CN111954719A

CN111954719A - 细胞培养物中产生的抗体的总去岩藻糖基化糖型

Info

Publication number: CN111954719A
Application number: CN201980021972.XA
Authority: CN
Inventors: P·布赫贝; M·耶伦斯; I·刘; K·库纳斯
Original assignee: American Amgen
Current assignee: American Amgen; Amgen Inc
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2020-11-17
Also published as: IL276910A; KR20200135781A; MX2020009907A; CA3093853A1; CL2020002450A1; MA52186A; JP2021519068A; AU2019243848A1; BR112020019559A2; SG11202009216YA; US20210079065A1; WO2019191150A1; IL276910B1; IL313983A; EA202092286A1; EP3775251A1; JP2024019717A

Abstract

本文提供了产生抗体组合物的方法，该抗体组合物包含所需或预定或预选水平的总去岩藻糖基化(TAF)糖型。在示例性实施例中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含如本文所述特定浓度的岩藻糖和/或葡萄糖的细胞培养基中，该特定浓度取决于所需的TAF糖型的水平。本文还提供了包含糖基化蛋白质及其TAF糖型的相关组合物。还提供了细胞培养基。

Description

细胞培养物中产生的抗体的总去岩藻糖基化糖型

相关申请的交叉引用

本申请要求了2018年3月26日提交的美国临时专利申请号62/648,308的优先权。每个申请的内容通过引用并入本文。

通过引用并入以电子方式提交的材料

通过引用整体并入的是与本文同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，其鉴定如下：名称为“52249A_Seqlisting.txt”的28,547字节ASCII(文本)文件；创建于2019年3月26日。

背景技术

糖基化是最常见但重要的翻译后修饰之一，因为它在多种细胞功能(包括例如蛋白质折叠、质量控制、分子运输和分选以及细胞表面受体相互作用)中起作用。糖基化影响重组蛋白药物的治疗功效，因为它影响治疗性糖蛋白的生物活性、药代动力学、免疫原性、溶解性和体内清除率。特别地，Fc糖型谱是重组抗体的重要产品质量属性，因为它们直接影响抗体的临床功效和药代动力学。

已经发现高甘露糖(HM)糖型含量影响某些治疗性抗体的药代动力学特性(Goetze等人,(2011)Glycobiology[糖生物学]21,949-59；Yu等人,(2012)MAbs 4,475-87)。HM糖型不仅影响抗体的血清清除率，而且除了去岩藻糖基化(afuco)糖型外的此类糖型还可以影响抗体效应子功能或抗体介导的靶细胞杀伤(也称为抗体依赖性细胞毒性(ADCC))。

许多因素影响聚糖结构，从而影响蛋白质(糖蛋白)的最终糖基化形式(糖型)。例如，表达抗体的细胞系、细胞培养基、进料培养基组成和细胞培养期间进料的时机可以影响蛋白质的糖型的产生。

虽然研究小组已经提出了许多方法来影响抗体特定糖型的水平，但是生物制药行业仍需要简单有效的方法来操纵和控制重组产生治疗性抗体期间总去岩藻糖基化(TAF)糖型水平。

发明内容

首次描述了如下数据，这些数据证明包含产生重组糖基化蛋白质(例如，抗体或抗体结合蛋白)的细胞的细胞培养基中岩藻糖和/或葡萄糖的浓度影响所产生的重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平。然而，重组糖基化蛋白质(例如抗体或抗体结合蛋白)的TAF糖型水平的较大变化可通过操纵细胞培养基中岩藻糖的浓度来实现，所述细胞培养基包含产生重组糖基化蛋白质(例如，抗体或抗体结合蛋白)的细胞，如本文所述，通过改变细胞培养基中葡萄糖的浓度，可以实现TAF糖型水平的较小变化。此外，数据表明，虽然细胞培养基的葡萄糖浓度影响高甘露糖聚糖和去岩藻糖基化聚糖的水平，但细胞培养基的岩藻糖浓度影响去岩藻糖基化聚糖的水平而不影响高甘露糖聚糖的水平。这些糖的每一种(化学式仅差异一个氧原子)导致了对TAF糖型水平的不同影响，这一发现是出乎意料的。不受特定理论的束缚，维持细胞(其产生重组糖基化蛋白质(例如，抗体或抗体结合蛋白))在包含如在本文中教导的浓度的岩藻糖和/或葡萄糖的细胞培养基中允许产生具有所需或预定或预选水平的TAF糖型(例如，高甘露糖聚糖和去岩藻糖基化聚糖)的重组糖基化蛋白质(例如，抗体或抗体结合蛋白)组合物。因此，本披露涉及产生包含所需或预定或预选水平的TAF糖型的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的方法。

本披露提供了产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的方法。在示例性实施例中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含如本文所述特定浓度的岩藻糖和/或葡萄糖的细胞培养基中，该特定浓度取决于所需的TAF糖型的水平。

在示例性实施例中，重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)中TAF糖型的水平低于或约10％，并且在示例性方面中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含岩藻糖的细胞培养基中，其中岩藻糖以在约0.17g/L和约1.0g/L之间的浓度存在于培养基中。

在示例性实施例中，重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)中TAF糖型的水平低于或约10％，并且在示例性方面中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含岩藻糖的细胞培养基中，其中岩藻糖以在约0.1g/L和约1.0g/L之间的浓度存在于培养基中，并且其中有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性。

本披露还提供了产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的方法，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含岩藻糖和葡萄糖的细胞培养基中，其中岩藻糖以约0.1g/L至约1.0g/L的浓度存在于培养基中，并且根据达到约10g/L或更低的平均葡萄糖浓度的葡萄糖进料方案将葡萄糖添加到细胞培养基中。

本文提供了通过本披露的方法产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)。另外，提供了相关的药物组合物和细胞培养基。在示例性方面中，细胞培养基包含编码抗体(例如，IgG抗体)的外源核酸和包含浓度为约0.1g/L至约1.0g/L或约0.17g/L至约1.0g/L的岩藻糖的培养基。在一些情况下，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性。任选地，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰敲除编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖(deoxymannonse)-3,5-差向异构酶,4-还原酶的基因。在一些方面中，培养基进一步包含浓度低于约10g/L，任选地低于约9g/L或约6g/L或更低(例如，约0.5g/L至约4g/L)的葡萄糖。在示例性情况下，培养基的pH是约6.85至约7.05，例如约6.90至约7.00。在一些情况下，细胞培养基不包含甘露糖。在某些方面中，抗体是IgG1抗体。在示例性方面中，抗体对肿瘤相关抗原具有特异性，例如包含SEQ ID NO:3的抗原。

本文进一步提供了改变或调节通过细胞培养基中有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的TAF聚糖水平的方法。在示例性方面中，该方法包括(A)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加岩藻糖，以达到约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖浓度，从而降低TAF聚糖的水平；(B)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加TAF水平；或(C)(A)和(B)两者的组合。

还提供了调节通过有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平的方法。在示例性实施例中，该方法包括(A)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加岩藻糖，以达到约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖浓度，从而降低去岩藻糖基化聚糖的水平；(B)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于或约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加去岩藻糖基化聚糖水平；或(C)(A)和(B)的组合。

本披露进一步提供了调节通过有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的高甘露糖(HM)聚糖水平的方法。在示例性实施例中，该方法包括向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加HM聚糖的水平。

本披露还提供了调节有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平的方法，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.03至约1.2，从而将该组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平降低约0.5％至约2％，或将细胞培养基的pH增加约0.03至约1.2，从而将该组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平增加约0.5％至约2％。

本披露提供了将有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平降低约1％至约2％的方法，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.05至约1.2。

另外，提供了将有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平降低约0.5％至约1.1％的方法，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.03-0.07。

本披露进一步提供了将有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平增加约1％至约2％的方法，该方法包括将细胞培养基的pH增加约0.05至约1.2。

还提供了将有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平增加约0.5％至约1.1％的方法，该方法包括将细胞培养基的pH增加约0.03-0.07。

本披露进一步提供了调节有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的TAF聚糖水平的方法，该方法包括根据当前披露的调节、降低或增加去岩藻糖基化聚糖水平的方法来调节、降低或增加该组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平。

本披露提供了一种产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的方法，其中该组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平是约6.2％至约8.4％，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在pH高于7.05且低于7.2的细胞培养基中，其中：(A)细胞培养基的pH在培养期期间变化低于0.15(任选地低于0.10)，或(B)细胞培养基的温度变化不超过2℃或该方法不包括在包含锰或甜菜碱的细胞培养基中培养细胞或(D)(A)、(B)和(C)中的二个或三个的组合。

附图说明

图1A是三种类型的N-聚糖(寡甘露糖、复合物和杂合体)和此类糖的常用符号的说明。

图1B是示例性聚糖结构的图示。

图2是岩藻糖代谢的补救途径和从头途径的图。在补救途径中，游离L-岩藻糖转化为GDP-岩藻糖，而在从头路径中，经由GMD和FX催化的三个反应合成了GDP-岩藻糖。然后，GDP-岩藻糖通过GDP-Fuc转移酶从细胞质转运到高尔基体腔，并转移到受体寡糖和蛋白质。另一个反应产物，GDP，通过腔核苷酸二磷酸酶转化为鸟苷5-单磷酸(GMP)和无机磷酸盐(Pi)。前者被输出到细胞质(经由与GDP-岩藻糖的转运偶联的反向运输系统)中，而后者被假定经由高尔基阴离子通道GOLAC离开高尔基体腔。参见，例如Nordeen等人2000；Hirschberg等人2001。

图3是图，其描绘(A)在细胞培养运行过程中，使用对照培养基(具有空心三角形的线)、第一测试培养基(具有空心圆形的线)和第二测试培养基(具有空心六边形的线)的细胞培养物的葡萄糖浓度(g/L)，(B)在细胞培养运行过程中，使用第二测试培养基(具有空心正方形的线)的细胞培养物的岩藻糖浓度(g/L)，以及(C)在细胞培养运行过程中，使用对照培养基(具有实心三角形的点线)、第一测试培养基(具有实心圆形的点线)和第二测试培养基(具有实心六边形的点线)的细胞培养物的TAF聚糖水平(％)。

图4是图，其描绘(A)在细胞培养运行过程中，使用对照培养基(具有空心三角形的线)、第一测试培养基(具有空心圆形的线)和第二测试培养基(具有空心六边形的线)的细胞培养物的葡萄糖浓度(g/L)，以及(B)在细胞培养运行过程中，使用对照培养基(具有实心三角形的点线)、第一测试培养基(具有实心圆形的点线)和第二测试培养基(具有实心六边形的点线)的细胞培养物的高甘露糖(HM)聚糖水平(％)。

图5是图，其描绘(A)在细胞培养运行过程中，使用对照培养基(具有空心三角形的线)、第一测试培养基(具有空心圆形的线)和第二测试培养基(具有空心六边形的线)的细胞培养物的葡萄糖浓度(g/L)，以及(B)在细胞培养运行过程中，使用对照培养基(具有实心三角形的点线)、第一测试培养基(具有实心圆形的点线)和第二测试培养基(具有实心六边形的点线)的细胞培养物的去岩藻糖基化(afuc)聚糖水平(％)。

图6是在含有0X葡萄糖、1X葡萄糖或2X葡萄糖的细胞培养基中，TAF聚糖水平(％)随岩藻糖浓度(g/L)变化的图。

图7是在含有0X葡萄糖、1X葡萄糖或2X葡萄糖的细胞培养基中，ADCC水平(表示为相对于具有相同氨基酸序列的对照抗体的％)随岩藻糖浓度(g/L)变化的图。

图8是说明葡萄糖和岩藻糖对TAF聚糖水平(％)的影响的模型的图。根据QTPP显示了最小、最大和平均TAF。下图的方程式显示了葡萄糖、岩藻糖和TAF之间的数学关系。

图9A是显示以下方面的一系列图：(i)在细胞培养基中TAF聚糖水平(％)随岩藻糖浓度(g/L)的变化(左上象限)，或在细胞培养基中随葡萄糖浓度(g/L)的变化(右上象限)，以及(ii)在细胞培养基中ADCC水平(表示为相对于具有相同氨基酸序列的对照抗体的％)随岩藻糖浓度(g/L)的变化(左下象限)或在细胞培养基中随葡萄糖浓度(g/L)的变化(右下象限)。TAF聚糖水平(％)的范围为3.30684至3.73083，并且ADCC水平的范围为78.3092-90.4408。在0.2g/L岩藻糖和3.0g/L葡萄糖下，TAF聚糖水平(％)为3.518836，并且ADCC水平(％)为84.37501。

图9B是显示以下方面的一系列图：(i)在细胞培养基中TAF聚糖水平(％)随岩藻糖浓度(g/L)的变化(左上象限)，或在细胞培养基中随葡萄糖浓度(g/L)的变化(右上象限)，以及(ii)在细胞培养基中ADCC水平(表示为相对于创新抗体或可商购抗体的％)随岩藻糖浓度(g/L)的变化(左下象限)或在细胞培养基中随葡萄糖浓度(g/L)的变化(右下象限)。TAF聚糖水平(％)的范围为3.52301至4.0559，并且ADCC水平的范围为75.6911-90.9385。在0g/L岩藻糖和0.554g/L葡萄糖下，TAF聚糖水平(％)为3.789458，并且ADCC水平(％)为83.3148。

图9C是显示以下方面的一系列图：(i)在细胞培养基中TAF聚糖水平(％)随岩藻糖浓度(g/L)的变化(左上象限)，或在细胞培养基中随葡萄糖浓度(g/L)的变化(右上象限)，以及(ii)在细胞培养基中ADCC水平(表示为相对于创新抗体或可商购抗体的％)随岩藻糖浓度(g/L)的变化(左下象限)或在细胞培养基中随葡萄糖浓度(g/L)的变化(右下象限)。TAF聚糖水平(％)的范围为2.9975-3.68468，并且ADCC水平的范围为79.2215-98.8836。在0.492g/L岩藻糖和6.0g/L葡萄糖下，TAF聚糖水平(％)为3.341092，并且ADCC水平(％)为89.05256。

图10是绘制的渗透压随岩藻糖浓度变化的图。

图11是绘制的细胞培养物中岩藻糖浓度随时间(持续时间)变化的图。

图12是％TAF和岩藻糖进料的图，每种随时间变化绘制。

图13是证明从第6天或更早将葡萄糖控制在目标范围内从而产生等效的TAF结果的一对图。

图14是绘制的去岩藻糖基化％随培养时间变化的图。

具体实施方式

许多分泌的蛋白质经历翻译后糖基化，一种糖部分(例如，聚糖、糖)共价附接至蛋白质的特定氨基酸所凭借的过程。在真核细胞中，出现两类糖基化反应：(1)N-连接糖基化，其中聚糖附接至识别序列Asn-X-Thr/Ser的天冬酰胺，其中“X”是除脯氨酸外的任何氨基酸；以及(2)O-连接糖基化，其中聚糖附接至丝氨酸或苏氨酸。不管糖基化类型如何(N-连接还是O-连接)，由于与每个位点(O或N)相关的大范围的聚糖结构，存在蛋白质糖型的微不均一性。

