DE69936105T3

DE69936105T3 - Menschliche tslp nukleinsäuren und polypeptide

Info

Publication number: DE69936105T3
Application number: DE69936105.2T
Authority: DE
Inventors: John Sims; Stewart Lyman; Hilary MCKENNA; Allison Armstrong
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1998-11-13
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2017-07-27
Anticipated expiration: 2019-11-13
Also published as: US7786271B2; CA2349762A1; AU755562B2; US20150005226A1; US7304144B2; CY1106806T1; CA2349762C; PT1129190E; US6555520B2; ES2288036T3; US8444979B2; JP2002530079A; JP2010088445A; JP2013078331A; ATE362534T2; AU1726600A; DK1129190T3; US20020146819A1; IL143034A; DE69936105D1

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht hiermit Nutzen der einstweiligen Anmeldung United States S. N. 60/108,452, eingereicht am 13. November 1998.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Technischer Bereich
Die Erfindung betrifft gereinigte und isolierte neue humane Thymus-Stroma-Lymphopoetin(TSLP)-Polypeptide und Fragmente davon,, Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Formen derartiger Polypeptide, fragmentierte Peptide, die von diesen Polypeptiden abstammen, sowie deren Verwendung.
Stand der Technik
Obwohl die Entwicklung der B-Zellen umfassend untersucht wurde, gibt es noch immer Lücken in dem Weg, der von hämatopoetischen Stammzellen zu reifen B-Zellen führt. Es wurde erkannt, dass Zytokine die B-Zellentwicklung und deren Wachstum beeinflussen und dabei eine kritische Rolle spielen. Bekannte Zytokine, die die B-Zellentwicklung beeinflussen, umfassen IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IFN-gamma und den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF).
In den letzten Jahren wurde nachgewiesen, dass ein neuer muriner Wachstumsfaktor, der als Thymus-Stroma-Lymphopoetin (TSLP) bezeichnet wird, bei der B-Zellentwicklung und -reifung eine Rolle spielt. Die Zytokinaktivität des murinen TSLP ist der von IL-7 sehr ähnlich, das während der Proliferation und dem Überleben von Prä-B-Zellen benötigt wird (Janeway et al., Immuno Biology, 2. Aufl. (1996)). Es wurde nachgewiesen, dass beide dieser Zytokine NAG8/7-Zellen erhalten (Friend et al., Exp. Hematol, 22: 321–328 (1994)) und B-Lymphopoiese unterstützen. Außerdem entwickeln sich reife B-Lymphozyten in der Abwesenheit von entweder IL-7 oder murinem TSLP nicht. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass murines TSLP IL-7 beim Aufrechterhalten von proliferativen B-Zell-Reaktionen ersetzen kann (Ray et al., Eur. J. Immunol., 26: 10–16 (1996)). So hat in dem Maus-System TSLP bei der B-Zellentwicklung eine maßgebliche Funktion.
Wie auch IL-7 kann murines TSLP auch Thymozyten und reife T-Zellen costimulieren (Friend et al., Exp. Hematol., 22: 321–328 (1994)). Untersuchungen mit IL-7-Rezeptor(IL-7R-)Knockout-Mäusen deuten drauf hin, dass IL-7, TSLP oder beide eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle des Orts der Neuanordnung des T-Zell-Rezeptors gamma (TCRγ) spielen, vermutlich durch Vermittlung von Zugänglichkeit der TCRγ-Gene zur VDJ-Rekombinase (Candeias et al., Immunology Letters, 57: 9–14 (1997)). So spielt murines TSLP auch bei der T-Zellentwicklung eine maßgebliche Rolle.
Murine TSLP-Rezeptoren und IL-7-Rezeptoren verwenden beide die IL-7R α-Kette als Teil ihres Signalgebungskomplexes (Levin et al., J. Immunol., 162: 677–683 (1999)). Trotz der gemeinsamen IL-7R α-Kette scheinen IL-7 und TSLP jedoch ihre lymphopoetischen Wirkungen durch unterschiedliche Mechanismen zu vermitteln. IL-7 induziert die Aktivierung von Stat5 und der Familie der Janus-Kinasen Jak1 und Jak3, wohingegen murines TSLP die Aktivierung von Stat5 induziert, aber nicht eine aus der bekannten Familie der Janus-Kinasen (Levin et al., J. Immunol., 162: 677–683 (1999)).
Im Anbetracht der wichtigen Funktion von murinem TSLP und der Bedeutung seiner Rolle bei der B-Zell- und T-Zellentwicklung und -reifung im System der Maus, besteht auf dem Gebiet ein Bedarf, humanes TSLP zu identifizieren und zu isolieren und seine Rolle bei der B-Zell- und T-Zellentwicklung und -reifung zu untersuchen. Außerdem stehen im Anbetracht des andauernden Interesses an der Lymphozytenentwicklung und dem Immunsystem die Entdeckung, Identifizierung und Rollen von neuen Proteinen, wie beispielsweise humanem TSLP und seinen Rezeptoren, in der modernen Molekularbiologie, Biochemie und Immunologie an vorderster Front. Trotz des wachsenden Wissenskorpus besteht noch immer Bedarf auf dem Gebiet nach der Identität und Funktion von Proteinen, die an zellulären und Immunantworten beteiligt sind.
In einem weiteren Aspekt ist die Identifizierung der Primärstruktur, oder Sequenz, eines unbekannten Proteins der Höhepunkt eines beschwerlichen Experimentierprozesses. Um ein unbekanntes Protein zu identifizieren, kann der Forscher sich auf den Vergleich des unbekannten Proteins mit bekannten Peptiden stützen, unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel werden Proteine routinemäßig unter Verwendung von Techniken wie Elektrophorese, Sedimentierung, Chromatographie, Sequenzierung und Massenspektrometrie analysiert.
Insbesondere ermöglicht der Vergleich eines unbekannten Proteins mit Polypeptiden von bekanntem Molekulargewicht die Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts des unbekannten Proteins (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microorganisms, S. 76–77, Prentice Hall, 6. Aufl., (1991)). Standards für Molekulargewichte von Proteinen sind kommerziell erhältlich, um die Abschätzung der Molekulargewichte von unbekannten Proteinen zu unterstützen (New England Biolabs Inc. Katalog: 130-13 (1995)); (J. L. Hartley, U.S. Patent Nr. 5,449,758 ). Die Standards für Molekulargewichte entsprechen jedoch vielleicht in der Größe nicht genau genug dem unbekannten Protein, um eine exakte Schätzung des scheinbaren Molekulargewichts zu ermöglichen. Die Schwierigkeit bei der Abschätzung des Molekulargewichts wird im Falle von Proteinen verschlimmert, die einer Fragmentierung durch chemische oder enzymatische Mittel unterzogen wurden, durch posttranslationale Modifizierung oder Verarbeitung modifiziert wurden und/oder mit anderen Proteinen in nicht kovalenten Komplexen assoziiert sind.
Außerdem führt die einzigartige Natur der Zusammensetzung eines Proteins mit Bezug auf seine spezifischen Aminosäurekomponenten zu einer einzigartigen Positionierung der Spaltungsstellen innerhalb des Proteins. Spezifische Fragmentierung eines Proteins durch chemische oder enzymatische Spaltung führt zu einem einzigartigen „Peptid-Fingerabdruck” (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106 (1977); M. Brown et al., J. Gen. Virol. 50: 309–316 (1980)). Demzufolge führt die Spaltung an spezifischen Stellen zu reproduzierbarer Fragmentierung eines gegebenen Proteins zu Peptiden mit präzisen Molekulargewichten. Des Weiteren besitzen diese Peptide einzigartige Ladungseigenschaften, die den isoelektrischen pH-Wert des Peptids bestimmen. Diese einzigartigen Eigenschaften können unter Verwendung einer Vielzahl von elektrophoretischen und anderen Techniken ausgenutzt werden (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microorganisms, S. 76–77, Prentice Hall, 6. Aufl. (1991)).
Fragmentierung von Proteinen wird des Weiteren für die Analyse der Aminosäurezusammensetzung und die Sequenzierung des Proteins eingesetzt (P. Matsudiara, J. Biol. Chem., 262: 10035–10038 (1987); C. Eckerskorn et al., Electrophoresis, 9: 830–838 (1988)), insbesondere die Herstellung von Fragmenten von Proteinen mit einem „blockierten” N-Terminus. Außerdem können fragmentierte Proteine für die Immunisierung, für Affinitätsselektion (R. A. Brown, U.S. Patent Nr. 5,151,412 ), für die Bestimmung von Modifizierungsstellen (z. B. Phosphorylierung), zur Erzeugung von aktiven biologischen Verbindungen (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microorganisms, 300–301 (Prentice Hall, 6. Aufl, (1991)), und für die Differenzierung von homologen Proteinen verwendet werden (M. Brown et al., J. Gen. Virol., 50: 309–316 (1980)).
Außerdem kann, wenn ein Peptid-Fingerabdruck eines unbekannten Proteins erhalten wird, dieser mit einer Datenbank von bekannten Proteinen verglichen werden, um die Identifizierung des unbekannten Proteins unter Verwendung von Massenspektrometrie unterstützen (W. J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5011–5015 (1993); D. Fenyo et al., Electrophoresis, 19: 998–1005 (1998)). Es ist eine Vielzahl an Softwareprogrammen für Computer zur Erleichterung dieser Vergleiche über das Internet zugänglich, wie beispielsweise Protein Prospector (Internetseite: prospector.uscf.edu), Multildent (Internetseite: www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (Internetseite: www.mann.embl-heidelberg.de...deSearch/FR_PeptideSearch Form.html), und ProFound (Internetseite: www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/protid-frag.html). Diese Programme ermöglichen dem Anwender, das Spaltungsmittel und die Molekulargewichte der fragmentierten Peptide innerhalb einer festgelegten Toleranz zu spezifizieren. Die Programme vergleichen diese Molekulargewichte mit den in Datenbanken gespeicherten Informationen über die Molekulargewichte der Proteine, um die Bestimmung der Identität des unbekannten Proteins zu unterstützen. Exakte Informationen bezüglich der Anzahl von fragmentierten Peptiden und dem präzisen Molekulargewicht dieser Peptide sind für eine exakte Identifizierung erforderlich. Daher sollte eine Steigerung der Genauigkeit bei der Bestimmung der Anzahl an fragmentierten Peptiden und des präzisen Molekulargewichts zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Identifizierung von unbekannten Proteinen führen.
Außerdem können Peptidverdauprodukte von unbekannten Proteinen unter Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) sequenziert werden und die resultierende Sequenz kann gegen Datenbanken gesucht werden (J. K. Eng, et al., J. Am. Soc. Mass Spec. 5: 976–989 (1994); M. Mann und M. Wilm, Anal. Chem., 66: 4390–4399 (1994); J. A. Taylor und R. S. Johnson, Rapid Comm. Mass Spec, 11: 1067–1075 (1997)). Suchprogramme, die in diesem Prozess verwendet werden können, existieren im Internet, wie beispielsweise Lutefisk 97 (Internetseite: www.lsbc.com:70/Lutefisk97.html), und die oben beschriebenen Programme Protein Prospector, Peptide Search und ProFound. Daher kann die Hinzufügung der Sequenz eines Gens und seiner vorhergesagten Proteinsequenz und Peptidfragmenten zu einer Sequenzdatenbank bei der Identifizierung von unbekannten Proteinen unter Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie helfen.
Also besteht auch ein Bedarf auf dem Gebiet nach Polypeptiden, die für die Verwendung in Peptid-Fragmentierungsuntersuchungen, für die Verwendung in Molekulargewichtsmessungen und für die Verwendung bei der Proteinsequenzierung unter Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie geeignet sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung trägt dazu bei, diese verschiedenen Bedürfnisse des Fachgebiets zu erfüllen, indem sie isolierte humane TSLP-Polypeptide zur Verfügung stellt, die durch diese Nukleinsäuren kodiert werden. Besondere Ausführungsformen sind auf ein isoliertes TSLP-Nukleinsäuremolekül gerichtet, das die DNA-Sequenz von SEQ ID NO:1 umfasst, und ein isoliertes TSLP-Nukleinsäuremolekül, das für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 kodiert, sowie Nukleinsäuremoleküle, die zu diesen Sequenzen komplementär sind. Es sind sowohl einzelsträngige und doppelsträngige RNA- und DNA-Nukleinsäuremoleküle eingeschlossen, als auch Nukleinsäuremoleküle, die an eine denaturierte, doppelsträngige DNA hybridisieren, welche die gesamte SEQ ID NO:1 oder einen Teil davon umfasst. Ebenfalls eingeschlossen sind isolierte Nukleinsäuremoleküle, die durch in vitro Mutagenese des Nukleinsäuremoleküls, das die Sequenz von SEQ ID NO:1 umfasst, gewonnen werden, die gegenüber dem Nukleinsäuremolekül, das die Sequenz von SEQ ID NO:1 umfasst, degeneriert sind und die allele Varianten von erfindungsgemäßer DNA sind. Die Beschreibung umfasst auch rekombinante Vektoren, die auf die Expression dieser Nukleinsäuremoleküle gerichtet sind, und Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert oder transfiziert wurden.
Außerdem umfasst die Beschreibung Verfahren zur Verwendung der oben genannten Nukleinsäure zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine mit der Fähigkeit, Zellproliferation in der B-Linie oder T-Linie zu induzieren, kodieren; zur Identifizierung des humanen Chromosoms Nummer 5; zur Kartierung von Genen des humanen Chromosoms Nummer 5; zur Identifizierung von Genen, die mit bestimmten Erkrankungen, Syndromen oder anderen humanen Zuständen zusammenhängen, die mit dem humanen Chromosom Nummer 5 zusammenhängen, und zur Untersuchung der Zellsignalgebung und des Immunsystems.
Die Beschreibung umfasst auch die Verwendung von Sense- oder Antisense-Oligonukleotiden von der Nukleinsäure von SEQ ID NO:1, um die Expression des durch das TSLP-Gen kodierten Polynukleotids zu inhibieren.
Die Erfindung umfasst auch isolierte Polypeptide und Fragmente davon, die durch diese Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, einschließlich löslicher Polypeptid-Teile von SEQ ID NO:2. Die Erfindung umfasst des Weiteren Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptide, umfassend die Kultivierung einer Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression begünstigen, und das Gewinnen des Polypeptids aus dem Kulturmedium. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung die Expression dieser Polypeptide in Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- und tierischen Zellen.
Im Allgemeinen können die erfindungsgemäßen Polypeptide verwendet werden, um zelluläre Prozesse wie Immunregulierung, Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Zelltod, Zellmigration, Zell-zu-Zelle-Wechselwirkung und entzündliche Reaktionen zu untersuchen. Außerdem können diese Polypeptide verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die mit TSLP-Liganden und TSLP-Rezeptoren zusammenhängen.
