JP6971221B2 - 組換えタンパク質のガラクトース含有量を増加させる方法 - Google Patents

Description

本発明は、哺乳動物細胞にて生産される組換えタンパク質のガラクトース含有量を増加させる方法であって、その細胞の培養中に、細胞培養物のｐＨを変化させ、ヌクレオシド、遷移金属塩および／または糖を含んでなる組成物を供給する、方法に関する。

過去２０年において、炎症性疾患およびがんなどの様々な疾患を処置するための治療用抗体の使用がますます重要になってきており、最初のバイオシミラー抗体産物は既に市販されている。

哺乳動物血清に由来する天然に存在する抗体はそれらの定常領域でグリコシル化され、このグリコシル化は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などの抗体のエフェクター機能にとって重要である。また、真核細胞において産生される組換えモノクローナル抗体は、特定のグリコシル化パターンを示す。バイオシミラー治療用抗体の開発において、バイオシミラー抗体がグリコシル化の点において先発医薬品（ｏｒｉｇｉｎａｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔ）に匹敵することも配慮されなければならない。

いくつかの研究では、組換え抗体のガラクトース含有量が、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて測定される抗体の生物活性に影響を及ぼすことが明らかとなっている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。糖タンパク質の活性および有効性に対するガラクトシル化の役割を鑑みると、糖タンパク質組成物中のガラクトシル化レベルをモニタリングおよび制御することは重要である。

先行技術は、糖タンパク質組成物のガラクトシル化プロファイルを調節する種々の方法を開示している。
非特許文献４は、抗体ガラクトシル化が、抗体を産生する細胞にウリジン、塩化マンガンおよびガラクトースを供給することによって調節され得ることを開示している。同様に、特許文献１は、マンガンおよび／またはガラクトース含有細胞培養補充物を使用してガラクトシル化を制御する方法を提供している。

さらに、特許文献２は、ｐＣＯ_２制御によってガラクトシル化を制御する方法を記載している。
非特許文献５においては、ｐＨおよび溶存酸素張力を包含する単一のおよび組み合わせた化学的および機械的ストレスパラメーターのグリコシル化に対する効果が調査されている。

特許文献３は、細胞培養プロセス中に温度を低下させ、ｐＣＯ_２レベルを特定の範囲に維持することによって、組換えタンパク質のガラクトース含有量を増加させる方法を開示している。

非特許文献６は、組換えタンパク質のガラクトシル化に対する細胞培養培地中のアスパラギンおよびアンモニウム濃度の影響について報告している。

国際公開第２０１２／１４９１９７号 欧州特許出願公開第２５１１２９３号明細書 国際公開第２０１４／１７０８６６号

ガザーノ−サントロら（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．）」、１９９７年、第２０２巻、ｐ．１６３ ボイドら（Ｂｏｙｄ ｅｔ ａｌ．）、「モレキュラー・イミュノロジー（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、１９９５年、第３２巻、ｐ．１３１１−１３１８ ジェフェリス（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ）、「ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）」、２００９年、第８巻、ｐ．２２６−２３４ グラマーら（Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．）、「バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．）」、２０１１年、第１０８巻、第７号、ｐ．１５９１−１６０２ イヴァルソンら（Ｉｖａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」、２０１４年、第１８８巻、ｐ．８８−９６ マクラケンら（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．）、「バイオテクノロジー・プログレス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．）」、２０１４年、第３０巻、第３号、ｐ．５４７−５５３

しかしながら、特に、バイオシミラーのガラクトースレベルが基準産物のガラクトースレベルに匹敵することが必要なバイオシミラー産物の開発において、タンパク質ガラクトシル化の正確な制御を可能にする細胞培養プロセスが依然として必要とされている。

本発明者らは、ｐＨ降下と哺乳動物細胞へのウリジン、塩化マンガンおよびガラクトースの供給との組み合わせが、ｐＨを下げることなく、ウリジン、塩化マンガンおよびガラクトースを供給した場合よりも組換え産生抗体のガラクトシル化を大幅に増加させることを見出した。

したがって、本発明は、哺乳動物細胞にて生産される組換えタンパク質のガラクトース含有量を増加させる方法であって、
ａ）組換えタンパク質をコードする１つ以上の組換え核酸分子で形質転換された哺乳動物細胞を細胞培養培地中、第１のｐＨで第１の期間、培養する工程と；
ｂ）この哺乳動物細胞をこの細胞培養培地中、第１のｐＨとは異なる第２のｐＨで第２の期間、培養する工程と；
ｃ）下記の成分：
（ｉ）１つまたは複数のヌクレオシド；
（ｉｉ）１つまたは複数の遷移金属塩；および
（ｉｉｉ）１つまたは複数の糖
の２つ以上を含んでなる組成物を（ｂ）の培養物に対して供給する工程と
を備える、方法に関する。

別の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞にて組換えタンパク質を生産するための方法であって、
ａ）組換えタンパク質をコードする１つ以上の組換え核酸分子で形質転換された哺乳動物細胞を細胞培養培地中、第１のｐＨで第１の期間、培養する工程と；
ｂ）この哺乳動物細胞をこの細胞培養培地中、第１のｐＨとは異なる第２のｐＨで第２の期間、培養する工程と；
ｃ）下記の成分：
（ｉ）１つまたは複数のヌクレオシド；
（ｉｉ）１つまたは複数の遷移金属塩；および
（ｉｉｉ）１つまたは複数の糖
の２つ以上を含んでなる組成物を（ｂ）の培養物に対して供給する工程と；
ｄ）組換えタンパク質を含んでなる細胞培養液を回収する工程と；
ｅ）組換えタンパク質を得る工程と
を備える、方法に関する。

好適には、組換えタンパク質は大規模で生産される。
また好適には、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
好適な実施形態において、組換えタンパク質はＦｃ含有タンパク質である。

好適には、第２のｐＨは第１のｐＨよりも低く、より好適には、第２のｐＨは、第１のｐＨよりも０．０５〜０．３ｐＨ単位低い。
好適には、ヌクレオシドはウリジンであり、より好適には、組成物内のウリジンの濃度は１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）である。

好適には、遷移金属塩は塩化マンガン（ＩＩ）であり、より好適には、組成物内の塩化マンガン（ＩＩ）の濃度は０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌである。
好適には、糖はガラクトースであり、より好適には、組成物内のガラクトースの濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。

さらに別の実施形態において、本発明は、チャイニーズハムスター卵巣細胞においてリツキシマブのバイオシミラー抗体を生産するための方法であって、
ａ）抗体の軽鎖および重鎖をコードする１つまたは複数の組換え核酸分子で形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞を細胞培養培地中、ｐＨ７．１５で第１の期間、培養する工程と；
ｂ）このチャイニーズハムスター卵巣細胞を細胞培養培地中、ｐＨ７．００で第２の期間、培養する工程と；
ｃ）下記の成分：
（ｉ）１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌのウリジン；
（ｉｉ）０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マンガン（ＩＩ）；および
（ｉｉｉ）５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌのガラクトース
を含んでなる組成物を（ｂ）の培養物に対して供給する工程と；
ｄ）リツキシマブを含んでなる細胞培養液を回収する工程と；
ｅ）リツキシマブを得る工程と
を備える方法に関する。

