KR20180070553A - 재조합 단백질의 갈락토오스 함량을 증가시키는 방법 - Google Patents

재조합 단백질의 갈락토오스 함량을 증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유류 세포에서 제조된 재조합 단백질의 갈라토오스 함량을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 세포의 배양 중에, 세포 배양물의 pH가 변화되고, 뉴클레오시드, 전이금속염 및/또는 당을 포함하는 조성물이 공급된다.

Description

재조합 단백질의 갈락토오스 함량을 증가시키는 방법
본 발명은 포유류 세포에서 제조된 재조합 단백질의 갈라토오스 함량을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 세포의 배양 중에, 세포 배양물의 pH가 변화되고, 뉴클레오시드, 전이금속염 및/또는 당을 포함하는 조성물이 공급된다.
지난 20년 동안, 염증성 질환 및 암과 같은 상이한 질병 치료를 위한 치료용 항체(therapeutic antibodies)의 이용이 점점 더 중요해졌고, 최초의 바이오시밀러(biosimilar) 항체 제품이 이미 시판되었다.
포유류 혈청으로부터 유래된 자연발생 항체는 불변부에서 글리코실화되고, 이 글리코실화(glycosylation)는 항체의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포 독성(CDC)과 같은 항체의 작용 기능에 중요하다. 또한, 진핵 세포에서 제조된 재조합 단일 클론 항체는 특정한 글리코실화 패턴(glycosylation pattern)을 나타낸다. 바이오시밀러 치료용 항체 개발에 있어서, 바이시밀러 항체가 글리코실화의 관점에서 오리지널 제품과 비슷하다는 점에 주의를 기울여야 한다.
여러 연구에 따르면, 재조합 항체의 갈락토오스 함량은 보체 의존성 세포 독성(CDC) 분석에서 측정된 상기 항체의 생물학적 활성에 영향을 미치는 것으로 나타났다(Gazzano-Santoro et al. (1997) J. Immunol. Meth. 202: 163; Boyd et al. (1995) Mol. Immunol. 32: 1311-1318; Jefferis (2009) Nature Reviews Drug Discovery 8: 226-234). 당단백질의 활성 및 효능에 대한 갈락토실화(galactosylation)의 역할에 비추어, 당단백질 조성물에서 갈락토실화 수준을 모니터링하고 제어하는 것이 중요하다.
선행 기술은 당단백질 조성물의 갈락토실화 프로파일을 조절하기 위한 다양한 방법을 개시한다.
Gramer et al. (2011) Biotechnol. Bioeng. 108(7): 1591-1602는 항체를 생산하는 세포에, 우리딘, 염화망간 및 갈락토오스를 공급함으로써 항체 갈락토실화가 조절될 수 있음을 개시한다. 유사하게, WO 2012/149197 A2는 망간 및/또는 갈락토오스 함유 세포 배양 보충제를 이용하여 갈락토실화를 제어하는 방법을 제공한다.
또한, EP 2 511 293 A1은 pCO2 조절에 의한 갈락토실화의 제어 방법을 기재한다.
Ivarsson et al. (2014) J. Biotechnol. 188: 88-96에 있어서, 글리코실화에 대한 pH 및 용존 산소 농도(dissolved oxygen tension)를 포함하는 단일 및 조합의 화학적 및 기계적 스트레스 파라미터의 효과가 조사된다.
WO 2014/170866 A2는 세포 배양 과정 중에 온도를 감소시키고, pCO2 수준을 특정 범위로 유지시킴으로써 재조합 단백질의 갈락토오스 함량을 증가시키는 방법을 개시한다.
McCracken et al. (2014) Biotechnol. Prog. 30(3): 547-553는 재조합 단백질의 갈락토실화에 대한 세포 배양 배지의 아스파라긴 및 암모늄 농도의 영향을 보고한다.
그럼에도 불구하고, 특히 바이오시밀러의 갈락토오스 수준이 표준 제품(reference product)의 갈락토오스 수준과 비슷해야 하는 바이오시밀러 제품 개발에 있어서, 단백질 갈락토실화를 정확하게 제어할 수 있는 세포 배양 과정에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명자들은 pH 감소와, 포유류 세포에의 우리딘, 염화망간 및 갈락토오스의 공급의 조합이 pH 감소 없이 우리딘, 염화망간 및 갈락토오스를 공급하는 것에 비하여 더 큰 범위로 재조합적으로 제조된 항체의 갈락토실화(galactosylation)를 증가시키는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 포유류 세포에서 제조되는 재조합 단백질의 갈락토오스 함량을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 상기 재조합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 포유류 세포를 제1 pH에서 제1 시간 동안 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
b) 상기 포유류 세포를 상기 제1 pH와 상이한 제2 pH에서 제2 시간 동안 상기 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
c) 하기 성분:
(ⅰ) 일 이상의 뉴클레오시드;
(ⅱ) 일 이상의 전이금속염; 및
(ⅲ) 일 이상의 당;
중 적어도 2종을 포함하는 조성물을 (b)의 배양물에 공급하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 포유류 세포에서 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 상기 재조합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 포유류 세포를 제1 pH에서 제1 시간 동안 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
b) 상기 포유류 세포를 상기 제1 pH와 상이한 제2 pH에서 제2 시간 동안 상기 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
c) 하기 성분:
(ⅰ) 일 이상의 뉴클레오시드;
(ⅱ) 일 이상의 전이금속염; 및
(ⅲ) 일 이상의 당
중 적어도 2종을 (b)의 배양물에 공급하는 단계;
d) 상기 재조합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계; 및
e) 상기 재조합 단백질을 수득하는 단계.
바람직하게, 상기 재조합 단백질은 대규모로 제조된다.
또한, 바람직하게, 상기 포유류 세포 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cells)이다.
바람직한 실시예에서, 상기 재조합 단백질은 Fc-함유 단백질이다.
바람직하게, 상기 제2 pH는 상기 제1 pH보다 낮으며, 더욱 바람직하게, 상기 제2 pH는 상기 제1 pH보다 제1 pH보다 0.05 내지 0.3 pH 단위(pH unit) 낮다.
바람직하게, 상기 뉴클레오시드는 우리딘이며, 더욱 바람직하게, 상기 조성물 내 우리딘의 농도는 1 내지 20 mM이다.
바람직하게, 상기 전이금속염은 염화망간(Ⅱ)(manganese (Ⅱ) chloride)이며, 더욱 바람직하게, 상기 조성물 중 염화망간(Ⅱ)의 농도는 0.002 mM 내지 0.1 mM이다.
바람직하게, 상기 당은 갈락토오스이며, 더욱 바람직하게, 상기 조성물 중 갈락토오스의 농도는 5 mM 내지 100 mM이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 중국 햄스터 난소 세포에서 리툭시맙 바이오시밀러 항체(rituximab biosimilar antibody)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 상기 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 중국 햄스터 난소 세포를 7.15의 pH에서 제1 시간 동안 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
b) 상기 중국 햄스터 난소 세포를 7.00의 pH에서 제2 시간 동안 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
c) 하기 성분:
(ⅰ) 1 내지 20 mM 우리딘;
(ⅱ) 0.002 mM 내지 0.1 mM 염화망간(Ⅱ); 및
(ⅲ) 5 mM 내지 100 mM 갈락토오스
를 포함하는 조성물을 (b)의 배양물에 공급하는 단계;
d) 리툭시맙을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계; 및
e) 상기 리툭시맙을 수득하는 단계.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 중국 햄스터 난소 세포에 의해 제조된 치료용 항체의 그의 표준 항체(reference antibody)에 대한 생물학적 동등성(biosimilarity)을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 상기 치료용 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 중국 햄스터 난소 세포를 7.15의 pH에서 제1 시간 동안 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
b) 상기 중국 햄스터 난소 세포를 7.00의 pH에서 제2 시간 동안 상기 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
c) 하기 성분:
(ⅰ) 우리딘;
(ⅱ) 염화망간(Ⅱ); 및
(ⅲ) 갈락토오스
을 포함하는 조성물을 (b)의 배양물에 공급하는 단계.
바람직한 실시예에서, 상기 세포는 생존 세포 밀도(viable cell density)가 4.5 내지 6.0 × 106 세포/㎖가 될 때까지 상기 제1 pH에서 배양된다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 세포는 상기 제2 pH에서 6 내지 7일 동안 배양된다.
바람직하게, 상기 온도는 단계 (a), (b) 및 (c) 중에 일정하게 유지된다.
또한, 바람직하게, 상기 조성물은 L-발린, L-시스테인, L-페닐알라닌 및 L-세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 더 함유한다.
바람직하게, 상기 공급 단계 (c)는 적어도 2회 수행된다.
또한, 바람직하게, 상기 공급 단계 (c) 전에, 성분 (ⅰ) 및 (ⅲ)이 첨가되지 않은 조성물의 공급 단계가 선행된다.
바람직하게, 단계 (a) 및 (b)의 상기 배양 배지는 우리딘 및 갈락토오스를 함유하지 않는다.
또한, 바람직하게, 단계 (c)의 상기 조성물은 티미딘(thymidine), 프럭토오스(fructose), 만노스(mannose), 수크로오스(sucrose) 및 N-아세틸만노사민(N-acetylmannosamine)의 일 이상을 함유하지 않는다.
바람직하게, 단계 (a), (b) 및 (c)의 배양물의 삼투질 농도(osmolality)는 400 mOsm/㎏보다 낮다.