所有N-聚糖都具有共同的核心糖序列：Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn-X-Ser/Thr(Man₃GlcNAc₂Asn)，并且被归类为以下三种类型之一：(A)高甘露糖(HM)或寡甘露糖(OM)类型，其由两个N-乙酰葡糖胺(GalNAc)部分和大量(例如，5、6、7、8或9个)甘露糖(Man)残基组成；(B)复合类型，其包含超过两个GlcNAc部分和任何数量的其他糖类型；或(C)杂合类型，其在分支的一侧包含Man残基而在复合分支的基部包含GlcNAc。图1A(取自Stanley等人,第8章:N-Glycans,Essentials of Glycobiology[N-聚糖，糖生物学的要点],第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]；2009)显示了三种类型的N-聚糖。

N-连接聚糖通常包含半乳糖(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺(GalN)、葡萄糖(GLc)、N-乙酰葡糖胺(ClcNAc)、葡糖胺(GlcN)、甘露糖(Man)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、甘露糖胺(ManN)、木糖(Xyl)、N0乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc)、2-酮基-3-脱氧壬酮酸(2-keto-3-doxynononic acid，Kdn)、岩藻糖(Fuc)、葡糖醛酸(GLcA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、半乳糖醛酸(Gal A)、甘露糖醛酸(Man A)中的一种或多种单糖。此类糖的常用符号示于图1A中。示例性聚糖及其身份示于图1B中。

N连接的糖基化开始于内质网(endoplasmic reticulum，ER)中，其中一组复杂反应引起基本上由两个GlcNAc残基和三个Man残基形成的核心聚糖结构的附接。在ER中形成的聚糖复合物在高尔基体中在酶作用下修饰。若酶相对难以接近该糖，则其通常保持初始HM形式。若酶可接近该糖，则许多Man残基裂解且进一步修饰该糖，产生复合型N聚糖结构。例如，位于顺面高尔基体中的甘露糖苷酶-1可裂解或水解HM聚糖，而位于中间高尔基体中的岩藻糖基转移酶FUT-8将聚糖岩藻糖基化(Hanrue Imai-Nishiya(2007),BMCBiotechnology[BMC生物技术],7:84)。

因此，聚糖结构的糖组成和结构构型根据ER和高尔基体中的糖基化机器、机械酶对聚糖结构的可及性、每种酶的作用顺序和蛋白质从糖基化机器中释放所处的阶段以及其他因素而不同。

本文提供的披露涉及产生抗体组合物的方法，该抗体组合物包含所需或预定或预选水平的TAF糖型。在示例性实施例中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含如本文所述特定浓度的岩藻糖和/或葡萄糖的细胞培养基中，该特定浓度取决于所需的TAF糖型的水平。此外，本披露涉及产生抗体组合物的方法，该抗体组合物包含所需或预定或预选水平的去岩藻糖基化糖型，例如，抗体组合物中的去岩藻糖基化聚糖水平为约6.2％至约8.4％。在示例性实施例中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在pH高于7.05且低于7.2的细胞培养基中，其中：(A)在培养期期间，细胞培养基的pH变化低于0.15(任选地低于0.10)，或(B)细胞培养基的温度变化不多于2℃，或该方法不包括在包含锰或甜菜碱的细胞培养基中培养细胞或(D)(A)、(B)和(C)中两种或三种的组合。不受特定理论的束缚，据信本披露的方法提供了用于定制组合物的手段，这些组合物包含给定抗体的特定量的特定糖形。

在示例性实施例中，调节TAF聚糖的水平。如本文所用，“总去岩藻糖基化聚糖”或“TAF聚糖”或“总去岩藻糖基化糖型”或“TAF糖型”是指高甘露糖(HM)聚糖和去岩藻糖基化聚糖的总量。在示例性实施例中，调节HM聚糖的水平。如本文所用，术语“高甘露糖聚糖”或“HM聚糖”或“高甘露糖糖型”或“HM糖型”或“HM”涵盖包含5、6、7、8或9个甘露糖残基的聚糖，分别缩写为Man5、Man6、Man7、Man8和Man9。在示例性实施例中，调节去岩藻糖基化聚糖的水平。如本文所用，术语“去岩藻糖基化聚糖”或“afuco聚糖”或“去岩藻糖基化糖型”或“Afuco”是指在参与与N-糖基化位点的Asn的酰胺键的GlcNAc残基上缺乏核心岩藻糖(例如，α1,6-连接的岩藻糖)的糖型。去岩藻糖基化糖型包括但不限于A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5。另外的去岩藻糖基化聚糖包括例如A1G1a、G0[H3N4]、G0[H4N4]、G0[H5N4]、FO-N[H3N3]。参见例如，Reusch和Tejada,Glycobiology[糖生物学]25(12):1325-1334(2015)。在示例性方面中，TAF的水平以及HM糖型和去岩藻糖基化糖型的量通过亲水性相互作用液相色谱(HILIC)确定，如在本文的实例1中进一步描述的。在酶切割N-聚糖后，进行HILIC以获得具有几个峰的色谱图，其中的每个峰代表不同糖型的平均分布(量)。出于这些目的，％峰面积＝峰面积/总峰面积x 100％，并且％总峰面积＝样品总面积/标准品总面积x 100％。用于确定％TAF目的的计算可以如下进行：

％去岩藻糖基化糖型＝％A1G0+％A2G0+％A2G1a+％A2G1b+％A2G2+％A1G1M5。

％高甘露糖糖型＝％Man5(如果可检测到)+％Man6(如果可检测到)+％Man7(如果可检测到)+％Man8(如果可检测到)+％Man9(如果可检测到)

本披露提供了产生重组糖基化蛋白质组合物的方法。在示例性实施例中，重组糖基化蛋白质组合物是抗体组合物。在示例性实施例中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含如本文所述特定浓度的岩藻糖和/或葡萄糖的细胞培养基中，该特定浓度取决于所需的TAF糖型的水平。

岩藻糖

在本文披露的方法的实施例中，岩藻糖以浓度从约0.1g/L至约2.0g/L，任选地，约0.1g/L至约1.75g/L、约0.1g/L至约1.5g/L、或约0.1g/L至约1.2g/L存在于培养基中。在示例性情况下，岩藻糖以低于或约1.2g/L的浓度存在于培养基中。在示例性情况下，岩藻糖以从约0.1g/L至约1.0g/L的浓度存在于培养基中。在示例性情况下，培养基包含浓度从约0.17g/L至约2.0g/L、约0.17g/L至约1.75g/L、约0.17g/L至约1.5g/L、或约0.17g/L至约1.2g/L的岩藻糖。在示例性方面中，岩藻糖以从约0.17g/L至约1.2g/L的浓度存在于培养基中。在示例性情况下，岩藻糖以从约0.17g/L至约1.0g/L的浓度存在于培养基中。在示例性情况下，培养基包含浓度从约0.2g/L至约2.0g/L、约0.2g/L至约1.75g/L、约0.2g/L至约1.5g/L、或约0.2g/L至约1.2g/L的岩藻糖。在示例性情况下，岩藻糖以从约0.2g/L至约1.0g/L的浓度存在于培养基中。在示例性情况下，岩藻糖以低于或约1.0g/L的浓度存在于培养基中。例如，在一些情况下，培养基的岩藻糖浓度是约0.10g/L、约0.11g/L、约0.12g/L、约0.13g/L、约0.14g/L、约0.15g/L、约0.16g/L、约0.17g/L、约0.18g/L、约0.19g/L或约0.20g/L。在一些情况下，培养基的岩藻糖浓度是约0.3g/L、约0.4g/L、约0.5g/L、约0.6g/L、约0.7g/L、约0.8g/L或约0.9g/L。在示例性方面中，岩藻糖浓度不多于或约1.0g/L、不多于或约0.9g/L、不多于或约0.8g/L、或不多于或约0.7g/L。在示例性情况下，岩藻糖以浓度低于或约0.75g/L、或约0.25g/L至约0.75g/L，例如约0.4g/L至约0.5g/L、或约0.6g/L存在于培养基中。在示例性方面中，岩藻糖以低于约0.6g/L，例如约0.2g/L至约0.5g/L的浓度存在于培养基中。

在示例性方面中，产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的方法包括将有糖基化能力的细胞维持在两种不同的细胞培养基中。在示例性方面中，产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的方法包括将有糖基化能力的细胞维持在第一细胞培养基中持续初始时间段，并随后将这些有糖基化能力的细胞维持在第二细胞培养基中，任选地，其中第一细胞培养基不包含浓度约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖，并且第二细胞培养基包含浓度约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖并且第二细胞培养基包含例如以上浓度之一的岩藻糖。在示例性情况下，当将细胞接种到包含细胞培养基(例如，细胞培养基)的生物反应器中时，初始时间段开始。在一些方面中，初始时间段是约1天至约3天，例如约24小时至约72小时。在示例性方面中，初始时间段大于约3天(约72小时)，但低于约10天(约240小时)或低于约156小时。在示例性方面中，初始时间段是约3、约4、约5、约6、约7、约8或约9天。在示例性方面中，该方法包括在初始时间段之后向培养基中添加岩藻糖。在一些方面中，将岩藻糖添加到第一培养基以获得第二细胞培养基。例如，在多个方面中，该方法包括在约1天至约3天后、约3天但低于约10天后、或约3、约4、约5、约6、约7、约8、或约9天后添加岩藻糖。在示例性方面中，该方法包括在细胞培养物接种后第6天、第7天、第8天或第9天向细胞培养基(例如，第一细胞培养基)中添加岩藻糖。在示例性方面中，将岩藻糖添加到大于约0.1g/L、大于约0.17g/L、或大于约0.2g/L且低于约2.0g/L的最终浓度。在示例性方面中，第一细胞培养基不包含岩藻糖。在示例性方面中，第一细胞培养基包含岩藻糖，但浓度不可检测或不可测量，或浓度基本低于第二细胞培养基的岩藻糖浓度，例如，基本低于0.1g/L、低于约0.17g/L或低于约0.2g/L。

在替代方面中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含岩藻糖(例如，浓度大于约0.1g/L、大于约0.17g/L或大于约0.2g/L并低于约2.0g/L)的细胞培养基中，持续所述有糖基化能力的细胞维持在细胞培养物中的整个持续时间内或培养期的大部分时间。在一些方面中，产生重组糖基化蛋白质组合物的方法(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)包括将有糖基化能力的细胞接种于包含含有岩藻糖的细胞培养基的生物反应器中，并且以岩藻糖在整个细胞培养期间维持基本相同的浓度将细胞维持在细胞培养基中。

在示例性实施例中，岩藻糖的浓度在细胞培养过程中波动很小。在示例性实施例中，在包含岩藻糖的细胞培养基中维持有糖基化能力的细胞期间，岩藻糖浓度波动约0.2g/L或更低。在示例性方面中，在包含岩藻糖的细胞培养基中维持有糖基化能力的细胞期间，岩藻糖浓度波动约0.1g/L或更低。在示例性方面中，当岩藻糖添加到细胞培养基中时(例如，在初始细胞培养期之后)，在细胞培养期期间向培养基中添加岩藻糖不多于一次或两次。

葡萄糖

在本文披露的方法的示例性实施例中，葡萄糖存在于培养基中。在示例性方面中，葡萄糖以低于或约10g/L，低于或约9.0g/L，或低于或约6.0g/L的浓度存在于培养基中。在示例性方面中，葡萄糖以从约0.5g/L至约4.0g/L的浓度存在于培养基中。在示例性方面中，葡萄糖以从约X g/L至约Y g/L的浓度存在，其中X是约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、或3.9，并且Y是约0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8。1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、或5.0，条件是X低于Y。

在示例性方面中，该方法包括将细胞培养基中的葡萄糖浓度维持相当于细胞培养期的时间段。在示例性情况下，维持细胞培养基中葡萄糖的浓度包括定期(例如每小时、每两小时、每3、4、5或6小时一次、每天一次、每天两次、每天三次或每天4次等)对细胞培养基进行取样，测量取样的细胞培养基的葡萄糖浓度，如果取样的细胞培养基的葡萄糖浓度低于所需维持的葡萄糖浓度，则向细胞培养物中添加葡萄糖。在示例性方面中，维持细胞培养基中的葡萄糖浓度包括经由葡萄糖感受器测量细胞培养基的葡萄糖浓度。在示例性方面中，经由葡萄糖传感器按规律间隔(例如每小时、每两小时、每3、4、5或6小时一次、每天一次、每天两次、每天三次或每天4次等)测量葡萄糖浓度，并且如果经由葡萄糖感受器确定葡萄糖浓度为低于所需维持的葡萄糖浓度，则添加葡萄糖至细胞培养物中。在替代方面中，该方法包括在包含葡萄糖的细胞培养基中维持有糖基化能力的细胞，但仅在初始时间段之后维持细胞培养基中葡萄糖的浓度。在示例性实施例中，初始时间段是约1天至约3天(约24小时至约72小时)。在一些情况下，初始时间段低于或约6天，任选地，其中初始时间段是在细胞培养接种后3天或4天或5天。在示例性方面中，该方法包括在包含葡萄糖的细胞培养基中维持有糖基化能力的细胞并在接种后第六天和其后在细胞培养基中维持葡萄糖的浓度。在示例性方面中，葡萄糖的浓度在初始时间段之后维持至少约4天或约5天，或者任选地在初始时间段之后维持至少约6天。

在示例性方面中，对于初始时间段，细胞培养基包含初始葡萄糖浓度。例如，在多个方面中，初始葡萄糖浓度是约1.0g/L至约15g/L，约1.0至约12g/L，或约1.0g/L至约10g/L。初始葡萄糖浓度，在一些方面中，是约1.0g/L、约1.5g/L、约2.0g/L、约2.5g/L、约3.0g/L、约3.5g/L、约4.0g/L、约4.5g/L、约5.0g/L、约5.5g/L、约6.0g/L、约6.5g/L、约7.0g/L、约7.5g/L、约8.0g/L、约8.5g/L、约9.0g/L、约9.5g/L、约10.0g/L、约10.5g/L、约11.0g/L、约11.5g/L、或约12.0g/L。在一些方面中，初始葡萄糖浓度是约12g/L±1g/L或约9g/L±1g/L或约6g/L±1g/L。在一些方面中，初始葡萄糖浓度低于约5.0g/L或低于约4.0g/L。在示例性方面中，初始葡萄糖浓度是初始时间段期间使用的细胞培养基的葡萄糖浓度。在示例性方面中，初始葡萄糖浓度是初始时间段期间维持的细胞培养基的葡萄糖浓度。