さらに別の実施形態において、本発明は、チャイニーズハムスター卵巣細胞によって生産される治療用抗体のその基準抗体に対するバイオシミラリティーを改善するための方法であって、
ａ）治療用抗体の軽鎖および重鎖をコードする１つまたは複数の組換え核酸分子で形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞を細胞培養培地中、ｐＨ７．１５で第１の期間、培養する工程と；
ｂ）このチャイニーズハムスター卵巣細胞をこの細胞培養培地中、ｐＨ７．００で第２の期間、培養する工程と；
ｃ）下記の成分：
（ｉ）ウリジン；
（ｉｉ）塩化マンガン（ＩＩ）；および
（ｉｉｉ）ガラクトース
を含んでなる組成物を（ｂ）の培養物に対して供給する工程と
を備える、方法に関する。

好適な実施形態において、生細胞密度が４．５〜６．０×１０^６細胞／ｍｌになるまで、細胞は第１のｐＨで培養される。
別の好適な実施形態において、細胞は、第２のｐＨで６〜７日間培養される。

好適には、温度は、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の間、一定に保持される。
また好適には、組成物は、Ｌ−バリン、Ｌ−システイン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−セリンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸をさらに含有する。

好適には、工程（ｃ）の供給は、２回以上実施される。
また好適には、工程（ｃ）の供給は、成分（ｉ）および（ｉｉｉ）が添加されていない組成物の供給工程によって開始される。

好適には、工程（ａ）および（ｂ）における培養培地は、ウリジンおよびガラクトースを含有しない。
また好適には、工程（ｃ）の組成物は、チミジン、フルクトース、マンノース、スクロースおよびＮ−アセチルマンノサミンの１つまたは複数を含有しない。

好適には、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）における培養物のオスモル濃度は、４００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも低い。

本発明は特定の実施形態に関して記載されるが、この記載は限定的な意味で解釈されるものではない。
本発明の例示的な実施形態を詳細に記載する前に、本発明の理解にとって重要な定義を示す。この明細書および添付した特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、文脈が明確に他を指示しない限り、それぞれの複数も包含する。本発明の文脈において、「約」および「およそ」という用語は、該当する特徴の技術的効果を依然として保証すると当業者が理解する精度の区間を示す。この用語は、典型的には、±２０％、好適には±１５％、より好適には±１０％、さらにより好適には±５％の示した数値からの偏差を示す。「含む」という用語は、限定的ではないことを理解されたい。本発明の目的において、「からなる」という用語は、「含む」という用語の好適な実施形態であると考えられる。これ以降において、群が特定の数以上の実施形態を含むと定義される場合、これはまた、好適にはこれらの実施形態のみからなる群も包含することを意味する。さらに、本明細書中および特許請求の範囲中の「第１の」、「第２の」、「第３の」、または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」などの用語は、類似要素を識別するために使用され、必ずしも連続的または時系列的な順序を記載するためではない。そのように使用される用語は適切な状況下では交換可能であり、本明細書に記載された本発明の実施形態は、本明細書に記載または説明されている以外の順序で操作可能であることを理解されたい。「第１の」、「第２の」、「第３の」、または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」、「ｉ」、「ｉｉ」などの用語が方法または使用またはアッセイの複数の工程に関する場合、それらの工程間の時間または時間的間隔の一貫性はなく、すなわち、それらの工程は同時に行なわれ得るか、または、本明細書の上記または下記に述べられた本願において特段の指示がない限り、このような工程間に秒、分、時間、日、週、月または年の時間間隔があり得る。

本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコル、試薬などが変化し得るので、それらに限定されないことを理解されたい。また本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、添付した特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。

上記で論じたように、本発明は、細胞培養物ｐＨの変化、好適には降下と、ヌクレオシド、遷移金属塩および糖を含んでなる、好適にはウリジン、塩化マンガン（ＩＩ）およびガラクトースを含んでなる組成物を細胞培養物に対して供給することとが、組換えタンパク質、好適には組換え抗体のガラクトース含有量を増加させるという知見に基づいている。

「ガラクトース含有量の増加」という用語は、細胞培養物のｐＨを変化させ、好適には降下させる場合であって、ヌクレオシド、遷移金属塩および糖を含んでなる組成物、好適にはウリジン、塩化マンガンおよびガラクトースを含んでなる組成物がその細胞培養物に対して供給された場合に、組換えタンパク質中のガラクトシル化アイソフォームＧ１Ｆ、Ｇ１’ＦおよびＧ２Ｆの１つまたは全部のパーセンテージが、一定ｐＨで維持され上記で定義した組成物が供給されていない細胞培養物によって生産される同じ組換えタンパク質中のこれらのアイソフォームのパーセンテージに比べて、より高いことを意味することを意図する。Ｇ１Ｆ、Ｇ１’ＦおよびＧ２Ｆのパーセンテージにおけるこの増加は、Ｇ０およびＧ０Ｆなどの非ガラクトシル化グリコフォームの減少を伴う。

Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ１’ＦおよびＧ２Ｆのグリコフォームは以下の構造を有する。

上記の式中、ＧｎはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｆｕｃはフコースであり、Ｍはマンノースであり、Ｇａｌはガラクトースである。これらのグリカン構造は、ＩｇＧ１組換え抗体の場合にＦｃ領域のＣγ２ドメインのアスパラギン３０１に位置され得るＮ−グリコシル化部位に対して連結される。

本発明の方法によって生産される組換えタンパク質中のＧ１Ｆ、Ｇ１’ＦおよびＧ２Ｆアイソフォームのパーセンテージの合計が、一定ｐＨで維持され上記で定義した組成物が供給されていない細胞培養物によって生産される同じ組換えタンパク質中のＧ１Ｆ、Ｇ１’ＦおよびＧ２Ｆアイソフォームのパーセンテージの合計と比べて、１％、２％または３％以上、好適には４％、５％、６％または７％以上、より好適には８％、９％または１０％以上、最適には１１％または１２％以上増加される場合、ガラクトース含有量は増加される。

また、本発明の方法によって生産される組換えタンパク質中のＧ０Ｆアイソフォームのパーセンテージが、一定ｐＨで維持され、上記で定義した組成物が供給されていない細胞培養物によって生産される同じ組換えタンパク質中のＧ０Ｆアイソフォームのパーセンテージと比べて、１％、２％または３％以上、好適には４％、５％または６％以上、より好適には７％、８％または９％以上、最適には１０％以上減少される場合、ガラクトース含有量は増加される。

ガラクトース含有量は、細胞培養培地への細胞の接種の８〜１４日後に決定される。好適な実施形態において、ガラクトース含有量は、細胞培養培地への細胞の接種の９〜１０日後に決定される。

組換えタンパク質の異なるグリカンアイソフォーム、特にガラクトシル化アイソフォームＧ１Ｆ、Ｇ１’ＦおよびＧ２Ｆの相対比、ならびにその結果のガラクトース含有量は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定され得る。好適には、組換えタンパク質が脱グリコシル化され、蛍光誘導体化剤で処置された後に、レーザー誘起蛍光法（ＣＥ−ＬＩＦ）検出を使用するキャピラリー電気泳動が使用される。それぞれのグリカンアイソフォームの相対含有量は蛍光検出によって決定され、対応するピークの面積％値を使用して計算される。例示的な方法は、以下の本明細書の実施例の項に記載されている。

「細胞培養培地への細胞の接種」という用語は、細胞の成長および増殖に適した条件下で細胞を細胞培養培地と接触させる工程を指す。
「組換えタンパク質」という用語は、哺乳動物の宿主細胞に導入された組換え核酸分子に遺伝子が担持されている、組換えタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳の結果として哺乳動物細胞培養物によって生産され得る、任意のタンパク質を指す。その組換えタンパク質は、使用される哺乳動物細胞中に天然には産生される可能性がないか、または、その組換えタンパク質は、使用される哺乳動物細胞中に天然に産生されるが、より低レベルであり得る。好適には、その組換えタンパク質は、哺乳動物宿主細胞によって天然には産生されない。