Außerdem umfasst die Erfindung Assays, die diese Polypeptide für das Screening nach möglichen Inhibitoren für Aktivität verwenden, die mit Molekülen mit entgegengesetzter Struktur zum Polypeptid einhergeht, und Verfahren zur Verwendung dieser Polypeptide als therapeutische Mittel für die Behandlung von Erkrankungen, die durch Moleküle mit entgegengesetzter Struktur zum TSLP-Polypeptid vermittelt werden. Des Weiteren sind Verfahren zur Verwendung dieser Polypeptide beim Entwurf von Inhibitoren dafür ebenfalls ein Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung umfasst des Weiteren ein Verfahren zur Verwendung dieser Polypeptide als Molekulargewichtsmarker, welche die Abschätzung des Molekulargewichts eines Proteins oder eines fragmentierten Proteins ermöglichen, sowie ein Verfahren zur Sichtbarmachung der erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarker dafür unter Verwendung von Elektrophorese. Die Erfindung umfasst des Weiteren Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide als Marker für die Bestimmung des isoelektrischen Punkts eines unbekannten Proteins, sowie als Kontrollen für die Festlegung des Ausmaßes der Fragmentierung eines Proteins.
Des Weiteren umfasst die vorliegende Erfindung Kits zur Unterstützung dieser Bestimmungen.
Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung der humanen TSLP Nukleinsäuresequenzen, der vorhergesagten Aminosäuresequenzen des Polypeptids oder dessen Fragmente oder eine Kombination aus den vorhergesagten Aminosäuresequenzen des Polypeptids und dessen Fragmenten zur Verwendung bei der Durchsuchung einer elektronischen Datenbank zur Unterstützung bei der Identifizierung von Nukleinsäure- und/oder Proteinproben.
Isolierte polyklonale oder monoklonale Antikörper, die an diese Polypeptide binden, sind ebenfalls beschrieben, sowie die Verwendung dieser Antikörper, um die Reinigung von TSLP-Polypeptiden zu unterstützen. Außerdem können die isolierten Antikörper verwendet werden, um ein Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) aufzubauen, um TSLP in Proben wie beispielsweise Serum zu messen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt die Nukleinsäuresequenz der humanen TSLP-DNA (SEQ ID NO:1) dar, und
2 stellt die Aminosäuresequenz von humanem TSLP (SEQ ID NO:2) dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Nukleinsäuremoleküle umfassen die folgende Nukleotidsequenz: Name: TSLP
Die Aminosäuresequenz des durch die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz kodierten Polypeptids umfasst: Name: TSLP (Polypeptid)
Die Entdeckung der Nukleinsäuren ermöglicht die Konstruktion von Expressionsvektoren, umfassend Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide kodieren; Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transfiziert oder transformiert werden; isolierte und gereinigte, biologisch aktive Polypeptide und Fragmente davon; die Verwendung der Nukleinsäuren oder Oligonukleotide davon als Sonden zur Identifizierung von Nukleinsäure, die für Proteine mit einer TSLP-ähnlichen Aktivität kodieren (z. B. Induzierung der Zellproliferation in der B-Linie oder T-Linie); die Verwendung der Nukleinsäuren oder Oligonukleotide davon zur Identifizierung des humanen Chromosoms Nummer 5; die Verwendung der Nukleinsäuren oder Oligonukleotide davon zur Kartierung von Genen auf dem humanen Chromosom Nummer 5; die Verwendung der Nukleinsäure oder Oligonukleotide davon zur Identifizierung von Genen, die mit bestimmten Erkrankungen, Syndromen oder anderen menschlichen Zuständen zusammenhängen, die mit dem humanen Chromosom Nummer 5, und insbesondere mit der q21-q22-Region von Chromosom Nummer 5 zusammenhängen, einschließlich des Gardner-Syndroms, der adenomatösen Polyposis coli, der erblichen Desmoid-Krankheit, des Turcot-Syndroms und des kolorektalen Karzinoms; die Verwendung von einzelsträngigen Sense- oder Antisense-Oligonukleotiden von den Nukleinsäuren, um die Expression der durch das TSLP-Gen kodierten Polynukleotide zu inhibieren. die Verwendung derartiger Polypeptide und löslicher Fragmente zur Induzierung der Zellproliferation in der B-Linie oder T-Linie; die Verwendung derartiger Polypeptide und fragmentierter Peptide als Molekulargewichtsmarker; die Verwendung derartiger Polypeptide und fragmentierter Peptide als Kontrollen für Peptidfragmentierung, und Kits, die diese Reagenzien enthalten; die Verwendung derartiger Polypeptide und Fragmenten davon zur Erzeugung von Antikörpern und die Verwendung der Antikörper, um TSLP-Polypeptide zu reinigen.
NUKLEINSAUREMOLEKÜLE
Beschrieben sind bestimmte, isolierte Nukleotidsequenzen, die frei von kontaminierendem, endogenem Material sind. Eine „Nukleotidsequenz” bezieht sich auf ein Polynukleotidmolekül in der Form eines separaten Fragments oder als ein Bestandteil eines größeren Nukleinsäurekonstrukts. Das Nukleinsäuremolekül wurde von der DNA oder RNA abgeleitet, welche zumindest einmal in im Wesentlichen reiner Form isoliert wurde und in einer Menge oder Konzentration, die die Identifizierung, Manipulation und Gewinnung deren einzelner Nukleotidsequenzen durch biochemische Standardmethoden ermöglicht (wie zum Beispiel die in Sambrok et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) dargestellten). Derartige Sequenzen werden vorzugsweise in der Form eines offenen Leserahmens bereitgestellt und/oder konstruiert, der durch interne nicht translatierte Sequenzen, oder Introns, nicht unterbrochen wird, die typischerweise in eukaryotischen Genen vorkommen. Sequenzen von nicht translatierter DNA können 5' oder 3' von einem offenen Leserahmen vorkommen, wobei derselbe die Manipulation oder Expression der codierenden Region nicht stört.
Nukleinsäuremoleküle umfassen DNA sowohl in einzelsträngiger als auch doppelsträngiger Form, sowie das RNA-Komplement davon. DNA umfasst, zum Beispiel, cDNA, genomische DNA, chemisch synthetisierte DNA, durch PCR amplifizierte DNA und Kombinationen daraus. Genomische DNA kann mittels herkömmlicher Techniken isoliert werden, z. B. unter Verwendung der cDNA von SEQ ID NO:1, oder einem geeigneten Fragment davon, als Sonde.
Die DNA-Moleküle umfassen Volllängen-Gene sowie Polynukleotide und Fragmente davon. Das Volllängen-Gen kann auch das N-terminale Signalpeptid umfassen. Andere Ausführungsformen umfassen DNA, die für eine lösliche Form kodiert, z. B. die für die extrazelluläre Domäne des Proteins, entweder mit oder ohne das Signalpeptid, kodiert.
Die Nukleinsäuren werden vorzugsweise aus menschlichen Quellen gewonnen, aber die Erfindung umfasst auch solche, die aus nicht menschlichen Spezies gewonnen wurden.
Bevorzugte Sequenzen
Die insbesondere bevorzugte Nukleotidsequenz ist SEQ ID NO:1, wie oben dargelegt. Ein cDNA-Klon mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. Die Sequenz der Aminosäuren, die durch die DNA von SEQ ID NO:1 kodiert wird, ist in SEQ ID NO:2 gezeigt. Diese Sequenz identifiziert das TSLP-Polynukleotid als ein Mitglied einer Gruppe von Faktoren, die das Zellwachstum der B-Linie und T-Linie beeinflussen (Ray et al., Eur. J. Immunol, 26: 10–16 (1996)); (Friend et al., Exp. Hematol., 22: 321–328 (1994)).
Zusätzliche Sequenzen
Aufgrund der bekannten Degeneration des genetischen Codes, wobei mehr als ein Codon für die gleiche Aminosäure kodieren kann, kann eine DNA-Sequenz von der in SEQ ID NO:1 gezeigten variieren und noch immer für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 kodieren. Derartige abweichende DNA-Sequenzen können eine Folge von stillen Mutationen sein (die z. B. während der PCR-Amplifizierung auftreten), oder können das Produkt einer absichtlichen Mutagenese einer nativen Sequenz sein.
Die Beschreibung stellt so isolierte DNA-Sequenzen bereit, die für erfindungsgemäße Polypeptide kodieren, ausgewählt aus: (a) DNA, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1; (b) DNA, kodierend für das Polypeptid von SEQ ID NO:2; (c) DNA, fähig zur Hybridisierung an eine DNA von (a) oder (b) unter mäßig stringenten Bedingungen, und die für erfindungsgemäße Polypeptide kodiert; (d) DNA, fähig zur Hybridisierung an eine DNA von (a) oder (b) unter hoch stringenten Bedingungen, und die für erfindungsgemäße Polypeptide kodiert, und (e) DNA, die als Folge des genetischen Codes zu einer DNA, definiert in (a), (b), (c) oder (d), degeneriert ist und die für erfindungsgemäße Polypeptide kodiert. Selbstverständlich umfasst die vorliegende Erfindung auch Polypeptide, die durch derartige DNA-Sequenzen kodiert werden.
Wie hier verwendet, können Bedingungen mäßiger Stringenz ohne Weiteres von einem durchschnittlichen Fachmann basierend auf, zum Beispiel, der Länge der DNA, bestimmt werden. Die grundlegenden Bedingungen werden dargelegt von (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Bd. 1, S. 1.101–104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), und umfassen die Verwendung einer Vorwaschlösung für die Nitrocellulose-Filter 5xSSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), Hybridisierungsbedingungen von etwa 50% Formamid, 6xSSC bei etwa 42°C (oder eine andere ähnliche Hybridisierungslösung, wie beispielsweise Stark-Lösung, in etwa 50% Formamid bei etwa 42°C), und Waschbedingungen von etwa 60°C 0,5xSSC, 0,1% SDS. Bedingungen hoher Stringenz können ebenfalls ohne Weiteres von einem Fachmann basierend auf, zum Beispiel, der Länge der DNA bestimmt werden. Im Allgemeinen sind derartige Bedingungen definiert als Hybridisierungsbedingungen wie oben, und mit Waschen bei etwa 68°C, 0,2xSSC, 0,1% SDS. Der Fachmann wird erkennen, dass die Temperatur und die Salzkonzentration der Waschlösung gegebenenfalls angepasst werden können, gemäß solcher Faktoren wie beispielsweise der Länge der Sonde.
Ebenfalls eingeschlossen ist DNA, die für Polypeptidfragmente und Polypeptide kodiert, die (eine) inaktivierte N-Glykosylierungsstelle(n), (eine) inaktivierte Protease-Prozessierungsstelle(n) oder (eine) konservative Aminosäure-Substitution(en) enthalten, wie unten beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform enthalten die Nukleinsäuremoleküle auch Nukleotidsequenzen, die zu mindestens 80% mit einer nativen Sequenz identisch sind. Ebenfalls in Erwägung gezogen werden Ausführungsformen, in denen ein Nukleinsäuremolekül eine Sequenz enthält, die zu mindestens 90% identisch, zu mindestens 95% identisch, zu mindestens 98% identisch, zu mindestens 99% identisch oder zu mindestens 99,9% identisch zu einer nativen Sequenz ist.
Der Grad an Identität kann durch visuelle Überprüfung und mathematische Berechnungen bestimmt werden. Alternativ kann der Grad an Identität von zwei Nukleinsäuresequenzen durch Vergleichen von Sequenzinformationen unter Verwendung des GAP-Computerprogramms, Version 6.0 beschrieben von (Devereux et al. Nucl. Acids Res. 12: 387, (1984)) und erhältlich von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG), bestimmt werden. Die bevorzugten vorgegebenen Parameter für das GAP-Programm umfassen: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (enthaltend einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten) für Nukleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von (Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, (1986)), wie von (Schwartz und Dayhoff, Hrgs., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, S. 353–358, (1979)) beschrieben; (2) eine Strafe von 3,0 für jede Lücke und eine zusätzliche 0,10 Strafe für jedes Symbol in jeder Lücke, und (3) keine Strafe für Endlücken. Es können auch andere von einem Fachmann zum Vergleich von Sequenzen verwendete Programme verwendet werden.
Die Beschreibung stellt auch isolierte Nukleinsäuren bereit, die bei der Herstellung von Polypeptiden von Nutzen sind. Derartige Polypeptide können durch eine beliebige einer Anzahl an herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Eine für ein humanes TSLP-Polypeptid kodierende DNA-Sequenz oder ein gewünschtes Fragment davon kann für die Herstellung des Polypeptids oder Fragments in einen Expressionsvektor subkloniert werden. Die DNA-Sequenz wird vorteilhafterweise an eine Sequenz fusioniert, die für ein geeignetes Leader- oder Signalpeptid kodiert. Alternativ kann das gewünschte Fragment unter Verwendung von bekannten Techniken chemisch synthetisiert werden. DNA-Fragmente können auch durch Verdau mit Restriktionsendonucleasen einer klonierten Volllängen-DNA-Sequenz hergestellt werden und durch Elektrophorese auf Agarose-Gelen isoliert werden. Gegebenenfalls können Oligonukleotide, die den 5'- oder 3'-Terminus bis zu einem gewünschten Punkt rekonstituieren, an ein DNA-Fragment ligiert werden, das durch den Verdau mit Restriktionsenzym erzeugt wurde. Derartige Oligonukleotide können außerdem eine Spaltungsstelle für eine Restriktionsendonuclease stromaufwärts der gewünschten kodierenden Sequenz enthalten, und positionieren einen Startcodon (ATG) am N-Terminus der kodierenden Sequenz.
Das wohlbekannte Verfahren der Polymerasekettenreaktion (PCR) kann ebenfalls eingesetzt werden, um eine DNA-Sequenz, die für ein gewünschtes Proteinfragment kodiert, zu isolieren und zu amplifizieren. Oligonukleotide, welche die gewünschten Termini des DNA-Fragments definieren, werden als 5'- und 3'-Primer eingesetzt. Die Oligonukleotide können zusätzlich Erkennungsstellen für Restriktionsendonucleasen enthalten, um die Insertion des amplifizierten DNA-Fragments in einen Expressionsvektor zu vereinfachen. PCR-Techniken werden beschrieben in (Saiki et al., Science, 239: 487 (1988)); (Wu et al., Recombinant DNA Methodology, Hrgs., Academic Press, Inc., San Diego, S. 189–196 (1989)); und (Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Hrgs., Academic Press, Inc. (1990)).
POLYPEPTIDE UND FRAGMENTE DAVON
Die Erfindung umfasst Polypeptide und Fragmente davon in verschiedenen Formen, einschließlich solcher, die natürlich vorkommen oder durch verschiedene Techniken hergestellt werden, wie beispielsweise Verfahren, die rekombinante DNA-Technologie umfassen. Derartige Formen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Derivate, Varianten und Oligomere sowie Fusionsproteine oder Fragmente davon.