본 발명은 특정 실시예에 대하여 기술되지만, 이 기재가 제한적인 의미로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 예시적인 실시예를 상세하게 설명하기 전에, 본 발명을 이해하는데 중요한 정의들이 제공된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 "일(a)" 및 "일(an)"은 문맥상 다르게 명확하게 지시하지 않는 한, 각각의 복수형을 포함한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "약(약)" 및 "대략(approximately)"은 당해 기술분야의 통상의 기술자가 당해 특징의 기술적 효과가 여전히 보장되는 것으로 이해하는 정확도의 간격을 나타낸다. 상기 용어는 전형적으로 ±20 %, 바람직하게 ±15 %, 더욱 바람직하게 ±10 %, 및 더욱 더 바람직하게 ±5 %의 표시된 수치의 편차를 나타낸다. 용어 "포함하는"은 제한적이지 않은 것으로 이해되어야 한다. 본 발명이 목적을 위하여, 용어 "이루어지는"은 용어 "포함하는"의 바람직한 실시형태로 여겨진다. 이하, 그룹이 적어도 특정 수의 실시형태를 포함하도록 정의되는 경우, 이는 바람직하게는 단지 이들 실시형태로만 이루어진 군을 포함하는 의미이다. 또한, 발명의 설명 및 청구범위에서 용어 "제1", "제2", "제3" 또는 "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" 등은 유사한 요소를 구별하기 위하여 사용되며, 반드시기 순차적 또는 발생순서적으로 설명하는 것은 아니다. 이와 같이 사용되는 용어들은 적절한 환경 하에서 상호교환가능하고, 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시예는 본 명세서에 기재되거나 예시된 것 이외의 다른 순서로 동작할 수 있음을 이해하여야 한다. "제1", "제2", "제3" 또는 "(a)", "(b)", "(c)", "(d)", "ⅰ", "ⅱ" 등의 용어가 방법 또는 용도 또는 분석의 단계와 관련되는 경우, 단계들 사이에 시간 또는 시간 간격의 일관성은 없다. 즉, 단계들은 동시에 수행될 수 있거나, 또는 상기 또는 하기에 기재된 바와 같이 다르게 명시되지 않는 한, 초, 분, 시간, 일, 주, 개월 또는 심지어 년의 시간 간격이 있을 수 있다.
방법, 프로토콜, 시약 등은 다양할 수 있기 때문에, 본 발명이 본 명세서에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 시약 등에 한정되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아님을 이해아여야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 세포 배양물 pH의 변화, 바람직하게는 감소 및 뉴클레오시드, 전이금속염 및 당, 바람직하게는 우리딘, 염화망간(Ⅱ) 및 갈락토오스를 포함하는 조성물의 세포 배양물에 대한 공급에 의해 재조합 단백질, 바람직하게 재조합 항체의 갈락토오스 함량이 증가된다는 발견에 기초하고 있다.
용어 "갈락토오스 함량의 증가"는 재조합 단백질 중의 갈락토실화된 동형단백질(galactosylated isoforms) G1F, G1'F 및 G2F의 하나 또는 모두의 퍼센티지가, 세포 배양물의 pH가 변화, 바람직하게는 감소되고, 뉴클레오시드, 전이금속염 및 당을 포함하는 조성물, 바람직하게 우리딘, 염화망간 및 갈락토오스를 포함하는 조성물이 세포 배양물에 공급될 때, 일정한 pH로 유지되고 상기 정의된 조성물이 공급되지 않는 세포 배양물에 의해 제조되는 동일한 재조합 단백질 중의 이러한 동형단백질의 퍼센티지에 비교하여 더 높다는 것을 의미하기 위한 것이다. 이러한 G1F, G1'F 및 G2F의 퍼센티지의 증가는 G0 및 G0F와 같은 비갈락토실화된 단백당형(non-galactosylated glycoforms)의 감소를 수반한다.
G0F, G1F, G1'F 및 G2F 단백당형은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00001
상기에서, Gn는 N-아세틸글루코사민, Fuc는 푸코오스, M은 만노스, Gal은 갈락토오스이다. 이 글리칸(glycan) 구조는, IgG1 재조합 항체의 경우 Fc 영역의 Cγ2 도메인의 아스파라긴 301에 위치할 수 있는 N-글리코실화 부위에 연결된다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 재조합 단백질 중의 G1F, G1'F 및 G2F 동형단백질의 퍼센티지의 합계가, 일정한 pH에서 유지되고 상기 정의된 조성물이 공급되지 않은 세포 배양물에 의해 제조된 동일한 재조합 단백질 중의 G1F, G1'F 및 G2F 동형단백질의 퍼센티지의 합계에 비하여, 적어도 1%, 2% 또는 3%, 바람직하게 적어도 4%, 5%, 6% 또는 7%, 더욱 바람직하게 적어도 8%, 9% 또는 10%, 가장 바람직하게 적어도 11% 또는 12% 증가하면, 갈락토오스 함량이 증가된다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 제조된 재조합 단백질 중의 G0F 동형단백질의 퍼센티지가, 일정한 pH에서 유지되고 상기 정의된 조성물이 공급되지 않은 세포 배양물에 의해 제조된 동일한 재조합 단백질 중의 G0F 동형단백질의 퍼센티지에 비하여 적어도 1%, 2% 또는 3%, 바람직하게 적어도 4%, 5% 또는 6%, 더욱 바람직하게 적어도 7%, 8% 또는 9%, 가장 바람직하게 10% 증가하면, 갈락토오스 함량이 증가된다.
갈락토오스 함량은 세포 배양 배지에 세포를 접종(inoculation)한 후 8일 내지 14일 후에 결정된다. 바람직한 실시예에서, 갈락토오스 함량은 세포 배양 배지에 세포를 접종한 후 9 내지 10일 후에 결정된다.
재조합 단백질의 상이한 글리칸 동형단백질, 특히 갈락토실화된 동형단백질 G1F, G1'F 및 G2F의 상대적인 비율, 및 결과적으로 갈락토오스 함량은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게, 재조합 단백질이 탈글리코실화되고(deglycosylated) 형광 유도체화제(fluorescence derivatizing agent)로 처리된 후, 레이저 유도 형광 검출을 이용하는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis using laser-induced fluorescence detection, CE-LIF)이 이용된다. 각각의 글리칸 동형단백질의 상대적인 함량은 형광 검출에 의해 결정되고, 상응하는 피크의 면적 % 값을 이용하여 계산된다. 예시적인 방법이 하기 실시예에 기술된다.
용어 "세포 배양 배지에의 세포의 접종"은 세포의 성장 및 증식에 적합한 조건 하에서, 세포를 세포 배양 배지에 접촉시키는 단계를 나타낸다.
용어 "재조합 단백질"은 포유류 숙주 세포에 도입되는 재조합 핵산 분자 상에 유전자가 운반되는 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 및 번역의 결과로, 포유류 세포 배양물에 의해 제조될 수 있는 임의의 단백질을 나타낸다. 재조합 단백질은 이용된 포유류 세포에서 자연적으로 생성될 수 없거나, 또는 재조합 단백질은 이용된 포유류 세포에서 자연적으로 생성될 수 있으나, 낮은 수준으로 생성될 수 있다. 바람직하게, 재조합 단백질은 포유류 숙주 세포에 의해 자연적으로 제조되지 않는다.
특히, 용어 "재조합 단백질"은 갈락토오스 함량이 단백질의 생물학적 기능에 영향을 미치는 사이토카인, 성장 인자, 응고 인자 및 항체와 같은 치료용 단백질을 포함한다. 바람직하게, 재조합 단백질은 항체와 같은 Fc 함유 단백질 또는 IgG 항체의 Fc 부분과 다른 단백질의 일부 또는 전부의 융합 단백질이다.
IgG 항체의 Fc 부분과 다른 단백질의 일부 또는 전부의 융합 단백질의 예는 에타너셉트(etanercept)(TNF 수용체와 융합), 애플리버셉트(aflibercept)(VEGF 수용체 1 및 2의 세포외 도메인과의 융합), 아바타셉트(abatacept)(CTLA-4의 세포외 도메인과의 융합) 및 베라타셉트(belatacept)(CTLA-4의 세포외 도메인과의 융합)을 포함한다.
더욱 바람직하게, 재조합 단백질은 재조합 항체이다. 용어 "재조합 항체"는 유전자가 포유류 숙주 세포로 도입되는 재조합 핵산 분자 상에 운반되는 상기 재조합 항체를 코딩하는 유전자의 전사 및 번역의 결과로 포유류 세포 배양물에 의해 제조될 수 있는 임의의 항체를 나타낸다. 재조합 항체는 이용된 포유류 세포에서 자연적으로 생성될 수 없거나, 또는 재조합 항체는 이용된 포유류 세포에서 자연적으로 생성될 수 있으나, 낮은 수준으로 생성될 수 있다. 바람직하게, 재조합 항체는 그 제조에 이용된 포유류 숙주 세포에 의해 자연적으로 제조되지 않는다.
용어 "면역글로불린" 및 "항체"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 면역글로불린은 단일 클론 항체, 다중 특이성 항체(예를 들면, 이중 특이성 항체) 또는 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 그의 단편일 수 있다. 자연발생 항체는 다양한 구조를 갖는 분자이다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 다이설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는, 3개 또는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4)이 수반되는, 가변 중 도메인(variable heavy domain) 또는 중쇄 가변 도메인(heavy chain variable domain)으로도 호칭되는, 가변 도메인(VH)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는, 불변 경쇄(CL) 도메인이 수반되는, 가변 경 도메인(variable light domain) 또는 경쇄 가변 도메인(light chain variable domain)으로도 호칭되는, 가변 도메인(VL)을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 호칭되는 두 가지 형태 중 하나에 할당될 수 있다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 단일 사슬 항체 분자; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 및 항체 단편으로 형성된 다중 특이성 항체를 포함한다.