特に、「組換えタンパク質」という用語は、治療用タンパク質、例えば、サイトカイン、成長因子、凝固因子、およびガラクトース含有量がタンパク質の生物学的機能に影響を及ぼす抗体などを包含する。好適には、組換えタンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質、例えば、抗体またはＩｇＧ抗体のＦｃ部分と別のタンパク質の一部または全部との融合タンパク質などである。

ＩｇＧ抗体のＦｃ部分と別のタンパク質の一部または全部との融合タンパク質の例としては、エタネルセプト（ＴＮＦ受容体との融合）、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ受容体１および２の細胞外ドメインとの融合）、アバタセプト（ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインとの融合）ならびにベラタセプト（ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインとの融合）が挙げられる。

より好適には、組換えタンパク質は組換え抗体である。「組換え抗体」という用語は、哺乳動物の宿主細胞に導入された組換え核酸分子に遺伝子が担持されている、組換え抗体をコードする遺伝子の転写および翻訳の結果として哺乳動物細胞培養によって産生され得る任意の抗体を指す。その組換え抗体は、使用される哺乳動物細胞中に天然には産生される可能性がないか、またはその組換え抗体は、使用される哺乳動物細胞中に天然に産生されるが、より低いレベルであり得る。好適には、その組換え抗体は、その生産に使用される哺乳動物宿主細胞によって天然には産生されない。

「免疫グロブリン」および「抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。本免疫グロブリンは、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）または所望の抗原結合活性を示すそのフラグメントであり得る。天然に存在する抗体は、種々の構造を有する分子である。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって連結されている２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成されている、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）、続いて３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および任意選択でＣＨ４）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのうちの１つに割り当てられ得る。

「抗体フラグメント」は、完全長抗体の一部分、一般に、その抗原結合領域または可変領域を含んでなる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；単鎖抗体分子；ダイアボディ；直鎖抗体；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。

好適には、本免疫グロブリンはモノクローナル抗体である。本明細書で使用される場合の「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質の抗体の群から得られる抗体を指し、すなわち、その群を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異を除いて同一である。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に包含する従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に対し向けられる。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な群から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。

本免疫グロブリンは、マウスのクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥ、ヒトのクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＤもしくはＩｇＥ、またはそれらの組み合わせもしくはフラグメントであり得る。

本免疫グロブリンは、限定するものではないが、以下の抗原を包含するタンパク質の任意の１つまたは組み合わせを認識することができる：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−β、およびそれらの類似体、ＰＬＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−ｐ１、ＥＧＦ受容体、ＰＬＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、血小板受容体ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、トロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｅｉｔｉｎ）受容体、アポトーシス受容体ＰＤ−１、肝細胞成長因子、破骨細胞分化抑制因子リガンド、インターフェロンガンマ、Ｂリンパ球刺激因子ＢＬｙＳ、Ｔ細胞活性化レギュレーターＣＴＬＡ−４、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ−２、患者の血清中に高レベルで存在する腫瘍関連エピトープ、がん関連エピトープまたはタンパク質（乳がん、結腸がん、扁平上皮細胞がん、前立腺がん、膵がん、肺がんおよび／もしくは腎臓がん細胞、ならびに／またはメラノーマ、神経膠腫もしくは神経芽腫細胞で発現される）、腫瘍の壊死核、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、α４β１およびα４β７インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリンアドヘシン（ｌｅｕｋｏｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｄｈｅｓｉｎ）、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心筋ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、スクレロスチン、ＭＨＣ Ｉ、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｆｃ−ｙ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、およびＩＦＮ−γ。

本免疫グロブリンは、例えば、アフェリモマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アルシツモマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、デノスマブ、トラスツズマブ、イムシロマブ（ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、カプロマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ、オマリズマブ、ダクリズマブ、イブリツモマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、エドレコロマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、ロモソズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、クレノリキシマブ、ケリキシマブ、ガリキシマブ、フォラビルマブ（ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、レキサツムマブ、ベバシズマブおよびベドリズマブであり得る。

本発明の免疫グロブリンは、好適には、ＩｇＧ分子、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子などである。より好適には、本免疫グロブリンはＩｇＧ１である。さらにより好適には、本免疫グロブリンは、少なくともＦｃ部分がヒトであるＩｇＧ１である。本免疫グロブリンは、ＩｇＧ１のＦｃ部分がヒトであり、可変領域がマウス起源であるマウス−ヒトキメラＩｇＧ１であり得る。最適には、キメラ免疫グロブリンは、リツキシマブまたはインフリキシマブである。

リツキシマブは、例えば国際公開第９４／１１０２６号に詳細に記載されているキメラ抗ＣＤ２０抗体である。
インフリキシマブは、例えば国際公開第９２／１６５５３号に詳細に記載されているキメラ抗ＴＮＦα抗体である。

本免疫グロブリンは、可変ドメインのＣＤＲがマウス由来であり、可変ドメインのフレームワーク領域がヒト由来である、マウス前駆体のヒト化ＩｇＧ１形態であり得る。最適には、そのヒト化抗体は、トラスツズマブまたはベバシズマブである。

トラスツズマブは、例えば国際公開第９２／２２６５３号に詳細に記載されているヒト化抗ＨＥＲ２抗体である。
ベバシズマブは、例えば国際公開第９８／４５３３１号に詳細に記載されているヒト化抗ＶＥＧＦ抗体である。

本免疫グロブリンは、完全ヒトＩｇＧ１抗体、すなわち、全部分がヒト起源に由来する抗体であり得る。最適には、そのヒト抗体は、アダリムマブまたはデノスマブである。
アダリムマブは、例えば国際公開第９７／２９１３１号に詳細に記載されているヒト抗ＴＮＦα抗体である。

デノスマブは、例えば国際公開第０３／００２７１３号に詳細に記載されているヒト抗ＲＡＮＫＬ抗体である。
一実施形態において、その抗体はリツキシマブまたはベバシズマブであり得る。

本明細書のモノクローナル抗体は、詳細には、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、一方、鎖の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列、ならびに所望の生物活性を示す限りこのような抗体のフラグメント中の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を包含する。

さらに、本明細書のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体も包含する。このような抗体は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」によって得られ、動物免疫グロブリン由来の最小限の配列のみを含有する。その分子の大部分は、ヒトアミノ酸配列から構成される。ヒトレシピエント抗体の超可変領域由来の残基は、所望の結合特性を有する非ヒトドナー抗体の超可変領域由来の残基により置き換えられる。

最後に、本明細書のモノクローナル抗体はまた、最初にヒト抗体ライブラリーのスクリーニングによって得られ得る完全ヒト抗体も包含する。
本発明の方法において、組換えタンパク質は哺乳動物細胞において生産される。本発明の組換え抗体の発現に適した哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用されるｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞、サル腎臓ＣＶ１、ヒト胚腎臓株２９３；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３ Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞およびＦＳ４細胞を包含する。好適には、宿主細胞はげっ歯類に由来する。より好適には、その哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、さらにより好適には、その細胞はＣＨＯ−Ｋ１細胞であり、最適には、その細胞は、無血清培地中での成長に適したＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＣＨＯ−Ｓ）であり、かつ／またはインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手することができる（カタログ番号Ｒ−８００−０７）。

その哺乳動物細胞は、哺乳動物宿主細胞における組換えタンパク質の安定した生産を可能にする発現ベクターなどの１つ以上の組換え核酸分子で形質転換された、すなわち、遺伝的に改変された。