在示例性方面中，初始葡萄糖浓度与初始时间段之后维持的葡萄糖浓度相同。在替代方面中，初始葡萄糖浓度不同于初始时间段之后维持的葡萄糖浓度。在示例性方面中，该方法包括在初始时间段之后向细胞培养基中添加葡萄糖，并将葡萄糖维持在相对于初始葡萄糖浓度的不同浓度下。在示例性方面中，该方法包括在初始时间段之后向细胞培养基中添加葡萄糖以将葡萄糖维持在相对于初始葡萄糖浓度的不同浓度下，其中添加葡萄糖的步骤达到约10g/L或更低(例如，约9g/L或更低，约6g/L或更低，约0.5g/L至约4g/L)的葡萄糖浓度。

在示例性方面中，该方法包括根据葡萄糖进料方案向细胞培养基中添加葡萄糖。在一些方面中，葡萄糖进料方案在初始时间段之后开始。例如，在一些方面中，初始时间段是至少3天或4天，并且葡萄糖进料方案是在细胞培养接种之后约4至约6天(例如，在细胞培养接种之后约4天、约5天、约6天)开始。在示例性情况下，葡萄糖进料方案达到约10g/L或更低(例如，约9g/L或更低、约6g/L或更低、约0.5g/L至约4g/L)的平均葡萄糖浓度。术语“平均葡萄糖浓度”是指通过葡萄糖感受器经一段时间(例如，1至2天)确定的细胞培养基中葡萄糖的平均浓度。在示例性情况下，葡萄糖进料方案达到基于细胞培养基的岩藻糖浓度的平均葡萄糖浓度。在一些方面中，平均葡萄糖浓度基于式I计算：

T＝3.354-1.388F+0.111G+[F-0.4375]x[1.9527(F-0.4375)]

(式I)

其中T是目标总去岩藻糖基化(TAF)聚糖％，并且是约2.5％至约6％，约2.75％至约5.5％，或约3％至约5％，F是培养基中岩藻糖的浓度(g/L)，并且G是平均葡萄糖浓度(g/L)。

在示例性情况下，(i)岩藻糖的浓度是约0.2±0.1g/L，并且平均葡萄糖浓度是约2至约4g/L；(ii)岩藻糖浓度是约0.5±0.1g/L，并且平均葡萄糖浓度是约3至约6g/L；或(iii)岩藻糖浓度是约0.75±0.1g/L，并且平均葡萄糖浓度是约4.5至约9g/L。

TAF、HM和去岩藻糖基化聚糖水平

在示例性实施例中，本文公开的方法产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)，其中该组合物中的TAF聚糖水平低于或约10％。在示例性方面中，组合物中TAF聚糖的水平低于或约9％、低于或约8％、低于或约7％、低于或约6％、低于或约5％。在示例性方面中，组合物中TAF聚糖的水平大于或约4％，例如在约4％和约10％之间。在一些方面中，组合物中TAF聚糖的水平是约2％至约6％或约2.5％至约5％。在一些方面中，TAF聚糖的水平是约2.0％、约2.5％、约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％、约5％、约5.5％、或约6.0％。在示例性方面中，TAF聚糖的水平是约2％至约5％或约2％至约4％。

在产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的方法的示例性方面中，岩藻糖以在约0.1g/L和约1.0g/L之间、或约0.17g/L和约1.0g/L之间的浓度存在于培养基中，且组合物中TAF聚糖的水平低于约10％。

在示例性实施例中，本文披露的方法产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)，其中抗体组合物中高甘露糖聚糖的水平低于或约3.5％，例如，低于或约3.25％、低于或约3.0％、低于或约2.5％、低于或约2.0％。在示例性方面中，抗体组合物中高甘露糖聚糖的水平是约0.7％至约3.0％，任选地，约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％、或约3.0％。

在示例性实施例中，本文披露的方法产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)，其中抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平低于或约3.5％，例如，低于或约3.25％、低于或约3.0％、低于或约2.5％、低于或约2.0％。在示例性方面中，抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平是约0.8％至约2.8％，任选地，约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、或约2.8％。

糖型测量的方法

本领域已知多种用于评估存在于含有糖蛋白的组合物中的糖型或用于确定、检测或测量包含糖蛋白的特定样品的糖型谱的方法。合适的方法包括但不限于阳离子MALDI-TOF分析、阴离子MALDI-TOF分析、弱阴离子交换(WAX)色谱、正相色谱(NP-HPLC)、外切糖苷酶消化、Bio-Gel P-4色谱、阴离子交换色谱和一维核磁共振光谱及其组合。参见例如，Mattu等人,JBC 273:2260-2272(1998)；Field等人,Biochem J[生物化学杂志]299(第1部分):261-275(1994)；Yoo等人,MAbs 2(3):320-334(2010)；Wuhrer M.等人,Journal ofChromatography B[色谱杂志B辑],2005,第825卷,第2期,第124-133页；Ruhaak L.R.,AnalBioanal Chem[分析与生物分析化学],2010,第397卷:3457-3481以及Geoffrey,R.G.等人Analytical Biochemistry[生物分析化学]1996,第240卷,第210-226页。此外，本文所述的实例描述了用于评估存在于含有糖蛋白的组合物中的糖型的合适方法。

关于本披露，可以根据适于重组糖基化蛋白质生产的任何一组条件维持细胞培养物。例如，在一些方面中，将细胞培养物维持在特定pH、温度、细胞密度、培养体积、溶解氧水平、压力、渗透压等下。在示例性方面中，将接种前的细胞培养物在CO₂培养箱中在标准加湿条件下在5％CO₂下振荡(例如，以70rpm)。在示例性方面中，在1.5L培养基中以约10⁶个细胞/mL的接种密度接种细胞培养物。

在示例性方面中，本披露的方法包括将有糖基化能力的细胞维持在pH为约6.85至约7.05，例如在多个方面中，约6.85、约6.86、约6.87、约6.88、约6.89、约6.90、约6.91、约6.92、约6.93、约6.94、约6.95、约6.96、约6.97、约6.98、约6.99、约7.00、约7.01、约7.02、约7.03、约7.04、或约7.05的细胞培养基中。在一些方面中，细胞培养基具有约6.9至约7.0的pH。

在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在30℃和40℃之间的温度下。在示例性实施例中，温度在约32℃至约38℃之间或在约35℃至约38℃之间。

在示例性方面中，该方法包括将渗透压维持在约200mOsm/kg至约500mOsm/kg之间。在示例性方面中，该方法包括将渗透压维持在约225mOsm/kg至约400mOsm/kg或约225mOsm/kg至约375mOsm/kg之间。在示例性方面中，该方法包括将渗透压维持在约225mOsm/kg至约350mOsm/kg之间。在多个方面中，将渗透压(mOsm/kg)维持在约200、225、约250、约275、约300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475、或约500。

在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物的溶解氧(DO)水平维持在约20％至约60％氧饱和度下。在示例性实例中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物的DO水平维持在约30％至约50％(例如，约35％至约45％)氧饱和度下。在示例性实例中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物的DO水平维持在约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、或约60％氧饱和度下。在示例性方面中，DO水平是约35mm Hg至约85mmHg或约40mm Hg至约80mmHg或约45mm Hg至约75mm Hg。

将细胞培养物维持在任何一种或多种培养基中。在示例性方面中，将细胞培养物维持在适于细胞生长的培养基中和/或为细胞培养物提供根据任何合适的进料方案的一种或多种进料培养基。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在包含葡萄糖、乳酸盐、氨、谷氨酰胺和/或谷氨酸盐的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度低于约1μM的锰的培养基中。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在包含约0.25μM至约1μM锰的培养基中。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在包含可忽略量的锰的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度低于或约50ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度低于或约40ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度低于或约30ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度低于或约20ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，培养基包含浓度大于或约5ppb或大于或约10ppb的铜。在示例性方面中，细胞培养基包含甘露糖。在示例性方面中，细胞培养基不包含甘露糖。

在示例性实施例中，细胞培养的类型是补料分批培养或连续灌注培养。然而，本披露的方法有利地不限于任何特定类型的细胞培养。

细胞

本披露涉及产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的方法，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在细胞培养基中。在示例性方面中，有糖基化能力的细胞是真核细胞，包括但不限于酵母细胞、丝状真菌细胞、原生动物细胞、藻类细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。本领域中描述此类宿主细胞。参见例如Frenzel等人,Front Immunol[免疫学前沿]4:217(2013)。在示例性方面中，真核细胞为哺乳动物细胞。在示例性方面中，真核细胞为非人类哺乳动物细胞。在一些方面中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞及其衍生物(例如，CHO-K1、CHO pro-3)、小鼠骨髓瘤细胞(例如，NS0、GS-NS0、Sp2/0)、被工程化为缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)活性的细胞(例如，DUKX-X11、DG44)、人胚肾293(HEK293)细胞或其衍生物(例如，HEK293T、HEK293-EBNA)、绿色非洲猴肾细胞(例如，COS细胞、VERO细胞)、人宫颈癌细胞(例如，HeLa)、人骨肉瘤骨上皮细胞U2-OS、腺癌人肺泡基底上皮细胞A549、人纤维肉瘤细胞HT1080、小鼠脑肿瘤细胞CAD、胚胎癌细胞P19、小鼠胚胎成纤维细胞NIH 3T3、小鼠成纤维细胞L929、小鼠神经母细胞瘤细胞N2a、人乳腺癌细胞MCF-7、视网膜母细胞瘤细胞Y79、人视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50、人肝癌细胞Hep G2、小鼠B骨髓瘤细胞J558L或幼仓鼠肾(BHK)细胞(Gaillet等人2007；Khan,Adv Pharm Bull[高级药物通报]3(2):257-263(2013))。

没有糖基化能力的细胞也可以例如通过用编码糖基化所必需的相关酶的基因转染它们而转化为有糖基化能力的细胞。示例性酶包括但不限于寡糖基转移酶、糖苷酶、葡糖苷酶I、葡糖苷酶II、钙联蛋白/钙网蛋白、糖基转移酶、甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶。

在示例性实施例中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性。这两种岩藻糖代谢途径示于图2中。在示例性实施例中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变以下任何一种或多种的活性：岩藻糖基转移酶(FUT，例如FUT1、FUT2、FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT8、FUT9)、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(GMD)、和GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶、4-还原酶(FX)。在示例性实施例中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰敲除编码FX的基因。

在示例性实施例中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GNTIII)或GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(RMD)的活性。在示例性方面中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰过表达GNTIII或RMD。

重组糖基化蛋白质

在示例性实施例中，重组糖基化蛋白质包含含有一个或多个下式的N-糖基化共有序列的氨基酸序列：

Asn-Xaa₁-Xaa₂

其中Xaa₁是除Pro外的任何氨基酸，并且Xaa₂是Ser或Thr。

在示例性实施例中，重组糖基化蛋白质包含可结晶片段(Fc)多肽。如本文所用的术语“Fc多肽”包括衍生自抗体Fc区的天然和突变蛋白形式的多肽。还包括含有促进二聚化的铰链区的截短形式的此类多肽。包含Fc部分(和由其形成的寡聚体)的融合蛋白提供了通过蛋白A或蛋白G柱上的亲和色谱进行简便纯化的优点。在示例性实施例中，重组糖基化蛋白质包含IgG(例如，人IgG)的Fc。在示例性方面中，重组糖基化蛋白质包含IgG1或IgG2的Fc。在示例性方面中，重组糖基化蛋白质是抗体、抗体蛋白质产物、肽体(peptibody)或Fc融合蛋白。

在示例性方面中，重组糖基化蛋白质是抗体。如本文所用，术语“抗体”是指具有常规免疫球蛋白形式、包含重链和轻链且包含可变区和恒定区的蛋白质。例如，抗体可以是IgG，其是两对相同多肽链的“Y形”结构，每对具有一条“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。抗体具有可变区和恒定区。在IgG形式中，可变区一般为约100-110个或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(CDR)，主要负责抗原识别，并且与结合不同抗原的其他抗体差异很大。参见，例如Janeway等人,“Structure ofthe Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes”[抗体分子和免疫球蛋白基因的结构],Immunobiology:The Immune System in Health andDisease[免疫生物学：健康与疾病的免疫系统],第4版.爱思唯尔科学有限公司(Elsevier Science Ltd.)/加兰出版社(Garland Publishing),(1999)。

简言之，在抗体骨架中，CDR包埋在重链和轻链可变区中的框架内，其中这些CDR构成主要负责抗原结合和识别的区域。可变区包含至少三个重链或轻链CDR(Kabat等人,1991,Sequences ofProteins of Immunological Interest[免疫学上感兴趣的蛋白质序列],Public Health Service N.I.H.[国立卫生研究院公共卫生服务部],马里兰州贝塞斯达；还参见Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:877-883)，在框架区(由Kabat等人,1991指定框架区1-4，即FR1、FR2、FR3和FR4；还参见Chothia和Lesk,1987,同上)内。

人类轻链分成κ和λ轻链。重链分成μ、δ、γ、α或ε，且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干个亚类，包括(但不限于)IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括(但不限于)IgM1和IgM2。本披露内容的实施例包括所有这种抗体类别或同种型。轻链恒定区可为例如κ或λ型轻链恒定区，例如人类κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如人类α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区。因此，在示例性实施例中，抗体为同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一个。

在各种方面中，该抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。在一些方面中，该抗体包含实质上与由哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、猪、人类等产生的天然存在抗体类似的序列。就此而言，抗体可视为哺乳动物抗体，例如小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、猪抗体、人类抗体等。在某些方面中，重组糖基化蛋白质是人抗体。在某些方面中，重组糖基化蛋白质是嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”在本文中用于指含有来自一个物种的恒定结构域和来自第二物种的可变结构域，或更一般而言，含有来自至少两个物种的氨基酸序列区段的抗体。术语“人源化”在关于抗体使用时，是指具有至少来自非人类来源的CDR区的抗体，这些抗体经工程化以具有比原始来源抗体更类似于真实人类抗体的结构和免疫功能。例如，人源化可涉及将来自非人类抗体(例如小鼠抗体)的CDR接枝到人类抗体中。人源化也可涉及选择氨基酸取代以使非人类序列看起来更类似人类序列。

在各种方面中，抗体被酶，诸如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶裂解成片段。木瓜蛋白酶使抗体裂解，以产生两个Fab片段和单个Fc片段。胃蛋白酶使抗体裂解，以产生F(ab’)₂片段和pFc’片段。在示例性方面中，重组糖基化蛋白质是保留至少一个糖基化位点的抗体片段，例如Fab、Fc、F(ab’)₂或pFc’。关于本披露的方法，抗体可能缺乏抗体的某些部分，并且可能为抗体片段。在多个方面中，抗体片段包含糖基化位点。在一些方面中，片段是“糖基化Fc片段”，其包含在真核细胞中翻译后糖基化的抗体Fc区的至少一部分。

已经开发出抗体的架构以产生越来越多可替代的抗体形式，这些抗体形式跨越至少或约12-150kDa的分子量范围和从单体(n＝1)、二聚体(n＝2)、和三聚体(n＝3)至四聚体(n＝4)以及潜在更高范围的效价(n)；此类可替代抗体形式在本文中称为“抗体蛋白质产物”或“抗体结合蛋白”。