바람직하게, 면역글로불린은 단일 클론 항체이다. 본 명세서에 사용된 용어 "단일 클론 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며, 즉 집단에 포함되는 개별적인 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 전형적으로 상이한 결정 부위(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (다중클론) 항체 제제와 달리, 각각의 단일 클론 항체는 항원 상의 단일 결정 부위에 대한 것이다. 수식어 "단일 클론"은 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다.
면역글로불린은 쥣과 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgM, IgA, IgD 또는 IgE, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 또는 IgE, 또는 그 조합 또는 그 단편일 수 있다.
면역글로불린은 하기 항원을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 단백질의 어느 하나 또는 조합을 인식할 수 있다: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, CD152, IL-la, IL-1β, IL-1, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-23, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, IL-13 수용체, IL-18 수용체 서브유닛, PDGF-β, 및 그의 유사체, PLGF, VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-p1, EGF 수용체, PLGF 수용체, VEGF 수용체, 혈소판 수용체 gpⅡb/Ⅲa, 트롬보포이에틴 수용체, 아포토시스 수용체 PD-1, 간세포 성장 인자, 오스테오프로테게린 리간드, 인터페론 감마, B 림프구 자극인자 BLyS, T-세포 활성화 조절자 CTLA-4, C5 보체, IgE, 종양특이 항원 CA125, 종양특이 항원 MUC1, PEM 항원, ErbB2/HER-2, 환자의 혈청에 증가된 수준으로 존재하는 종양-관련 에피토프, 유방암, 결장암, 편평 상피 세포암, 전립선암, 췌장암, 폐암 및/또는 신장암 세포에서, 및/또는 흑생종 세포, 신경 교종 세포 또는 신경 모세포종 세포에서 발현되는 암관련 에피토프 또는 단백질, 종양의 괴사성 코어, 인테그린 알파 4 베타 7, 인테그린 VLA-4, B2 인테그린, α4β1 및 α4β7 인테그린, TRAIL 수용체 1,2, 3 및 4, RANK, RANK 리간드(RANKL), TNF-α, 부착 분자 VAP-1, 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 세포간 부착 분자-3(ICAM-3), 루코인테그린 부착 분자(leukointegrin adhesin), 혈소판 당단백질 gp　Ⅱb/Ⅲa, 심장 미오신 중쇄, 부갑상선 호르몬, 스클레로스틴(sclerostin), MHC I, 암배아 항원(CEA), 알파페토단백질(AFP), 종양 괴사 인자(TNF), Fc-y-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, L-셀렉틴 및 IFN-γ.
면역글로불린은 예를 들면, 아펠리모맙(afelimomab), 압식시맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 아르시투모맙(arcitumomab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 세투시맙(cetuximab), 데노수맙(denosumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 임시로맙(imciromab), 카프로맙(capromab), 인플릭시맙(infliximab), 이필리무맙(ipilimumab), 압식시맙(abciximab), 리툭시맙(rituximab), 바실릭시맙(basiliximab), 팔리비주맙(palivizumab), 나탈리주맙(natalizumab), 니볼루맙(nivolumab), 노페투모맙(nofetumomab), 오말리주맙(omalizumab), 다클리주맙(daclizumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 무로모납-CD3(muromonab-CD3), 에드레콜로맙(edrecolomab), 젬투주맙(gemtuzumab), 골리무맙(golimumab), 세르톨리주맙(certolizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오파투무맙(ofatumumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 페르누주맙(pertuzumab), 라니비주맙(ranibizumab), 로모소주맙(romosozumab), 토실리주맙(tocilizumab), 토시투모맙(tositumomab), 클레놀릭시맙(clenoliximab), 켈릭시맙(keliximab), 갈릭시맙(galiximab), 포르라비루맙(foravirumab), 렉사투무맙(lexatumumab), 베바시주맙(bevacizumab) 및 베돌리주맙(vedolizumab)일 수 있다.
본 발명의 면역글로불린은 바람직하게 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자와 같은 IgG 분자이다. 더욱 바람직하게, 면역글로불린은 IgG1이다. 더욱더 바람직하게, 면역글로불린은, 적어도 Fc 부분이 인간인 IgG1이다. 면역글로불린은 IgG1의 Fc 부분이 인간이고, 가변 영역은 생쥐 근원의 것인 쥐-인간 키메라 IgG1일 수 있다. 가장 바람직하게, 키메라 면역글로불린은 리툭시맙 또는 인플릭시맙이다.
리툭시맙은 키메라 항-CD20 항체(chimeric anti-CD20 antibody)이며, 예를 들면, WO 94/11026에 상세하게 기재되어 있다.
인플릭시맙은 키메라 항-TNFα 항체(chimeric anti-TNFα antibody)이며, 예를 들면, WO 92/16553에 상세하게 기재되어 있다.
면역글로불린은 가변 도메인의 CDRs이 생쥐로부터 유래되고, 가변 도메인의 프레임워크 영역은 인간으로부터 유래된 쥐 프로제니터(murine progenitor)의 인간화된 IgG1 형태일 수 있다. 가장 바람직하게, 인간화된 항체는 트라스투주맙 또는 베바시주맙이다.
트라스투주맙은 인간화된 항-HER2 항체이며, 예를 들면, WO 92/22653에 상세하게 기재되어 있다.
베바시주맙은 인간화된 항-VEGF 항체이며, 예를 들면, WO 98/45331에 상세하게 기재되어 있다.
면역글로불린은 완전한 인간 IgG1 항체, 즉 모든 부분이 인간 근원으로부터 유래된 항체일 수 있다. 가장 바람직하게, 인간 항체는 아달리무맙 또는 데노수맙이다.
아달리무맙은 인간 항-TNF-α 항체이며, 예를 들면, WO 97/29131에 상세하게 기재되어 있다.
데노수맙은 인간 항-RANKL 항체이며, 예를 들면, WO 03/002713에 상세하게 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 항체는 리툭시맙 또는 베바시주맙일 수 있다.
본 명세서에서 단일 클론 항체는 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이며, 사슬의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체, 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함한다.
또한, 본 명세서에서 단일 클론 항체는 "인간화된" 항체를 포함한다. 그러한 항체는 비-인간(예를 들면, 쥐) 항체의 "인간화(humanization)"에 의해 수득되며, 동물 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열만을 함유한다. 분자의 대부분은 인간 아미노산 서열로 이루어진다. 인간 수여자 항체의 초가변 영역(hypervariable region)으로부터의 잔기는 원하는 결합 특성을 갖는 비-인간 공여자 항체의 초가변 영역으로부터 잔기에 의해 대체된다.
마지막으로, 본 명세서에서 단일 클론 항체는 인간 항체 라이브러리의 스크리닝에 의해 초기에 수득될 수 있는 완전 인간 항체를 포함한다.
본 발명의 방법에서, 재조합 단백질은 포유류 세포에서 제조된다. 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 적합한 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(DHFR 선별 마커와 함께 사용된 dhfr 네거티드 CHO 세포를 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포, SP2 세포, 원숭이 신장 CV1, 인간 배아 신장 세포주 293; 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 생쥐 세르톨리 세포(TM4), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDC), 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3 A), human lung 세포 (W138), human liver 세포 (Hep G2), 생쥐 유방암 세포 (MMT 060562), TRI 세포, MRC 5 세포 and FS4 세포를 포함한다. 바람직하게, 숙주 세포는 설치류로부터 유래된다. 더욱 바람직하게, 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이며, 더욱더 바람직하게 세포는 CHO-K1 세포이며, 가장 바람직하게 세포는 무혈청 배지(CHO-S)에서의 성장에 적합한 CHO-K1 세포이며, 및/또는 Invitrogen(Catalogue number R-800-07)으로부터 수득할 수 있다.
포유류 세포는, 포유류 숙주 세포에서 재조합 단백질을 안정하게 제조할 수 있는 발현 벡터와 같은 적어도 하나의 재조합 핵산 분자로 형질전환, 즉 유전자적으로 변형되었다.
재조합 항체의 제조에 있어서, 포유류 세포는 항체의 중쇄 및 경쇄를 모두 코딩하는 하나의 재조합 핵산 분자, 또는 하나는 항체의 경쇄를 코딩하고 다른 하나는 항체의 중쇄를 코딩하는 2개의 재조합 핵산 분자에 의해 형질전환될 수 있다. 일 실시형태에서, 재조합 항체는 항체의 중쇄 및 경쇄를 모두 코딩하는 하나의 재조합 핵산 분자로부터 제조된다. 바람직한 실시형태에서, 재조합 항체는 하나의 재조합 핵산 분자로부터 제조되며, 중쇄 및 경쇄의 발현은 동일하거나 상이할 수 있는 별개의 프로모터에 의해 제어된다. 가장 바람직한 실시형태에서,재조합 항체는 하나의 재조합 핵산 분자로부터 제조되며, 중쇄 및 경쇄의 발현은 동일한 별개의 프로모터에 의해 제어된다.