組換え抗体の生産において、哺乳動物細胞は、抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする１つの組換え核酸分子で形質転換され得るか、１つが抗体の軽鎖をコードし、他の１つが抗体の重鎖をコードする２つの組換え核酸分子で形質転換され得る。一実施形態において、組換え抗体は、抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする１つの組換え核酸分子から生産される。より好適な実施形態において、組換え抗体は１つの組換え核酸分子から生産され、重鎖および軽鎖の発現は、同じであっても異なっていてもよい個別のプロモーターによって制御される。最適な実施形態において、組換え抗体は１つの組換え核酸分子から生産され、重鎖および軽鎖の発現は同じ個別のプロモーターによって制御される。

「培地」、「細胞培養培地」および「培養培地」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、哺乳動物細胞を成長させるために必要な栄養源を含有する溶液を指す。典型的には、細胞培養培地は、最小限の成長および／または生存のために細胞により必要とされる必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質および微量元素を提供する。好適には、培地は、そのすべての成分およびそれらの濃度が既知であるという点において化学的に定義されている。また好適には、培地は血清および加水分解物を含まず、動物由来のいかなる成分も含有しない。より好適な実施形態において、培地は血清および加水分解物を含まず、ＨＥＰＥＳおよびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８を含有する以外、動物由来のいかなる成分も含有しない。特に好適な実施形態において、本発明の方法の工程（ａ）および（ｂ）、すなわち供給前の工程において使用される培地は、組換えインスリン、脂質、クエン酸第二鉄およびＰＥＧ２００００が補充されたＰｏｗｅｒＣＨＯ−２ ＣＤ（カタログ番号ＢＥ１２−７７１Ｑでロンザ社（Ｌｏｎｚａ）から購入可能）である。最適な実施形態において、ＰｏｗｅｒＣＨＯ−２ ＣＤ培地は、組換えインスリン、脂質、クエン酸第二鉄およびＰＥＧ２００００、ならびに過剰量のＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−グルタミンが補充される。過剰量のＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−グルタミンは、８ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１．２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−チロシンおよび２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−フェニルアラニンを含んでなる。

好適には、追加量のウリジン、塩化マンガンおよびガラクトースは細胞培養培地に添加されないが、１つまたは複数のこれらの成分は基本細胞培養培地中に存在し得る。それにもかかわらず、細胞培養培地は、使用される既知組成の培地中にそれらが存在する場合、これらの化合物のいずれかまたは全部を含有し得る。より好適には、細胞培養培地はガラクトースを含まない。

細胞培養培地は、好適には、滅菌濾過、より好適には０．１ミクロンの孔径を有するフィルタを使用する滅菌濾過に供される。
「第１のｐＨ」とも呼ばれる、本発明の方法の工程ａ）における細胞培養培地のｐＨは、好適にはＮａ_２ＣＯ_３またはＨ_３ＰＯ_４を添加することによって、第１の期間の間、ｐＨ７．１５〜７．２５の間の範囲に維持される。第１の期間は、細胞培養培地への哺乳動物細胞の接種後、６０〜８０時間、好適には６３〜７９時間、より好適には６６〜７８時間、最適には７０時間である。

第１の期間の後、細胞培養培地のｐＨは第２のｐＨに変化し、好適には低下する。より好適には、第２のｐＨは、第１のｐＨよりも０．０５〜０．３ｐＨ単位低く、さらにより好適には、第２のｐＨは、第１のｐＨよりも０．１５〜０．２５ｐＨ単位低い。最適には、第２のｐＨはｐＨ７．００である。ｐＨは、適切な酸またはＣＯ_２ガスを添加することによって、好適にはＨ_３ＰＯ_４を添加することによって低下し得る。ｐＨは、４．０〜７．０×１０^６の生細胞密度に達したときに変化する。細胞が第２のｐＨで培養される第２の期間は、約６〜１１日、または約６〜８日、好適には約７日である。したがって、本発明の方法における全培養期間は、細胞培養培地への哺乳動物細胞の接種後８〜１４日である。好適には、本発明の方法における全培養期間は、細胞培養培地への哺乳動物細胞の接種後９〜１０日である。

本発明の方法において、細胞には、工程（ｃ）において、２つ以上の以下の成分：（ｉ）１つまたは複数のヌクレオシド、（ｉｉ）１つまたは複数の遷移金属塩、および（ｉｉｉ）１つまたは複数の糖（これ以降、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）とも呼ばれる）を含んでなる組成物が供給され、特にウリジン、塩化マンガンおよびガラクトースを含んでなる組成物が供給される。

「供給」という用語は、組成物が工程（ａ）または（ｂ）の細胞培養物に対して添加され、培地または細胞は供給中に取り出されないことを意味する。供給は、典型的には、連続的に起こるのではなく、定義された時点で起こる。本発明の方法において、組成物は、以下でさらに詳述されるように、定義された時点で供給される。

供給される組成物は、例えば水または適切な緩衝液中に、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）のみを含んでなり得るか、または成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）をさらに含有する細胞培養培地をベースとし得る。好適には、方法の工程（ｃ）において供給される組成物は、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）をさらに含有する細胞培養培地をベースとする。この細胞培養培地は、細胞の初期培養において、すなわち、接種後および供給前（工程（ａ）および（ｂ））に使用される細胞培養培地と同じであっても異なっていてもよい。好適には、供給に使用される細胞培養培地は、細胞の初期培養（すなわち、工程（ａ）および（ｂ））において使用されるものとは異なる。より好適には、供給に使用される細胞培養培地は、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）製のＥｘＣｅｌｌ（登録商標）である。別の好適な実施形態において、供給に使用される細胞培養培地は、シグマアルドリッチ社製のカスタマイズされた無塩（ＳＦ）ＥｘＣｅｌｌ（登録商標）である。

成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）に加えて、供給に使用される細胞培養培地はまた、基本細胞培養培地に加えてアミノ酸および他の補充物などの他の成分も含有し得る。好適には、供給に使用される細胞培養培地は、１つまたは複数のＬ−バリン、Ｌ−システイン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリンおよびＢＤ Ｒｅｃｈａｒｇｅなどの既知組成の補充物をさらに含有する。より好適には、供給に使用される細胞培養培地は、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）に加えて、Ｌ−バリン、Ｌ−システイン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリンおよび既知組成の補充物を含んでなる。最適には、供給に使用される細胞培養培地は、ＥｘＣｅｌｌ（登録商標）またはカスタマイズされた無塩ＳＦ ＥｘＣｅｌｌ（登録商標）であり、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）に加えて、Ｌ−バリン、Ｌ−システイン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリンおよび既知組成の補充物を含んでなる。供給に使用される細胞培養培地中のＬ−バリンの濃度は３４ｍｍｏｌ／Ｌであり、供給に使用される細胞培養培地中のＬ−システインの濃度は８．３ｍｍｏｌ／Ｌであり、供給に使用される細胞培養培地中のＬ−フェニルアラニンの濃度は４．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、供給に使用される細胞培養培地中のＬ−セリンの濃度は３８ｍｍｏｌ／Ｌである。

供給に使用される細胞培養培地は、好適には滅菌濾過、より好適には０．２または０．１ミクロンの孔径を有するフィルタを使用する滅菌濾過に供される。
別の実施形態において、供給に使用される組成物は、チミジン、フルクトース、マンノース、スクロースおよびＮ−アセチルマンノサミンを含有しない。

供給に使用される組成物は、１つまたは複数のヌクレオシドを含んでなる。ヌクレオシドは、窒素塩基と、リボースおよびデオキシリボース（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）などの５個の炭素原子を含んでなる糖とから構成される。ヌクレオシドの例は、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシンを包含する。好適には、ヌクレオシドはウリジンである。