抗体蛋白质产物可为基于保留完全抗原结合能力的抗体片段，例如scFv、Fab和VHH/VH的抗原结合形式。保留其完整抗原结合位点的最小抗原结合片段是Fv片段，后者完全由可变(V)区组成。可溶的柔性氨基酸肽接头用于连接V区至scFv(单链片段可变)片段以稳定分子，或将恒定(C)域添加至V区以产生Fab片段[抗原结合片段]。scFv和Fab都是可以在原核宿主中容易地产生的广泛使用的片段。其他抗体蛋白质产物包括经二硫键稳定的scFv(ds-scFv)、单链Fab(scFab)以及二聚体和多聚体抗体形式，如双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体，或包含由连接于寡聚结构域的scFv组成的不同形式的迷你抗体(miniAb)。最小片段为骆驼科重链Ab的VHH/VH以及单域Ab(sdAb)。最常用于产生新颖抗体形式的构建基块为单链可变(V)域抗体片段(scFv)，其包含由约15个氨基酸残基的肽接头连接的来自重链和轻链的V结构域(VH和VL结构域)。肽体或肽-Fc融合物为又一种抗体蛋白质产物。肽体的结构由移植至Fc结构域上的生物活性肽组成。本领域中充分描述肽体。参见例如Shimamoto等人,mAbs 4(5):586-591(2012)。

其他抗体蛋白质产物包括单链抗体(SCA)、双功能抗体、三功能抗体；四功能抗体；双特异性或三特异性抗体等。双特异性抗体可分成五大类：BsIgG、附加IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白和BsAb缀合物。参见例如Spiess等人,Molecular Immunology[分子免疫学]67(2)A部分:97-106(2015)。

在示例性方面中，重组糖基化蛋白质包含这些抗体蛋白质产物(例如，scFv、FabVHH/VH、Fv片段、ds-scFv、scFab、二聚体抗体、多聚体抗体(例如，双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体)、miniAb、肽体、骆驼重链抗体的VHH/VH、sdAb、双抗体；三功能抗体；四功能抗体；双特异性或三特异性抗体、BsIgG、附加IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白和BsAb缀合物)中的任一个并且包含一个或多个N-糖基化共有序列，任选地，一个或多个Fc多肽。在多个方面中，抗体蛋白质产物包含糖基化位点。在示例性方面中，抗体蛋白质产物可以是缀和到抗体结合片段的糖基化Fc片段(“糖基化Fc片段抗体产物”)。

重组糖基化蛋白质可以是呈单体形式或者聚合体、寡聚体或多聚体形式的抗体蛋白质产物。在抗体包含两种或更多种不同抗原结合区片段的某些实施例中，抗体视为双特异性、三特异性或多特异性或者二价、三价或多价，视由抗体识别和结合的不同抗原决定基的数目而定。

有利地，这些方法不限于抗体的抗原特异性。因此，抗体对几乎任何抗原都具有任何结合特异性。在示例性方面中，抗体与激素、生长因子、细胞因子、细胞表面受体或其任何配体结合。在示例性方面中，抗体与在免疫细胞的细胞表面上表达的蛋白质结合。在示例性方面中，抗体与选自下组的分化簇分子结合，该组由以下组成：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11A、CD11B、CD11C、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CDw128、CD129、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CD146、CD147、CD148、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166和CD182。

在示例性方面中，抗体是以下中描述的那些之一：美国专利号7947809和美国专利申请公开号20090041784(胰高血糖素受体)；美国专利号7939070、美国专利号7833527、美国专利号7767206和美国专利号7786284(IL-17受体A)；美国专利号7872106和美国专利号7592429(硬化蛋白)；美国专利号7871611、美国专利号7815907、美国专利号7037498、美国专利号7700742和美国专利申请公开号20100255538(IGF-1受体)；美国专利号7868140(B7RP1)；美国专利号7807159和美国专利申请公开号20110091455(肌生成抑制素)；美国专利号7736644、美国专利号7628986、美国专利号7524496和美国专利申请公开号20100111979(表皮生长因子受体的缺失突变体)；美国专利号7728110(SARS冠状病毒)；美国专利号7718776和美国专利申请公开号20100209435(OPGL)；美国专利号7658924和美国专利号7521053(血管生成素-2)；美国专利号7601818、美国专利号7795413、美国专利申请公开号20090155274、美国专利申请公开号20110040076(NGF)；美国专利号7579186(TGF-βII型受体)；美国专利号7541438(结缔组织生长因子)；美国专利号7438910(IL1-R1)；美国专利号7423128(备解素)；美国专利号7411057、美国专利号7824679、美国专利号7109003、美国专利号6682736、美国专利号7132281和美国专利号7807797(CTLA-4)；美国专利号7084257、美国专利号7790859、美国专利号7335743、美国专利号7084257和美国专利申请公开号20110045537(干扰素-γ)；美国专利号7932372(MAdCAM)；美国专利号7906625、美国专利申请公开号20080292639和美国专利申请公开号20110044986(淀粉样蛋白)；美国专利号7815907和美国专利号7700742(胰岛素样生长因子I)；美国专利号7566772和美国专利号7964193(白介素-1β)；美国专利号7563442、美国专利号7288251、美国专利号7338660、美国专利号7626012、美国专利号7618633和美国专利申请公开号20100098694(CD40)；美国专利号7498420(c-Met)；美国专利号7326414、美国专利号7592430和美国专利号7728113(M-CSF)；美国专利号6924360、美国专利号7067131和美国专利号7090844(MUC18)；美国专利号6235883、美国专利号7807798和美国专利申请公开号20100305307(表皮生长因子受体)；美国专利号6716587、美国专利号7872113、美国专利号7465450、美国专利号7186809、美国专利号7317090和美国专利号7638606(白介素-4受体)；美国专利申请公开号20110135657(β-KLOTHO)；美国专利号7887799和美国专利号7879323(成纤维细胞生长因子样多肽)；美国专利号7867494(IgE)；美国专利申请公开号20100254975(α-4β-7)；美国专利申请公开号20100197005和美国专利号7537762(活化素受体样激酶1)；美国专利号7585500和美国专利申请公开号20100047253(IL-13)；美国专利申请公开号20090263383和美国专利号7449555(CD148)；美国专利申请公开号20090234106(活化素A)；美国专利申请公开号20090226447(血管生成素-1和血管生成素-2)；美国专利申请公开号20090191212(血管生成素-2)；美国专利申请公开号20090155164(C-FMS)；美国专利号7537762(活化素受体样激酶-1)；美国专利号7371381(甘丙肽)；美国专利申请公开号20070196376(胰岛素样生长因子)；美国专利号7267960和美国专利号7741115(LDCAM)；US7265212(CD45RB)；美国专利号7709611、美国专利申请公开号20060127393和美国专利申请公开号20100040619(DKK1)；美国专利号7807795、美国专利申请公开号20030103978和美国专利号7923008(骨保护素)；美国专利申请公开号20090208489(OV064)；美国专利申请公开号20080286284(PSMA)；美国专利号7888482、美国专利申请公开号20110165171和美国专利申请公开号20110059063(PAR2)；美国专利申请公开号20110150888(肝杀菌肽)；美国专利号7939640(B7L-1)；美国专利号7915391(c-Kit)；美国专利号7807796、美国专利号7193058和美国专利号7427669(ULBP)；美国专利号7786271、美国专利号7304144和美国专利申请公开号20090238823(TSLP)；美国专利号7767793(SIGIRR)；美国专利号7705130(HER-3)；美国专利号7704501(脊髓小脑共济失调蛋白-1样多肽)；美国专利号7695948和美国专利号7199224(TNF-α转化酶)；美国专利申请公开号20090234106(活化素A)；美国专利申请公开号20090214559和美国专利号7438910(IL1-R1)；美国专利号7579186(TGF-βII型受体)；美国专利号7569387(TNF受体样分子)；美国专利号7541438(结缔组织生长因子)；美国专利号7521048(TRAIL受体-2)；美国专利号6319499、美国专利号7081523和美国专利申请公开号20080182976(促红细胞生成素受体)；美国专利申请公开号20080166352和美国专利号7435796(B7RP1)；美国专利号7423128(备解素)；美国专利号7422742和美国专利号7141653(白介素-5)；美国专利号6740522和美国专利号7411050(RANKL)；美国专利号7378091(碳酸酐酶IX(CA IX)肿瘤抗原)；美国专利号7318925和美国专利号7288253(甲状旁腺激素)；美国专利号7285269(TNF)；美国专利号6692740和美国专利号7270817(ACPL)；美国专利号7202343(单核细胞趋化蛋白-1)；美国专利号7144731(SCF)；美国专利号6355779和美国专利号7138500(4-1BB)；美国专利号7135174(PDGFD)；美国专利号6630143和美国专利号7045128(Flt-3配体)；美国专利号6849450(金属蛋白酶抑制剂)；美国专利号6596852(LERK-5)；美国专利号6232447(LERK-6)；美国专利号6500429(脑源性神经营养因子)；美国专利号6184359(上皮衍生的T细胞因子)；美国专利号6143874(神经营养因子NNT-1)；美国专利申请公开号20110027287(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶KEXIN 9型(PCSK9))；美国专利申请公开号20110014201(IL-18受体)；以及美国专利申请公开号20090155164(C-FMS)。出于其对可变结构域多肽、可变结构域编码核酸、宿主细胞、载体、制备编码所述可变结构域的多肽的方法、药物组合物以及治疗与含有可变结构域的抗原结合蛋白或抗体的相应靶标相关的疾病的方法的目的，将上述专利和公开的专利申请通过引用以其整体并入本文。

在示例性实施例中，抗体是以下之一：莫罗单抗-CD3(以商标名称Orthoclone

市售的产品)、阿昔单抗(以商标名称

市售的产品)、利妥昔单抗(以商标名称

市售的产品)、巴利昔单抗(以商标名称

市售的产品)、达利珠单抗(以商标名称

市售的产品)、帕利珠单抗(以商标名称

市售的产品)、英利昔单抗(以商标名称

市售的产品)、曲妥珠单抗(以商标名称

市售的产品)、阿仑单抗(以商标名称

市售的产品)、阿达木单抗(以商标名称

市售的产品)、托西莫单抗-I131(以商标名称

市售的产品)、依法利珠单抗(以商标名称

市售的产品)、西妥昔单抗(以商标名称

市售的产品)、替伊莫单抗(以商标名称

市售的产品)、奥马珠单抗(以商标名称

市售的产品)、贝伐单抗(以商标名称

市售的产品)、那他珠单抗(以商标名称

市售的产品)、兰尼单抗(以商标名称

市售的产品)、帕尼单抗(以商标名称

市售的产品)、依库珠单抗(以商标名称

市售的产品)、培舍珠单抗(以商标名称

市售的产品)、戈利木单抗(以商标名称

市售的产品)、康纳单抗(以商标名称

市售的产品)、卡妥索单抗(以商标名称

市售的产品)、优特克单抗(以商标名称

市售的产品)、托珠单抗(以商标名称

市售的产品)、奥法木单抗(以商标名称

市售的产品)、德尼单抗(以商标名称

市售的产品)、贝利木单抗(以商标名称

市售的产品)、瑞西巴库单抗、易普利姆玛(以商标名称

市售的产品)以及帕妥珠单抗(以商标名称

市售的产品)。在示例性实施例中，抗体是以下中之一：抗TNFα抗体，例如阿达木单抗、英利昔单抗、依那西普、戈利木单抗、和培舍珠单抗；抗IL1β抗体，如康纳单抗；抗IL12/23(p40)抗体，如优特克单抗和布瑞吉努单抗(briakinumab)；以及抗IL2R抗体，如达利珠单抗。在示例性方面中，该抗体结合肿瘤相关抗原且为抗癌抗体。合适的抗癌抗体的实例包括但不限于抗BAFF抗体，如贝利木单抗；抗CD20抗体，如利妥昔单抗；抗CD22抗体，如依帕珠单抗；抗CD25抗体，如达利珠单抗；抗CD30抗体，如伊雷单抗(iratumumab)；抗CD33抗体，如吉妥珠单抗；抗CD52抗体，如阿仑单抗；抗CD152抗体，如易普利姆玛；抗EGFR抗体，如西妥昔单抗；抗HER2抗体，如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；抗IL6抗体，如司妥昔单抗(siltuximab)；以及抗VEGF抗体，如贝伐单抗；抗IL6受体抗体，如托珠单抗。在示例性方面中，肿瘤相关抗原是CD20且抗体是抗CD20抗体。在示例性方面中，肿瘤相关抗原包含SEQ ID NO:3。在示例性情况下，抗体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列和SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在示例性方面中，抗体是抗CD20抗体，例如，抗CD20单克隆抗体。在替代方面中，IgG1抗体是利妥昔单抗或其生物类似物(biosimilar)。术语利妥昔单抗是指结合CD20抗原的IgG1κ嵌合鼠/人单克隆抗体(参见CAS号：174722-31-7；药物银行(DrugBank)-DB00073；京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia ofGenes andGenomes，KEGG)条目D02994)。在示例性方面中，抗体包含含有表A中所列出的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。在示例性方面中，抗体包含含有表A中所列出的CDR1、CDR2和CDR3的重链。在不同情况下，抗体包含列举于表A中的VH和VL或包含VH-IgG1和VL-IgGκ序列。

表A：利妥昔单抗氨基酸序列

LC，轻链；HC，重链；VL，可变轻链；VH，可变重链。

在示例性方面中，抗体是抗EGFR抗体，例如，抗HER2单克隆抗体。在示例性方面中，抗体是曲妥珠单抗或其生物类似物。术语曲妥珠单抗是指结合HER2/neu抗原的IgG1κ人源化单克隆抗体(参见CAS号：180288-69-1；药物银行-DB00072；京都基因和基因组百科全书(KEGG)条目D03257)。在示例性方面中，抗体包含含有表B中所列出的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。在示例性方面中，抗体包含含有表B中所列出的CDR1、CDR2和CDR3的重链。在不同情况下，抗体包含列举于表B中的VH和VL或包含VH-IgG1和VL-IgGκ序列。

表B：曲妥珠单抗氨基酸序列

LC，轻链；HC，重链；VL，可变轻链；VH，可变重链。

另外的步骤

在多个方面中，本文披露的方法包括另外的步骤。例如，在一些方面中，该方法包括涉及生产、纯化和配制重组糖基化蛋白质的一个或多个上游步骤或下游步骤。在示例性实施例中，该方法包括用于生成表达重组糖基化蛋白质(例如，抗体或抗体结合蛋白)的宿主细胞的步骤。在一些方面中，宿主细胞是原核宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，或者在一些方面中宿主细胞是真核宿主细胞，例如酵母细胞、丝状真菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)。本领域中描述此类宿主细胞。参见例如，Frenzel等人,Front Immunol[免疫学前沿]4:217(2013)和本文中“Cells[细胞]”章节。例如，在一些情况下，该方法包括向宿主细胞中引入包含核酸的载体，该核酸包含编码重组糖基化蛋白质或其多肽链的核苷酸序列。