용어 "배지", "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 포유류 세포를 성장시키기 위하여 요구되는 영양분을 함유하는 용액을 나타낸다. 전형적으로, 세포 배양 배지는 최소 성장 및/또는 생존을 위하여 세포가 필요로 하는 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 리피드 및 미량원소를 공급한다. 바람직하게, 배지는 모든 성분 및 그 농도가 알려져 있다는 점에서 화학적으로 규명된다. 또한, 바람직하게, 배지는 무혈청이고, 가수분해물을 함유하지 않으며, 동물로부터 유래된 성분을 전혀 함유하지 않는다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 배지는 무혈청이고, 가수분해물을 함유하지 않고, 동물로부터 유래된 성분을 전혀 함유하지 않으나, HEPES 및 Pluronic® F-68를 함유한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계(a) 및 (b), 즉 공급 전 단계에서 이용된 배지는 재조합 인슐린, 리피드, 구연산 철 및 PEG20000이 보충된 PowerCHO-2 CD(Catalogue number BE12-771Q로 Lonza로부터 입수 가능)이다. 가장 바람직한 실시형태에서, PowerCHO-2 CD 배지에는 재조합 인슐린, 리피드, 구연산 철 및 PEG20000, 및 추가량의 L-티로신, L-페닐알라닌 및 L-글루타민이 보충되어 있다. 추가량의 L-티로신, L-페닐알라닌 및 L-글루타민은 8 mM L-글루타민, 1.2 mM L-티로신 및 2 mM L-페닐알라닌을 포함한다.
바람직하게, 부가적인 양의 우리딘, 염화망간 및 갈락토오스는 세포 배양 배지에 첨가되지 않지만, 이들 성분 중 일 이상은 기본 세포 배양 배지에 존재할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들이 이용된 화학적으로 규명된 배지에 존재하는 경우, 세포 배양 배지는 이들 화합물의 일부 또는 전부를 함유할 수 있다. 더욱 바람직하게, 세포 배양 배지는 갈락토오스를 포함하지 않는다.
세포 배양 배지는 바람직하게 멸균 여과되고, 더욱 바람직하게 0.1 마이크론 기공 크기를 갖는 필터를 이용하여 멸균 여과된다.
"제1 pH"로도 호칭되는 본 발명의 방법의 단계 a)에서의 세포 배양 배지의 pH는 제1 시간 동안, 바람직하게는 Na2CO3 또는 H3PO4의 첨가에 의해 pH 7.15 내지 7.25의 범위로 유진된다. 제1 시간은, 포유류 세포를 세포 배양 배지에 접종한 후 60 내지 80 시간, 바람직하게 63 내지 79 시간, 더욱 바람직하게 66 내지 78 시간, 가장 바람직하게 70 시간이다.
제1 시간 후, 세포 배양 배지의 pH는 제2 pH로 변화, 바람직하게는 낮아진다. 더욱 바람직하게, 제2 pH는 제1 pH보다 0.05 내지 0.3 pH 단위(pH units) 낮으며, 더욱더 바람직하게, 제2 pH는 제1 pH보다 0.15 내지 0.25 pH 단위 낮다. 가장 바람직하게, 제2 pH는 pH 7.00이다. pH는 적합한 산 또는 CO2 가스를 첨가함으로써, 바람직하게 H3PO4을 첨가함으로써 낮아질 수 있다. pH는 생존 세포 밀도가 4.0 내지 7.0 × 106에 도달했을 때, 변화된다. 세포가 제2 pH에서 배양되는 제2 시간은 약 6 내지 11 일, 또는 약 6 내지 8 일, 바람직하게 약 7 일이다. 따라서, 본 발명의 방법에서 전체 배양 기간은 포유류 세포를 세포 배양 배지에 접종한 후 8 내지 14일이다. 바람직하게, 본 발명의 방법에서 전체 배양 기간은 포유류 세포를 세포 배양 배지에 접종한 후 9 내지 10일이다.
본 발명의 방법에서, 세포는 단계 (c)에서 하기 성분: (ⅰ) 일 이상의 뉴클레오시드, (ⅱ) 일 이상의 전이금속염 및 (ⅲ) 일 이상의 당 (이하, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)으로도 호칭됨)의 적어도 2종을 포함하는 조성물이 공급되며, 특히 조성물은 우리딘, 염화망간 및 갈락토오스를 포함한다.
용어 "공급"은, 조성물이 단계 (a) 또는 (b)의 세포 배양물에 첨가되는 것을 의미하고, 공급 중에 배지 또는 세포가 배출되지 않는다. 공급은 전형적으로 연속적으로 일어나지 않고, 정해진 시점에 이루어진다. 본 발명의 방법에서, 조성물은 하기에 상술되는 정해진 시점에 공급된다.
공급되는 조성물은, 예를 들면, 물 또는 적합한 버퍼 중에 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)만을 포함할 수 있거나, 또는 추가적으로 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 함유하는 세포 배양 배지에 기초할 수 있다. 바람직하게, 본 방법의 단계 (c)에서 공급되는 조성물은 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 추가적으로 함유하는 세포 배양 배지에 기초한다. 이 세포 배양 배지는 세포의 초기 배양에 이용된 세포 배양 배지, 즉 접종 후 및 공급 전(단계 (a) 및 (b))에 이용되는 세포 배양 배지와 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게, 공급에 이용되는 세포 배양 배지는 세포의 초기 배양(즉, 단계 (a) 및 (b))에 이용된 것과 상이하다. 더욱 바람직하게, 공급에 이용되는 세포 배양 배지는 Sigma Aldrich의 ExCell®이다. 다른 바람직한 실시예에서, 공급에 이용되는 세포 배양 배지는 Sigma Aldrich의 맞춤화 무염(salt-free, SF) ExCell®이다.
성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)에 더하여, 공급에 이용되는 세포 배양 배지는 기본 세포 배양 배지에 더하여 아미노산 및 다른 보충제와 같은 다른 성분을 더 함유할 수 있다. 바람직하게, 공급에 이용되는 세포 배양 배지는 L-발린, L-시스테인, L-페닐알라닌, L-세린, 및 BD Recharge와 같은 화학적으로 규명된 보충제의 일 이상을 추가적으로 함유한다. 더욱 바람직하게, 공급에 이용되는 세포 배양 배지는 (ⅰ) 내지 (ⅲ)에 더하여, L-발린, L-시스테인, L-페닐알라닌, L-세린 및 화학적으로 규명된 보충제를 함유한다. 가장 바람직하게, 공급에 이용되는 세포 배양 배지는 ExCell® 또는 맞춤화 무염 SF ExCell®이며, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)에 더하여, L-발린, L-시스테인, L-페닐알라닌, L-세린 및 화학적으로 규명된 보충제를 포함한다. 공급에 이용되는 세포 배양 배지 중 L-발린의 농도는 34 mM이며, 공급에 이용되는 세포 배양 배지 중 L-시스테인의 농도는 8.3 mM이며, 공급에 이용되는 세포 배양 배지 중 L-페닐알라닌의 농도는 4.5 mM이며, 공급에 이용되는 세포 배양 배지 중 L-세린의 농도는 38 mM이다.
공급에 이용되는 세포 배양 배지는 바람직하게 멸균여과되고, 더욱 바람직하게 0.2 또는 0.1 마이크론 기공 크기를 갖는 필터를 이용하여 멸균여과된다.
다른 실시예에서, 공급에 이용되는 조성물은 티미딘, 프럭토오스, 만노스, 수크로오스 및 N-아세틸만노사민을 함유하지 않는다.
공급에 이용되는 조성물은 일 이상의 뉴클레오시드를 포함한다. 뉴클레오시드는 질소 염기와 리보오스 및 데옥시리보오스와 같은 5개의 탄소 원자를 포함하는 당으로 이루어진다. 뉴클레오시드의 예는 시티딘, 우리딘, 아데노신, 구아노신, 티미딘 및 이노신을 포함한다. 바람직하게, 뉴클레오시드는 우리딘이다.
공급에 이용되는 조성물 중의 일 이상의 뉴클레오시드의 농도는 1 내지 20 mM이며, 바람직하게 1.5 내지 15 mM이며, 더욱 바람직하게 2 내지 12 mM이며, 더욱더 바람직하게 2.5 내지 10 mM이며, 가장 바람직하게 3 mM이다. 공급에 이용되는 조성물 중의 우리딘의 농도는 1 내지 20 mM이며, 바람직하게 1.5 내지 15 mM이며, 더욱 바람직하게 2 내지 12 mM이며, 더욱더 바람직하게 2.5 내지 10 mM이며, 가장 바람직하게 3 mM이다.
공급에 이용되는 조성물은 일 이상의 전이금속염을 더 포함한다. 전이금속염은 전이금속과 카운터 이온의 염이다. 전이금속은 Fe, Co, Cr, Mn, Mo, Ni, Cu, Zn을 포함하며, 적합한 카운터 이온은 클로라이드(Cl-), 설페이트(SO4 2-) 및 포스페이트(PO4 3-)를 포함한다. 바람직하게, 전이금속염은 망간염이며, 가장 바람직하게 염화망간(Ⅱ)이다.
공급에 이용되는 조성물 중의 일 이상의 전이금속염의 농도는 0.002 mM 내지 0.1 mM이며, 바람직하게 0.005 mM 내지 0.09 mM이며, 더욱 바람직하게 0.008 mM 내지 0.08 mM이며, 더욱더 바람직하게 0.01 mM 내지 0.07 mM이며, 가장 바람직하게 0.06 mM이다. 공급에 이용되는 조성물 중의 염화망간(Ⅱ)의 농도는 0.002 mM 내지 0.1 mM이며, 바람직하게 0.005 mM 내지 0.09 mM이며, 더욱 바람직하게 0.008 mM 내지 0.08 mM이며, 더욱더 바람직하게 0.01 mM 내지 0.07 mM이며, 가장 바람직하게 0.06 mM이다.
공급에 이용되는 조성물은 일 이상의 당을 더 포함한다. 당은 단쇄 탄수화물이며, 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 갈락토오스, 말토오스 및 락토오스를 포함한다. 바람직하게, 당은 갈락토오스이다.