供給に使用される組成物内の１つまたは複数のヌクレオシドの濃度は１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、好適には１．５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好適には２〜１２ｍｍｏｌ／Ｌ、さらにより好適には２．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、最適には３ｍｍｏｌ／Ｌである。供給に使用される組成物内のウリジンの濃度は１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、好適には１．５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好適には２〜１２ｍｍｏｌ／Ｌ、さらにより好適には２．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、最適には３ｍｍｏｌ／Ｌである。

供給に使用される組成物は、１つまたは複数の遷移金属塩をさらに含んでなる。遷移金属塩は、遷移金属と対イオンとの塩である。遷移金属は、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎを包含し、適切な対イオンは、塩化物（Ｃｌ⁻）、硫酸塩（ＳＯ_４ ^２−）およびリン酸塩（ＰＯ_４ ^３−）を包含する。好適には、遷移金属塩はマンガン塩であり、最適には、塩化マンガン（ＩＩ）である。

供給に使用される組成物内の１つまたは複数の遷移金属塩の濃度は、０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、好適には０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．０９ｍｍｏｌ／Ｌ、より好適には０．００８ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．０８ｍｍｏｌ／Ｌ、さらにより好適には０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．０７ｍｍｏｌ／Ｌであり、最適には０．０６ｍｍｏｌ／Ｌである。供給に使用される組成物内の塩化マンガン（ＩＩ）の濃度は、０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、好適には０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．０９ｍｍｏｌ／Ｌ、より好適には０．００８ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．０８ｍｍｏｌ／Ｌ、さらにより好適には０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．０７ｍｍｏｌ／Ｌであり、最適には０．０６ｍｍｏｌ／Ｌである。

供給に使用される組成物は、１つまたは複数の糖をさらに含んでなる。糖は短鎖炭水化物であり、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトースおよびラクトースを包含する。好適には、この糖はガラクトースである。

供給に使用される組成物内の１つまたは複数の糖の濃度は、５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好適には７．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好適には１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらにより好適には１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、最適には１５ｍｍｏｌ／Ｌである。供給に使用される組成物内のガラクトースの濃度は、５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好適には７．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好適には１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらにより好適には１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、最適には１５ｍｍｏｌ／Ｌである。

一実施形態において、供給に使用される組成物内の１つまたは複数のヌクレオシドの濃度は１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、供給に使用される組成物内の１つまたは複数の遷移金属塩の濃度は０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌであり、供給に使用される組成物内の１つまたは複数の糖の濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。好適な実施形態において、供給に使用される組成物内の１つまたは複数のヌクレオシドの濃度は３ｍｍｏｌ／Ｌであり、供給に使用される組成物内の１つまたは複数の遷移金属塩の濃度は０．０６ｍｍｏｌ／Ｌであり、供給に使用される組成物内の１つまたは複数の糖の濃度は１５ｍｍｏｌ／Ｌである。

一実施形態において、供給に使用される組成物内のウリジンの濃度は１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、供給に使用される組成物内の塩化マンガン（ＩＩ）の濃度は０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌであり、供給に使用される組成物内のガラクトースの濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。好適な実施形態において、供給に使用される組成物内のウリジンの濃度は３ｍｍｏｌ／Ｌであり、供給に使用される組成物内の塩化マンガン（ＩＩ）の濃度は０．０６ｍｍｏｌ／Ｌであり、供給に使用される組成物内のガラクトースの濃度は１５ｍｍｏｌ／Ｌである。

本細胞培養物には、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物が１回以上、好適には２回以上供給され、より好適には２回供給される。成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物の供給は、好適には、細胞培養培地への細胞の接種の４〜６日後に起こり、より好適には、細胞培養培地への細胞の接種の５日後に起こる。成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物の供給が２回実施される場合、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物の第１の供給は細胞培養培地の接種の４〜６日後、好適には５日後に実施され、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物の第２の供給は、細胞培養培地の接種の６〜８日後、好適には７日後に実施される。より好適には、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物の第１の供給は、接種の５日後に実施され、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物の第２の供給は、接種の７日後に実施される。

第１の供給工程において、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物は、８．５〜１０．５倍、好適には９．０〜１０．０倍、最適には９．３倍に希釈される。第２の供給工程において、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物は、９．５〜１１．５倍、好適には１０．０〜１１．０倍、最適には１０．３倍に希釈される。

好適には、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物の供給の１つまたは複数の工程は、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）は添加されていない以外は成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物と同一である組成物の供給工程によって開始される。成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）は添加されていない以外は成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる組成物と同一である組成物の供給は、細胞培養培地の接種の２〜４日後、好適には３日後に行なわれる。

したがって、本発明の方法は、好適には、以下の供給工程
ｃ１）成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）が添加されていない組成物を接種後３日目に供給する工程、
ｃ２）成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）が添加された組成物を接種後５日目に供給する工程、および、
ｃ３）成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）が添加された組成物を接種後７日目に供給する工程
を含んでなる。

本発明の方法において、細胞培養物、すなわち哺乳動物細胞を含んでなる細胞培養培地の温度は、好適には、全培養プロセスの間、一定に保持されるが、これは、温度がそのプロセスにおいて積極的にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされないこと、また常に同じ設定温度が使用されることを意味している。それにもかかわらず、温度のわずかな変動が培養プロセスの間に起こり得る。好適には、培養プロセスの間の温度は３６℃〜３８℃に設定され、より好適には、温度は３７℃に設定される。

本発明のプロセスにおいて、オスモル濃度は、好適には、全プロセス、すなわち、特許請求の範囲で定義された、工程（ａ）〜（ｃ）を通じて４００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも低い。好適には、オスモル濃度は２５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲、より好適には３００〜３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲、最適には３３０〜３７０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。本明細書で使用される「オスモル濃度」という用語は、溶媒１キログラム当たりの溶質のオスモルとして定義され、イオン化分子または非イオン化分子を包含し得る。低オスモル濃度、例えば４００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも低いオスモル濃度は、低塩濃度の培地を使用することにより維持され得る。特に、供給に使用される組成物は低塩濃度を含有するか、または供給工程ｃ）において使用される遷移金属塩以外の塩を全く含有しない。

本発明のプロセスにおいて、細胞は好気条件下、すなわち、５０±４０％の溶存酸素レベルで培養される。二酸化炭素のレベルは、任意選択で、混合速度または通気の強度を調整することによって、０〜９０ｍｍＨｇの間の範囲内に維持される。

本発明のプロセスは、グルコースの限定なく実施される。したがって、グルコースは、５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好適には１０〜２５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲のグルコースレベルを保持するように細胞培養物に対して添加される。

細胞培養物の起泡が生じる場合、本発明のプロセスの間の任意の時点で、消泡剤が培養物に対して添加され得る。
組換えタンパク質が本発明の方法によって生産された後、産物が回収される。哺乳動物細胞から発現される組換えタンパク質、特に抗体は、典型的には培養プロセスの間に細胞培養液へと分泌されるので、培養プロセスの終了時の産物回収は、組換えタンパク質を含んでなる細胞培養液を細胞から分離することによって起こる。細胞分離方法は、細胞破壊を最小限にするために穏やかにし、細胞破壊片の増加を回避し、免疫グロブリン産物の品質に影響する可能性があるプロテアーゼおよび他の分子の放出を回避する。通常、組換えタンパク質を含んでなる細胞培養液の回収は、遠心分離および／または濾過を含んでなり、それにより組換えタンパク質は上清および濾液中に、それぞれ存在する。エクスパンデットベッドカラムクロマトグラフィーは、遠心分離法／濾過法を回避する代替方法である。