Polypeptide und Fragmente davon
Die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen Volllängen-Proteine, die durch die oben dargelegten Nukleinsäuresequenzen kodiert werden. Besonders bevorzugte Polypeptide umfassen die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, wobei besonders bevorzugte Fragmente die Aminosäuren 29 bis 159 (der reifen Polypeptidsequenz) von SEQ ID NO:2 umfassen.
Das Polypeptid von SEQ ID NO:2 umfasst eine N-terminale hydrophobe Region, die als ein Signalpeptid wirkt. Die Computeranalyse sagt vorher, dass das Signalpeptid den Resten 1 bis 28 von SEQ ID NO:2 entspricht (obwohl die nächsten, wahrscheinlichsten vom Computer vorhergesagten Signalpeptid-Spaltungsstellen (in absteigender Reihenfolge) nach den Aminosäuren 34 und 116 von SEQ ID NO:2 auftreten). Abspaltung des Signalpeptids würde daher ein reifes Protein ergeben, das die Aminosäuren 29 bis 159 von SEQ ID NO:2 enthält.
Der Fachmann wird erkennen, dass die oben beschriebenen Grenzen derartiger Regionen des Polypeptids angenähert sind. Zur Veranschaulichung: die Grenzen des Signalpeptids (die unter Verwendung von für diesen Zweck erhältlichen Computerprogrammen vorhergesagt werden können) können von den oben beschriebenen abweichen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können an die Membran gebunden sein oder sie können sezerniert werden und also löslich sein. Lösliche Polypeptide können von den Zellen, in denen sie exprimiert werden, sezerniert werden. Im Allgemeinen können lösliche Polypeptide durch Abtrennung von intakten Zellen, die das gewünschte Polypeptid exprimieren, von dem Kulturmedium, zum Beispiel durch Zentrifugieren, und Untersuchen des Mediums (Überstands) auf die Gegenwart des gewünschten Polypeptids, identifiziert (und von nicht löslichen an die Membran gebundenen Gegenstücken unterschieden) werden. Die Gegenwart des Polypeptids in dem Medium deutet darauf hin, dass das Polypeptid von den Zellen sezerniert wurde und also eine lösliche Form des Proteins ist.
In einer Ausführungsform umfassen die löslichen Polypeptide und Fragmente davon die gesamte oder einen Teil der extrazellulären Domäne, aber es fehlt ihnen die Transmembranregion, die ein Zurückhalten des Polypeptids auf einer Zellmembran verursachen würde. Ein lösliches Polypeptid kann die cytoplasmatische Domäne enthalten oder einen Teil davon, so lange wie das Polypeptid von der Zelle, in der es produziert wird, sezerniert wird.
Weitere Ausführungsformen umfassen lösliche Fragmente mit einem N-Terminus bei den Aminosäuren 29 oder 35 und einem C-Terminus bei Aminosäure 159.
Im Allgemeinen ist die Verwendung von löslichen Formen für bestimmte Anwendungen von Vorteil. Die Reinigung der Polypeptide von rekombinanten Wirtszellen wird vereinfacht, da die löslichen Polypeptide von den Zellen sezerniert werden. Des Weiteren sind lösliche Polypeptide im Allgemeinen mehr geeignet für die intravenöse Verabreichung.
Die Erfindung stellt auch Polypeptide und Fragmente der extrazellulären Domäne bereit, die eine gewünschte biologische Aktivität beibehalten. Besondere Ausführungsformen sind auf Polypeptidfragmente gerichtet, welche die Fähigkeit, TSLP-Rezeptoren zu binden, beibehalten. Ein derartiges Fragment kann ein lösliches Polypeptid sein, wie oben beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Polypeptide und Fragmente vorteilhafterweise Regionen, die unter der Proteinfamilie, die das Zellwachstum in der B-Linie oder T-Linie wie oben beschrieben beeinflussen, konserviert sind.
Es werden hierin ebenfalls Polypeptidfragmente bereitgestellt, die mindestens 20, oder mindestens 30, zusammenhängende Aminosäuren der Sequenz von SEQ ID NO:2 enthalten. Fragmente, die von der cytoplasmatischen Domäne abgeleitet wurden, finden Verwendung bei Untersuchungen der Signaltransduktion und bei der Regulierung von zellulären Prozessen, die mit der Transduktion von biologischen Signalen einhergehen. Polypeptidfragmente können auch als Immunogene bei der Erzeugung von Antikörpern eingesetzt werden.
Varianten
Natürlich vorkommende Varianten sowie abgeleitete Varianten der Polypeptide und Fragmente werden hierin bereitgestellt.
Varianten können Aminosäuresequenzen aufweisen, die zu mindestens 95% identisch, zu mindestens 98% identisch, zu mindestens 99% identisch oder zu mindestens 99,9% identisch mit dem bevorzugten Polypeptid oder Fragment davon ist. Der Grad an Identität kann durch visuelle Überprüfung und mathematische Berechnungen bestimmt werden. Alternativ kann der Grad an Identität von zwei Proteinsequenzen durch Vergleichen von Sequenzinformationen unter Verwendung des GAP-Computerprogramms, basierend auf dem Algorithmus von (Neddleman und Wunsch, J. Mol. Bio., 48: 443, (1970)) und erhältlich von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG), bestimmt werden. Die bevorzugten vorgegebenen Parameter für das GAP-Programm umfassen: (1) eine Wertungsmatrix BLOSUM62, wie beschrieben von (Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992)); (2) ein Gap Weight von 12; (3) eine Gap Length Weight von 4; und (4) keine Strafe für Endlücken. Es können auch andere von einem Fachmann zum Vergleich von Sequenzen verwendete Programme verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Varianten umfassen, zum Beispiel, solche, die eine Folge von alternativen mRNA-Spleißereignissen oder von proteolytischer Spaltung sind. Alternatives Spleißen von mRNA kann, zum Beispiel, ein verkürztes, aber biologisch aktives Protein ergeben, wie beispielsweise eine natürlich vorkommende lösliche Form des Proteins. Variationen, die einer Proteolyse zugeschrieben werden können, umfassen, zum Beispiel, Unterschiede in den N- oder C-Termini bei Expression in verschiedenen Arten von Wirtszellen, aufgrund der proteolytischen Entfernung von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren aus dem Protein (im Allgemeinen 1 – 5 terminale Aminosäuren). Proteine, bei denen Unterschiede in der Aminosäuresequenz dem genetischen Polymorphismus zugeschrieben werden können (allele Variationen unter Individuen, die das Protein produzieren), werden hierin ebenfalls in Betracht gezogen.
Zusätzliche Varianten innerhalb des Bereichs der Erfindung umfassen Polypeptide, die modifiziert werden können, um Derivate davon zu schaffen, durch Bildung von kovalenten oder aggregativen Konjugaten mit anderen chemischen Einheiten wie beispielsweise Glykosylgruppen, Lipiden, Phosphat, Acetylgruppen und dergleichen. Kovalente Derivate können hergestellt werden, indem die chemischen Einheiten an funktionelle Gruppen an einer Aminosäure-Seitenkette oder an den N-Terminus oder C-Terminus eines Polypeptids geknüpft werden. Konjugate, die diagnostische (nachweisbare) oder therapeutische Mittel enthalten, an die sie geknüpft sind, werden hier in Erwägung gezogen, wie unten ausführlicher diskutiert wird.
Weitere Derivate umfassen kovalente oder aggregative Konjugate der Polypeptide mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie beispielsweise durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Beispiele für Fusionsproteine werden unten im Zusammenhang mit Oligomeren diskutiert. Des Weiteren können Fusionsproteine Peptide umfassen, die für eine Erleichterung der Reinigung und Identifizierung angefügt werden. Derartige Peptide umfassen, zum Beispiel, poly-His oder die in U.S. Patent Nr. 5,011,912 und in (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, (1988)) beschriebenen, antigenischen Identifizierungspeptide. Ein solches Peptid ist das FLAG^®-Peptid, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, (SEQ ID NO:3), das hoch antigen ist und ein Epitop bereitstellt, das reversibel durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden wird, was eine schnelle Untersuchung und einfache Reinigung von exprimiertem, rekombinantem Protein ermöglicht. Ein murines, mit 4E11 bezeichnetes Hybridom stellt einen monoklonalen Antikörper her, der das FLAG^®-Peptid in der Gegenwart von bestimmten zweiwertigen Metallkationen bindet, wie in U.S. Patent 5,011,912 beschrieben. Die 4E11-Hybridom-Zelllinie wurde bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer HB 9259 hinterlegt. Monoklonale Antikörper, die das FLAG^®-Peptid binden, sind erhältlich von Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Hauen, Connecticut.
Unter den hierin bereitgestellten Varianten von Polypeptiden sind Varianten von nativen Polypeptiden, welche die native biologische Aktivität beibehalten oder das wesentliche Äquivalent davon. Ein Beispiel ist eine Variante, die im Wesentlichen mit der gleichen Bindungsaffinität bindet wie die native Form. Die Bindungsaffinität kann durch herkömmliche Verfahren gemessen werden, z. B. wie in U.S. Patent Nr. 5,512,457 beschrieben und im Folgenden dargelegt.
Varianten umfassen Polypeptide, die im Wesentlichen zu ihrer nativen Form homolog sind, die aber eine Aminosäuresequenz aufweisen, die sich von der nativen Form unterscheidet, aufgrund von einer oder mehreren Deletionen, Insertionen oder Substitutionen. Besondere Ausführungsformen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Polypeptide, die von einer bis zehn Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten enthalten, verglichen mit einer nativen Sequenz.
Eine gegebene Aminosäure kann ersetzt werden, zum Beispiel, durch einen Rest mit gleichartigen physiko-chemischen Eigenschaften. Beispiele für derartige konservative Substitutionen umfassen die Substitution eines aliphatischen Rests durch einen anderen, wie beispielsweise Ile, Val, Leu oder Ala durch einander; Substitutionen von einem polaren Rest durch einen anderen, wie beispielsweise zwischen Lys und Arg, Glu und Asp oder Gln und Asn; oder Substitutionen von einem aromatischen Rest durch einen anderen, wie beispielsweise Phe, Trp oder Tyr durch einander. Weitere konservative Substitutionen, die, z. B., Substitutionen von gesamten Regionen mit gleichartigen hydrophoben Eigenschaften umfassen, sind wohlbekannt.
Ebenso umfassen DNAs Varianten, die sich von einer nativen DNA-Sequenz aufgrund von einer oder mehreren Deletionen, Insertionen oder Substitutionen unterscheiden, die jedoch für ein biologisch aktives Polypeptid kodieren.
Die Erfindung umfasst des Weiteren erfindungsgemäße Polypeptide mit oder ohne eine damit einhergehende Glykosylierung nach natürlichem Muster. Polypeptide, die in Hefe- oder Säugetier-Expressionssystemen exprimiert werden (z. B., COS-1 oder COS-7-Zellen) können einem nativen Polypeptid ähnlich sein oder sich deutlich von ihm unterscheiden, was Molekulargewicht oder Glykosylierungsmuster angeht, in Abhängigkeit von der Wahl des Expressionssystems. Expression von erfindungsgemäßen Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen wie beispielsweise E. coli liefert nicht glykosylierte Moleküle. Des Weiteren kann ein gegebenes Präparat multiple, unterschiedlich glykosylierte Spezies des Proteins umfassen. Glykosylgruppen können mittels herkömmlicher Verfahren entfernt werden, insbesondere mittels solcher, die Glykopeptidase verwenden. Im Allgemeinen können glykosylierte, erfindungsgemäße Polypeptide mit einem molaren Überschuss an Glykopeptidase (Boehringer Mannheim) inkubiert werden.
Entsprechend sind gleichartige DNA-Konstrukte, die für verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten oder -sequenzen, oder Deletionen von terminalen oder inneren Resten oder Sequenzen kodieren, eingeschlossen. Zum Beispiel können N-Glykosylierungsstellen in einer extrazellulären Domäne des Polypeptids modifiziert werden, um Glykosylierung auszuschließen, was eine Expression eines reduzierten Kohlenhydratanalogons in Säugetier- und Hefe-Expressionssystemen ermöglicht. N-Glykosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden sind durch ein Aminosäure-Triplett Asn-X-Y gekennzeichnet, wobei X irgendeine Aminosäure ist, und Y Ser oder Thr ist. Geeignete Substitutionen, Additionen oder Deletionen an der Nukleotidsequenz, die für diese Tripletts kodiert, werden zur Vermeidung einer Bindung der Kohlenhydratreste an die Asn-Seitenkette führen. Veränderung eines einzelnen Nukleotids, so ausgewählt, dass Asn durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, zum Beispiel, ist ausreichend, um die N-Glykosylierungsstelle zu inaktivieren. Alternativ kann das Ser oder Thr durch eine andere Aminosäure, wie beispielsweise Ala ersetzt werden. Bekannte Verfahren zur Inaktivierung von N-Glykosylierungsstellen in Proteinen umfassen solche, die in U.S. Patent 5,071,972 und EP 276 846 beschrieben werden.
In einem weiteren Beispiel können Varianten, Sequenzen, die für Cys-Reste kodieren, die für die biologische Aktivität nicht essentiell sind, verändert werden, um eine Deletion oder einen Austausch der Cys-Reste durch andere Aminosäuren zu verursachen, was die Bildung von falschen, intramolekularen Disulfidbrücken bei Faltung oder Renaturierung verhindert.
Andere Varianten werden durch Modifizierung von benachbarten zweiwertigen Aminosäureresten hergestellt, um die Expression in Hefesystemen zu verstärken, in denen eine KEX2-Protease-Aktivität vorliegt. EP 212,914 offenbart die Verwendung von ortspezifischer Mutagenese, um Prozessierungsstellen für KEX2-Protease in einem Protein zu inaktivieren. Prozessierungsstellen für KEX2-Protease werden durch Deletion, Addition oder Substitution von Resten zur Veränderung von Arg-Arg-, Arg-Lys- und Lys-Arg Paaren inaktiviert, um das Auftreten dieser benachbarten Basenpaare zu eliminieren. Lys-Lys-Paarungen sind deutlich weniger empfindlich gegenüber KEX2-Spaltung und Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg zu Lys-Lys stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz zur Inaktivierung von KEX2-Stellen dar.