공급에 이용되는 조성물 중의 일 이상의 당의 농도는 5 mM 내지 100 mM이며, 바람직하게 7.5 mM 내지 75 mM이며, 더욱 바람직하게 10 mM 내지 60 mM이며, 더욱더 바람직하게 12.5 mM 내지 50 mM이며, 가장 바람직하게 15 mM이다. 공급에 이용되는 조성물 중의 갈락토오스의 농도는 5 mM 내지 100 mM이며, 바람직하게 7.5 mM 내지 75 mM이며, 더욱 바람직하게 10 mM 내지 60 mM이며, 더욱더 바람직하게 12.5 mM 내지 50 mM이며, 가장 바람직하게 15 mM이다.
일 실시형태에서, 공급에 이용되는 조성물 중의 일 이상의 뉴클레오시드의 농도는 1 내지 20 mM이며, 공급에 이용되는 조성물 중의 일 이상의 전이금속염의 농도는 0.002 mM 내지 0.1 mM이며, 공급에 이용되는 조성물 중의 일 이상의 당의 농도는 5 mM 내지 100 mM이다. 바람직한 실시예에서, 공급에 이용되는 조성물 중의 일 이상의 뉴클레오시드의 농도는 3 mM이며, 공급에 이용되는 조성물 중의 일 이상의 전이금속염의 농도는 0.06 mM이며, 공급에 이용되는 조성물 중의 일 이상의 당의 농도는 15 mM이다.
일 실시형태에서, 공급에 이용되는 조성물 중의 우리딘의 농도는 1 내지 20 mM이며, 공급에 이용되는 조성물 중의 염화망간(Ⅱ)의 농도는 0.002 mM 내지 0.1 mM이며, 공급에 이용되는 조성물 중의 갈락토오스의 농도는 5 mM 내지 100 mM이다. 바람직한 실시예에서, 공급에 이용되는 조성물 중의 우리딘의 농도는 3 mM이며, 공급에 이용되는 조성물 중의 염화망간(Ⅱ)의 농도는 0.06 mM이며, 공급에 이용되는 조성물 중의 갈락토오스의 농도는 15 mM이다.
세포 배양물에, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물은 적어도 1회, 바람직하게 적어도 2회, 더욱 바람직하게 2회 공급된다. 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물의 공급은 바람직하게 세포 배양 배지에 세포를 접종한 후, 4 내지 6일 후에 이루어지며, 바람직하게 5일 후에 이루어진다. 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물의 공급이 2회 수행되는 경우, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물의 제1 공급은 세포 배양 배지에 대한 접종 후 4일 내지 6일 후에, 바람직하게 5일 후에 수행되며, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물의 제2 공급은 세포 배양 배지에 대한 접종 후 6일 내지 8일 후에, 바람직하게 7일 후에 수행된다. 더욱 바람직하게, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물의 제1 공급은 접종 5일 후에 수행되며, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물의 제2 공급은 접종 7일 후에 수행된다.
제1 공급 단계에서, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물은 8.5 내지 10.5배, 바람직하게 9.0 내지 10.0배, 가장 바람직하게 9.3배 희석된다. 제2 공급 단계에서, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물은 9.5 내지 11.5배, 바람직하게 10.0 내지 11.0배, 가장 바람직하게 10.3배 희석된다.
바람직하게, 일 이상의, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물의 공급 단계 전에, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)이 첨가되지 않은 점을 제외하고는 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물과 동일한 조성물의 공급 단계가 선행된다. 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)이 첨가되지 않은 점을 제외하고는 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)을 포함하는 조성물과 동일한 조성물의 공급은 세포 배양 배지에 대한 접종 후, 2일 내지 4일 후, 바람직하게 3일 후에 이루어진다.
따라서, 본 발명의 방법은 바람직하게 하기 공급 단계를 포함한다:
c1) 접종 3일 후에, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)이 첨가되지 않은 조성물의 공급;
c2) 접종 5일 후에, 성분 (ⅰ) 내지 (ⅲ)이 첨가된 조성물의 공급; 및
c3) 접종 7일 후에, (ⅰ) 내지 (ⅲ)이 첨가된 조성물의 공급.
본 발명의 방법에서, 세포 배양물, 즉 포유류 세포를 포함하는 세포 배양 배지의 온도는 바람직하게 전체 배양 과정 중에 일정하게 유지되며, 이는 온도가 과정 중에 활발하게 상향 또는 하향 조절되지 않으며, 항상 동일한 미리 설정된 온도가 사용된다는 것을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 온도의 미세한 변화가 배양 과정 중에 발생할 수 있다. 바람직하게, 배양 과정 중 온도는 36℃ 내지 38℃로 설정되며, 더욱 바람직하게 온도는 37℃로 설정된다.
본 발명의 방법에서, 삼투질 농도는 전체 과정에 걸쳐, 즉 청구범위에 정의된 단계 (a) 내지 (c)에 걸쳐 바람직하게 400 mOsm/㎏보다 낮게 유지된다. 바람직하게, 삼투질 농도는 250 내지 400 mOsm/㎏의 범위이며, 더욱 바람직하게 300 내지 380 mOsm/㎏의 범위이며, 가장 바람직하게 330 내지 370 mOsm/㎏의 범위이다. 본 명세서에 사용된 용어 "삼투질 농도"은 용매 킬로그램 당 용질의 오스몰(osmoles)로 정의되며, 이온화된 또는 비이온화된 분자를 포함할 수 있다. 400 mOsm/㎏ 미만의 삼투질 농도와 같은 낮은 삼투질 농도는 낮은 염 농도를 갖는 매질을 이용함으로써 유지될 수 있다. 특히, 공급에 이용되는 조성물은 낮은 염 농도를 갖거나, 또는 공급 단계 c)에 이용된 전이금속염 이외에 염을 함유하지 않는다.
본 발명의 방법에서, 세포는 호기성 조건, 즉 50 ± 40%의 용존 산소 수준 하에 배양된다. 이산화탄소의 수준은 선택적으로 혼합 속도 또는 에어레이션(aeration)의 세기를 조절함으로써, 0 내지 90 mmHg의 범위 내로 유지된다.
본 발명의 방법은 글루코오스 제한 없이 수행된다. 따라서, 글루코오스 수준을 5 내지 35 mM의 범위, 바람직하게 10 내지 25 mM의 범위로 유지하기 위하여, 글루코오스가 세포 배양물에 첨가된다.
세포 배양물에 거품이 발생하는 경우, 소포제(antifoam agent)가 본 발명의 방법 중 임의의 시점에 배양물에 첨가될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 재조합 단백질이 제조된 후, 생성물이 수확된다. 포유류 세포로부터 발현된 재조합 단백질, 특히 항체는 전형적으로 배양 과정 중에 세포 배양액으로 분비되므로, 배양 과정의 마지막에 생성물 수확은 세포로부터 재조합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 분리함으로써 이루어진다. 세포 분리 방법은, 면역글로불린 생성물의 품질에 영향을 미칠 수 있는 세포 파편의 증가 및 프로테아제 및 다른 분자의 배출을 방지하기 위하여 세포 파괴를 최소화하도록 온화하여야 한다. 일반적으로, 재조합 단백질을 포함하는 세포 배양액의 수확은 원심분리 및/또는 여과를 포함하며, 이에 의해 재조합 단백질이 상청액 및 여액에 각각 존재한다. 팽창층 흡착 크로마토그래피(Expanded bed adsorption chromatography)가 원심분리/여과 방법을 피하기 위한 대안이다.
재조합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 수확한 후에, 재조합 단백질은 세포 배양액으로부터 정제되어야 한다. 재조합 단백질, 특히 재조합 항체의 정제는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피와 같은 일련의 크로마토그래피 단계에 의해 일반적으로 이루어진다. 또한, 정제 과정은 일 이상의 한외여과(ultrafiltration), 나노여과(nanofiltration) 또는 투석여과(diafiltration) 단계를 포함할 수 있다. PCT/EP2015/054862에 기재된 특히 적합한 방법은 플로우-스루 모드(flow-through mode)에서의 음이온 교환 크로마토그래피, 단백질 A 수지 상의 친화성 크로마토그래피 및 결합 및 용리 모드(bind-and-elute mode)에서의 양이온 교환 크로마토그래피의 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 적어도 500 또는 1,000 리터, 바람직하게 적어도 5,000 또는 8,000 리터, 가장 바람직하게 10,000 또는 20,000 리터의 배양 부피(culture volume)를 의미하는 대규모로 재조합 단백질을 제조하는데 적합하다.
본 발명의 방법은 바이오시밀러 치료용 항체의 생물학적 동등성을 그의 표준 제품, 즉 시판 치료용 항체까지 향상시킨다. 바이오시밀러 치료용 항체는 오리지널 제품에 대한 특허보호가 만료된 후 시판되고, 오리지널 제품과 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 단백질 번역후 변형(posttranslational modifications)에 있어서 약간 상이할 수 있는 치료용 항체이다. 그럼에도 불구하고, 바이오시밀러 치료용 항체는 오리지널 제품과 동일한 생리학적 효과를 나타낸다. 시판된 항체의 바이오시밀러 제품에 대한 시판 허가 신청이 제출되는 경우, 바이오시밀러 항체의 구조가 표준 제품에 필적한다는 것을 보여주어야 한다. 글리코실화 단백질의 생물학적 동등성을 평가하는 중요한 파라미터의 하나는 항체의 작용 기능에 영향을 미칠 수 있는 글리코실화 패턴이다.