組換えタンパク質を含んでなる細胞培養液を回収した後、組換えタンパク質は細胞培養液から精製されなければならない。組換えタンパク質、特に組換え抗体の精製は、通常、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーなどの一連のクロマトグラフィー工程によって達成される。さらに、精製プロセスは、１つまたは複数の超濾過、ナノ濾過または透析濾過工程を含んでなり得る。ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５４８６２に記載されている特に適切な１つの方法は、フロースルーモード（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅ）の陰イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ樹脂のアフィニティークロマトグラフィー、およびバインド−アンド−エルート（ｂｉｎｄ−ａｎｄ−ｅｌｕｔｅ）モードの陽イオン交換クロマトグラフィーの工程を含んでなる。

本発明のプロセスは、５００または１．０００リットル以上、好適には５．０００または８．０００リットル以上、最適には１０．０００または２０．０００リットルの培養物容量を意味する、大規模での組換えタンパク質の生産に適している。

本発明のプロセスは、バイオシミラー治療用抗体の、その基準産物（すなわち市販の治療用抗体）に対するバイオシミラリティーを改善する。バイオシミラー治療用抗体は、先発医薬品（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ）に対する特許保護が期限切れした後に市販され、先発医薬品と同じアミノ酸配列を有するが、翻訳後修飾がわずかに相違し得る治療用抗体である。それにもかかわらず、バイオシミラー治療用抗体は、先発医薬品と同一の生理学的な効果を示す。市販の抗体のバイオシミラーについての販売許可申請が提出される場合、バイオシミラー抗体の構造が基準産物に匹敵することが示されなければならない。グリコシル化タンパク質のバイオシミラリティーを評価するための重要な１つのパラメーターは、抗体のエフェクター機能に影響を及ぼし得るグリコシル化パターンである。

本発明の方法を使用することによって、バイオシミラー抗体のグリコシル化パターン、特にガラクトースレベルは基準産物に匹敵する。それによって、ｐＨ降下に供されておらず、ウリジン、塩化マンガン（ＩＩ）およびガラクトースを含んでなる組成物が供給されなかった治療用抗体のグリコシル化パターンおよびバイオシミラリティーと比べて、本バイオシミラー抗体はバイオシミラリティーが改善される。

以下の実施例および図面は説明目的で提供される。したがって、実施例および図面は限定として解釈されないことを理解されたい。当業者には、明らかに、本明細書に詳説された原理のさらなる変更を想定することができよう。

実施例
本発明の方法は、以下の非限定的な実施例を参照することによって支持され、例示される。

以下のテーブルに提示した選択実験は、異なる規模の流加培養において増殖したＣＨＯ細胞で組換え発現された、マウス−ヒトキメラ抗ＣＤ２０、ＩｇＧ１抗体のリツキシマブを用いて実施された。実施例において、この抗体はモデル抗体とも呼ばれる。

しかし、本発明の方法は、特異抗体にも、免疫グロブリンの発現に使用される特定の宿主細胞にも依存しない。タンパク質ガラクトシル化プロファイルおよび回収における最大収率の観点において最適化された発現モードおよび選択した培養条件についても同じことが言える。

１． 方法
１．１ 細胞培養
細胞
無血清培地における成長に適合され、その優れた成長（撹拌培養において凝集が少ないことを包含する）およびトランスフェクション効率によってもともと選択された、一般のＣＨＯ Ｋ１細胞株の市販の懸濁液選択性サブクローンに由来する、チャイニーズハムスター卵巣細胞株Ｓ（ＣＨＯ−Ｓ）は、インビトロジェン社（カタログ番号：Ｒ−８００−０７、Ｌｏｔ．１３３５７５０）から購入された。ＣＨＯ−Ｓ細胞は、無血清の、既知組成のＰｏｗｅｒＣＨＯ−２培地（ロンザ インコーポレイテッド社製、米国所在）における成長に適合された。

流加培養法
モデル抗体が発現するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞は、最初に、基本培地ＰｏｗｅｒＣＨＯ−２（ロンザ社製）において成長させた。最初の操作容量（接種培地プラス基本培地の容量）に対する供給物の比が、１５％で、３倍濃縮された（３×）ＥｘＣｅｌｌ供給物（３７ｇ／Ｌ；ＳＡＦＣ）での培養の（接種後）３日目から１日おきに、ショット−ワイズモードで培養物に添加された。

実施例において利用された培地および追加補充物の供給者およびカタログ番号は、以下に要約される。

培養温度は３７℃に維持された。ｐＨは、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ_２Ｃ０_３またはＨ_３Ｐ０_４を添加することによってｐＨ７．０５からｐＨ７．１５の間の範囲で保持された。溶存酸素（ＤＯ）設定点は４０％であった。関連代謝産物は毎日測定された。グルコースレベルは約２０ｍｍｏｌ／Ｌで維持された。細胞は、９〜１０日間培養された。

実験は、主として、１、５、１０または１００Ｌの実験室規模から回収された培養液を用いて実施された。これらの例において使用された生産規模および最大培養容量は、１０００Ｌであった。他に指定がない限り、この規模は通常、培養容量を指す。

１．２ 精製
プロテインＡクロマトグラフィー
品質分析のために、得られたモデル抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して、発酵ブロスからアフィニティー精製された。この捕捉はＦｃ担持分子に対する優れた選択率を提供し、それによって、単一工程において９９．５％を超える夾雑物が除去される。

１．３ 分析
生細胞密度および生存率
生細胞密度および細胞生存率は、トリパンブルー染色法を使用して、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）自動細胞カウンター（インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在、２００８）によって決定された。

グルコース
グルコース濃度は、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ血糖計（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）所在）を用いて測定された。

ｐＣＯ２
溶存二酸化炭素含有量（ｐＣＯ２）は、ＡＢＬ８０血液ガスアナライザー（ラジオメーター社（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ）、デンマーク、ブレンスホイ（Ｂｒｏｎｓｈｏｊ）所在）を用いて決定された。

ｐＨ測定
ｉｎ ｓｉｔｕ ｐＨメーター再較正のためのアトライン（Ａｔ−ｌｉｎｅ）ｐＨ測定は、Ｓ４７ ＳｅｖｅｎＭｕｌｔｉ ｐＨメーター（メトラートレド社（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）、スイス、チューリッヒ（Ｚｕｒｉｃｈ）所在）を用いて実施された。

オスモル濃度
試料のオスモル濃度は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｄｅｌ ２０２０マルチサンプル浸透圧計（アドバンスト インストルメント社（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国マサチューセッツ州ノーウッド（Ｎｏｒｗｏｏｄ）所在）を用いて決定された。

力価
（インプロセス）試料のタンパク質力価は、プロテインＡアフィニティーＨＰＬＣによって決定された。

グリコシル化プロファイル
グリカンフォームの移動時間補正面積％で表したグリカン集団の相対比の決定は、レーザー誘起蛍光法検出を使用するキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＬＩＦ）によって実施された。タンパク質試料（２００μｇ）は、ＰＮＧａｓｅ−Ｆと共に３７℃で３時間インキュベーションすることによって脱グリコシル化された。タンパク質の沈澱は、冷却されたエタノールを使用して実施され、続いて乾燥させた。蛍光性誘導体化剤９−アミノピレン−１，４，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用する還元的アミノ化に続いて、５５℃で９０分間加熱を行った。試料がクエンチされ、４８８ｎｍ固体レーザーを装備したＣＥ−ＬＩＦシステムを使用して電気泳動が行われた。グリカンの相対的含有量は、蛍光検出によって決定された。放出されたグリカンの量は、対応するピークの面積％値を使用して計算された。モデル抗体の４つの主要グリカン（Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ１’Ｆ、Ｇ２Ｆ）は、放出および安定性試験について評価された。合格基準は以下のとおりであった：Ｇ０Ｆ：４０〜５６面積％；Ｇ１Ｆ：２８〜３８面積％；Ｇ１’Ｆ：９〜１３面積％、およびＧ２Ｆ：５〜１２面積％。