Oligomere
Eingeschlossen in die Erfindung sind Oligomere oder Fusionsproteine, die humane TSLP-Polypeptide enthalten. Derartige Oligomere können in der Form von kovalent gebundenen oder nicht kovalent gebundenen Multimeren vorliegen, einschließlich Dimeren, Trimeren oder höheren Oligomeren. Wie oben erwähnt sind bevorzugte Polypeptide löslich und daher können diese Oligomere lösliche Polypeptide enthalten. In einem Aspekt der Erfindung behalten die Oligomere die Bindungsfähigkeit der Polypeptidkomponenten bei und bieten daher zweiwertige, dreiwertige, usw. Bindungsstellen sein.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist auf Oligomere gerichtet, die multiple Polypeptide enthalten, die durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen zwischen Peptideinheiten, die an die Polypeptide fusioniert sind, verbunden werden. Derartige Peptide können Peptidlinker (Spacer) sein, oder Peptide, welche die Eigenschaft aufweisen, Oligomerisierung zu begünstigen. Leucin-Zipper und bestimmte Polypeptide, die aus Antikörpern gewonnen werden, gehören zu den Peptiden, die Oligomerisierung der daran geknüpften Polypeptide begünstigen können, wie unten genauer beschrieben werden wird.
Auf Immunglobulin basierende Oligomere
Als eine Alternative wird ein Oligomer hergestellt, indem Polypeptide verwendet werden, die von Immunglobulinen abgeleitet wurden. Die Herstellung von Fusionsproteinen, die bestimmte heterologe Polypeptide umfassen, die an verschiedene Teile von aus Antikörpern abgeleiteten Polypeptiden fusioniert sind (einschließlich der Fc-Domäne), wurde beschrieben, z. B. von (Ashkenazi et al. PNAS USA 88: 10535, 1991), (Byrn et al., Nature 344: 677, 1990), und (Hollenbaugh und Aruffo „Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, Seiten 10.19.1–10.19.11 (1992)).
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein Dimer, das zwei Fusionsproteine umfasst und das durch Fusion eines erfindungsgemäßen Polypeptids an ein Fc-Polypeptid geschaffen wurde, das von einem Antikörper abgeleitet wurde. Eine Genfusion, die für das Polypeptid/Fc-Fusionsprotein kodiert, wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt. Polypeptid/Fc-Fusionsproteine werden in Wirtszellen exprimiert, die mit dem rekombinanten Expressionsvektor transformiert wurden, und dürfen sich dann ganz wie Antikörpermoleküle anordnen, worauf sich Disulfidbindungen zwischen den Ketten der Fc-Einheiten bilden, um zweiwertige Moleküle zu ergeben.
Der Begriff „Fc-Polypeptid”, wie hier verwendet, umfasst native und Mutein-Formen von Polypeptiden, hergestellt aus der Fc-Region eines Antikörpers, welche die gesamten CH-Domänen der Fc-Region umfasst. Verkürzte Formen solcher Polypeptide, welche die Gelenk-Region enthalten, die Dimerisierung begünstigt, sind ebenfalls eingeschlossen. Bevorzugte Polypeptide umfassen ein Fc-Polypeptid, das von einem humanen IgG1-Antikörper abgeleitet wurde.
Ein geeignetes Fe-Polypeptid, das in der PCT-Anmeldung WO 93/10151 beschrieben wird, ist ein einzelsträngiges Polypeptid, das sich von der N-terminalen Gelenk-Region zum nativen C-Terminus der Fc-Region eines humanen IgG1-Antikörpers erstreckt. Ein weiteres nützliches Fe-Polypeptid ist das Fc-Mutein, das im U.S. Patent 5,457,035 , und in (Baum et al., EMBO J. 13: 3992–4001, (1994)) beschrieben wird. Die Aminosäuresequenz dieses Muteins ist identisch mit der der nativen Fc-Sequenz, die in WO 93/10151 vorgestellt wird, außer das Aminosäure 19 von Leu zu Ala ausgetauscht wurde, Aminosäure 20 von Leu zu Glu ausgetauscht wurde und Aminosäure 22 von Gly zu Ala ausgetauscht wurde. Das Mutein zeigt eine verminderte Affinität für Fc-Rezeptoren.
Die oben beschriebenen Fusionsproteine, die Fc-Einheiten enthalten (und daraus gebildete Oligomere), bieten den Vorteil, dass sie leicht mittels Affinitätschromatographie über Protein A- oder Protein G-Säulen zu reinigen sind.
In anderen Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Polypeptide durch den variablen Teil einer schweren oder leichten Kette eines Antikörpers ersetzt werden. Werden Fusionsproteine sowohl mit schweren wie auch mit leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt, ist es möglich, Oligomere mit nicht weniger als vier extrazellulären Regionen von TSLP zu bilden.
Auf Peptid-Linker basierende Oligomere
Alternativ ist das Oligomer ein Fusionsprotein, das mehrere Polypeptide mit oder ohne Peptid-Linker (Spacerpeptide) enthält. Unter den geeigneten Peptidlinkern sind diejenigen, die in den U.S. Patenten 4,751,180 und 4,935,233 beschriebenen werden. Eine DNA-Sequenz, die für einen gewünschten Peptidlinker kodiert, kann zwischen, und in den gleichen Leserahmen wie, die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen eingefügt werden, unter Verwendung von jeglicher geeigneter herkömmlicher Technik. Zum Beispiel kann ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid, das für den Linker kodiert, zwischen die Sequenzen ligiert werden. In bestimmten Ausführungsformen enthält ein Fusionsprotein von zwei bis vier lösliche TSLP-Polypeptide, die durch Peptidlinker getrennt werden.
Leucin-Zipper
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Oligomere umfasst die Verwendung eines Leucin-Zippers. Leucin-Zipper-Domänen sind Peptide, die Oligomerisierung der Proteine begünstigen, in welchen sie gefunden werden. Leucin-Zipper wurden ursprünglich in einigen DNA-bindenden Proteinen identifiziert (Landschulz et al., Science 240: 1759 (1988)), und wurden seitdem in einer Vielzahl von unterschiedlichen Proteinen gefunden. Unter den bekannten Leucin-Zippern gibt es natürlich vorkommende Peptide und Derivate davon, die dimerisieren oder trimerisieren.
Die Zipper-Domäne (hierin auch als eine oligomerisierende, oder Oligomer bildende, Domäne bezeichnet) umfasst eine repetitive Heptad-Wiederholung, oftmals mit vier oder fünf Leucinresten, die mit anderen Aminosäuren durchsetzt sind. Beispiele für Zipperdomänen sind solche, die in dem Hefe-Transktiptionsfaktor GCN4 und einem in Rattenleber gefundenen, hitzestabilen, DNA bindenden Protein gefunden werden (C/EBP; Landschulz et al., Science, 243: 1681 (1989)). Zwei nukleär transformierende Proteine, fos und jun, weisen ebenfalls Zipperdomänen auf, wie auch das Genprodukt des murinen Protoonkogens, c-myc (Landschulz et al., Science, 240: 1759 (1988)). Die Produkte der nukleären Onkogene fos und jun umfassen Zipperdomänen, die vorzugsweise Heterodimere bilden (O'Shea et al., Science, 245: 646 (1989)), (Turner und Tjian, Science, 243: 1689 (1989)). Die Zipperdomäne ist für die biologische Aktivität (DNA-Bindung) in diesen Proteinen notwendig.
Die fusogenen Proteine von mehreren unterschiedlichen Viren, einschließlich Paramyxovirus, Coronavirus, Masernvirus und vielen Retroviren besitzen ebenfalls Zipperdomänen (Buckland und Wild, Nature, 338: 547 (1989); (Britton, Nature, 353: 394 (1991)); (Delwart und Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses, 6: 703 (1990)). Die Zipperdomänen in diesen fusogenen viralen Proteinen befinden sich nahe der Transmembranregion der Proteine; es wurde vorgeschlagen, dass die Zipperdomänen zu der oligomeren Struktur der fusogenen Proteine beitragen könnten. Oligomerisierung von fusogenen viralen Proteinen ist an der Bildung von Fusionsporen beteiligt (Spruce et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3523 (1991)). Es wurde kürzlich berichtet, dass Zipperdomänen eine Rolle bei der Oligomerisierung von Hitzeschock-Transkriptionsfaktoren spielen (Rabindran et al., Science 259: 230 (1993)).
Zipperdomänen falten als kurze, parallele Doppelschrauben (coiled coils). (O'Shea et al., Science 254: 539 (1991)). Die allgemeine Struktur der parallelen Doppelschraube wurde treffend beschrieben mit einem „Knubbel in Löcher”-Packen, wie von (Crick, Acta Crystallogr., 6: 689) vorgeschlagen. Das durch eine Zipperdomäne gebildete Dimer wird durch die Heptad-Wiederholung stabilisiert, die mit (abcdefg)_n bezeichnet wird, gemäß der Notation von (McLachlan und Stewart, J. Mol. Biol., 98: 293 (1975)), in der Reste a und d im Allgemeinen hydrophobe Reste sind, wobei d ein Leucin ist, die sich auf der gleichen Seite einer Helix anordnen. Entgegengesetzt geladene Reste treten üblicherweise an den Positionen g und e auf So sind in einer parallelen Doppelschraube, die aus zwei helikalen Zipperdomänen gebildet wurde, die durch die hydrophoben Seitenketten der ersten Helix gebildeten „Knubbel” in die zwischen den Seitenketten der zweiten Helix gebildeten „Löcher” gepackt.
Die Reste an Position d (oftmals Leucin) tragen große hydrophobe Stabilisierungsenergien bei und sind für die Oligomerbildung von Bedeutung (Krystek et al., Int. J. Peptide Res., 38: 229 (1991)). (Lovejoy et al., Science 259: 1288 (1993)) berichteten kürzlich über die Synthese eines tripelsträngigen α-helikalen Bündels, in welchem die Helizes up-up-down verlaufen. Ihre Untersuchungen bestätigten, dass die hydrophobe Stabilisierungsenergie die hauptsächliche Antriebskraft für die Bildung von Doppelschrauben aus helikalen Monomeren darstellt. Diese Untersuchungen deuten auch darauf hin, dass elektrostatische Wechselwirkungen zur Stöchiometrie und Geometrie von Doppelschrauben beitragen. Weitere Diskussionen der Struktur der Leucin-Zipper finden sich in (Harbury et al., Science, 262: 1401 (26. November 1993)).
Beispiele für Leucin-Zipper-Domänen, die für die Herstellung von löslichen oligomeren Proteinen geeignet sind, werden in der PCT-Anmeldung WO 94/10308 beschrieben, und der Leucin-Zipper, der sich vom Surfactant Protein D (SPD) der Lunge ableitet, wird beschrieben in (Hoppe et al., FEBS Letters, 344: 191 (1994)). Die Verwendung eines modifizierten Leucin-Zippers, der die stabile Trimerisierung eines daran fusionierten heterologen Proteins ermöglicht, wird beschrieben in (Fanslowet al., Semin. Immunol., 6: 267–278 (1994)). Rekombinante Fusionsproteine, die ein lösliches, an ein Leucin-Zipper-Peptid fusioniertes Polypeptid enthalten, werden in geeigneten Wirtszellen exprimiert und das sich bildende lösliche Oligomer wird aus dem Kulturüberstand gewonnen.
Bestimmte Leucin-Zipper-Einheiten bilden vorzugsweise Trimere. Ein Beispiel ist ein Leucin-Zipper, der sich von dem Surfactant Protein D (SPD) der Lunge ableitet, wie beschrieben in (Hoppe et al., FEBS Letters, 344: 191 (1994)) und in U.S. Patent 5,716,805 . Dieses vom SPD der Lunge abgeleitete Leucin-Zipper-Peptid enthält die Aminosäuresequenz Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gln Val Gln His Leu Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr (SEQ ID NO:4).
Ein weiteres Beispiel eines Leucin-Zippers, der Trimerisierung begünstigt, ist ein Peptid, enthaltend die Aminosäuresequenz Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg, (SEQ ID NO:5), wie beschrieben in U.S. Patent 5,716,805 . In einer alternativen Ausführungsform wird ein N-terminaler Asp-Rest angefügt; in einer anderen fehlt dem Peptid der N-terminale Arg-Rest.
Fragmente der vorstehenden Zipper-Peptide, welche die Eigenschaft, Oligomerisierung zu begünstigen, beibehalten, können ebenfalls eingesetzt werden. Beispiele derartiger Fragmente umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Peptide, denen ein oder zwei der N-terminalen oder C-terminalen Reste fehlen, die in den vorstehenden Aminosäuresequenzen angegeben wurden. Leucin-Zipper können von natürlich vorkommenden Leucin-Zipper-Peptiden abgeleitet werden, z. B. über konservative Substitution(en) in der nativen Aminosäuresequenz, wobei die Fähigkeit des Peptids, Oligomerisierung zu begünstigen, erhalten wird.
Andere Peptide, die von natürlich vorkommenden trimeren Proteinen abgeleitet werden, können bei der Herstellung von trimeren Oligomeren verwendet werden. Alternativ können synthetische Peptide, welche die Oligomerisierung begünstigen, eingesetzt werden. In bestimmten Ausführungsformen, werden Leucinreste in einer Leucin-Zipper-Einheit durch Isoleucinreste ersetzt. Derartige, Isoleucin enthaltende Peptide können als Isoleucin-Zipper bezeichnet werden, sind aber durch den Begriff „Leucin-Zipper”, wie hierin verwendet, mit eingeschlossen.
HERSTELLUNG VON POLYPEPTIDEN UND FRAGMENTEN DAVON
Expression, Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Polypeptide und Fragmente kann durch jegliche geeignete Technik ausgeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die folgenden Verfahren:
Expressionssysteme
Die vorliegende Erfindung stellt auch rekombinante, DNA enthaltende Klonierungs- und Expressionsvektoren bereit, sowie Wirtszellen, welche die rekombinanten Vektoren enthalten. DNA enthaltende Expressionsvektoren können für die Herstellung der erfindungsgemäßen, durch die DNA kodierten Polypeptide oder Fragmente verwendet werden. Ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden umfasst das Kultivieren von Wirtszellen, die mit einem für das Polypeptid kodierenden rekombinanten Expressionsvektor transformiert wurden, unter Bedingungen, die eine Expression des Polypeptids begünstigen, und anschließend die Gewinnung der exprimierten Polypeptide aus der Kultur. Der Fachmann wird erkennen, dass das Verfahren zum Reinigen der exprimierten Polypeptide variieren wird gemäß solcher Faktoren wie der Art der eingesetzten Wirtszellen, und ob das Polypeptid an die Membran gebunden ist oder in einer löslichen Form vorliegt, die von der Wirtszelle sezerniert wird.