在示例性实施例中，本文披露的方法包括用于从培养物中分离和/或纯化重组糖基化蛋白质(例如，重组抗体)的步骤。在示例性方面中，该方法包括一个或多个色谱步骤，该一个或多个色谱包括但不限于例如亲和色谱(例如蛋白A亲和色谱)、离子交换色谱、和/或疏水性相互作用色谱。在示例性方面中，该方法包括用于从包含重组糖基化蛋白质的溶液中产生结晶生物分子的步骤。

在多个方面中，本披露的方法包括用于制备组合物的一个或多个步骤，在一些方面中，该组合物包括包含纯化的重组糖基化蛋白质的药物组合物。此类组合物于下文论述。

组合物

本文提供了包含重组糖基化蛋白质的组合物。在示例性实施例中，组合物是通过产生本文所述的重组糖基化蛋白质组合物的发明方法制备。在示例性方面中，重组糖基化蛋白质是抗体。因此，本文提供了抗体组合物。在示例性实施例中，抗体组合物包含抗体的不同糖型。在示例性实施例中，抗体组合物包含抗体的TAF糖型、HM糖型和/或去岩藻糖基化糖型。还提供了包含抗体片段或抗体蛋白质产物的组合物。在多个方面中，抗体片段、抗体蛋白质产物、糖基化Fc片段或糖基化Fc片段抗体产物包含糖基化位点。在示例性实施例中，抗体组合物通过包括在包含岩藻糖的细胞培养基中维持有糖基化能力的细胞的方法产生，其中岩藻糖以约0.17g/L和约1.0g/L之间的浓度存在于培养基中。在示例性实施例中，抗体组合物通过包括在包含岩藻糖的细胞培养基中维持有糖基化能力的细胞的方法产生，其中岩藻糖以约0.1g/L和约1.0g/L之间的浓度存在于培养基中，且其中该有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性。在示例性实施例中，抗体组合物通过以下方法产生：所述方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含岩藻糖和葡萄糖的细胞培养基中，其中岩藻糖以约0.1g/L至约1.0g/L的浓度存在于培养基中，并且根据达到约10g/L或更低的平均葡萄糖浓度的葡萄糖进料方案将葡萄糖添加到细胞培养基中。在示例性实施例中，抗体组合物是在实施调节有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的TAF聚糖、去岩藻糖基化聚糖或高甘露糖聚糖的水平的方法后产生。在示例性方面中，抗体组合物是在实施调节TAF聚糖的水平的方法后产生的，该方法包括(A)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加岩藻糖，以达到约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖浓度，从而降低TAF聚糖的水平；(B)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加TAF聚糖水平；或(C)(A)和(B)两者。在示例性方面中，抗体组合物是在实施调节有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平的方法后产生的，该方法包括(A)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加岩藻糖，以达到约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖浓度，从而降低去岩藻糖基化聚糖的水平；(B)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于或约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加去岩藻糖基化聚糖水平；或(C)(A)和(B)两者。在示例性情况下，抗体组合物是在实施调节有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的高甘露糖聚糖水平的方法后产生的，该方法包括向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖以达到低于或约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加高甘露糖聚糖的水平。

在示例性方面中，组合物中低于或约50％(例如低于或约40％、低于或约30％、低于或约25％、低于或约20％、低于或约15％)的重组糖基化蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中低于约10％(例如低于或约9％、低于或约8％、低于或约7％、低于或约6％、低于或约5％、低于或约4％、低于或约3％、低于或约2％)的重组糖基化蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中约4％至约10％的重组糖基化蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中约2％至约6％的重组糖基化蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中约2.5％至约5％的重组糖基化蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中低于或约4％的重组糖基化蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中低于或约4％且大于或约2％的重组糖基化蛋白质是TAF糖型。

在示例性方面中，本披露的组合物具有低于或约50％(例如，低于或约40％、低于或约30％、低于或约25％、低于或约20％、低于或约15％)TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本披露的组合物具有低于或约10％(例如，低于或约9％、低于或约8％、低于或约7％、低于或约6％、低于或约5％、低于或约4％、低于或约3％、低于或约2％)TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本披露的组合物具有包含约4％至约10％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本披露的组合物具有约2％至约6％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本披露的组合物具有约2.5％至约5％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本披露的组合物具有低于或约4％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本披露的组合物具有低于或约4％且大于或约2％TAF糖型的糖型谱。

在示例性方面中，组合物中低于或约5％的重组糖基化蛋白质(例如，抗体或抗体结合蛋白)是去岩藻糖基化糖型。在示例性方面中，组合物中低于或约4％的重组糖基化蛋白质(例如，抗体或抗体结合蛋白)是去岩藻糖基化糖型。在示例性方面中，组合物中低于或约3.5％的重组糖基化蛋白质(例如，抗体或抗体结合蛋白)是去岩藻糖基化糖型。在示例性方面中，组合物中约0.8％至约2.8％的重组糖基化蛋白质是去岩藻糖基化糖型。在一些方面中，抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平是约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、或约2.8％。

在示例性方面中，组合物中低于或约5％的重组糖基化蛋白质(例如，抗体或抗体结合蛋白)是高甘露糖糖型。在示例性方面中，组合物中低于或约4％的重组糖基化蛋白质(例如，抗体或抗体结合蛋白)是高甘露糖糖型。在示例性方面中，组合物中低于或约3.5％的重组糖基化蛋白质(例如，抗体或抗体结合蛋白)是高甘露糖糖型。在示例性方面中，组合物中约0.7％至约3.0％的重组糖基化蛋白质是高甘露糖糖型。在一些方面中，抗体组合物中高甘露糖聚糖的水平是约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％、或约3.0％。

在示例性实施例中，组合物与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合。因此，本文提供了包含本文所述的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的药物组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”包括任一标准药物载剂，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种类型润湿剂。

细胞培养基

本文提供了一种细胞培养基，该细胞培养基包含：(a)有糖基化能力的细胞，该有糖基化能力的细胞包含编码抗体的外源核苷酸序列；以及(b)培养基，该培养基包含浓度为约0.1g/L至约1.0g/L或约0.17g/L至约1.0g/L的岩藻糖。有糖基化能力的细胞可以是本文所述的任何细胞。在示例性情况下，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性，任选地，其中该有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰敲除编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶的基因。在示例性实施例中，培养基进一步包含葡萄糖。在一些方面中，培养基包含浓度低于约10g/L或低于约9g/L，例如约6g/L或更低或约0.5g/L至约4g/L的葡萄糖。在一些方面中，培养基包含岩藻糖。在示例性方面中，培养基的pH是约6.85至约7.05，任选地，约6.90至约7.00。在示例性情况下，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性。例如，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰敲除编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶的基因。在示例性方面中，抗体是IgG抗体，任选地，IgG1抗体。在示例性方面中，IgG1抗体对肿瘤相关抗原(例如CD20)具有特异性。在示例性方面中，细胞培养基不包含甘露糖。

调节方法

本文进一步提供了改变或调节通过细胞培养基中有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的TAF聚糖水平的方法。在示例性方面中，该方法包括(A)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加岩藻糖，以达到约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖浓度，从而降低TAF聚糖的水平；(B)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加TAF聚糖水平；或(C)(A)和(B)两者。

本披露还提供了调节有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平的方法。在示例性方面中，该方法包括(A)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加岩藻糖，以达到约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖浓度，从而降低去岩藻糖基化聚糖的水平；或(B)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加去岩藻糖基化聚糖水平；或(C)(A)和(B)两者。

还提供了调节有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的高甘露糖聚糖水平的方法。在示例性实施例中，这些方法包括向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加HM聚糖的水平。

因此，在一些示例性实施例中，本披露的方法涉及增加通过细胞培养物中的细胞产生的蛋白质(例如抗体)的TAF聚糖、HM聚糖或去岩藻糖基化聚糖的水平。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的HM糖型的水平增加。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9中的一种或多种的水平增加。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的去岩藻糖基化糖型的水平增加。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5中的一种或多种的水平增加。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的A1G1a、G0[H3N4]、G0[H4N4]、G0[H5N4]和FO-N[H3N3]中的一种或多种的水平增加。在一些方面中，增加是相对于对照细胞培养物的增加，如通过亲水性相互作用液相色谱(HILIC)确定的。在一些方面中，增加是相对于培养的对照细胞的增加，如通过本领域技术人员已知的方法确定的。

在一些方面中，相对于对照细胞培养物，本披露的方法将TAF、HM或afuco糖型水平增加至任何程度或水平。例如，在一些方面中，相对于对照细胞培养物，通过本披露的方法提供的增加是至少或约1％至约10％增加(例如，至少或约1％增加、至少或约2％增加、至少或约3％增加、至少或约4％增加、至少或约5％增加、至少或约6％增加、至少或约7％增加、至少或约8％增加、至少或约9％增加、至少或约9.5％增加、至少或约9.8％增加、至少或约10％增加)。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，通过本披露的方法提供的增加超过100％，例如200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或甚至1000％。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平增加至少约1.5倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平增加至少约2倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平增加至少约3倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平增加至少约4倍或约5倍。

在示例性方面中，早在岩藻糖和/或葡萄糖浓度变化后第1天就观察到或可观察到或检测到或可检测到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平增加。在示例性方面中，早在变化后第2天就观察到或可观察到或检测到或可检测到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平增加。在示例性方面中，早在变化后第3天就观察到或可观察到或检测到或可检测到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平增加。在示例性方面中，早在变化后约第4天就观察到或可观察到或检测到或可检测到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平增加。在示例性方面中，在变化后约第5天之后就观察到或可观察到或检测到或可检测到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平增加。在示例性方面中，在从细胞培养物中收获重组糖基化蛋白质时，观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平增加。

在示例性方面中，观察到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平增加长于细胞培养的约第4天、第5天或第6天或更多天。在示例性方面中，观察到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平增加持续细胞培养(接种后)的7、8、9、10、11或12天或更长时间(例如，约2周、约3周、约4周、约1月、约2月、约3月、约6月、或约1年)。在示例性方面中，在从细胞培养物中收获蛋白质时，观察到蛋白质的TAF糖型的水平增加。

在其他方面，本披露的方法涉及降低通过细胞培养物中的细胞产生的蛋白质的TAF糖型的水平。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的HM糖型的水平降低。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9中的一种或多种的水平降低。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的去岩藻糖基化糖型的水平降低。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5中的一种或多种的水平降低。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的A1G1a、G0[H3N4]、G0[H4N4]、G0[H5N4]和FO-N[H3N3]中的一种或多种的水平降低。在示例性方面中，该方法是将TAF糖型的水平降低约1％至约4％的方法，并且该方法包括维持第一细胞培养基细胞中的有糖基化能力的细胞并将岩藻糖浓度增加至约0.1g/L至约1.0g/L。在一些方面中，降低是相对于对照细胞培养物的降低，如通过HILIC确定的。在一些方面中，降低是相对于培养的对照细胞的降低，如通过本领域技术人员已知的方法确定的。

在一些方面中，相对于对照细胞培养物，本披露的方法将TAF、HM或afuco糖型的一个或多个水平降低至任何程度或水平。例如，相对于对照细胞培养物的水平，通过本披露的方法提供的降低是降低至少或约0.1％至约1％(例如降低至少或约0.1％、降低至少或约0.2％、降低至少或约0.3％、降低至少或约0.4％、降低至少或约0.5％、降低至少或约0.6％、降低至少或约0.7％、降低至少或约0.8％、降低至少或约0.9％、降低至少或约0.95％、降低至少或约0.98％、降低至少或约1.0％)。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物的水平，通过本披露的方法提供的降低超过约100％，例如约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或甚至约1000％。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平降低至少或约1.5倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平降低至少约2倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平降低至少约3倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平降低至少约4倍或至少约5倍。

在示例性方面中，早在接种后约第1天就观察到或可观察到或检测到或可检测到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平降低。在示例性方面中，早在接种后约第2天就观察到或可观察到或检测到或可检测到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平降低。在示例性方面中，早在接种后约第3天就观察到或可观察到或检测到或可检测到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平降低。在示例性方面中，早在接种后约第4天就观察到或可观察到或检测到或可检测到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平降低。在示例性方面中，在接种后约第5天之后就观察到或可观察到或检测到或可检测到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平降低。在示例性方面中，大约在从细胞培养物中收获蛋白质时，观察到或可观察到或检测到或可检测到重组糖基化蛋白质的TAF糖型的水平降低。

在示例性方面中，观察到蛋白质的TAF糖型的水平降低长于细胞培养的约第4天、约第5天或约第6天或超过初始细胞培养期。在示例性方面中，观察到蛋白质的TAF糖型的水平降低持续细胞培养(接种后)的约7、约8、约9、约10、约11或约12天或更长时间(例如，约2周、约3周、约4周、约1月、约2月、约3月、约6月、或约1年)。在示例性方面中，大约在从细胞培养物中收获蛋白质时，观察到蛋白质的TAF糖型的水平降低。

关于本披露的方法，通过此类方法实现的调节、增加或降低是相对于“对照”或“对照细胞培养物”。在示例性方面中，对照是当不进行本发明方法的步骤时蛋白质的TAF糖型的水平。在示例性方面中，对照是当进行重组生产的已知方法时蛋白质的TAF糖型的水平。在示例性方面中，对照是当在重组生产期间维持已知的葡萄糖或岩藻糖浓度时TAF糖型的水平。如本文所用，术语“对照细胞培养物”意指除了岩藻糖/葡萄糖浓度外以与进行本发明方法的步骤(例如，披露的方法的细胞培养)的细胞培养物相同的方式维持的细胞培养物。在示例性方面中，对照细胞培养物是维持在已知的操作或标准参数(包括对照岩藻糖/葡萄糖浓度)下的细胞培养物。如本文所用，术语“对照岩藻糖浓度”或“对照葡萄糖浓度”可以指已知的操作岩藻糖/葡萄糖浓度，例如在第一时间点或在进行本披露的方法之前的时间点维持的细胞培养物的岩藻糖/葡萄糖浓度。在示例性方面中，对照岩藻糖/葡萄糖浓度是其TAF水平是已知的或确定的细胞培养物的岩藻糖/葡萄糖浓度。

在调节本披露的方法的示例性方面中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性。任选地，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰敲除编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶的基因。

在示例性方面中，在进行本披露的方法之后，抗体组合物中TAF聚糖的水平低于约10％，例如约2％至约6％、约2％至约5％、或约2％至约4％。

在示例性方面中，在进行本披露的方法之后，抗体组合物中高甘露糖聚糖的水平低于约3.5％，任选地，约0.7％至约3.0％。

在示例性方面中，在进行本披露的方法之后，抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平低于约3.5％，任选地，约0.8％至约2.8％。