分離パラメーターは以下を包含していた。
・５０μΜの内径（Ｉ．Ｄ．）のキャピラリー直径
・キャピラリーの長さ：全長（Ｌｔ）＝５０．２ｃｍ
・検出器までの長さ（Ｌｄ）＝４０．２ｃｍ
・ニュートラルキャピラリー
・ＰＥＯゲル
・２０分のラン時間
・キャピラリー温度２０℃
・試料保存温度１０℃
生物活性
モデル抗体の生物活性は、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイを使用して決定された。ＣＤＣ法の基本原理は、モデル抗体が、標的細胞の表面上で発現されるその抗原に対して特異的に結合するということである。こうして形成された抗原−抗体複合体は補体系を活性化し、その結果、細胞は用量依存的に死滅する。生存細胞は、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）試薬を添加することによって検出される。ＣＤＣのアッセイの評価は、試料と基準の両方の希釈系列について得られたシグモイド用量−応答曲線の比較に基づく。

２． 結果
２．１ オスモル濃度の最適化
細胞の栄養要求性による供給組成物の最適化のために、ＣＨＯ細胞によって生産されるモデル抗体のタンパク質グリコフォーム／ガラクトシル化に対する供給組成物のオスモル濃度の影響は、１Ｌ流加発酵実験において分析された。

モデル抗体を発現するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞は、まず、基本培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ−２、ロンザ インコーポレイテッド社、米国所在）で成長した。（接種後の）３日目から２日毎に、１５％の３×濃縮ＥｘＣｅｌｌ供給物（３７ｇ／Ｌ；ＳＡＦＣ）がショット−ワイズモードで培養物に添加された。

テーブル１は、それぞれの実験中の培地補充を示す。

培養温度は３７℃に維持された。ｐＨは、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ_２Ｃ０_３またはＨ_３Ｐ０_４を添加することによってｐＨ７．０５からｐＨ７．１５の間の範囲で保持された。溶存酸素（ＤＯ）設定点は４０％であった。関連代謝産物は毎日測定された。グルコースレベルは約２０ｍｍｏｌ／Ｌで維持された。細胞は、９〜１０日間培養された。

グリコシル化パターンは、培養の３日目（接種後）から発酵ブロスの試料から毎日分析された。品質分析のために、得られた抗体は、プロテインＡを使用して、発酵ブロスからアフィニティー精製された。細胞生存率、力価およびオスモル濃度は、培養の接種後３日目から毎日評価された。

得られた抗体の生物活性は、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイを使用して決定された。
一定のｐＨ、ＤＯ、撹拌速度および温度で代謝産物をモニタリングし、適切な栄養レベルを確認しながら、オスモル濃度は培養中に一貫して増加し、培養の後期に６５０ｍＯｓｍ／ｋｇまで達したが、一方、生細胞密度は着実に減少した。

テーブル２は、オスモル濃度の増加がグリコシル化パターンを有意に低下させた、流加バッチ実験からの試料のいくつかの結果を示すが、これは、４００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも高いオスモル濃度がタンパク質グリコシル化にマイナスの影響を及ぼし得ることを意味する。培養物に塩が蓄積することにより、非ガラクトシル化形態（Ｇ０Ｆ）の量は増加しており、その一方でガラクトシル化形態の量は減少していた。同様に、ＣＤＣアッセイによるそれぞれの抗体試料の生物活性は、発酵ブロスのオスモル濃度の増加とともに減少していた。

３倍濃縮された塩含有ＥｘＣｅｌｌ供給物が細胞培養物の高オスモル濃度の一因となったので、本来のＥｘＣｅｌｌ供給組成物は、本来の培地と比べて６６％少ないリン酸ナトリウムを含有するように変更された。

流加発酵ランＡおよびＢからの培養１０日後（接種後）の抗体グリコシル化パターンをテーブル３に示す。

４００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度は、流加発酵ランＢで使用したカスタマイズされた塩非含有のＥｘＣｅｌｌ供給物によって、塩含有ＥｘＣｅｌｌ供給物を用いて実施された流加発酵ランＡと比べて、抗体グリコシル化パターンにプラスの影響（例えば、非グリコシル化グリコフォームの減少、ガラクトシル化グリコフォームの増加、およびＣＤＣ活性の増加）を及ぼした。

２．２ 培養ｐＨの変更と組み合わせたＵＭＧの供給物補充によるガラクトシル化の最適化
マイクロスケールでベンチトップバイオリアクターの特性を模したハイスループットダウンスケール発酵プラットフォームである、ＴＡＰバイオシステムズ社（ＴＡＰ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、英国所在）のＡＭＢＲ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）システムを使用してＵＭＧ供給とｐＨシフト適用の様々な時点でのわずかなｐＨシフトとの後に、得られた抗体のガラクトシル化パターンが調査された。

方法
モデル抗体を発現するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞は、基本培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ−２、ロンザ インコーポレイテッド社、米国所在）で９日間培養された。（接種後）３日目から１日おきに、実験Ｂ（実施例２．１、テーブル１、ただしプロリンを除く）に従って補充された１５％（３×）ＳＦ ＥｘＣｅｌｌ供給物（３７ｇ／Ｌ；ＳＡＦＣ）が培養物にショット−ワイズモードで添加された。ＵＭＧ補充物（３ｍｍｏｌ／Ｌのウリジン、０．０６ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マンガン（ＩＩ）および１５ｍｍｏｌ／Ｌのガラクトース）は、培養の（接種後）５日目および７日目に、カスタマイズされたＳＦ ＥｘＣｅｌｌ供給物と共に添加された。

培養ｐＨは、培養の（接種後）３日目まで、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ_２Ｃ０_３またはＨ_３ＰＯ_４を添加することによってｐＨ７．１５で保持された。ｐＨ７．００へのシフトは、接種後６５〜７８時間の間の様々な時点で、４．０〜７．０×１０^６細胞／ｍＬの間の生細胞密度で、Ｈ_３ＰＯ_４の添加により実施された。

生産された抗体のガラクトシル化パターンは、粗精製タンパク質からキャピラリー電気泳動により分析された。
得られた抗体試料のガラクトシル化パターンに対する培養ｐＨの効果がテーブル４に要約される。

培養（接種後）の３日目のｐＨ７．１５からｐＨ７．００へのわずかなシフトは、培養中ｐＨ７．１５が一定に保持されていた対照と比べて、抗体のグリコシル化に既に影響を及ぼしていた。非ガラクトシル化グリコフォーム（Ｇ０Ｆ）のパーセンテージを低下し得、ガラクトシル化グリコフォームＧ１Ｆ、Ｇ１’ＦおよびＧ２ＦのパーセンテージはこのｐＨシフト後に増加した。抗体ガラクトシル化に対するわずかなｐＨシフトのこのプラスの効果は、それぞれの試料においてＮａＣｌの培地補充物によって調整された場合、４００ｍＯｓｍ／ｋｇを超えるオスモル濃度で観察される可能性もある。それにもかかわらず、４００ｍＯｓｍ／ｋｇを超えるオスモル濃度では、それぞれの抗体のグリコシル化パターンが有意に低かった。