Es kann ein beliebiges, geeignetes Expressionssystem verwendet werden. Die Vektoren umfassen eine DNA, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Fragment kodiert, funktionell verbunden mit geeigneten transkriptionell oder translational regulierenden Nukleotidsequenzen, wie beispielsweise solchen, die von einem Säugetier-, Mikroorganismus-, viralen oder Insektengen abstammen. Beispiele für regulatorische Sequenzen umfassen transkriptionelle Promotoren, Operatoren oder Enhancer, eine ribosomale Bindungsstelle für mRNA und geeignete Sequenzen, welche Start und Stop von Transkription und Translation kontrollieren. Nukleotidsequenzen sind funktionell verbunden, wenn die regulatorische Sequenz funktionell mit der DNA-Sequenz zusammenhängt. So ist eine Nukleotidsequenz für einen Promoter funktionell mit einer DNA-Sequenz verbunden, wenn die Nukleotidsequenz für den Promotor die Transkription der DNA-Sequenz kontrolliert. Ein Replikationsstartpunkt, der den gewünschten Wirtszellen die Fähigkeit zur Replikation vermittelt, und ein Selektionsgen, durch das Transformanden identifiziert werden, werden im Allgemeinen in den Expressionsvektor eingebaut.
Außerdem kann eine Sequenz, die für ein geeignetes Signalpeptid (nativ oder heterolog) kodiert, in die Expressionsvektoren eingebaut werden. Eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) kann im Rahmen an die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz fusioniert werden, so dass die DNA anfangs transkribiert wird, und die mRNA translatiert, in ein Fusionsprotein, das das Signalpeptid enthält. Ein Signalpeptid, das in den beabsichtigten Wirtszellen funktional ist, begünstigt extrazelluläre Sekretion des Polypeptids. Das Signalpeptid wird von dem Polypeptid bei Sekretion von Polypeptid von der Zelle abgespalten.
Der Fachmann wird auch erkennen, dass die Position(en), an der/denen das Signalpeptid abgespalten wird, von der vom Computerprogramm vorhergesagten Position abweichen kann, und sie kann/können gemäß solcher Faktoren wie der Art der für die Expression eines rekombinanten Polypeptids eingesetzten Zelle variieren. Ein Proteinpräparat kann eine Mischung aus Proteinmolekülen mit unterschiedlichen Aminosäuren am N-Terminus umfassen, was zur Abspaltung des Signalpeptids an mehr als einer Stelle führt. Besondere Ausführungsformen der hier bereitgestellten, reifen Proteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Proteine mit dem Rest an Position 16, 29, 35, 95 oder 117 von SEQ ID NO:2 als N-terminale Aminosäure.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von Polypeptiden umfassen Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen. Säugetier- oder Insektenzellen werden im Allgemeinen für die Verwendung als Wirtszellen bevorzugt. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit zellulären bakteriellen, Pilz-, Hefe- und Säugetierwirten werden beschrieben, zum Beispiel, in (Pouwels et al.. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)). Zellfreie Translationssysteme könnten ebenfalls eingesetzt werden, um Polypeptide unter Verwendung von RNAs herzustellen, die aus den hierin beschriebenen DNA-Konstrukten gewonnen wurden.
Prokaryotische Systeme
Prokaryoten umfassen gramnegative oder grampositive Organismen. Geeignete prokaryotische Wirtszellen für Transformation umfassen, zum Beispiel, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus. In einer prokaryotischen Wirtszelle wie beispielsweise E. coli, kann ein Polypeptid einen Methioninrest am N-Terminus umfassen, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle zu erleichtern. Das Met am N-Terminus kann von dem exprimierten rekombinanten Polypeptid abgespalten werden.
Expressionsvektoren für die Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen umfassen im Allgemeinen ein oder mehrere phänotypische selektierbare Markergene. Ein phänotypisches selektierbares Markergen ist, zum Beispiel, ein Gen, das für ein Protein kodiert, das eine Resistenz gegen Antibiotika überträgt oder das eine autotrophe Anforderung liefert. Beispiele für nützliche Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen umfassen solche, die von kommerziell erhältlichen Plasmiden wie beispielsweise dem Klonierungsvektor pBP322 (ATCC 37017) abstammen. pBP322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und bietet so einfache Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen. Ein geeigneter Promotor und eine DNA-Sequenz werden in den pBP322-Vektor insertiert. Andere kommerziell erhältliche Vektoren umfassen, zum Beispiel, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Promotersequenzen, die üblicherweise für rekombinante Expressionsvektoren von prokaryotischen Wirtszellen verwendet werden, umfassen β-Lactmase (Penicillinase), das Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275: 615 (1978); und (Goeddel et al., Nature 281: 544 (1979)), Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057 (1980); und EP-A-36776) und tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 412 (1982)). Ein besonders nützliches Expressionssystem von prokaryotischen Wirtszellen setzt einen Phage λP_L-Promoter und eine wärmeempfindliche c1857ts Repressorsequenz ein. Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind und die Derivate des λP₁-Promotors einbauen, umfassen Plasmid pHUB2 (ansässig im E. coli Stamm JMB9, ATCC 37092) und pPLc28 (ansässig im E. coli RR1, ATCC 53082).
Hefe-Systeme
Alternativ können die Polypeptide in Hefe-Wirtszellen exprimiert werden, vorzugsweise von der Gattung Saccharomyces (z. B., S. cerevisiae). Andere Hefe-Gattungen wie beispielsweise Pichia oder Kluyveromyces, können ebenfalls eingesetzt werden. Hefe-Vektoren werden oftmals eine Replikationsstartpunkt-Sequenz von einem 2μ Hefeplasmid enthalten, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für Polyadenylierung, Sequenzen für Transkriptionsstop und ein selektierbares Markergen. Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren umfassen, unter anderem, Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968)); und (Holland et al., Biochem. 17: 4900 (1978)), wie beispielsweise Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Andere geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung bei der Expression in Hefe werden des Weiteren beschrieben in (Hitzeman, EPA-73,657). Eine weitere Alternative ist der Glukose reprimierbare ADH2-Promotor, beschrieben von (Russell et al., J. Biol. Chem. 258: 2674 (1982)) und (Geier et al., Nature 300: 724 (1982)). Schaukelvektoren, die sowohl in Hefe als auch in E. coli replizierbar sind, können durch Insertion von DNA-Sequenzen von pBR322 für die Selektion und Replikation in E. coli (Amp'-Gen und Replikationsstartpunkt) in die oben beschriebenen Hefe-Vektoren konstruiert werden.
Die Leadersequenz des Hefe-α-Faktors kann für eine direkte Sekretion des Polypeptids eingesetzt werden. Die Leadersequenz des α-Faktors wird meistens zwischen die Promotorsequenz und die strukturelle Gensequenz insertiert. Siehe, z. B., (Kurjan et al., Cell 30: 933 (1982)) und (Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330 (1984)). Andere Leadersequenzen, die für die Erleichterung der Sekretion von rekombinanten Polypeptiden aus Hefewirten geeignet sind, sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Eine Leadersequenz kann nahe seinem 3'-Ende modifiziert werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies wird die Fusion der Leadersequenz des strukturellen Gens erleichtern.
Protokolle für die Hefetransformation sind Fachleuten wohlbekannt. Ein derartiges Protokoll wird beschrieben von (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929 (1978)). Das Protokoll von Hinnen et al. selektiert nach Trp⁺-Transformanden in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67% Yeast Nitrogen Base, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glukose, 10 mg/ml Adenin und 20 mg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, die durch eine ADH2-Promotorsequenz enthaltende Vektoren transformiert wurden, können für die Induzierung der Expression in einem „Voll-” Medium gezüchtet werden. Ein Beispiel für ein Vollmedium ist eines, das aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glukose besteht, ergänzt mit 80 mg/ml Adenin und 80 mg/ml Uracil. Derepression des ADH2-Promotors tritt auf, wenn die Glukose im Medium erschöpft ist.
Säugetier- oder Insektensysteme
Kultursysteme aus Säugetier- oder Insektenwirtszellen können ebenfalls eingesetzt werden, um rekombinante Polypeptide zu exprimieren. Eine Übersicht über Bacculovirus-Systeme für die Herstellung von heterologen Proteinen in Insektenzellen wurde gegeben von (Luckow und Summers, Bio/Technology, 6: 47 (1988)). Es können auch bestehende Zelllinien mit Säugetierursprung eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Säugetier-Wirtszelllinien umfassen die COS-7-Linie aus Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23: 175 (1981)), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Chinese hamster ovary-(CHO-)Zellen, HeLa-Zellen und BHK-(ATCC CRL 10)Zelllinien, und die CV1/EBNA-Zelllinie, die von der African Green Monkey-Nierenzelllinie CV1 (ATCC CCL 70) abstammt, wie beschrieben durch (McMahan et al., EMBO J., 10: 2821 (1991)).
Bewährte Verfahren zur Einführung von DNA in Säugetierzellen wurden beschrieben (Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, S. 15–69 (1990)). Zusätzliche Protokolle, die kommerziell erhältliche Reagenzien wie das Lipidreagenz Lipofectamin (Gibco/BRL) oder das Lipidreagenz Lipofectamin-Plus verwenden, können zur Transfektion von Zellen verwendet werden (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417, (1987)). Zusätzlich kann Elektroporation verwendet werden, um Säugetierzellen zu transfizieren, unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren wie beispielsweise solchen in (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. Vol. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Die Auswahl von stabilen Transformanden kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren ausgeführt werden, zum Beispiel, Resistenz gegenüber cytotoxischen Wirkstoffen. (Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185: 487–511 (1990)), beschreiben einige Selektionsschemata, wie Resistenz gegenüber Dihydrofolatreduktase (DHFR). Ein geeigneter Wirtstamm für DHFR-Selektion kann der CHO-Stamm DX-B11 sein, welchem DHFR fehlt (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216–4220, (1980)). Ein Plasmid, welches die cDNA für DHFR exprimiert, kann in den DX-B11-Stamm eingeführt werden, und nur Zellen, die das Plasmid enthalten, können in den geeigneten selektiven Medien wachsen. Andere Beispiele für selektierbare Marker, die in einen Expressionsvektor eingebaut werden können, umfassen cDNAs, die Resistenz gegenüber Antibiotika vermitteln, wie beispielsweise G418 und Hygromycin B. Zellen, die den Vektor in sich tragen, können auf der Grundlage der Resistenz gegenüber diesen Verbindungen selektiert werden.
Transkriptionelle und translationale Kontrollsequenzen für Expressionsvektoren in Säugetierwirtszellen können aus viralen Genomen ausgeschnitten werden. Üblicherweise verwendete Promotorsequenzen und Enhancersequenzen stammen vom Polyoma-Virus, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und dem humanen Cytomegalovirus. Vom viralen Genom SV40 abgeleitete DNA-Sequenzen, zum Beispiel, die SV40-Startstelle, der frühe und späte Promoter, Enhancer, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente für die Expression einer strukturellen Gensequenz in einer Säugetierwirtszelle bereitzustellen. Virale frühe und späte Promotoren sind insbesondere von Nutzen, da beide ohne Weiteres aus einem viralen Genom als ein Fragment erhalten werden, das auch einen viralen Replikationsstartpunkt enthalten kann (Fiers et al., Nature 273: 113 (1978)); (Kaufman, Meth. in Enzymology (1990)). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können auch verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Sequenz mit 250 bp, die sich von der Hind III-Stelle bis zur Bgl I-Stelle erstreckt, die sich in der Stelle des Replikationsstartpunkt des viralen SV40 befindet, eingeschlossen ist.
Zusätzliche Kontrollsequenzen, die nachweislich die Expression von heterologen Genen von Säugetier-Expressionsvektoren verbessern, umfassen solche Elemente wie das „Expression Augmenting Sequence Element” (EASE), das von CHO-Zellen abgeleitet wurde (Morris et al., Animal Cell Technology, S. 529–534 und PCT-Anmeldung WO 97/25420 (1997)) und der „Tripartite Leader” (TPL) und die VA-Gen RNAs vom Adenovirus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257: 13475–13491 (1982)). Die Sequenzen der internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) mit viralem Ursprung ermöglichen eine effiziente Translation von dicistronischen mRNAs (Oh und Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3: 295–300 (1993)); (Ramesh et al., Nucleic Acids Research 24: 2697–2700 (1996)). Es wurde gezeigt, dass Expression einer heterologen cDNA als Teil einer dicistronischen mRNA, gefolgt von dem Gen für einen selektierbaren Marker (z. B. DHFR) die Transfizierbarkeit des Wirts und die Expression der heterologen cDNA verbessert (Kaufman, Meth. in Enzymology (1990)). Beispielhafte Expressionsvektoren, die dicistronische mRNAs einsetzen, sind pTR-DC/GFP, beschrieben von (Mosser et al., Biotechniques 22: 150–161 (1997)), und p2A5I, beschrieben von (Morris et al., Animal Cell Technology, S. 529–534 (1997)).
Ein nützlicher starker Expressionsvektor, pCAVNOT, wurde beschrieben von (Mosley et al., Cell 59: 335–348 (1989)). Andere Expressionsvektoren für die Verwendung in Säugetierwirtszellen können konstruiert werden wie beschrieben von (Okayama und Berg, Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983)). Ein nützliches System für stabile Hochexpression für Säugetier-cDNAs in murinen mammären C127-Epithelzellen kann im Wesentlichen konstruiert werden wie beschrieben von (Cosman et al., Mol. Immunol. 23: 935 (1986)). Ein nützlicher starker Expressionsvektor, PMLSV N1/N4, beschrieben von (Cosman et al., Nature 312: 768 (1984)), wurde hinterlegt als ATCC 39890. Zusätzliche nützliche Säugetier-Expressionsvektoren werden beschrieben in EP-A-0367566 und in WO 91/18982 . In noch einer weiteren Alternative können die Vektoren von Retroviren abgeleitet werden.
Es kann ein weiterer nützlicher Expressionsvektor, pFLAG^®, verwendet werden. Die FLAG^®-Technologie basiert auf der Fusion eines hydrophilen FLAG^® Markerpeptids mit geringem Molekulargewicht (1 kD) an den N-Terminus eines rekombinanten Proteins, das durch pFLAG^® Expressionsvektoren exprimiert wird. pDC311 ist ein weiterer spezialisierter Vektor, der für die Expression von Proteinen in CHO-Zellen verwendet wird. pDC311 ist durch eine bicistronische Sequenz gekennzeichnet, die das Gen von Interesse enthält, und ein Dihydrofolatreduktase-(DHFR)Gen mit einer internen ribosomalen Bindungsstelle für DHFR-Translation, einem „Expression Augmenting Sequence Element” (EASE), dem humanen CMV-Promotor, einer Tripartite Leadersequenz und einer Polyadenylierungsstelle.