본 발명의 방법을 이용함으로써, 바이오시밀러 항체의 글리코실화 패턴, 특히 갈락토오스 수준이 표준 제품과 비슷하며, 이에 의해 pH 감소가 이루어지지 않고, 우리딘, 염화망간(Ⅱ) 및 갈락토오스를 포함하는 조성물이 공급되지 않은 치료용 항체의 글리코실화 패턴 및 생물학적 동등성에 비하여 생물학적 동등성을 향상시킨다.
하기 실시예 및 도표는 설명 목적으로 제공된다. 따라서, 실시예 및 도표는 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 제시된 원리의 추가적인 변경을 명확하게 예측할 수 있을 것이다.
실시예
본 발명의 방법은 하기 비제한적 실시예를 참조하여 뒷받침되고 설명된다.
하기 표에 제시된 선택된 실험들은 상이한 스케일의 유가 배양(fed-batch cultures)에서 증식된 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 생쥐-인간 키메라 항-CD20, IgG1 항체인 리툭시맙에 의해 수행되었다.
그러나, 본 발명의 방법은 특정 항체, 및 면역글로불린의 발현에 사용된 특정 숙주 세포에 의존하지 않는다. 단백질 갈락토실화 프로파일 및 최대 수확량 측면에서 최적화된 발현 모드 및 선택된 배양 조건에 대해서도 마찬가지이다.
1. 방법
1.1 세포 배양
세포
상업적으로 입수가능한 통상적인 CHO K1 세포주의 현탁-선호 서브클론(suspension-preferring subclone)으로부터 유래되고, 무혈청 배지에서의 성장에 적응되고, 그의 우수한 성장(교반된 배양물에서의 감소된 응집을 포함) 및 형질주입 효율에 있어서 원래 선택된, 중국 햄스터 난소 세포주 S(CHO-S)를 Invitrogen(Cat. No.: R-800-07, Lot. 1335750)으로부터 구입하였다. CHO-S 세포를 무혈청의 화학적으로 정의된 PowerCHO-2 배지(Lonza Inc US)에서의 성장에 적응시켰다.
유가 배양
모델 항체를 발현하도록 유전자 조작된 CHO 세포를 초기에 기본 배지 PowerCHO-2 (Lonza)에서 성장시켰다. 배양 (접종 후) 3일째부터 매 2일째에, 3배 농축된(3×) ExCell feed(37g/L; SAFC)를 15%의 초기 작업 부피(기본 배지 및 접종물의 부피)에 대한 공급량으로 배양물에 쇼트-와이즈 모드(shot-wise mode)로 첨가되었다.
실시예에 이용된 배지 및 추가적인 보충제의 공급처 및 카탈로그 번호(Catalogue Numbers)를 하기에 요약한다:
PowerCHO-2 CD Lonza, Cat. No.: BE12-771Q
ExCell® CD CHO Fusion SAFC, Cat. No.: 24365C
SF ExCell® CD CHO Fusion SAFC, customized
L-글루타민 Gibco, Cat. No.: 25030
Sigma-Aldrich, Cat No.: G5792
L-프롤린 (Pro; L-Pro) Sigma-Aldrich, Cat No.: P8865
L-발린 (Val; L-Val) Sigma-Aldrich, Cat No.: V4638
L-시스테인 (Cys; L-Cys) Sigma-Aldrich, Cat No.: C5360
L-페닐알라닌 (Phe; L-Phe) Sigma-Aldrich, Cat No.: P8740
L-티로신 (Tyr; L-Tyr) Sigma-Aldrich, Cat No.: T4321
L-세린 (Ser; L-Ser) Sigma-Aldrich, Cat No.: S1315
BD RechargeTM Supplement Becton-Dickinson Biosciences, Cat. No.: 670002
우리딘 Sigma-Aldrich, Cat. No.: U3003
이염화망간(Manganese(Ⅱ) chloride) 용액 Sigma-Aldrich, Cat. No.: M1787
β-D-갈락토오스 Sigma-Aldrich, Cat. No.: G5388
배양 온도는 37℃로 유지하였다. pH는 0.5 M Na2CO3 또는 H3PO4를 첨가함으로써 pH 7.05 내지 pH 7.15의 범위로 유지하였다. 용존 산소 (DO) 설정값은 40%이었다. 관련 대사산물을 매일 측정하였다. 글루코오스 수준은 약 20 mM로 유지되었다. 세포는 9일 내지 10일 동안 배양되었다.
실험은 1, 5, 10 또는 100 L의 실험실 스케일로부터 수확된 배양액에 의해 주로 수행되었다. 다르게 특정되지 않으면, 스케일은 항상 배양 부피를 나타낸다.
1.2 정제
단백질 A 크로마토그래피
정성분석을 위하여, 수득된 모델 항체를 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 발효 브로스(fermentation broth)로부터 친화성 정제하였다. 이 캡쳐는 Fc-함유 분자에 대하여 탁월한 선택성을 제공하므로, 단일 단계에서 99.5%가 넘는 오염물을 제거한다.
1.3 분석
생존 세포 밀도 및 생존율
생존 세포 밀도 및 세포 생존율은 트립판 블루 염색법을 이용하여 Countess™ AutomatedCell Counter(Invitrogen Carlsbad, CA, 2008)에 의해 결정되었다.
글루코오스
글루코오스 농도는 Accu-Chek 혈중포도당 측정기(Roche, Mannheim, Germany)에 의해 측정되었다.
pCO2
용존 이산화탄소 함량(pCO2)은 ABL80 혈액가스 분석기(Radiometer, Bronshoj, Denmark)에 의해 결정되었다.
pH 측정
인 시츄 pH 미터 재보정(re-calibration)을 위한 At-line pH 측정이 S47 SevenMulti pH meter(Mettler Toledo, Zurich, Switzerland)에 의해 수행되었다.
삼투질 농도
샘플의 삼투질 농도는 Advanced Model 2020 다중 샘플 삼투질 농도 측정기(Advanced Instruments, Norwood, MA)에 의해 결정되었다.
역가(titer)
(공정 중) 단백질 역가는 단백질 A 친화성 HPLC에 의해 결정되었다.
글리코실화 프로파일
글리칸 형태의 이동 시간 보정된 영역 %(migration time corrected area %)에서 발현된 글리칸 집단의 상대적 비율의 결정은 레이저 유도 형광 검출을 이용하는 모세관 전기영동(CE-LIF)에 의해 수행되었다. 단백질 샘플(200㎍)은 37℃에서 3시간 동안 PNGase-F에 의해 배양함으로써 탈글리코실화시켰다. 단백질의 침전은 냉각된 에탄올을 이용하여 수행한 후, 건조시켰다. 형광 유도체화제인 9-아미노피렌-1,4,6-트리설폰산(9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid, APTS) 및 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)를 이용하는 환원성 아미노화가 55℃에서 90분 동안 가열함으로써 이어졌다. 샘플을 켄치시키고, 488 nm 고체 레이저가 구비된 CE-LIF 시스템을 이용하여 전기영동시켰다. 글리칸의 상대적인 함량은 형광 검출에 의해 결정되었다. 방출된 글리칸의 양은 대응하는 피크의 면적 % 값을 이용하여 계산하였다. 모델 항체의 4개의 주요 글리칸(G0F, G1F, G1'F, G2F)은 방출 및 안정성 테스트를 위하여 평가되었다. 허용 기준은 G0F: 40-56 면적%; G1F: 28-38 면적%; G1'F: 9-13 면적% 및 G2F: 5-12 면적%이었다.
분리 파라미터는 하기를 포함한다:
- 50 μM I.D.의 모세관 직경
- 모세관 길이:총길이(Lt) = 50.2 cm
- 검출기까지의 길이(Ld) = 40.2 cm
- 중성 모세관(Neutral Capillary)
- PEO Gel
- 20 분 실행시간
- 모세관 온도 20℃
- 샘플 저장 온도 10℃
생물활성
모델 항체의 생물활성은 보체 의존성 세포독성(CDC) 분석을 이용하여 결정되었다. CDC 법의 기본은, 모델 항체가 표적 세포 표면에서 발현된 그 항원에 특정 방식으로 결합한다는 것이다; 이에 따라 형성된 항원-항체 복합체는 보체 시스템을 활성화시키고, 그 결과 세포는 용량 의존적 방식으로 죽는다는 것이다. 생존 세포는 AlamarBlue® 시약의 첨가에 의해 검출한다. CDC 분석의 평가는 샘플과 레퍼런스 모두의 희석 시리즈에 대하여 얻어진 S자형 용량-반응 곡선의 비교를 기반으로 한다.
2. 결과
2.1 삼투질 농도의 최적화
세포의 영양 요구 조건에 따른 공급 조성물의 최적화를 위하여, CHO 세포에 의해 생성된 모델 항체의 단백당형/갈락토실화에 대한 공급 조성물의 삼투질 농도의 영향을 1L 유가 발효 실험(fed-batch fermentation experiments)에서 분석하였다.
모델 항체를 발현하도록 유전자 조작된 CHO 세포는 초기에 기본 배지(PowerCHO-2, Lonza Inc US)에서 성장하였다. (접종 후) 3일째부터 매 2일째에, 15% 3배 농축된 ExCell feed(37g/L; SAFC)가 쇼트-와이즈 모드로 배양물에 첨가되었다.
표 1은 각각의 실험 중 배지 보충제를 나타낸다.