关于本文所述包含添加岩藻糖的调节方法，细胞培养基的最终岩藻糖浓度在多个方面中为约0.17g/L至约1.0g/L，或约0.2g/L至约0.5g/L。然而，考虑了本文所述的任何岩藻糖浓度。

关于本文所述的包含向细胞培养基中添加葡萄糖的调节方法，在一些方面中，根据达到约10g/L或更低或约9g/L或更低的平均葡萄糖浓度的葡萄糖进料方案添加葡萄糖。在一些方面中，平均葡萄糖浓度低于约6.0g/L，任选地，低于约4.0g/L。在一些情况下，平均葡萄糖浓度是基于细胞培养基中的岩藻糖浓度。例如，平均葡萄糖浓度可以基于式I计算：

T＝3.354-1.388F+0.111G+[F-0.4375]x[1.9527(F-0.4375)]

式I

其中T是目标TAF聚糖％，并且是2.5％至约6％，约2.75％至约5.5％，或约3％至约5％，F是培养基中岩藻糖的浓度(g/L)，并且G是平均葡萄糖浓度(g/L)。

本披露另外提供了调节(降低或增加)有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平的方法。在示例性实施例中，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.03至约1.2(例如，0.05至约1.0)，以将重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平降低约0.5％至约2％(例如，0.5％至约1.5％、0.5％至约1.0％、1.0％至约2％、1.5％至约2.0％)或将细胞培养基的pH增加约0.03至约1.2(例如，0.05至约1.0)，以将重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平增加约0.5％至约2％(例如，0.5％至约1.5％，0.5％至约1.0％，1.0％至约2％，1.5％至约2.0％)。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.05至约1.2(例如0.06、0.07、0.08、0.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.20)，以将重组糖基化蛋白质组合物(例如抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖的水平降低约1％至约2％(例如1.0％至1.5％、1.5％至2.0％)，或将细胞培养基的pH增加约0.05至约1.2(例如0.06、0.07、0.08、0.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.20)，以将重组糖基化蛋白质组合物(例如抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖的水平增加约1％至约2％(例如1.0％至1.5％、1.5％至2.0％)。在不同情况下，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.03至约0.07(例如0.03、0.04、0.05、0.06、0.07)，以将重组糖基化蛋白质组合物(例如抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖的水平降低约0.5％至约1.1％(例如0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、1.0％、1.01％、1.02％、1.03％、1.04％、1.05％、1.06％、1.07％、1.08％、1.09％、1.10％)或将细胞培养基的pH增加约0.03至约0.07(例如0.03、0.04、0.05、0.06、0.07)，以将重组糖基化蛋白质组合物(例如抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平增加约0.5％至约1.1％(例如0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、1.0％、1.01％、1.02％、1.03％、1.04％、1.05％、1.06％、1.07％、1.08％、1.09％、1.10％)。

本文还提供了将有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平降低约1％至约2％的方法。在示例性实施例中，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.05至约1.2。任选地，该方法包括将pH降低约0.05至约0.07，以减少约1％的去岩藻糖基化聚糖；或将pH降低约0.09至约1.2，以减少多于约1.5％的去岩藻糖基化聚糖。在多个方面中，该方法包括在约7.10至约7.20之间，任选地在约7.12至约7.19之间的pH下培养细胞。

此外，提供了将有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平降低约0.5％至约1.1％的方法。在示例性实施例中，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.03-0.07。在多个方面中，该方法包括将pH降低约0.03至约0.06，使去岩藻糖基化聚糖降低约0.8％。在一些方面中，该方法包括将pH降低约0.05至约0.07，使去岩藻糖基化聚糖降低约1％。在不同情况下，该方法包括在约7.05至约7.15之间，任选地在约7.07至约7.13之间的pH下培养细胞。

本披露提供了将有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平增加约1％至约2％的方法。在示例性实施例中，该方法包括将细胞培养基的pH增加约0.05至约1.2。任选地，该方法包括将pH增加约0.05至约0.07，以减少约1％的去岩藻糖基化聚糖；或将pH增加约0.09至约1.2，以减少多于约1.5％的去岩藻糖基化聚糖。在一些方面中，该方法包括在约7.10至约7.20之间，任选地在约7.12至约7.19之间的pH下培养细胞。

本披露还提供了将有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平增加约0.5％至约1.1％的方法。在示例性实施例中，该方法包括将细胞培养基的pH增加约0.03-0.07或将pH增加约0.03至约0.06，以减少约0.8％的去岩藻糖基化聚糖；或将pH增加约0.05至约0.07，以减少多于约1％的去岩藻糖基化聚糖。在不同情况下，该方法包括在约7.05至约7.15之间，任选地在约7.07至约7.13之间的pH下培养细胞。

在前述方法的任一个中，贯穿整个培养，细胞培养基的pH大于7.0，任选地，高于7.05且低于7.2。在一些方面中，重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)中的去岩藻糖基化聚糖水平低于约10％，例如约6.2％至约8.4％。在前述方法的任一个中，在培养期期间，温度变化低于2℃。例如，在一些方面中，培养的温度变化不多于1.5℃或1.0℃。在前述方法的任一个中，细胞培养基不包含任何可检测量的锰或甜菜碱。在一些方面中，细胞培养基包含约0.10g/L至约1.0g/L的岩藻糖，任选地，约0.17至约1.0g/L的岩藻糖。任选地，岩藻糖以低于约0.75g/L，低于约0.6g/L，或约0.2g/L至约0.5g/L的浓度存在于培养基中。培养基中岩藻糖的添加或存在可以根据本文提供的任何教导。在示例性方面中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性。在前述方法的任一个中，根据达到约10g/L或更低的平均葡萄糖浓度的葡萄糖进料方案将葡萄糖添加到细胞培养基中。可以根据本文提供的任何教导添加葡萄糖。

如上文讨论的，TAF聚糖是HM聚糖和去岩藻糖基化聚糖的总和。因此，目前披露的调节去岩藻糖基化聚糖的方法将在不同情况下调节重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的TAF聚糖的水平。因此，本文提供了调节有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的TAF聚糖水平的方法。在示例性方面中，该方法包括根据目前披露的调节去岩藻糖基化聚糖水平的方法，调节重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖的水平。在示例性实施例中，调节TAF聚糖的方法包括根据目前披露的降低去岩藻糖基化聚糖水平的方法降低重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平或根据目前披露的增加去岩藻糖基化聚糖的方法增加重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖的水平。

此外，本披露提供了产生抗体组合物的方法，其中抗体组合物中的去岩藻糖基化聚糖的水平是约6.2％至约8.4％。在示例性实施例中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在pH高于7.05且低于7.2的细胞培养基中，

其中，任选地：

(A)在培养期期间，该细胞培养基的pH变化低于0.15(任选地低于0.10)或

(B)该细胞培养基的温度变化不多于2℃或

(C)该方法不包括在包含锰或甜菜碱的细胞培养基中培养这些细胞或

(D)(A)、(B)和(C)中两种或三种的组合。

在多个方面中，在培养期期间，将pH维持在pH为约7.07至约7.19(例如7.08、7.09、7.10、7.11、7.12、7.13、7.14、7.15、7.16、7.17、7.18、或7.19)，任选地，其中将pH维持在约7.07或更高且低于7.10，或约7.10或更高且低于7.15，或约7.15或更高达约7.19。在多个方面中，抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平低于约10％，任选地，约6.2％至约8.4％。在不同情况下，培养期期间温度的变化低于2℃，任选地，培养的温度变化不超过1.5℃或1.0℃。在多个方面中，细胞培养基不包含任何可检测量的锰或甜菜碱。在示例性方面中，细胞培养基包含约0.10g/L至约1.0g/L岩藻糖(任选地，约0.17至约1.0g/L岩藻糖)，任选地，岩藻糖以低于约0.75g/L、低于约0.6g/L、或约0.2g/L至约0.5g/L的浓度存在于培养基中。在一些方面中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性，并且在一些方面中，根据达到约10g/L或更低的平均葡萄糖浓度的葡萄糖进料方案将葡萄糖添加到细胞培养基中。

示例性实施例

本披露提供了产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的方法。在示例性实施例中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含如本文所述特定浓度的岩藻糖和/或葡萄糖的细胞培养基中，该特定浓度取决于所需的TAF糖型的水平。在示例性实施例中，重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)中TAF糖型的水平低于或约10％，并且在示例性方面中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含岩藻糖的细胞培养基中，其中岩藻糖以在约0.17g/L和约1.0g/L之间的浓度存在于培养基中。在示例性实施例中，重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)中TAF糖型的水平低于或约10％，并且在示例性方面中，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含岩藻糖的细胞培养基中，其中岩藻糖以在约0.1g/L和约1.0g/L之间的浓度存在于培养基中，并且其中有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性。本披露还提供了产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的方法，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含岩藻糖和葡萄糖的细胞培养基中，其中岩藻糖以约0.1g/L至约1.0g/L的浓度存在于培养基中，并且根据达到约10g/L或更低的平均葡萄糖浓度的葡萄糖进料方案将葡萄糖添加到细胞培养基中。在示例性方面中，岩藻糖以低于约0.75g/L，任选地低于约0.6g/L的浓度存在于培养基中。在示例性情况下，岩藻糖以约0.2g/L至约0.5g/L的浓度存在于培养基中。在一些方面中，岩藻糖在有糖基化能力的细胞维持在细胞培养物中的整个持续时间内存在于培养基中。在示例性情况下，产生重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的方法包括将有糖基化能力的细胞维持在第一细胞培养基中持续初始时间段，并随后将这些有糖基化能力的细胞维持在第二细胞培养基中，其中第一细胞培养基不包含浓度约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖，并且第二细胞培养基包含浓度约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖。在一些情况下，初始时间段是约24至约72小时。在替代方面中，初始时间段是约或大于约72小时，但低于或约156小时。在一些方面中，细胞培养物接种后第6天，将岩藻糖添加至第一培养基，以得到第二细胞培养基。在包含岩藻糖的细胞培养基中维持有糖基化能力的细胞期间，岩藻糖浓度波动约0.2g/L或更少(例如，0.1g/L或更少)。在一些方面中，对于初始时间段，细胞培养基包含初始葡萄糖浓度。任选地，初始葡萄糖浓度是约1g/L至约15g/L，例如，约12g/L±1g/L。在示例性方面中，该方法进一步包括根据葡萄糖进料方案向细胞培养基中添加葡萄糖。在示例性方面中，葡萄糖进料方案是在细胞培养物接种后约4至约6天开始。例如，葡萄糖进料方案可以在细胞培养物接种后约6天开始。在示例性情况下，葡萄糖进料方案在细胞培养基中达到约10g/L或更低(例如，约9g/L或更低、约6g/L或更低、约0.5g/L至约4g/L)的平均葡萄糖浓度。在示例性情况下，葡萄糖进料方案达到基于细胞培养基中的岩藻糖浓度的平均葡萄糖浓度。在示例性方面中，平均葡萄糖浓度基于式I计算：

T＝3.354-1.388F+0.111G+[F-0.4375]x[1.9527(F-0.4375)]

(式I)

其中T是该抗体组合物中的目标总去岩藻糖基化(TAF)聚糖％，并且是约2.5％至约6％，约2.75％至约5.5％，或约3％至约5％，F是该培养基中岩藻糖的浓度(g/L)，并且G是该培养基中的平均葡萄糖浓度(g/L)。在示例性方面中，(i)岩藻糖的浓度是约0.2±0.1g/L，并且平均葡萄糖浓度是约2至约4g/L；(ii)岩藻糖浓度是约0.5±0.1g/L，并且平均葡萄糖浓度是约3至约6g/L；或(iii)岩藻糖浓度是约0.75±0.1g/L，并且平均葡萄糖浓度是约4.5至约9g/L。在示例性方面中，细胞培养基的pH是约6.85至约7.05(例如约6.90至约7.00)。在一些方面中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性。例如，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰敲除编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶的基因。在示例性情况下，抗体组合物中总去岩藻糖基化(TAF)聚糖的水平低于约10％(例如约2％至约6％、约2％至约5％、约2％至约4％)。在示例性情况下，抗体组合物中高甘露糖聚糖的水平低于约3.5％(例如，约0.7％至约3.0％)。在示例性情况下，抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平低于约3.5％(例如，约0.8％至约2.8％)。在一些方面中，有糖基化能力的细胞产生IgG抗体，任选地，IgG1抗体。在一些方面中，该IgG1抗体对肿瘤相关抗原具有特异性(例如，CD20)。在示例性方面中，培养基不包含甘露糖。

提供了一种细胞培养基，该细胞培养基包含：(a)有糖基化能力的细胞，该有糖基化能力的细胞包含编码抗体的外源核酸；以及(b)培养基，该培养基包含浓度为约0.1g/L至约1.0g/L或约0.17g/L至约1.0g/L的岩藻糖。在示例性方面中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性，任选地，其中该有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰敲除编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶的基因。在示例性方面中，培养基进一步包含浓度低于约10g/L，例如低于约9g/L、低于约6g/L或约0.5g/L至约4g/L的葡萄糖。在示例性方面中，培养基的pH是约6.85至约7.05(例如约6.9至约7.0)。在一些方面中，细胞培养基不包含甘露糖。在示例性方面中，抗体是IgG抗体，例如，IgG1抗体。在示例性情况下，该IgG1抗体对肿瘤相关抗原(例如CD20)具有特异性。

本文进一步提供了改变或调节通过细胞培养基中有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的TAF聚糖水平的方法。在示例性方面中，该方法包括(A)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加岩藻糖，以达到约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖浓度，从而降低TAF聚糖的水平；(B)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加TAF聚糖水平；或(C)(A)和(B)两者。还提供了调节通过有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的去岩藻糖基化聚糖水平的方法。在示例性实施例中，该方法包括(A)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加岩藻糖，以达到约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖浓度，从而降低去岩藻糖基化聚糖的水平；(B)向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于或约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加去岩藻糖基化聚糖水平；或(C)(A)和(B)两者。本披露进一步提供了调节通过有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)的高甘露糖聚糖水平的方法。在示例性实施例中，该方法包括向包含有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加HM聚糖的水平。在调节方法的示例性方面中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰改变从头途径或补救途径的酶的活性。例如，在一些方面中，有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰敲除编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶的基因。在一些方面中，抗体组合物中TAF聚糖的水平低于或约10％(例如约2％至约6％、约2％至约5％、约2％至约4％)。在一些方面中，抗体组合物中高甘露糖聚糖的水平低于或约3.5％(例如，约0.7％至约3.0％)。在一些方面中，抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平低于约3.5％(例如，约0.8％至约2.8％)。在示例性方面中，岩藻糖浓度是约0.17g/L至约1.0g/L，任选地，约0.2g/L至约0.5g/L。在一些方面中，该方法进一步包括根据达到约10g/L(例如低于约9.0g/L、低于约6.0g/L、低于约4.0g/L)平均葡萄糖浓度的葡萄糖进料方案向细胞培养基中添加葡萄糖。在一些情况下，平均葡萄糖浓度是基于细胞培养基中的岩藻糖浓度。例如，在一些方面中，平均葡萄糖浓度基于式I计算：