Bezogen auf Signalpeptide, die eingesetzt werden können, kann das native Signalpeptid durch ein heterologes Signalpeptid oder eine Leadersequenz ersetzt werden, sofern gewünscht. Die Wahl des Signalpeptids oder Leaders kann von Faktoren abhängen wie beispielsweise der Art der Wirtszellen, in denen das rekombinante Polypeptid hergestellt werden soll. Zur Erläuterung, Beispiele für heterologe Signalpeptide, die in Säugetierwirtszellen funktional sind, umfassen die Signalsequenz für Interleukin 7 (IL-7), beschrieben in U.S. Patent 4,965,195 ; die Signalsequenz für den Interleukin-2-Rezeptor beschrieben in (Cosman et al., Nature 312: 768 (1984)); das Interleukin-4-Rezeptor-Signalpeptid, beschrieben in EP 367,566 ; das Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid vom Typ I, beschrieben in U.S. Patent 4,968,607 ; und das Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid vom Typ II, beschrieben in EP 460,846 .
Reinigung
Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Isolierung und Reinigung der Polypeptide und Fragmente davon.
Isolierung und Reinigung
Die „isolierten” Polypeptide oder Fragmente davon, die von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind, sind Polypeptide oder Fragmente, die sich nicht in einer Umgebung befinden, die mit einer Umgebung identisch ist, in der es oder sie in der Natur gefunden werden können. Die „gereinigten” Polypeptide oder Fragmente davon, die von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind, sind im Wesentlichen frei von einer Assoziierung mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, zum Beispiel, als ein Reinigungsprodukt der rekombinanten Expressionssysteme wie solchen, die oben beschrieben wurden, oder als ein gereinigtes Produkt aus einer nicht rekombinanten Quelle, wie beispielsweise natürlich vorkommenden Zellen und/oder Geweben.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Reinigung der rekombinanten Polypeptide oder Fragmente erreicht werden unter Verwendung der Fusionen von erfindungsgemäßen Polypeptiden oder Fragmenten an ein weiteres Polypeptid zur Unterstützung der Reinigung der erfindungsgemäßen Polypeptide oder Fragmente. Derartige Fusionspartner können das poly-His oder andere oben beschriebene antigenische Identifizierungspeptide sowie die vorher beschriebenen Fc-Einheiten umfassen.
Mit Bezug auf jegliche Art von Wirtszelle, wie dem Fachmann bekannt ist, werden Verfahren zur Reinigung eines rekombinanten Polypeptids oder Fragments variieren, gemäß solcher Faktoren wie der Art der eingesetzten Wirtszelle und ob das rekombinante Polypeptid oder Fragment in das Kulturmedium sezerniert wird oder nicht.
Im Allgemeinen kann das rekombinante Polypeptid oder Fragment aus den Wirtszellen isoliert werden, wenn es nicht sezerniert wird, oder aus dem Medium oder Überstand, wenn es löslich ist und sezerniert wird, gefolgt von einem oder mehreren Schritten wie Konzentrieren, Aussalzen, Ionenaustausch, hydrophobe Wechselwirkung, Affinitätsreinigung oder Größenausschlusschromatographie. Was spezifische Wege zur Erreichung dieser Schritte angeht, so kann das Kulturmedium zunächst eingeengt werden, unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Konzentrationsfiltern für Proteine, zum Beispiel, einer Ultrafiltrationseinheit von Amicon oder Millipore Pellicon. Auf den Konzentrierungsschritt folgend kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix wie beispielsweise einem Gelfiltrationsmedium aufgebracht werden. Alternativ kann ein Anionenaustauscherharz eingesetzt werden, zum Beispiel, eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminoethyl-(DEAE-)Gruppen. Die Matrizes können Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere Arten sein, die üblicherweise bei der Proteinreinigung verwendet werden. Alternativ kann ein Kationenaustauscherschritt eingesetzt werden. Geeignete Kationenaustauscher umfassen verschiedene unlösliche Matrizes, die Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen enthalten. Außerdem kann ein Chromatofokussierungsschritt eingesetzt werden. Alternativ kann ein Chromatographieschritt mit hydrophober Wechselwirkung eingesetzt werden. Geeignete Matrizes können an Harze gebundene Phenyl- oder Octyleinheiten sein. Außerdem kann Affinitätschromatographie mit einer Matrix eingesetzt werden, die das rekombinante Protein selektiv bindet. Beispiele für derartige eingesetzte Harze sind Säulen mit Lektin, Säulen mit Farbstoffen und metallchelatisierende Säulen. Schließlich können eine oder mehrere Stufen der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) eingesetzt werden, bei der hydrophobe RP-HPLC-Medien eingesetzt werden (z. B., Silicagel oder Polymerharze mit anhängenden Methyl- Octyl- Octyldecyl- oder anderen aliphatischen Gruppen), um das Polypeptid weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorgenannten Reinigungsstufen, in verschiedenen Kombinationen, sind wohlbekannt und können auch eingesetzt werden, um ein isoliertes und gereinigtes, rekombinantes Polypeptid zu ergeben.
Es ist auch möglich, eine Affinitätssäule zu verwenden, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid bindendes Protein, wie beispielsweise einen monoklonalen Antikörper, der gegen erfindungsgemäße Polypeptide erzeugt wurde, enthält, um exprimierte Polypeptide einer Affinitätsreinigung zu unterziehen. Diese Polypeptide können von einer Affinitätssäule unter Verwendung von herkömmlichen Techniken entfernt werden, z. B., in einem Hochsalz-Elutionspuffer, und anschließend in einem niedrigeren Salzpuffer zur Verwendung dialysiert werden oder durch Veränderung des pH-Werts oder anderer Bestandteile, in Abhängigkeit von der verwendeten Affinitätsmatrix, oder können kompetitiv entfernt werden, unter Verwendung des natürlich vorkommenden Substrats der Affinitätseinheit, wie beispielsweise einem Polypeptid, das aus der vorliegenden Erfindung abgeleitet wurde.
In diesem Aspekt der Erfindung können Polypeptid bindende Proteine, wie die erfindungsgemäßen anti-Polypeptid-Antikörper oder andere Proteine, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid Wechselwirken können, an einen festphasigen Träger wie beispielsweise einer Säulenchromatographiematrix oder einem ähnlichen Substrat gebunden werden, das für die Identifizierung, Trennung oder Reinigung von Zellen, welche die erfindungsgemäßen Polypeptide auf ihrer Oberfläche exprimieren, geeignet ist. Haftung von erfindungsgemäßen Polypeptid bindenden Proteinen an eine Festphasen-Kontaktoberfläche kann durch jegliches Mittel erreicht werden, zum Beispiel können magnetische Mikrosphären mit diesen Peptid bindenden Proteinen beschichtet werden und durch ein magnetisches Feld in dem Inkubationsgefäß gehalten werden. Suspensionen von Zellmischungen werden mit der Festphase in Kontakt gebracht, die solche Polypeptid bindenden Proteine darauf aufweist. Zellen mit erfindungsgemäßen Polypeptiden auf ihrer Oberfläche binden an das fixierte Polypeptid bindende Protein und ungebundene Zellen werden anschließend weggewaschen. Dieses Affinitätsbindungsverfahren ist für die Reinigung, das Screening oder die Trennung solcher Polypeptid exprimierender Zellen aus Lösung von Nutzen. Verfahren zur Freisetzung von positiv gewählten Zellen von der Festphase sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen, zum Beispiel, die Verwendung von Enzymen. Solche Enzyme sind vorzugsweise für die Zellen nicht-toxisch und unschädlich und sind vorzugsweise darauf gerichtet, die Zelloberflächen-Bindungspartner abzuspalten.
Alternativ können Zellmischungen, in denen erfindungsgemäße Polypeptid exprimierende Zellen vermutet werden, zunächst mit einem erfindungsgemäßen biotinylierten, Polypeptid bindendem Protein inkubiert werden. Inkubationsperioden dauern typischerweise mindestens eine Stunde, um eine ausreichende Bindung der erfindungsgemäßen Polypeptide zu gewährleisten. Die resultierende Mischung wird dann durch eine Säule geschickt, die mit mit Avidin beschichteten Perlen gepackt ist, wodurch die hohe Affinität des Biotins für Avidin die Bindung der Polypeptid bindenden Zellen auf den Perlen ermöglicht. Die Verwendung von Avidin beschichteten Perlen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe (Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D: 239, 1986). Das Auswaschen von ungebundenem Material und die Freisetzung der gebundenen Zellen wird unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren durchgeführt.
Der gewünschte Reinheitsgrad hängt von der beabsichtigten Verwendung des Proteins ab. Ein relativ hoher Reinheitsgrad ist erwünscht, wenn das Polypeptid in vivo verabreicht werden soll, zum Beispiel. In solch einem Fall werden die Polypeptide so gereinigt, dass keine anderen Proteinbanden, die anderen Proteinen entsprechen, bei Analyse durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nachweisbar sind. Von einem Fachmann auf dem relevanten Gebiet wird erkannt werden, dass multiple, dem Polypeptid entsprechende Banden, durch SDS-PAGE sichtbar gemacht werden können, aufgrund von unterschiedlicher Glykosylierung, unterschiedlicher post-translationaler Reifung und dergleichen. Am meisten bevorzugt wird das erfindungsgemäße Polypeptid bis zur echten Homogenität gereinigt, wie durch eine einzelne Proteinbande bei Analyse durch SDS-PAGE angezeigt. Die Proteinbande kann durch Silberfärbung, Coomassie-Blau-Färbung oder (wenn das Protein radioaktiv markiert ist) durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden
Assays
Die gereinigten erfindungsgemäßen Polypeptide (einschließlich Proteine, Polypeptide, Fragmente, Varianten, Oligomere und andere Formen) können auf ihre Fähigkeit untersucht werden, TSLP-Rezeptoren in einem beliebigen geeigneten Assay, wie beispielsweise einem herkömmlichen Bindungsassay, zu binden. Zur Erläuterung, das Polypeptid kann mit einem nachweisbaren Reagenz markiert werden (z. B., einem Radionuklid, einem Chromophor, einem Enzym, das eine kolorimetrische oder fluorimetrische Reaktion katalysiert und dergleichen). Das markierte Polypeptid wird mit Zellen in Kontakt gebracht, die TSLP-Rezeptoren exprimieren. Die Zellen werden dann gewaschen, um ungebundenes, markiertes Polypeptid zu entfernen und die Gegenwart der zellgebundenen Markierungen wird durch eine geeignete Technik bestimmt, die je nach Art der Markierung ausgewählt wird.
Ein Beispiel für eine Bindungsassay-Prozedur ist wie folgt. Es wird mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren ein rekombinanter Expressionsvektor konstruiert, der cDNA von TSLP enthält Der TSLP-Rezeptor der Maus enthält eine N-terminale extrazelluläre Domäne, eine Transmembranregion und eine C-terminale cytoplasmatische Domäne. CV1-EBNA-1 Zellen in 10 cm² Schalen werden mit dem rekombinanten Expressionsvektor transfiziert. Die CV-1/EBNA-1 Zellen (ATCC CRL 10478) exprimieren konstitutiv nukleäres EBV-Antigen-1, das sich vom Immediate-early Enhancer/Promotor vom CMV ableitet. CV1-EBNA-1 wurde von der African Green Monkey Nierenzelllinie CV-1 (ATCC CCL 70) abgeleitet, wie beschrieben von (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821 (1991)).
Die transfizierten Zellen werden für 24 Stunden kultiviert und die Zellen in jeder Schale werden dann in eine 24-Well-Platte aufgeteilt. Nach Kultivieren für weitere 48 Stunden werden die transfizierten Zellen (etwa 4 × 10⁴ Zellen/Well) mit BM-NFDM gewaschen, das ein Bindungsmedium ist (RPMI 1640, enthaltend 25 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes, pH 7,2), zu dem 50 mg/ml nicht fetter, Trockenmilch gegeben wurde. Die Zellen werden anschließend für 1 Stunde bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen, zum Beispiel, eines löslichen Polypeptid/Fc-Fusionsproteins inkubiert, das wie oben dargelegt hergestellt wurde. Die Zellen werden dann gewaschen und mit einer konstanten Sättigungskonzentration eines ¹²⁵I anti-humanem IgG der Maus unter sanftem Rühren für eine Stunde bei 37°C in Bindungsmedium inkubiert. Nach ausgiebigem Waschen werden die Zellen über Trypsinisierung freigesetzt.
Das oben eingesetzte anti-humane IgG der Maus ist gegen die Fc-Region von humanem IgG gerichtet und kann von Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. erhalten werden. Der Antikörper wird unter Verwendung des standardmäßigen Chloramin-T-Verfahrens mit radioaktivem Iod markiert. Der Antikörper wird an den Fc-Teil von jeglichem Polypeptid/Fc-Protein binden, das an die Zellen gebunden wurde. In allen Assays wird nicht spezifische Bindung des ¹²⁵I-Antikörpers in der Abwesenheit des Fc-Fusionsproteins/Fc, sowie in der Gegenwart des Fc-Fusionsproteins und einem 200-fachen molaren Überschuss an unmarkiertem anti-humanem IgG-Antikörper der Maus untersucht.
Zellgebundene ¹²⁵I-Antikörper werden auf einem Autogamma-Zähler von Packard quantifiziert. Affinitätsberechnungen (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660 (1949)) werden auf RS/1 (BBN Software, Boston, MA) generiert, das auf einem Microvax-Computer läuft.
Eine weitere Art von geeignetem Bindungsassay ist ein kompetitives Bindungsassay. Zur Erläuterung: die biologische Aktivität einer Variante kann bestimmt werden, indem die Fähigkeit der Variante, mit dem nativen Protein um die Bindung an TSLP-Rezeptoren zu konkurrieren, untersucht wird.
Kompetitive Bindungsassays können mittels herkömmlicher Methoden ausgeführt werden. Reagenzien, die in kompetitiven Bindungsassays eingesetzt werden können, umfassen ein radioaktiv markiertes TSLP und intakte Zellen, die TSLP-Rezeptoren (endogen oder rekombinant) auf der Zelloberfläche exprimieren. Zum Beispiel kann ein radioaktiv markiertes, lösliches TSLP-Fragment verwendet werden, um mit einer löslichen TSLP-Variante um die Bindung an TSLP-Rezeptoren auf der Zelloberfläche zu konkurrieren. Anstelle der intakten Zellen kann als Ersatz ein lösliches TSLP-Rezeptor/Fc-Fusionsprotein verwendet werden, das durch die Wechselwirkung von Protein A oder Protein G (auf der festen Phase) mit der Fc-Einheit an eine feste Phase gebunden ist. Chromatographiesäulen, die Protein A und Protein G enthalten, umfassen solche, die von Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ. erhältlich sind.
Eine weitere Art von kompetitivem Bindungsassay verwendet radioaktiv markierte, lösliche TSLP-Rezeptoren, wie beispielsweise ein lösliches TSLP-Rezeptor/Fc-Fusionsprotein, und intakte Zellen, die endogene oder rekombinante TSLP-Rezeptoren exprimieren. Der radioaktiv markierte TSLP-Rezeptor kann verwendet werden, um mit dem Membran gebundenen TSLP-Rezeptor um lösliches TSLP zu konkurrieren. Qualitative Ergebnisse können durch kompetitive autoradiographische Plattenbindungsassays erhalten werden, während Scatchard-Plots (Scatchard, Ann. N. Y. Acad Sci. 51: 660 (1949)) zur Erzeugung von quantitativen Ergebnissen verwendet werden können.
