 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 195 200 205 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 210 215 220 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 12 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain for antibody binding to human transferrin receptor <400> 12 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn 85 90 95 Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215

Claims (20)

  1. 당화된 단일클론 항체를 포함하는 조성물로서,
    상기 항체는 항-인간 A-베타 항체, 항-인간 A-베타 항체를 포함하는 이중-특이적 항체, 또는 당화된 Fab 영역을 포함하고 A-베타를 결합할 수 있는 항-인간 A-베타 항체의 단편이고, 상기 항체는 이의 Fab 영역에서 N-당화를 갖고, 이때 조성물 내의 당화된 Fab의 총량에 대해, 조성물 내의 약 20% 이하의 Fab 영역은 N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체의 재조합 생성 동안 또는 이후에 수득가능한 약학적 조성물 또는 세포 배양 상청액인, 조성물.
  3. 당화된 단일클론 항체가 투여된 동물의 순환으로부터 상기 항체가 제거되는 속도를 감소시키는 방법으로서,
    상기 항체는 항-인간 A-베타 항체, 항-인간 A-베타 항체를 포함하는 이중-특이적 항체, 또는 당화된 Fab 영역을 포함하고 A-베타를 결합할 수 있는 항-인간 A-베타 항체의 단편이고, 상기 방법은 상기 항체를 포함하는 조성물 중 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형(glycoform)의 상대적인 함량을 조절하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 항체를 포함하는 조성물 중 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적인 함량을 조절하는 단계는, 상기 단일클론 항체를 발현하는 진핵 세포의 내부에서 발효에 의해 당화된 단일클론 항체의 생성에 사용되는 배양 배지 중에서, 상기 발효의 생성기(production phase)의 전부 또는 일부 동안 포도당의 평균 농도를 유지하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 조성물 중 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 상대적인 함량을 조절하는 방법으로서,
    상기 항체는 항-인간 A-베타 항체, 항-인간 A-베타 항체를 포함하는 이중-특이적 항체, 또는 당화된 Fab 영역을 포함하고 A-베타를 결합할 수 있는 항-인간 A-베타 항체의 단편이고, 상기 방법은, 발효의 생성기 동안, 단일클론 항체를 발현하는 진핵 세포의 내부에서 발효에 의해 당화된 단일클론 항체의 생성에 사용되는 배양 배지 중 진핵 세포를 위한 탄수화물 공급원의 농도를 최적화하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 생성기의 전부 또는 일부 동안 배양 배지 중 포도당의 평균 농도를 유지하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 항체를 배양 배지로부터 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고 만노스 Fab 당형은 단일 클론 항체의 총 Fab 당형의 약 20% 이하를 구성하는, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 따른 조성물 또는 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법으로서,
    N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는 Fab 영역의 백분율은 약 0 내지 20%, 약 0 내지 15%, 약 0 내지 12% 또는 약 0 내지 10%이고, 임의적으로, N-연결된 고 만노스 글리칸을 갖는 Fab 영역의 백분율은 약 2 내지 20%, 약 2 내지 15%, 약 2 내지 12%, 약 2 내지 10%, 약 4 내지 10%, 약 4 내지 12%, 약 4 내지 15% 또는 약 4 내지 20%인, 조성물 또는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 고 만노스 글리칸은 Man5, Man6 및 Man7 당형 중 하나 또는 이들의 혼합물이고, 임의적으로 상기 고 만노스 글리칸 내의 만노스 잔기는 Man5, Man6 및 Man7인, 조성물 또는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일클론 항체는 간테네루맙이고,
    (a) 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 VH 및 VL CDR 아미노산 서열, 서열번호 7 및 서열번호 8의 VH 및 VL 도메인 아미노산 서열, 또는 서열번호 9 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄;
    (b) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3;
    (c) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (d) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고;
    상기 조성물은 조성물 중 VH 당화된 항체의 총량에 대해 상기 항체의 약 20% 이하의 고 만노스 당형을 포함하고, 이때 상기 당화는 서열번호 9의 Asn52에서 N-당화인,
    조성물 또는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 단일클론 항체가 이중-특이적 항체일 때, 결합 특이성 중 하나는 인간 A-베타에 대한 것이고, 다른 특이성은 트랜스페린 수용체에 대한 것인, 조성물 또는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 단일클론 항체는
    - 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄;
    - 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄;
    - 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 Fab 단편; 및
    - 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄
    를 포함하는 이중-특이적 항체인, 조성물 또는 방법.
  14. 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일클론 항체의 재조합 생성에서 생성기에 걸쳐 배양 배지 중 평균 포도당 농도는 약 0.5 g/L 내지 약 18 g/L인, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    포도당의 농도는 생성기의 -7일 내지 0일에 걸쳐 평균화되는, 방법.
  16. 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    포도당의 농도는 생성기의 전부 또는 일부에 걸쳐, 임의적으로 생성기의 -7일 내지 0일에 걸쳐 이의 평균 농도를 달성하기 위해 배양 배지에서 모니터링 및 조절되는, 방법.
  17. 제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 원하는 상대 함량은 약 3%이고, 약 -7일 내지 0일의 배양 배지 중 포도당의 평균 농도는 약 0 g/L 내지 약 3 g/L이거나;
    (b) 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 원하는 상대 함량은 약 7%이고, 약 -7일 내지 0일의 배양 배지 중 포도당의 평균 농도는 약 3 g/L 내지 약 6 g/L이거나;
    (c) 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 원하는 상대 함량은 약 10.5%이고, 약 -7일 내지 0일의 배양 배지 중 포도당의 평균 농도는 약 6 g/L 내지 약 9 g/L이거나;
    (d) 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 원하는 상대 함량은 약 13%이고, 약 -7일 내지 0일의 배양 배지 중 포도당의 평균 농도는 약 9 g/L 내지 약 11 g/L이거나;
    (e) 발효로부터 생성된 당화된 단일클론 항체의 고 만노스 Fab 당형의 원하는 상대 함량은 약 15%이고, 약 -7일 내지 0일의 배양 배지 중 포도당의 평균 농도는 약 11 g/L 내지 약 14 g/L인, 방법.
  18. 제3항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 단일클론 항체 조성물.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    질병이 의심되거나 질병을 앓고 있는 개체에서 질병의 진단 또는 치료에 사용하기 위한 조성물로서,
    임의적으로 상기 질병은 치매, 알츠하이머병, 운동 신경병증, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 스크래피, HIV-관련 치매, 크로이츠펠트-야콥병(CJD), 유전성 뇌 출혈, 다운 증후군 및 노화와 관련된 신경 장애; 및 전이성 직장암, 전이성 비-소세포 폐암, 난소암 및 두경부암과 같은 암인, 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물 중 당화된 Fab의 총량에 대한 Fab 영역 중 N-연결된 고 만노스 글리칸의 상대적인 양은 2-아미노벤즈아미드 표지된 글리칸의 후속 형광 검출과 함께 친수성-상호작용 크로마토그래피-초고성능 액체 크로마토그래피(HILIC-UHPLC)에 의해 분석되는, 조성물 또는 방법.
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