テーブル５は、それぞれ（接種後の）培養の８日および９日目、ならびにｐＨシフトが適用された時点における、得られた抗体試料のＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ１’ＦおよびＧ２Ｆガラクトシル化のパーセント分布（ｐｅｒｃｅｎｔａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示す。

培養８日目のガラクトシル化パターンの分析は、ｐＨ７．１５が発酵中一定に保持された対照試料と比べて、非グリコシル化グリコフォームＧ０Ｆのパーセント量の減少を示す。ｐＨシフトおよびＵＭＧ供給の組み合わせは、得られた抗体のガラクトシル化グリコフォーム（Ｇ１Ｆ、Ｇ１’ＦおよびＧ２Ｆ）のパーセント量の増加をもたらした。

テーブル６から分かるように、ＵＭＧ単独の供給は、ＵＭＧを添加しない対照と比べて、（接種後）培養の７日目に抗体ガラクトシル化に対してプラスの影響を及ぼした。しかし、非ガラクトシル化グリコフォームのパーセント量の有意な減少、および得られた抗体のガラクトシル化グリコフォームのパーセント量の有意な増加は、両方の特徴（わずかなｐＨシフト＋ＵＭＧの供給補充）が組み合わされた時のみ達成された。

まとめると、得られた抗体試料のグリコシル化パターンの分析は、ｐＨ７．１５からｐＨ７．００へのわずかなｐＨシフトと、培養の（接種後）５日目および７日目のＵＭＧによる補充とを含んでなる改善された供給方策が抗体ガラクトシル化の増加をもたらすことを示した。

Claims (18)

1. 哺乳動物細胞にて生産される組換えタンパク質のガラクトース含有量を増加させる方法において、
   ａ）前記組換えタンパク質をコードする１つ以上の組換え核酸分子で形質転換された哺乳動物細胞を細胞培養培地中、第１のｐＨで第１の期間、培養する工程であって、前記細胞培養培地はガラクトースを含まない、第１の期間、生細胞密度が４．５〜６．０×１０ ^６ 細胞／ｍｌになるまで培養する工程と、
   ｂ）前記哺乳動物細胞を前記細胞培養培地中、前記第１のｐＨとは異なり、前記第１のｐＨよりも０．０５〜０．３ｐＨ単位だけ小さい第２のｐＨで第２の期間、培養する工程と、
   ｃ）下記の成分
   （ｉ）１つまたは複数のヌクレオシドであって、前記ヌクレオシドはウリジンである、ヌクレオシド、
   （ｉｉ）１つまたは複数の遷移金属塩であって、前記遷移金属塩はマンガン塩である、遷移金属塩、および
   （ｉｉｉ）１つまたは複数の糖であって、前記糖はガラクトースである、糖
   を含んでなる組成物を（ｂ）の培養物に対して供給する工程と
   を備え、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）における前記培養物のオスモル濃度は４００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも低い、方法。
2. 哺乳動物細胞にて組換えタンパク質を生産するための方法において、
   ａ）前記組換えタンパク質をコードする１つ以上の組換え核酸分子で形質転換された哺乳動物細胞を細胞培養培地中、第１のｐＨで第１の期間、生細胞密度が４．５〜６．０×１０ ^６ 細胞／ｍｌになるまで培養する工程であって、前記細胞培養培地はガラクトースを含まない、第１の期間、培養する工程と、
   ｂ）前記哺乳動物細胞を前記細胞培養培地中、前記第１のｐＨとは異なり、前記第１のｐＨよりも０．０５〜０．３ｐＨ単位だけ小さい第２のｐＨで第２の期間、培養する工程と、
   ｃ）下記の成分
   （ｉ）１つまたは複数のヌクレオシドであって、前記ヌクレオシドはウリジンである、ヌクレオシド、
   （ｉｉ）１つまたは複数の遷移金属塩であって、前記遷移金属塩はマンガン塩である、遷移金属塩、および
   （ｉｉｉ）１つまたは複数の糖であって、前記糖はガラクトースである、糖
   を含んでなる組成物を（ｂ）の培養物に対して供給する工程と、
   ｄ）前記組換えタンパク質を含んでなる細胞培養液を回収する工程と、
   ｅ）前記組換えタンパク質を得る工程と
   を備え、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）における前記培養物のオスモル濃度は４００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも低い、方法。
3. 前記組換えタンパク質は大規模で生産される、請求項２に記載の方法。
4. 前記哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記組換えタンパク質はＦｃ含有タンパク質である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記組成物内のウリジンの濃度は１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記遷移金属塩は塩化マンガン（ＩＩ）である、請求項６に記載の方法。
8. 前記組成物内の塩化マンガン（ＩＩ）の濃度は０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項７に記載の方法。
9. 前記組成物内のガラクトースの濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. チャイニーズハムスター卵巣細胞においてリツキシマブのバイオシミラー抗体を生産するための方法において、
    ａ）前記抗体の軽鎖および重鎖をコードする１つまたは複数の組換え核酸分子で形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞を細胞培養培地中、ｐＨ７．１５で第１の期間、生細胞密度が４．５〜６．０×１０ ^６ 細胞／ｍｌになるまで培養する工程と、
    ｂ）前記チャイニーズハムスター卵巣細胞を細胞培養培地中、ｐＨ７．００で第２の期間、培養する工程と、
    ｃ）下記の成分
    （ｉ）１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌのウリジン、
    （ｉｉ）０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マンガン（ＩＩ）、および
    （ｉｉｉ）５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌのガラクトース
    を含んでなる組成物を（ｂ）の培養物に対して供給する工程と、
    ｄ）前記リツキシマブを含んでなる細胞培養液を回収する工程と、
    ｅ）前記リツキシマブを得る工程と
    を備え、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）における前記培養物のオスモル濃度は４００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも低い、方法。
11. チャイニーズハムスター卵巣細胞によって生産される治療用抗体のその基準抗体に対するバイオシミラリティーを改善するための方法において、
    ａ）前記治療用抗体の軽鎖および重鎖をコードする１つまたは複数の組換え核酸分子で形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞を細胞培養培地中、ｐＨ７．１５で第１の期間、生細胞密度が４．５〜６．０×１０ ^６ 細胞／ｍｌになるまで培養する工程と、
    ｂ）前記チャイニーズハムスター卵巣細胞を前記細胞培養培地中、ｐＨ７．００で第２の期間、培養する工程と、
    ｃ）下記の成分
    （ｉ）ウリジン、
    （ｉｉ）塩化マンガン（ＩＩ）、および
    （ｉｉｉ）ガラクトース
    を含んでなる組成物を（ｂ）の培養物に対して供給する工程と
    を備え、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）における前記培養物のオスモル濃度は４００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも低い、方法。
12. 前記細胞は前記第２のｐＨで６〜７日間培養される、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記温度は工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の間、一定に保持される、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記組成物はＬ−バリン、Ｌ−システイン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−セリンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸をさらに含有する、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記工程（ｃ）の供給は２回以上実施される、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記工程（ｃ）の供給は、前記成分（ｉ）および前記成分（ｉｉｉ）が添加されていない組成物の供給工程によって開始される、請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 工程（ａ）および（ｂ）における前記培養培地はウリジンおよびガラクトースを含有しない、請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 工程（ｃ）の前記組成物はチミジン、フルクトース、マンノース、スクロースおよびＮ−アセチルマンノサミンの１つまたは複数を含有しない、請求項１乃至１７のいずれか一項に記載の方法。