VERWENDUNG VON NUKLEINSÄURE ODER OLIGONUKLEOTIDEN DES HUMANEN TSLP
Zusätzlich zu einer Verwendung zur Expression von Polypeptiden wie oben beschrieben, können die Nukleinsäuren, einschließlich DNA, RNA, mRNA und Oligonukleotiden davon verwendet werden:

– als Sonden zur Identifizierung von Nukleinsäure, die für Proteine mit der Fähigkeit zur Induzierung der Zellproliferation in der B-Linie oder T-Linie kodieren;
– zur Identifizierung des humanen Chromosoms Nummer 5;
– zur Kartierung von Genen auf dem humanen Chromosom Nummer 5;
– zur Identifizierung von Genen, die mit bestimmten Erkrankungen, Syndromen oder anderen mit dem humanen Chromosom Nummer 5 in Verbindung stehenden Zuständen in Verbindung stehen;
– als einzelsträngige Sense- oder Antisense-Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression des durch das TSLP-Gen kodierten Polynukleotids;
– zur Unterstützung beim Nachweis von defekten Genen in einem Individuum; und
– für Gentherapie.

Sonden
Unter den Verwendungen für die Nukleinsäuren gibt es die Verwendung von Fragmenten als Sonden oder Primer. Solche Fragmente enthalten im Allgemeinen mindestens etwa 17 zusammenhängende Nukleotide einer DNA-Sequenz. In anderen Ausführungsformen enthält ein DNA-Fragment mindestens 30, oder mindestens 60, zusammenhängende Nukleotide einer DNA-Sequenz.
Da Homologe von SEQ ID NO:1, von anderen Säugetierspezies, hier in Betracht gezogen werden, können Sonden, die auf der humanen DNA-Sequenz von SEQ ID NO:1 basieren, zum Screening von cDNA-Bibliotheken verwendet werden, die sich von anderen Säugetierspezies ableiten, unter Verwendung von herkömmlichen Interspezies-Hybridisierungstechniken.
Unter Verwendung des Wissens um den genetischen Code im Zusammenhang mit den oben dargelegten Aminosäuresequenzen, können Sätze mit degenerierten Oligonukleotiden hergestellt werden. Solche Oligonukleotide sind als Primer von Nutzen, z. B. in Polymerasekettenreaktionen (PCR), wodurch DNA-Fragmente isoliert und amplifiziert werden.
Chromosom-Kartierung.
Alle oder ein Teil der Nukleinsäuren von SEQ ID NO:1, einschließlich der Oligonukleotide, können von einem Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung von wohlbekannten Techniken verwendet werden, um das humane Chromosom 5 zu identifizieren, und dessen spezifischen Ort, der die DNA von anderen Mitgliedern der TSLP-Familie enthalten könnte. Nützliche Techniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Verwendung der Sequenz oder Teilen davon, einschließlich der Oligonukleotide, als eine Sonde in verschiedenen wohlbekannten Techniken, wie Radiation Hybrid Mapping (hohe Auflösung), In-Situ-Hybridisierung an Chromosomausstrichen (mäßige Auflösung) und Southern Blot Hybridisierung an Hybridzelllinien, die individuelle humane Chromosomen enthalten (niedrige Auflösung).
Zum Beispiel können Chromosomen unter Verwendung von PCR und Radiation-Hybridization kartiert werden. PCR wird unter Verwendung des Genebridge4-Panels mit 93 Radiation-Hybrids vom Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research ausgeführt (http:/lwww-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/rhmap/genebridge4.html). Es werden Primer verwendet, die innerhalb eines putativen Exons, über einem Intron, oder über einem Intron-Exon-Fragment des Gens von Interesse liegen, und die ein Produkt aus menschlicher genomischer DNA amplifizieren, aber nicht, zum Beispiel, die Amplifizierung von genomischer DNA-Kontrolle des Hamsters. Die Ergebnisse der PCRs werden in einen Datenvektor umgewandelt, welcher der Whitehead/MIT Radiation Mapping Seite im Internet übermittelt wird (http://www-seq.wi.mit.edu). Die Daten werden bewertet und die chromosomale Zuordnung und Anordnung relativ zu bekannten Sequenzmarkierten Stellen-(STS-)Markern auf der Radiation-Hybrid-Karte wird geliefert. Die folgenden Webseite liefert zusätzliche Informationen über Radiation Hybrid Mapping: http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/07-97.INTRO.htm1).
Identifizierung von damit verbundenen Erkrankungen
Wie unten dargelegt, wurde SEQ ID NO:1 durch syntenische Analyse des murinen Gens auf die q21-q22-Region von Chromosom 5 kartiert. Daher kann die Nukleinsäure von SEQ ID NO:1 oder ein Fragment davon von einem Fachmann unter Verwendung von wohlbekannten Techniken verwendet werden, um Anomalien, die mit dem humanen Chromosom Nummer 5 in Verbindung stehen, und, insbesondere mit der q21-q22-Region von Chromosom Nummer 5, zu analysieren, einschließlich des Gardner-Syndroms, adenomatöser Polyposis coli, erblicher Desmoid-Krankheit, Turcot-Syndrom und kolorektalem Karzinom. Dies ermöglicht einem die Unterscheidung von Bedingungen, in denen dieser Marker neu angeordnet oder deletiert wird. Außerdem können erfindungsgemäße Nukleotide von SEQ ID NO:1 oder ein Fragment davon als ein Positionsmarker verwendet werden, um andere Gene mit unbekanntem Ort zuzuordnen.
Die DNA kann bei der Entwicklung von Behandlungen für jegliche Störung verwendet werden, die (direkt oder indirekt) durch defekte, oder ungenügende Mengen an Genen, die den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren entsprechen, vermittelt werden. Die Offenbarung der nativen Nukleinsäuresequenzen hierin ermöglicht den Nachweis von defekten Genen und deren Austausch durch normale Gene. Defekte Gene können in In-Vitro Diagnoseassays nachgewiesen werden und durch Vergleich einer hier offenbarten nativen Nukleotidsequenz mit der eines Gens, das von einer Person gewonnen wurde, von der vermutet wird, dass sie einen Defekt in diesem Gen in sich trägt.
Sense-Antisense
Andere nützliche Fragmente der Nukleinsäuren umfassen Antisense- oder Sense-Oligonukleotide, die eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz enthalten (entweder RNA oder DNA), die an Ziel-mRNA-(Sense) oder DNA-(Antisense)Sequenzen binden kann. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide, gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassen ein Fragment von DNA (SEQ ID NO: 1). Ein derartiges Fragment umfasst im Allgemeinen mindestens etwa 14 Nukleotide, vorzugsweise von etwa 14 bis etwa 30 Nukleotide. Die Fähigkeit, ein Antisense- oder ein Sense-Oligonukleotid abzuleiten, basierend auf einer cDNA-Sequenz, die für ein gegebenes Protein kodiert, wird beschrieben in, zum Beispiel, (Stein und Cohen, Cancer Res. 48: 2659 (1988)) und (van der Krol et al., BioTechniques 6: 958 (1988)).
Bindung von Antisense- oder Sense-Oligonukleotiden an Ziel-Nukleinsäuresequenzen führt zur der Bildung von Doppelsträngen, die Proteinexpression durch eines von mehreren Mitteln blockieren oder inhibieren, einschließlich verstärktem Abbau der mRNA durch RNAseH, Inhibierung des Spleißens, verfrühter Stop der Transkription oder Translation, oder durch andere Mittel. Die Antisense-Oligonukleotide können daher zur Blockierung der Proteinexpression verwendet werden. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide umfassen des Weiteren Oligonukleotide mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Grundgerüsten (oder anderen Zucker-Bindungen, wie solchen, die in WO 91/0662 beschrieben werden und in denen die Zucker-Bindungen gegenüber endogenen Nukleasen beständig sind). Derartige Oligonukleotide mit beständigen Zucker-Bindungen sind stabil in vivo (d. h. sie sind in der Lage, einem enzymatischen Abbau zu widerstehen), behalten jedoch die Sequenzspezifizität, an Ziel-Nukleinsäuresequenzen binden zu können.
Andere Beispiele von Sense- oder Antisense-Oligonukleotiden umfassen solche Oligonukleotide, die kovalent an organische Einheiten gebunden sind, wie solchen, die in WO 90/10448 beschrieben werden, und andere Einheiten, welche die Affinität des Oligonukleotids für eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, wie beispielsweise Poly-(L-Lysin), erhöhen. Des Weiteren können auch interkalierende Mittel wie Ellipticin und alkylierende Mittel oder Metallkomplexe an Sense- oder Antisense-Oligonukleotide geknüpft werden, um die Bindungsspezifizitäten des Antisense- oder Sense-Oligonukleotids für die Ziel-Nukleinsäuresequenz zu modifizieren.
Antisense- oder Sense-Oligonukleotide können, durch ein beliebiges Gentransfer-Verfahren einschließlich, zum Beispiel, Lipofektion, CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder unter Verwendung von Gentransfervektoren wie beispielsweise dem Epstein-Barr-Virus, in eine Zelle eingeführt werden, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält.
Sense- oder Antisense-Oligonukleotide können auch durch Bildung eines Konjugats mit einem Liganden bindenden Molekül, wie beschrieben in WO 91/04753 , in eine Zelle eingeführt werden, die die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält. Geeignete Liganden bindende Moleküle umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Zytokine oder andere Liganden, die an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise stört die Konjugation des Liganden bindenden Moleküls die Fähigkeit des Liganden bindenden Moleküls, an sein entsprechendes Molekül oder seinen entsprechenden Rezeptor zu binden, oder blockiert den Eintritt des Sense- oder Antisense-Oligonukleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle nicht wesentlich.
Alternativ kann ein Sense- oder Antisense-Oligonukleotid durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipid-Komplexes, wie beschrieben in WO 90/10448 , in eine Zelle eingeführt werden, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält. Der Sense- oder Antisense-Oligonukleotid-Lipid-Komplex wird vorzugsweise innerhalb der Zelle von einer endogenen Lipase dissoziiert.
VERWENDUNG VON POLYPEPTIDEN UND FRAGMENTIERTEN POLYPEPTIDEN DES HUMANEN TSLP
Verwendungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die folgenden:

– Reinigung von Proteinen und Messung von deren Aktivität
– Transportmittel
– Therapeutische Reagenzien und solchen für die Forschung
– Marker für Molekulargewicht und isoelektrische Fokussierung
– Kontrollen für Peptidfragmentierung
– Identifizierung von unbekannten Proteinen
– Herstellung von Antikörpern

Reinigungsreagenzien
Das erfindungsgemäße Polypeptid findet Anwendung als ein Reagenz bei der Proteinreinigung. Zum Beispiel können die Polypeptide verwendet werden, um TSLP-Bindungspartner, wie beispielsweise humane TSLP-Rezeptoren zu reinigen. In bestimmten Ausführungsformen wird ein Polypeptid (in jeglicher, hierin beschriebenen Form, die TSLP-Rezeptoren binden kann) durch herkömmliche Verfahren an einen festen Träger gebunden. Als ein Beispiel sind Säulen für Affinitätschromatographie erhältlich (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), die funktionelle Gruppen enthalten, die mit funktionellen Gruppen auf den Aminosäure-Seitenketten von Proteinen reagieren werden. In einer Alternative wird ein TSLP-Polypeptid/Fc-Protein (wie oben diskutiert) an Protein A oder Protein G enthaltende Chromatographiesäulen durch Wechselwirkung mit der Fc-Einheit gebunden.
Das Polypeptid findet auch Verwendung bei der Reinigung oder Identifizierung von Zellen, die TSLP-Rezeptoren auf der Zelloberfläche exprimieren. Polypeptide werden an eine feste Phase wie beispielsweise eine Säulenchromatographiematrix oder ein gleichartiges, geeignetes Substrat gebunden. Zum Beispiel können magnetische Mikrosphären mit den Polypeptiden beschichtet werden und in einem Inkubationsgefäß durch ein Magnetfeld gehalten werden. Suspensionen von Zellmischungen, welche die TSLP-Rezeptor exprimierenden Zellen enthalten, werden mit der festen Phase, auf der sich die Polypeptide befinden, in Kontakt gebracht. Zellen, die den TSLP-Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimieren, binden an die fixierten Polypeptide und ungebundene Zellen werden anschließend weggewaschen.
Alternativ können die Polypeptide an eine nachweisbare Einheit konjugiert werden, dann mit den Zellen, die auf TSLP-Rezeptor-Expression untersucht werden sollen, inkubiert werden. Nach der Inkubation wird ungebundene, markierte Materie entfernt und die Gegenwart oder Abwesenheit der nachweisbaren Einheit auf den Zellen wird bestimmt.
In einer weiteren Alternative werden Mischungen von Zellen, von denen vermutet wird, dass sie TSLP-Rezeptoren enthalten, mit biotinylierten Polypeptiden inkubiert. Inkubationsperioden betragen typischerweise mindestens eine Stunde, um eine ausreichende Bindung zu gewährleisten. Die resultierende Mischung wird dann durch eine Säule geschickt, die mit mit Avidin beschichteten Perlen gepackt ist, wodurch die hohe Affinität des Biotins für Avidin die Bindung der gewünschten Zellen auf den Perlen ermöglicht. Verfahren zur Verwendung von mit Avidin beschichteten Perlen sind bekannt (siehe Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D: 239, (1986)). Das Auswaschen zur Entfernung von ungebundenem Material und die Freisetzung der gebundenen Zellen wird unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren durchgeführt.
Messung der Aktivität
Polypeptide finden auch Verwendung bei der Messung der biologischen Aktivität von TSLP-Rezeptoren bezogen auf ihre Bindungsaffinität. Die Polypeptide können daher von jemandem eingesetzt werden, der „Qualitätssicherungs”-Studien durchführt, z. B. um die Haltbarkeitsdauer und Stabilität des Proteins unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen. Zum Beispiel können die Polypeptide in einer Bindungsaffinitätsstudie eingesetzt werden, um die biologische Aktivität eines TSLP-Rezeptors zu messen, der bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert wurde, oder in unterschiedlichen Zellarten hergestellt wurde. Die Proteine können auch verwendet werden, um zu bestimmen, ob die biologische Aktivität nach Modifizierung eines TSLP-Rezeptors (z. B., chemische Modifizierung, Trunkierung, Mutation, usw.) aufrechterhalten wird. Die Bindungsaffinität des modifizierten TSLP-Rezeptors wird mit der eines unmodifizierten TSLP-Rezeptors verglichen, um jegliche gegensätzliche Einwirkung der Modifizierungen auf die biologische Aktivität von TSLP-Rezeptoren nachzuweisen. Die biologische Aktivität eines TSLP-Rezeptors kann daher vor seiner Verwendung in einer Forschungsstudie sichergestellt werden, zum Beispiel.