T＝3.354-1.388F+0.111G+[F-0.4375]x[1.9527(F-0.4375)]

式I

其中T是抗体组合物中的目标总去岩藻糖基化(TAF)聚糖％，并且是约2.5％至约6％，约2.75％至约5.5％，或约3％至约5％，F是培养基中岩藻糖的浓度(g/L)，并且G是平均葡萄糖浓度(g/L)。

以下实例仅是为描述本披露内容而给出，且不以任何方式限制其范围。

实例

实例1

此实例描述了实例2的实验中进行的方法和使用的材料。

细胞系、细胞培养和培养基

所有实验使用表达抗体的克隆进行，该抗体包含含有SEQ ID NO.1的轻链和含有SEQ ID NO.2的重链。所有的实验使用单独瓶的培养的细胞进行25天。以下参数保持不变：持续时间(12天)，溶解氧(48mm Hg至74mm Hg)，pH(6.85至7.05)，搅动(350RPM，20W/m³)，温度(36.0℃)。

亲水性相互作用液相色谱(HILIC)聚糖图谱

使用HILIC确定酶促释放的N-连接聚糖的聚糖图谱。简而言之，将聚糖与包含PNG酶F和磷酸钠缓冲液(pH 7.5)的溶液在约37℃下一起孵育约2小时。然后将包含2-氨基苯甲酸(2-AA)和氰基硼氢化钠的标记溶液添加到PNG酶F处理的聚糖中，并且将混合物在约80℃下孵育约75分钟。孵育后，将混合物离心以获得沉淀蛋白质的沉淀。收集上清液并置于小瓶中。

通过与荧光检测器联机的HILIC分离聚糖：在高有机条件(流动相A和流动相B分别为甲酸铵和乙腈)下注射聚糖并与柱结合，然后用增加梯度的水性甲酸铵缓冲液洗脱。使用1.7μm小颗粒柱形式和150mm柱长实现高分辨率。总运行时间(包括柱再平衡)为155分钟。

实例2

此实例表明了在培养基中增加葡萄糖和岩藻糖水平对TAF％的影响。

将表达包含SEQ ID NO:1的轻链和包含SEQ ID NO:2的重链的抗体的细胞添加到含有以下三种培养基之一的生物反应器中：对照培养基、第一测试培养基和第二测试培养基。第一测试培养基除了含有两倍量的葡萄糖外与对照培养基相同，并且第二测试培养基是含有0.5g/L岩藻糖的对照培养基。每种培养基都缺乏甘露糖。细胞培养物在6.85至7.05的pH下维持12天。

周期性从生物反应器中采集培养基样品，以测量葡萄糖浓度、TAF水平和ADCC水平。经由HILIC N-聚糖图谱程序测定TAF和/或去岩藻糖基化(Afuc)聚糖水平，并使用体外测定测试刺激ADCC的能力。将结果显示在下表1中。

表1

<u>培养基</u>	<u>TAF水平(％)</u>	<u>ADCC(％)</u>
			目标范围	2.0％-4.2％	69％-97％
对照	4.00％±0.23％	～100％
			第一测试	5.87％±0.23％	152％±15％
第二测试	～3.4％	～85％

ADCC水平表示为相对于对照达到的ADCC水平的年龄％，该对照是具有相同氨基酸序列的可商购的抗体。

在整个培养运行中确定葡萄糖浓度，并且将这些测量随时间变化进行绘制，并且与每种细胞培养基类型产生的抗体的TAF水平有关。结果示于图3中。如图所示，在第一测试培养中培养的细胞产生的抗体表明TAF的增加，该增加相应于细胞培养物中葡萄糖水平的增加。这些结果(和表1的结果)表明葡萄糖可以影响TAF水平和ADCC。

在包含0.5g/L岩藻糖的第二测试培养基中培养的细胞产生的抗体在TAF中显示约1％的降低(图3)。如图3所示，岩藻糖浓度经12天运行变化不大，可能是因为细胞对岩藻糖的摄取是可忽略的。

进一步分析在每种不同培养基中产生的抗体的不同聚糖种类。有趣的是，如图4所示，当细胞在第一测试培养基(与对照培养基相比，其含有2倍量的葡萄糖)中培养时，高甘露糖(HM)聚糖％增加。在含有岩藻糖的第二测试培养基中培养的细胞中没有获得HM聚糖％的这种增加。如图4所示，在含有岩藻糖的第二测试培养基中培养的细胞产生的抗体的HM聚糖％与在对照培养基中培养的细胞产生的抗体的HM聚糖％大致相同。

在含有两倍量葡萄糖的培养基(第一测试培养基)或含有岩藻糖的培养基(第二测试培养基)中培养对去岩藻糖基化聚糖％的影响与对TAF聚糖％的影响相似。如图5所示，在包含较高葡萄糖浓度的第一测试培养基中培养的细胞表明去岩藻糖基化聚糖的增加，而在包含岩藻糖的第二测试培养基中培养的细胞产生具有减少的去岩藻糖基化聚糖的抗体。

此实例表明葡萄糖和岩藻糖是用来调节高甘露糖和去岩藻糖基化聚糖水平以及影响ADCC的杠杆。

实例3

此实例表明另外的研究表明葡萄糖和岩藻糖是调节TAF水平和ADCC的杠杆。

设计了随访多变量全因子实验，以(1)阐明岩藻糖和葡萄糖变量的主要效应、相互作用效应和二次效应，并且(2)找出这些变量的数量，这些数量会导致TAF聚糖和ADCC水平的改变。在培养基中以0g/L，0.5g/L和1g/L的浓度来评估岩藻糖。葡萄糖以0X、1X(对照)和2X的速率供给。0X意味着没有向培养物中添加葡萄糖储备溶液，并且这在细胞培养6天后转化为约1g/L的残余葡萄糖浓度。葡萄糖仅通过含有12g/L糖的培养基提供。在1X进料时，葡萄糖在葡萄糖进料开始后维持在3±1g/L的平均浓度。在2X进料中，平均葡萄糖水平维持在6±1g/L。结果表明，岩藻糖浓度可以改变，以影响TAF水平(图6)和ADCC水平(图7)。

在这些实验中，开始进料后(即第6天之后)，葡萄糖浓度控制在3±1g/L。如果葡萄糖浓度超过4g/L，则不添加另外的葡萄糖，并且细胞依靠生物反应器中的残余葡萄糖和通过灌注培养基获得的葡萄糖，直到葡萄糖水平降至控制范围内。基于这些实验，根据图8所示的模型，预测了对于不同岩藻糖和葡萄糖浓度下的TAF值。该模型表明，在包含约0.1g/L至约1.0g/L岩藻糖和/或约0.5g/L至约4.0g/L葡萄糖的培养基中培养细胞后可获得质量目标产物谱(QTTP)。利用该模型预测了以下不同岩藻糖和葡萄糖浓度的TAF值：0.2g/L岩藻糖和3g/L葡萄糖，0g/L岩藻糖和0.554g/L葡萄糖；和0.492g/L岩藻糖和6g/L葡萄糖。图9A-9C.这些结果表明，有几种方法可以达到所需的TAF水平和ADCC水平。

为了确认图9A-9C的预测，进行了另外的实验。表2中提供了实验的汇总。

表2

0X，在第6天之后测量葡萄糖浓度在约1g/L处；1X，测量葡萄糖浓度在约3±1g/L处；2X，测量葡萄糖浓度在约6±1g/L处。

此实例表明葡萄糖浓度和岩藻糖浓度都是可变的，可以被操纵以改变TAF和ADCC的水平。

实例4

此实例表明了岩藻糖对细胞培养物的影响。

对上述细胞培养物进行另外分析。例如，对细胞培养物的渗透压进行了测量，并且其范围从大约175mOsm/kg到大约345mOsm/kg。观察到细胞培养渗透压与岩藻糖浓度之间缺乏相关性。参见图10。如图所示，向培养基中添加岩藻糖似乎不会以任何特定方式影响渗透压。在对照条件下(不含岩藻糖)渗透压变化很大，表明培养基中的成分(岩藻糖除外)对渗透压有积极的影响。

在此岩藻糖研究的一个实验中，将细胞接种到五个生物反应器之一中，其中两个反应器中含有不含任何岩藻糖的培养基(ctrl_a和ctrl_b)，并且其中三个含有具有0.5g/L岩藻糖的培养基(fuc_a、fuc_b和fuc_c)。在整个12天的培养期间内，在第0天、第3天、第5天、第7天、第9天和第12天，从五种细胞培养物中收集培养基样品。测量样品的岩藻糖浓度。如图11所示，岩藻糖的浓度在整个培养期间并未发生实质性变化，这表明在培养过程中岩藻糖的消耗小和/或慢。

在此岩藻糖研究的另一个实验中，细胞在细胞培养物中在不含岩藻糖的培养基中维持12天。在此特定的实验中，细胞培养物的pH自7.1被干扰，引起TAF％从第5天到第8天增加至约5.5％。从第5天开始每天测量TAF％。为了将TAF水平调节回4.0％的目标，在培养的第9天以每天0.9g/L的进料速率添加岩藻糖。如图12所示，在向培养基中添加岩藻糖后，TAF％从约5.5％下降。TAF％在第12天继续下降至约3.8％。这些数据表明，添加岩藻糖可能发生在培养期晚期，并且仍然会引起TAF％的调节。

此实例表明了培养基中岩藻糖浓度对TAF水平的影响。

实例5

此实例表明了维持葡萄糖在目标范围内可以发生在培养期晚期。

在12天的培养期期间，进行了三个实验以监测达到目标葡萄糖范围的时间。对于每个实验，每个细胞培养物的初始葡萄糖浓度范围在从约5.0g/L至约6.0g/L。每天监测细胞培养基的葡萄糖浓度。如图13所示，每个细胞培养物在培养期的不同天达到目标葡萄糖浓度(0.5g/L-4.0g/L)。在一个实验中(具有空心正方形的线)，在第2天达到目标范围。在第二个实验(具有空心菱形的点线)中，在第4天达到目标范围，而在第三个实验(具有空心圆形的线)中，在第6天达到目标范围。尽管存在这些差异，但每个细胞培养物达到了TAF％的目标范围(约2.0％至约4.3％)(参见图13的左图；第三个实验由空心圆形表示；第二个实验由空心菱形表示；第一个实验由空心正方形表示)。这些数据表明，葡萄糖维持可以发生在培养期晚期，以达到培养期早期维持的相同的培养物TAF水平。

这些数据表明，早期和晚期葡萄糖浓度的控制会导致相似的TAF水平。

实例6

此实例表明了在添加和不添加岩藻糖的情况下降低细胞培养物的pH对抗体的去岩藻糖基化水平的影响。

从2000L生物反应器中去除细胞培养物样品，并用于接种平行的3L生物反应器。使用连续补料分批过程，用进料A和进料B持续12天进料2000L和3L生物反应器。在第5天，用岩藻糖进料两个3L生物反应器至1.0g/L的最终浓度。如实例1中所述测量去岩藻糖基化水平，并且在表3中提供结果。

表3

pH	添加岩藻糖	去岩藻糖基化％
			7.09	-	6.29
7.09	-	6.317
			7.07	-	6.559
7.07	+	4.384
			7.12	-	7.13
7.13	-	7.24
			7.18	-	8.365
7.19	-	7.917
			7.18	+	6.183

如表3所示，在不添加岩藻糖的情况下，当pH低于7.1时，平均去岩藻糖基化％为6.39，而当pH高于7.10但低于7.15时，平均去岩藻糖基化％更高(去岩藻糖基化％＝7.185)。当pH高于7.15时，平均去岩藻糖基化％甚至更高(去岩藻糖基化％＝8.276)。因此，较低的pH值与较低的去岩藻糖基化％有关。

当向培养基中添加岩藻糖(以达到1.0g/L岩藻糖的最终浓度时，在较低的pH(7.07)和较高的pH(7.18)下，去岩藻糖基化％显著降低。当添加岩藻糖时，对于这些pH水平的每一个，去岩藻糖基化％的平均降低是2.18％。

这些结果表明，降低细胞培养基的pH和/或向细胞培养基中添加岩藻糖导致降低的去岩藻糖基化百分比。当pH降低并且向细胞培养基中添加岩藻糖时，观察到更大程度降低的去岩藻糖基化百分比。

实例7

此实例进一步表明了在添加和不添加岩藻糖的情况下降低细胞培养物的pH对抗体的去岩藻糖基化水平的影响。

使用来自2000L生物反应器的细胞培养物样品接种平行的3L生物反应器。使用连续补料分批过程，使用进料A和进料B持续12天进料2000L和3L生物反应器。在第5天，用岩藻糖进料一些生物反应器(即，细胞培养物)至0.25、0.5或1g/L的最终浓度。如实例1中所述测量去岩藻糖基化水平，并且在图14中提供结果。

如图14所示，对照3L生物反应器(对照pH 7.1)显示与最初的2000L生物反应器相似的去岩藻糖基化水平。两者都显示出约6.5％或更高的去岩藻糖基化％。添加处于任何一个测试水平的岩藻糖导致去岩藻糖基化％的显著降低(5.5％或更低)。在添加0.25g/L岩藻糖的情况下，去岩藻糖基化百分比最低。

此外，如图14所示，在不向培养基中添加岩藻糖的情况下，将pH从7.1降低到7.0，也会导致去岩藻糖基化降低至少约1.0％。

本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请案和专利均在此通过引用并入本文中，其并入程度如同个别且特定地指示各参考文献通过引用以其全文并入本文中和阐述一般。

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除非本文中另外指示，否则本文中数值范围的叙述仅仅旨在用作单独地提及在该范围内的各独立值和各终点的一种速记方法，且各独立值和终点并入说明书中，如同本文中单独地叙述其一样。

除非本文中另外指示或与上下文另外明显相矛盾，否则本文所述的所有方法均可按任何合适的顺序进行。除非另外要求保护，否则关于本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地描述本披露内容，而非对本披露内容的范围施加限制。说明书中的语言不应视作指示任何未要求保护的要素为实施本披露内容所必要的。

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Claims

1.一种产生抗体组合物的方法，其中该抗体组合物中的总去岩藻糖基化(TAF)聚糖的水平低于约10％，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含岩藻糖的细胞培养基中，其中岩藻糖以约0.17g/L至约1.0g/L的浓度存在于该培养基中。

2.一种产生抗体组合物的方法，其中该抗体组合物中的总去岩藻糖基化(TAF)聚糖的水平低于约10％，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含岩藻糖的细胞培养基中，其中岩藻糖以约0.1g/L至约1.0g/L的浓度存在于该培养基中，且其中这些有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰以改变从头途径或补救途径的酶的活性。