유가 발효 시험 A 및 B 중에 이용된 공급 전략
실험 공급 전략 기본 배지 + 공급
A 기본 배지
+ 1 아미노산;
15% (3x) ExCell feed
+ 4종 아미노산		 기본 배지: PowerCHO-2 CD + 8mM Gln
기본 공급: 3일째, 5일째, 7일째, 9일째...에 15% (37 g/L) 3x ExCell CD
보충: 3일째, 5일째, 7일째, 9일째...에 Pro, Cys, Val, Phe
B 기본 배지
+ 2종 아미노산;
15% (3x) SF ExCell feed + 6종 아미노산		 기본 배지: PowerCHO-2 CD
+ 8mM Gln + Tyr + Phe
기본 공급: 3일째, 5일째, 7일째, 9일째...에 15% (37 g/L) 3x SF ExCell CD
보충: 3일째, 5일째, 7일째, 9일째...에 Pro, Cys, Val, Phe, Ser; 5일째에 Tyr (3x cc.)
배양 온도는 37℃로 유지되었다. 0.5 M Na2CO3 또는 H3PO4의 첨가에 의해 pH를 pH 7.05 내지 pH 7.15 범위로 유지하였다. 용존 산소(DO) 설정값은 40%이었다. 관련 대사산물은 매일 측정하였다. 글루코오스 수준은 약 20 mM로 유지되었다. 세포는 9일 내지 10일 동안 배양되었다.
글리코실화 패턴은 배양 (접종 후) 3일째로부터의 발효 브로스의 샘플로부터 매일 분석되었다. 정성분석을 위하여, 수득된 항체는 단백질 A를 이용하여 발효 브로스로부터 친화성 정제되었다. 세포 생존율, 역가 및 삼투질 농도는 배양의 접종 후 3일째로부터 매일 평가되었다.
수득된 항체의 생물활성은 보체 의존성 세포독성(CDC) 분석을 이용하여 결정되었다.
일정한 pH, DP, 교반속도 및 온도에서 대사산물을 모니터링하고, 적절한 영양분 수준을 유지하는 동안, 삼투질 농도는 배양 중에 지속적으로 증가하여 배양의 후기 단계에서 650 mOsm/㎏까지 증가하였고, 생존 세포 밀도는 지속적으로 감소하였다.
표 2는, 유가 실험으로부터의 샘플의 몇몇 결과에 기초하여, 삼투질 농도의 증가가 상당히 나쁜 글리코실화 패턴을 야기하는 것을 나타내며, 이는 400 mOsm/㎏보다 큰 삼투질 농도가 단백질 글리코실화에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 배양물 중의 염의 축적에 의해, 비-갈락토실화된 형태(non-galactosylated forms, GOF)의 양이 증가한 반면, 갈락토실화된 형태의 양은 감소하였다. 유사하게, CDC 분석에 따른 각각의 항체 샘플의 생물활성은 발효 브로스의 삼투질 농도가 증가할수록 감소하였다.
갈락토실화에 대한 삼투질 농도 발효 파라미터의 영향
최종 삼투질 농도 [mOsm/㎏] G0F
[%] 		G1F
[%] 		G1'F
[%] 		G2F
[%] 		CDC
Rel. Pot.
레퍼런스* - 40-56 28-38 9-13 5-12 1.0
350 40.7 39.5 11.4 8.5 1.1
369 49.0 33.8 10.0 7.1 0.9
405 47.6 34.5 10.6 7.3 1.1
430 50.8 32.5 9.7 7.0 1.0
439 51.0 31.8 9.9 7.2 0.9
570 51.2 32.2 10.1 6.5 0.8
618 56.6 29.2 9.4 4.6 0.7
* 13종의 상업적으로 입수가능한 항체 배치(batch)의 글리코실화 프로파일의 평균 및 표준편차로부터 계산됨.
3배 농축된 염-함유 ExCell feed가 세포 배양물의 높은 삼투질 농도에 기여했기 때문에, 원래의 ExCell feed 조성물은 원래의 배지와 비교하여 66% 적은 인산나트륨을 함유하도록 변형되었다.
유가 발효 시험 A 및 B로부터 배양 (접종 후) 10일 후의 항체 글리코실화 패턴을 표 3에 나타낸다.
갈락토실화에 대한 삼투질 농도 발효 파라미터의 영향
실험 삼투질 농도
[mOsm/㎏] 		G0F
[%] 		G1F [%] G1'F [%] G2F [%] CDC
Rel. Pot.
레퍼런스* 40-56 28-38 9-13 5-12 1.0
A 618 56.6 29.2 9.4 4.6 0.7
B 369 49.0 33.8 10.0 7.1 0.9
* 13종의 상업적으로 입수가능한 항체 배치의 글리코실화 프로파일의 평균 및 표준 편차로부터 계산됨.
유가 발효 시험 B에 이용된 맞춤화 무염 ExCell feed에 의한 400 mOsm/㎏ 미만의 삼투질 농도는 항체 글리코실화 패턴에 대하여 긍정적인 영향을 가졌으며, 예를 들면, 염 함유 ExCell feed에 의해 수행된 유가 발효 시험 A에 비하여 비-갈락토실화 단백당형의 감소 및 갈락토실화 단백당형 및 CDC 활성의 증가가 이루어졌다.
2.2 배양 pH의 변화와 함께 UMG가 보충된 공급물을 통한 갈락토실화의 최적화
수득된 항체의 갈락토실화 패턴은, 마이크로스케일의 벤치-탑 바이오리액터의 특성을 모방한 고처리량 다운 스케일 발효 플랫폼인 영국 TAP Biosystems의 AMBR(Advanced Microscale Bioreactor) 시스템을 이용하여 pH 쉬프트(shift) 적용의 상이한 시점에서 UMG 공급 및 약간의 pH 쉬프트 후에 조사되었다.
방법
모델 항체를 발현하도록 유전자 조작된 CHO 세포는 기본 배지(PowerCHO-2, Lonza Inc US)에서 9일 동안 배양되었다. (접종 후) 3일째부터 매 2일째에, 실험 B(실시예 2.1, 프롤린(Proline)을 제외한 표 1)에 따라 보충된 15% (3×) SF ExCell feed (37g/L; SAFC)를 쇼트-와이즈 모드에서 배양물에 첨가하였다. UMG 보충제(3 mM 우리딘, 0.06 mM 염화망간(Ⅱ) 및 15 mM 갈락토오스)가, 맞춤 SF ExCell feed와 함께 (접종 후) 5일째 및 7일째에 첨가되었다.
배양 pH는 배양의 (접종 후) 3일째까지 0.5 M Na2CO3 또는 H3PO4의 첨가에 의해 pH 7.15로 유지되었다. pH 7.00으로의 쉬프트는 H3PO4의 첨가에 의해 4.0-7.0 × 106 세포/㎖의 생존 세포 밀도에서 접종 후 65 내지 78시간 사이의 상이한 시점에서 수행되었다.
제조된 항체의 갈락토실화 패턴은 조 정제 단백질로부터 모세관 전기 영동에 의해 분석되었다.
수득된 항체 샘플의 갈락코실화 패턴에 대한 배양 pH의 영향을 하기 표 4에 요약한다.
배양 pH에 따른 항체 갈락토실화
pH 초기 삼투질 농도 [mOsm/㎏] 삼투질 농도 조절 갈락토실화 [%]
3일째까지 3일째부터 G0F G1F G1'F G2F
레퍼런스* 40-56 28-38 9-13 5-12
7.15 7.15 355 no 52.0 31.0 10.8 6.3
7.15 7.00 355 no 47.0 34.1 11.3 7.6
7.15 7.15 409 NaCl 57.7 27.9 9.8 4.7
7.15 7.00 409 NaCl 52.7 30.9 10.5 5.9
* 13종의 상업적으로 입수가능한 항체 배치의 글리코실화 프로파일의 평균 및 표준편차로부터 계산됨.
배양 (접종 후) 3일째 pH 7.15으로부터 pH 7.00로의 미세한 이동은, 배양 중 pH 7.15가 일정하게 유지되는 대조군에 비하여 항체의 글리코실화에 이미 영향을 미쳤다. 비-갈락토실화 단백당형(G0F)의 퍼센티지는 감소될 수 있었으며, 갈락토실화 단백당형 G1F, G1'F 및 G2F의 퍼센티지는 pH 쉬프트에 따라 증가하였다. 항체 갈락토실화에 대한 미세한 pH 쉬프트의 이러한 긍정적인 효과는 NaCl이 보충된 배지에 의해 각각의 샘플에서 조정된 400 mOsm/㎏를 넘는 삼투질 농도에서 관찰될 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 400 mOsm/㎏를 넘는 삼투질 농도는 각각의 항체의 글리코실화 패턴을 현저하게 저하시켰다.
표 5는 각각 배양 (접종 후) 8일째 및 9일째에 수득된 항체의 G0F, G1F, G1'F 및 G2F 갈락토실화의 퍼센티지 분포 및 pH 쉬프트가 적용된 시점을 나타낸다.
UMG 공급과 pH 변화의 상이한 시점에서의 pH 쉬프트의 조합에 따른 항체 갈락토실화 패턴
G0F G1F G1'F G2F
Day 8 Day 9 Day 8 Day 9 Day 8 Day 9 Day 8 Day 9
대조군 pH 7.15 43.45 44.66 31.43 30.13 10.57 10.16 6.96 6.48
pH-쉬프트 (66hr) 39.83 42.12 33.29 31.04 10.80 10.15 7.94 7.03
pH-쉬프트 (70hr) 38.75 42.24 34.12 31.27 11.10 10.27 8.35 7.10
pH-쉬프트 (74hr) 41.31 41.94 32.54 31.51 10.62 10.33 7.61 7.19
pH-쉬프트
(78hr)		 42.18 42.92 32.05 31.00 10.60 10.24 7.38 6.92
배양 8일째의 갈락토실화 패턴의 분석은, 발효 중 pH 7.15가 일정하게 유지되었던 대조군 샘플에 비하여 비-갈락토실화 단백당형 G0F의 퍼센티지 양(percental amount)의 감소를 나타내었다. pH 쉬프트와 UMG 공급의 조합은 수득된 항체의 갈락토실화 단백당형(G1F, G1'F 및 G2F)의 퍼센티지 양을 증가시켰다.