3.一种产生抗体组合物的方法，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在包含岩藻糖和葡萄糖的细胞培养基中，其中岩藻糖以约0.1g/L至约1.0g/L的浓度存在于该培养基中，并且根据达到约10g/L或更低的平均葡萄糖浓度的葡萄糖进料方案将葡萄糖添加到该细胞培养基中。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中岩藻糖以低于约0.75g/L的浓度存在于该培养基中。

5.如权利要求4所述的方法，其中岩藻糖以低于约0.6g/L的浓度存在于该培养基中。

6.如权利要求5所述的方法，其中岩藻糖以约0.2g/L至约0.5g/L的浓度存在于培养基中。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该岩藻糖在将这些有糖基化能力的细胞维持细胞培养的整个持续时间内存在于该培养基中。

8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，该方法包括将这些有糖基化能力的细胞维持在第一细胞培养基中持续初始时间段，并随后将这些有糖基化能力的细胞维持在第二细胞培养基中，其中，该第一细胞培养基不包含浓度约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖，并且该第二细胞培养基包含浓度约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖。

9.如权利要求8所述的方法，其中该初始时间段是约24至约72小时。

10.如权利要求8所述的方法，其中该初始时间段是约或大于约72小时，但低于或约156小时。

11.如权利要求8至10中任一项所述的方法，其中细胞培养物接种后第6天，将岩藻糖添加至该第一培养基，以得到该第二细胞培养基。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在包含岩藻糖的细胞培养基中维持这些有糖基化能力的细胞期间，岩藻糖浓度波动约0.2g/L或更低。

13.如权利要求12所述的方法，其中在包含岩藻糖的细胞培养基中维持这些有糖基化能力的细胞期间，岩藻糖浓度波动约0.1g/L或更低。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中对于初始时间段，该细胞培养基包含初始葡萄糖浓度。

15.如权利要求14所述的方法，其中该初始葡萄糖浓度是约1g/L至约15g/L。

16.如权利要求15所述的方法，其中该初始葡萄糖浓度是约12g/L±1g/L。

17.如权利要求1、2和4至16中任一项所述的方法，该方法进一步包括根据葡萄糖进料方案向该细胞培养基中添加葡萄糖。

18.如权利要求17所述的方法，其中该葡萄糖进料方案在细胞培养物接种后约4至约6天开始。

19.如权利要求18所述的方法，其中该葡萄糖进料方案在细胞培养物接种后约6天开始。

20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中该葡萄糖进料方案在该细胞培养基中达到约10g/L或更低的平均葡萄糖浓度。

21.如权利要求3和17至20中任一项所述的方法，其中该葡萄糖进料方案在该细胞培养基中达到约9g/L或更低的平均葡萄糖浓度。

22.如权利要求21所述的方法，其中该葡萄糖进料方案在该细胞培养基中达到约6g/L或更低的平均葡萄糖浓度。

23.如权利要求22所述的方法，其中该葡萄糖进料方案在该细胞培养基中达到约0.5g/L至约4g/L的平均葡萄糖浓度。

24.如权利要求17至23中任一项所述的方法，其中该葡萄糖进料方案达到基于该细胞培养基中的岩藻糖浓度的平均葡萄糖浓度。

25.如权利要求24所述的方法，其中该平均葡萄糖浓度基于式I计算：

T＝3.354-1.388F+0.111G+[F-0.4375]x[1.9527(F-0.4375)] (式I)

其中T是该抗体组合物中的目标总去岩藻糖基化(TAF)聚糖％，并且是约2.5％至约6％，约2.75％至约5.5％，或约3％至约5％，F是该培养基中岩藻糖的浓度(g/L)，并且G是该培养基中的平均葡萄糖浓度(g/L)。

26.如权利要求24或25所述的方法，其中(i)岩藻糖的浓度是约0.2±0.1g/L，并且平均葡萄糖浓度是约2至约4g/L；(ii)岩藻糖浓度是约0.5±0.1g/L，并且平均葡萄糖浓度是约3至约6g/L；或(iii)岩藻糖浓度是约0.75±0.1g/L，并且平均葡萄糖浓度是约4.5至约9g/L。

27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中该细胞培养基的pH是约6.85至约7.05。

28.如权利要求27所述的方法，其中该细胞培养基的pH是约6.90至约7.00。

29.如权利要求1和3至34中任一项所述的方法，其中这些有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰以改变从头途径或补救途径的酶的活性。

30.如权利要求2和29所述的方法，其中这些有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰以敲除编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶的基因。

31.如权利要求3至30中任一项所述的方法，其中该抗体组合物中总去岩藻糖基化(TAF)聚糖的水平低于约10％。

32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中TAF聚糖的水平是约2％至约6％。

33.如权利要求32所述的方法，其中TAF聚糖的水平是约2％至约5％。

34.如权利要求33所述的方法，其中该抗体组合物中TAF聚糖的水平是约2％至约4％。

35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中该抗体组合物中高甘露糖聚糖的水平低于约3.5％。

36.如权利要求35所述的方法，其中该抗体组合物中高甘露糖聚糖的水平是约0.7％至约3.0％。

37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中该抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平低于约3.5％。

38.如权利要求37所述的方法，其中该抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平是约0.8％至约2.8％。

39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中这些有糖基化能力的细胞产生IgG抗体。

40.如权利要求39所述的方法，其中这些有糖基化能力的细胞产生IgG1抗体。

41.如权利要求40所述的方法，其中这些IgG1抗体对肿瘤相关抗原具有特异性。

42.如权利要求41所述的方法，其中该肿瘤相关抗原包含SEQ ID NO.3。

43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中该培养基不包含甘露糖。

44.一种抗体组合物，该抗体组合物通过如权利要求1至43中任一项所述的方法产生。

45.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求44所述的抗体组合物以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。

46.一种细胞培养基，该细胞培养基包含：

a.有糖基化能力的细胞，这些有糖基化能力的细胞包含编码抗体的外源核酸；以及

b.培养基，该培养基包含浓度为约0.1g/L至约1.0g/L或约0.17g/L至约1.0g/L的岩藻糖。

47.如权利要求46所述的细胞培养基，其中这些有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰以改变从头途径或补救途径的酶的活性，任选地，其中这些有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰以敲除编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶的基因。

48.如权利要求46或47所述的细胞培养基，其中该培养基进一步包含浓度低于约10g/L，任选地低于约9g/L的葡萄糖。

49.如权利要求48所述的细胞培养基，其中该葡萄糖的浓度是约6g/L或更低。

50.如权利要求49所述的细胞培养基，其中该葡萄糖的浓度是约0.5g/L至约4g/L。

51.如权利要求46至50中任一项所述的细胞培养基，其中该培养基的pH是约6.85至约7.05。

52.如权利要求51所述的细胞培养基，其中该细胞培养基的pH是约6.90至约7.00。

53.如权利要求46至52中任一项所述的细胞培养基，其中该细胞培养基不包含甘露糖。

54.如权利要求46至53中任一项所述的细胞培养基，其中该抗体是IgG抗体。

55.如权利要求54所述的细胞培养基，其中该IgG抗体是IgG1抗体。

56.如权利要求55所述的细胞培养基，其中该IgG1抗体对肿瘤相关抗原具有特异性。

57.如权利要求56所述的细胞培养基，其中该肿瘤相关抗原包含SEQ ID NO:3。

58.一种调节有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的TAF聚糖水平的方法，该方法包括(A)向包含这些有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加岩藻糖以达到约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖浓度，从而降低TAF聚糖的水平；或(B)向包含这些有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加TAF聚糖的水平；或(C)(A)和(B)两者。

59.一种调节有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖水平的方法，该方法包括(A)向包含这些有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加岩藻糖以达到约0.1g/L至约1.0g/L的岩藻糖浓度，从而降低去岩藻糖基化聚糖的水平；或(B)向包含这些有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖，以达到低于或约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加去岩藻糖基化聚糖的水平；或(C)(A)和(B)两者。

60.一种调节有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的高甘露糖聚糖水平的方法，该方法包括向包含这些有糖基化能力的细胞的细胞培养基中添加葡萄糖以达到低于或约10g/L的葡萄糖浓度，从而增加高甘露糖聚糖的水平。

61.如权利要求58-60中任一项所述的方法，其中这些有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰以改变从头途径或补救途径的酶的活性。

62.如权利要求61所述的方法，其中这些有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰以敲除编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶的基因。

63.如权利要求58-62中任一项所述的方法，其中该抗体组合物中TAF聚糖的水平低于或约10％。

64.如权利要求63所述的方法，其中TAF聚糖的水平是约2％至约6％。

65.如权利要求64所述的方法，其中TAF聚糖的水平是约2％至约5％。

66.如权利要求65所述的方法，其中该抗体组合物中TAF聚糖的水平是约2％至约4％。

67.如权利要求58-66中任一项所述的方法，其中该抗体组合物中高甘露糖聚糖的水平低于或约3.5％。

68.如权利要求67所述的方法，其中该抗体组合物中高甘露糖聚糖的水平是约0.7％至约3.0％。

69.如权利要求58-68中任一项所述的方法，其中该抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平低于或约3.5％。

70.如权利要求69所述的方法，其中该抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平是约0.8％至约2.8％。

71.如权利要求58-70中任一项所述的方法，其中该岩藻糖浓度是约0.17g/L至约1.0g/L。

72.如权利要求71所述的方法，其中该岩藻糖浓度是约0.2g/L至约0.5g/L。

73.如权利要求58至72中任一项所述的方法，该方法进一步包括根据达到约10g/L、任选地更低的平均葡萄糖浓度的葡萄糖进料方案将葡萄糖添加到该细胞培养基中。

74.如权利要求73所述的方法，其中该平均葡萄糖浓度低于约6.0g/L，任选地低于约4.0g/L。

75.如权利要求73或74所述的方法，其中该平均葡萄糖浓度基于该细胞培养基的岩藻糖浓度。

76.如权利要求75所述的方法，其中该平均葡萄糖浓度基于式I计算：

T＝3.354-1.388F+0.111G+[F-0.4375]x[1.9527(F-0.4375)] 式I

其中T是抗体组合物中的目标总去岩藻糖基化(TAF)聚糖％，并且是约3％至约5％，F是该培养基中岩藻糖的浓度(g/L)，并且G是平均葡萄糖浓度(g/L)。

77.一种调节有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖水平的方法，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.03至约1.2，从而将抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平降低约0.5％至约2％，或将细胞培养基的pH增加约0.03至约1.2，从而将抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平增加约0.5％至约2％。

78.如权利要求77所述的方法，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.05至约1.2，从而将抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平降低约1％至约2％，或将细胞培养基的pH增加约0.05至约1.2，从而将抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平增加约1％至约2％。

79.如权利要求77所述的方法，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.03至约0.07，从而将抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平降低约0.5％至约1.1％，或将细胞培养基的pH增加约0.03至约0.07，从而将抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平增加约0.5％至约1.1％。

80.一种将有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖水平降低约1％至约2％的方法，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.05至约1.2。

81.如权利要求80所述的方法，该方法包括将该pH降低约0.05至约0.07，使去岩藻糖基化聚糖降低约1％。

82.如权利要求80所述的方法，该方法包括将pH降低约0.09至约1.2，使去岩藻糖基化聚糖降低多于约1.5％。

83.如权利要求80所述的方法，该方法包括在约7.10至约7.20之间，任选地在约7.12至约7.19之间的pH下培养这些细胞。

84.一种将有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖水平降低约0.5％至约1.1％的方法，该方法包括将细胞培养基的pH降低约0.03-0.07。

85.如权利要求84所述的方法，该方法包括将该pH降低约0.03至约0.06，使去岩藻糖基化聚糖降低约0.8％。

86.如权利要求84所述的方法，该方法包括将该pH降低约0.05至约0.07，使去岩藻糖基化聚糖降低约1％。

87.如权利要求84所述的方法，该方法包括在pH高于7.05且低于或约7.15，任选地在约7.07至约7.13下培养这些细胞。

88.一种将有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖水平增加约1％至约2％的方法，该方法包括将细胞培养基的pH增加约0.05至约1.2。

89.如权利要求88所述的方法，该方法包括将该pH增加约0.05至约0.07，使去岩藻糖基化聚糖降低约1％。

90.如权利要求88所述的方法，该方法包括将该pH增加约0.09至约1.2，使去岩藻糖基化聚糖降低多于约1.5％。

91.如权利要求88所述的方法，该方法包括在约7.10至约7.20之间，任选地在约7.12至约7.19之间的pH下培养这些细胞。

92.一种将有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖水平增加约0.5％至约1.1％的方法，该方法包括将细胞培养基的pH增加约0.03-0.07。

93.如权利要求92所述的方法，该方法包括将该pH增加约0.03至约0.06，使去岩藻糖基化聚糖降低约0.8％。

94.如权利要求92所述的方法，该方法包括将该pH增加约0.05至约0.07，使去岩藻糖基化聚糖降低约1％。

95.如权利要求92所述的方法，该方法包括在pH高于7.05且低于或约7.15，任选地在约7.07至约7.13下培养这些细胞。

96.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中贯穿整个培养，该细胞培养基的pH大于7.0，任选地，高于7.05且低于7.2。

97.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平低于约10％。

98.如权利要求97所述的方法，其中该抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平是约6.2％至约8.4％。

99.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在培养期期间，温度变化低于2℃。

100.如权利要求99所述的方法，其中培养的温度变化不多于1.5℃或1.0℃。

101.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该细胞培养基不包含任何可检测量的锰或甜菜碱。

102.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该细胞培养基包含约0.10g/L至约1.0g/L的岩藻糖，任选地，约0.17至约1.0g/L的岩藻糖。

103.如权利要求102所述的方法，其中岩藻糖以低于约0.75g/L，低于约0.6g/L，或约0.2g/L至约0.5g/L的浓度存在于该培养基中。

104.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些有糖基化能力的细胞没有进行遗传修饰以改变从头途径或补救途径的酶的活性。

105.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据达到约10g/L或更低的平均葡萄糖浓度的葡萄糖进料方案将葡萄糖添加到该细胞培养基中。

106.一种调节有糖基化能力的细胞产生的抗体组合物的TAF聚糖水平的方法，该方法包括根据权利要求77-79中任一项所述的方法调节该抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平，根据权利要求80-87中任一项所述的方法降低该抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平，或根据权利要求88-105中任一项所述的方法增加该抗体组合物的去岩藻糖基化聚糖的水平。

107.一种产生抗体组合物的方法，其中该抗体组合物中去岩藻糖基化聚糖的水平是约6.2％至约8.4％，该方法包括将有糖基化能力的细胞维持在pH高于7.05且低于7.2的细胞培养基中，

其中：

(B)该细胞培养基的温度变化不多于2℃或

(D)(A)、(B)和(C)中两种或三种的组合。

108.如权利要求107所述的方法，其中在培养期期间，将该pH维持在pH为约7.07至约7.19，任选地，其中将该pH维持在约7.07或更高且低于7.10，或约7.10或更高且低于7.15，或约7.15或更高直到约7.19。