표 6에 나타내어진 바와 같이, UMG 단독의 공급은 UMG가 첨가되지 않은 대조군에 비하여 배양 (접종 후) 7일째에 항체 갈락토실화에 긍정적인 영향을 미쳤다. 그러나, 두 가지 특징(약간의 pH 쉬프트 + UMG가 보충된 공급물)이 결합된 경우, 수득된 항체의 비-갈락토실화 단백당형의 퍼센티지 양의 현저한 저하 및 갈락토실화 단백당형의 퍼센티지 양의 현저가 증가가 이루어졌다.
항체 갈락토실화에 대한 pH 쉬프트와 UMG 공급의 조합의 효과
Set-up 공정 시간 [h] G0F
[%] 		G1F
[%] 		G1'F
[%] 		G2F
[%]
레퍼런스* 40-56 28-38 9-13 5-12
pH 7.15 w/o UMG 168,00 55.31 29.04 10.12 5.53
pH 7.15 + UMG 168,00 50.41 32.12 10.99 6.48
쉬프트: pH 7.15에서 pH 7.0 + UMG 168,00 47.41 33.95 11.31 7.34
* 13종의 상업적으로 입수가능한 항체 배치의 글리코시롸 프로파일의 평균 및 표준편차로부터 계산됨
전체적으로, 수득된 항체 샘플의 글리코실화 패턴의 분석은 pH 7.15로부터 pH 7.00으로의 약간의 pH 쉬프트와 배양 (접종 후) 5일째 및 7일째에 UMG 보충제를 포함하는 향상된 공급 전략에 의해 항체 갈락토실화를 증가시켰음을 나타내었다.

Claims (24)

  1. 포유류 세포에서 제조되는 재조합 단백질의 갈락토오스 함량을 증가시키는 방법으로서,
    a) 상기 재조합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 핵산 분자로 형질전화된 포유류 세포를 제1 pH에서 제1 시간 동안 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
    b) 상기 포유류 세포를 상기 제1 pH와 상이한 제2 pH에서 제2 시간 동안 상기 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    c) 하기 성분:
    (ⅰ) 일 이상의 뉴클레오시드;
    (ⅱ) 일 이상의 전이금속염; 및
    (ⅲ) 일 이상의 당;
    의 적어도 2종을 포함하는 조성물을 (b)의 배양물에 공급하는 단계를 포함하는
    방법.
  2. 포유류 세포에서 재조합 단백질을 제조하는 방법으로서,
    a) 상기 재조합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 포유류 세포를 제1 pH에서 제1 시간 동안 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
    b) 상기 포유류 세포를 상기 제1 pH와 상이한 제2 pH에서 제2 시간 동안 상기 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    c) 하기 성분:
    (ⅰ) 일 이상의 뉴클레오시드;
    (ⅱ) 일 이상의 전이금속염; 및
    (ⅲ) 일 이상의 당
    의 적어도 2종을 포함하는 조성물을 (b)의 배양물에 공급하는 단계;
    d) 상기 재조합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계; 및
    e) 상기 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는
    방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 대규모로 제조되는
    방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유류 세포는 중국 햄스터 난소 세포인
    방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 Fc-함유 단백질인
    방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 pH는 상기 제1 pH보다 낮은
    방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제2 pH는 상기 제1 pH보다 0.05 내지 0.3 pH 단위(pH unit) 낮은
    방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레오시드는 우리딘인
    방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 조성물 내 상기 우리딘의 농도는 1 mM 내지 20 mM인
    방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전이금속염은 염화망간(Ⅱ)(manganese (Ⅱ) chloride)인
    방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 조성물 내 상기 염화망간(Ⅱ)의 농도는 0.002 mM 내지 0.1 mM인
    방법.
  12. 제1항 내지 제11항에 있어서,
    상기 당은 갈락토오스인
    방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 조성물 내 상기 갈락토오스의 농도는 5 mM 내지 100 mM인
    방법.
  14. 중국 햄스터 난소 세포에서 리툭시맙 바이오시밀러 항체(rituximab biosimilar antibody)를 제조하는 방법으로서,
    a) 상기 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 중국 햄스터 난소 세포를 7.15의 pH에서 제1 시간 동안 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
    b) 상기 중국 햄스터 난소 세포를 7.00의 pH에서 제2 시간 동안 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
    c) 하기 성분:
    (ⅰ) 1 mM 내지 20 mM 우리딘;
    (ⅱ) 0.002 mM 내지 0.1 mM 염화망간(Ⅱ); 및
    (ⅲ) 5 mM 내지 100 mM 갈락토오스
    를 포함하는 조성물을 (b)의 배양물에 공급하는 단계;
    d) 리툭시맙을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계; 및
    e) 리툭시맙을 수득하는 단계를 포함하는
    방법.
  15. 중국 햄스터 난소 세포에 의해 제조된 치료용 항체의, 그의 표준 항체에 대한 생물학적 동등성을 향상시키는 방법으로서,
    a) 상기 치료용 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 중국 햄스터 난소 세포를 7.15의 pH에서 제1 시간 동안 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
    b) 상기 중국 햄스터 난소 세포를 7.00의 pH에서 제2 시간 동안 상기 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    c) 하기 성분:
    (ⅰ) 우리딘;
    (ⅱ) 염화망간(Ⅱ); 및
    (ⅲ) 갈락토오스
    을 포함하는 조성물을 (b)의 배양물에 공급하는 단계를 포함하는
    방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는, 생존 세포 밀도가 4.5 내지 6.0 × 106 세포/㎖가 될 때까지 상기 제1 pH에서 배양되는
    방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 상기 제2 pH에서 6일 내지 7일 동안 배양되는
    방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    온도는 단계 (a), (b) 및 (c) 중에 일정하게 유지되는
    방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 L-발린, L-시스테인, L-페닐알라닌 및 L-세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 더 함유하는
    방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (c)의 공급은 적어도 2회 수행되는
    방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (c)의 공급 전에, 상기 성분 (ⅰ) 및 (ⅲ)이 첨가되지 않은 조성물에 의한 공급 단계가 선행되는
    방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (a) 및 (b)에서의 배양 배지는 우리딘 및 갈락토오스를 함유하지 않는
    방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (c)의 조성물은 티미딘, 프럭토오스, 만노스, 수크로오스 및 N-아세틸만노사민의 일 이상을 함유하지 않는
    방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (a), (b) 및 (c)의 배양물의 삼투질 농도는 400 mOsm/㎏보다 낮은
    방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3833688A1 (en) * 2018-08-10 2021-06-16 Genentech, Inc. Cell culture strategies for modulating protein glycosylation
HUP1800376A2 (hu) * 2018-11-07 2020-05-28 Richter Gedeon Nyrt Sejttenyészetben elõállított rekombináns glikoprotein glikozilációs-mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer
CN111321188A (zh) * 2018-12-17 2020-06-23 嘉和生物药业有限公司 一种抗体糖型改造的配方、细胞培养方法以及在工业化生产中的应用
WO2020201296A1 (en) * 2019-04-01 2020-10-08 The Automation Partnership (Cambridge) Ltd. Operation process for a cell cultivation system
WO2020252082A1 (en) * 2019-06-10 2020-12-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Cell culture methods and compositions for antibody production
WO2021066772A1 (en) * 2019-10-01 2021-04-08 Arven Ilac Sanayi Ve Ticaret Anonim Sirketi Cell culture medium for reducing fucosylation and basic variants in the production of antibodies
CN113403281B (zh) * 2020-03-16 2024-02-27 夏尔巴生物技术(苏州)有限公司 一种提高抗体半乳糖基化水平的细胞培养方法
WO2022036232A2 (en) * 2020-08-14 2022-02-17 Bristol-Myers Squibb Company Method of making protein

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120276631A1 (en) * 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE07006112T1 (de) 1991-03-18 2010-01-21 New York University Monoklonale und chimäre Antikörper gegen humanen Tumornekrosefaktor
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
SI9720020B (en) 1996-02-09 2001-12-31 Basf Ag Human antibodies that bind human TNF alpha
DE69829891T2 (de) 1997-04-07 2005-10-06 Genentech, Inc., South San Francisco Anti-VEGF Antikörper
CA2451955C (en) 2001-06-26 2015-09-29 Abgenix, Inc. Antibodies to opgl
AR059065A1 (es) * 2006-01-23 2008-03-12 Amgen Inc Metodos para modular el contenido de manosa de las proteinas recombinantes
MX2011003241A (es) * 2008-09-26 2011-04-21 Schering Corp Produccion de anticuerpos con alto titulo.
PL3330370T3 (pl) * 2010-04-26 2021-09-20 Novartis Ag Sposób hodowania komórek cho
EP2511293A1 (en) 2011-04-13 2012-10-17 LEK Pharmaceuticals d.d. A method for controlling the main complex N-glycan structures and the acidic variants and variability in bioprocesses producing recombinant proteins
WO2014170866A2 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process of obtaining glycoprotein composition with increased galactosylation content

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120276631A1 (en) * 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biotechnology and bioengineering, Vol. 108, No. 7, pp. 1591-1602(2011.7.)* *
Biotechnology and bioengineering, Vol. 110, No. 11, pp.2970-2983(2013.11.) *
Journal of biotechnology, Vol. 170, pp.17-27(2013.11.) *

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