Transportmittel
Die Polypeptide finden auch Verwendung als Träger, um daran gebundene Mittel zu den Zellen zu transportieren, die TSLP-Rezeptoren tragen. TSLP-Rezeptoren exprimierende Zellen umfassen solche, die im Thymus, in Milz, Niere und Knochenmark identifiziert wurden. Die Polypeptide können also verwendet werden, um diagnostische oder therapeutische Mittel an solche Zellen (oder an andere Zelltypen, bei denen eine Expression von TSLP-Rezeptoren auf der Zelloberfläche gefunden wurden) in In-Vitro- oder In-Vivo-Verfahren zu transportieren.
Nachweisbare (diagnostische) und therapeutische Mittel, die an ein Polypeptid gebunden werden können, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Toxine, andere cytotoxische Mittel, Wirkstoffe, Radionuklide, Chromophore, Enzyme, die eine kolorimetrische oder fluorimetrische Reaktion katalysieren, und dergleichen, wobei das bestimmte Mittel je nach der beabsichtigten Anwendung ausgewählt wird. Unter den Toxine gibt es Ricin, Abrin, Diphtherie-Toxin, Exotoxin A aus Pseudomonas aeruginosa, Ribosom inaktivierende Proteine, Mykotoxine wie Trichothecen und Derivate und Fragmente (z. B., Einzelstränge) davon. Radionuklide, die für diagnostische Verwendung geeignet sind, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, ¹²³I, ¹³¹I, ^99mTc, ¹¹¹In und ⁷⁶Br. Beispiele für Radionuklide, die sich für therapeutische Verwendung eignen, sind ¹³¹I, ²¹¹At, ⁷⁷Br, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹⁰⁹Pd, ⁶⁴Cu und ⁶⁷Cu.
Solche Mittel können an das Polypeptid durch jegliches geeignete herkömmliche Verfahren gebunden werden. Das Polypeptid umfasst funktionelle Gruppen an Aminosäure-Seitenketten, die mit funktionellen Gruppen an einem gewünschten Mittel zur Reaktion gebracht werden können, um, zum Beispiel, kovalente Bindungen zu bilden. Alternativ kann das Protein oder das Mittel derivatisiert werden, um eine gewünschte, reaktive, funktionelle Gruppe zu erzeugen oder daran anzuknüpfen. Die Derivatisierung kann die Bindung von einem der bifunktionellen Kopplungsreagenzien umfassen, die für die Bindung von verschiedenen Molekülen an Proteine erhältlich sind (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Es sind eine Vielzahl an Techniken zur radioaktiven Markierung von Proteinen bekannt. Radionuklidmetalle können an Polypeptide unter Verwendung eines geeigneten bifunktionalen Chelatisierungsmittel gebunden werden, zum Beispiel.
So werden Konjugate, die Polypeptide und ein geeignetes diagnostisches oder therapeutisches Mittel enthalten (vorzugsweise kovalent gebunden) hergestellt. Die Konjugate werden in einer Menge verabreicht oder anderweitig eingesetzt, die für die bestimmte Anwendung geeignet ist.
Therapeutische Mittel
Erfindungsgemäße Polypeptide können bei der Entwicklung von Behandlungen für jegliche Störung verwendet werden, die (direkt oder indirekt) durch defekte, oder ungenügende Mengen der Polypeptide vermittelt werden. Diese Polypeptide können einem Säugetier, das an einer solchen Störung leidet, verabreicht werden.
Die Polypeptide können auch eingesetzt werden, um die biologische Aktivität von TSLP-Rezeptoren in In-Vitro- oder In-Vivo-Verfahren zu inhibieren. Zum Beispiel kann ein gereinigtes oder modifiziertes Polypeptid oder ein Fragment davon (z. B. modifizierte TSLP-Polypeptide, die den Rezeptor binden, denen aber die Fähigkeit zur Induktion der Signalgebung fehlt) verwendet werden, um die Bindung von endogenem TSLP auf Zelloberflächenrezeptoren zu inhibieren. Biologische Wirkungen, die aus der Bindung von endogenem TSLP an Rezeptoren resultieren, werden so inhibiert.
Außerdem können TSLP-Rezeptor-Polypeptide einem Säugetier verabreicht werden, um eine durch einen TSLP-Rezeptor vermittelte Störung zu behandeln. Derartige durch TSLP-Rezeptoren vermittelte Störungen umfassen Zustände, die (direkt oder indirekt) durch TSLP-Rezeptoren verursacht oder verschlimmert werden.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ein Polypeptid in jeglicher hier beschriebenen Form enthalten, wie beispielsweise native Proteine, Varianten, Derivate, Oligomere und biologisch aktive Fragmente. In besonderen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung ein lösliches TSLP-Polypeptid oder ein Oligomer, das lösliche TSLP-Polypeptide umfasst.
Es werden hier Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids enthalten, in Kombination mit anderen Bestandteilen wie einem physiologisch zulässigen Verdünnungsmittel, Träger oder Hilfsstoff bereitgestellt. Die Polypeptide können gemäß bekannter Verfahren formuliert werden, die zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher Zusammensetzungen verwendet werden. Sie können in Beimengung kombiniert werden, entweder als einziges aktives Material oder mit anderen bekannten aktiven Materialien, die für eine gegebene Indikation geeignet sind, mit pharmazeutisch zulässigen Verdünnungsmitteln (z. B., Kochsalzlösung, Tris-HCl, Acetat und Phosphat-gepufferte Lösungen), Konservierungsmitteln (z. B., Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Emulgatoren, Lösungsvermittlern, Zusatzstoffen und/oder Trägern. Geeignete Formulierungen für pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen solche, die beschrieben werden in (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage Mack Publishing Company, Easton, PA (1980)).
Außerdem können solche Zusammensetzungen mit Polyethylenglykol (PEG), Metallionen komplexiert werden oder in polymere Verbindungen wie beispielsweise Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Hydrogelen, Dextran usw. eingebaut werden oder in Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamellaren oder multilamellaren Vesikeln, leere Erythrozytenmembranen oder Spheroblasten eingebaut werden. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, Stabilität, Geschwindigkeit der In-Vivo-Freisetzung und die Geschwindigkeit der In-Vivo-Clearance beeinflussen und werden daher gemäß der beabsichtigten Anwendung ausgewählt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auf jegliche geeignete Weise verabreicht werden, zum Beispiel, topisch, parenteral oder durch Inhalation. Der Begriff „parenteral” umfasst Injektion, z. B. durch subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Wege, und umfasst auch lokale Verabreichung, z. B. an der Stelle der Erkrankung oder Verletzung. Es werden auch Implantatformen mit verzögerter Freisetzung in Betracht gezogen. Ein Fachmann wird erkennen, dass geeignete Dosierungen variieren werden, in Abhängigkeit von Faktoren wie der Art oder Schwere der zu behandelnden Störung, dem Körpergewicht, Alter, dem allgemeinen Zustand, früheren Erkrankungen und/oder Behandlungen des Patienten und dem Verabreichungsweg. Vorläufige Dosen können gemäß den Tierversuchen bestimmt werden und die Skalierung der Dosierungen für Verabreichung beim Menschen werden gemäß auf dem Fachgebiet anerkannten Praktiken ausgeführt.
Zusammensetzungen, die Nukleinsäuren in physiologisch unbedenklichen Formulierungen enthalten, werden ebenfalls in Betracht gezogen. DNA kann, zum Beispiel, für eine Injektion formuliert werden.
Mittel für die Forschung
Eine weitere Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids ist als ein Werkzeug für die Forschung bei der Untersuchung der biologischen Wirkungen, die aus der Inhibierung der TSLP/TSLP-Rezeptor-Wechselwirkungen auf unterschiedliche Zelltypen resultieren. Polypeptide können auch in in vitro Assays zum Nachweis von TSLP oder TSLP-Rezeptoren oder deren Wechselwirkungen verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Verwendungen von humanem TSLP zur Untersuchung der Signaltransduktion durch B-Zellen oder T-Zellen. Humanes TSLP und andere Zytokine spielen eine zentrale Rolle bei der B-Zell- und T-Zellentwicklung und Immunantworten, einschließlich der Weiterleitung von zellulären Signalen, Stimulierung der Zellen zur Sekretion von Zytokinen und Induktion von B-Zell- und T-Zellproliferation. Als solche können Veränderungen in der Expression und/oder Aktivierung von TSLP tiefgreifende Auswirkungen auf eine Fülle an zellulären Prozessen ausüben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Aktivierung oder Inhibierung von zellspezifischen Reaktionen und Proliferation. Expression von geklontem TSLP oder von katalytisch inaktiven Mutanten von TSLP wurde verwendet, um die Rolle, die ein bestimmtes Protein bei der Vermittlung von spezifischen Signalereignissen spielt, zu identifizieren.
Zelluläre Signalgebung umfasst oftmals eine molekulare Aktivierungskaskade, während der ein Rezeptor ein Ligand-Rezeptor vermitteltes Signal verbreitet, indem er spezifisch intrazelluläre Kinasen aktiviert, die Zielsubstrate phosphorylieren. Diese Substrate können ihrerseits Kinasen sein, die durch die folgende Phosphorylierung aktiviert werden. Alternativ können sie Adaptormoleküle sein, die eine downstream Signalgebung durch Protein-Protein-Wechselwirkung gefolgt von Phosphorylierung erleichtern. Ungeachtet der Natur des/der Substratmolekül(s/e), können exprimierte, katalytisch aktive Versionen der TSLP-Ligandrezeptoren verwendet werden, um zu identifizieren, welche(s) Substrat(e) durch den/die TSLP-Ligandenrezeptor(en) erkannt und aktiviert wurde(n). Als solche können diese neuen TSLP-Rezeptoren als Reagenzien verwendet werden, um neue Moleküle, die an Signaltransduktionswegen beteiligt sind, zu identifizieren.
Außerdem kann TSLP von einem Fachmann unter Verwendung von wohlbekannte Techniken verwendet werden, um Zellproliferation in der B-Linie oder T-Linie zu stimulieren (Rayetal., Eur. J. Immunology 26, 10–16 (1996)) und (Namikawa et al., Blood 87: 1881–1890 (1996)), um den humanen TSLP-Rezeptor zu expressionsklonieren (Sims et al., Science 241: 585–589 (1988)), um ein verwandtes Protein zu klonieren (Kozlosky et. al., Cytokine 9: 540–549 (1997)) und (Lyman et al., Blood 10: 2795–2801 (1994)), und um ex vivo Zellen zu expandieren (Piacibello et al., Blood 89: 2644–2653 (1997)).
Verwendungen davon
Also umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zur Stimulierung der B- und T-Lymphozytenproliferation, wobei das Verfahren die Inkubation von Lymphozyten mit humanem TSLP umfasst. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren die Inkubation von Lymphozyten mit humanem TSLP und mindestens einem weiteren Zytokin in vivo oder in vitro. Vorzugsweise wird das Zytokin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-7, Steel Factor, Stem Cell Factor, Mast Cell Growth Factor oder flt3-Ligand. Mehr bevorzugt ist das Zytokin IL-7.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zur Stimulation von Lymphozytenentwicklung oder Lymphopoiese, wobei das Verfahren das Inkubieren von Vorläuferzellen, wie aus dem Knochenmark abgeleitete mononukleäre Zellen, mit humanem TSLP in vivo oder in vitro umfasst. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren die Inkubation von Lymphozyten mit humanem TSLP und mindestens einem weiteren Zytokin. Vorzugsweise wird das Zytokin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-7, Steel Factor, Stem Cell Factor, Mast Cell Growth Factor oder flt3-Ligand. Mehr bevorzugt ist das Zytokin IL-7.
Marker für Molekulargewicht und den isoelektrische Punkt
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können einer Fragmentierung in kleinere Peptide durch chemische und enzymatische Mittel unterzogen werden, und die so hergestellten Peptidfragmente können bei der Analyse von anderen Proteinen oder Polypeptiden verwendet werden. Zum Beispiel können derartige Peptidfragmente als Marker für Peptidmolekulargewichte, Marker für isoelektrische Punkte von Peptiden oder bei der Analyse des Grads der Peptidfragmentierung verwendet werden. Also umfasst die vorliegende Erfindung auch diese Polypeptide und Peptidfragmente, sowie Kits, die bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts und des isoelektrischen Punkts eines unbekannten Proteins helfen, und Kits zur Bestimmung des Grads an Fragmentierung eines unbekannten Proteins.
Obwohl alle Verfahren zur Fragmentierung in der Erfindung eingeschlossen sind, ist chemische Fragmentierung eine bevorzugte Ausführungsform und umfasst die Verwendung von Bromcyanid zur Spaltung unter neutralen oder sauren Bedingungen, so dass spezifische Spaltung an Methioninresten auftritt (E. Gross, Methods in Enz. 11: 238–255 (1967)). Dies kann des Weiteren zusätzliche Schritte umfassen, wie einem Carboxymethylierungsschritt zur Umwandlung von Cysteinresten in eine nicht reaktive Spezies.
Enzymatische Fragmentierung ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform und umfasst die Verwendung einer Protease wie beispielsweise Asparginylendopeptidase, Arginylendopeptidase, Achromobacter-Protease I, Trypsin, Staphylococcus aureus V8 Protease, Endoproteinase Asp-N oder Endoproteinase Lys-C unter herkömmlichen Bedingungen, was zu einer Spaltung an spezifischen Aminosäureresten führt. Asparaginylendopeptidase kann spezifisch an der Carboxylseite der Asparaginreste spalten, die in den erfindungsgemäßen Polypeptiden vorkommen. Arginylendopeptidase kann spezifisch an der Carboxylseite der Argininreste spalten, die in diesen Polypeptiden vorkommen. Achromobacter Protease I kann spezifisch an der Carboxylseite der Lysinreste spalten, die in den Polypeptiden vorkommen (Sakiyama und Nakat, U.S. Patent Nr. 5,248,599 ; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 44–50 (1981); T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 51–55 (1981)). Trypsin kann spezifisch an der Carboxylseite der Arginin- und Lysinreste spalten, die in den erfindungsgemäßen Polypeptiden vorkommen. Enzymatische Fragmentierung kann auch mit einer Protease auftreten, die an verschiedenen Aminosäureresten spaltet. Zum Beispiel kann Staphylococcus aureus V8 Protease spezifisch auf der Carboxylseite der Asparagin- und Glutaminsäureresten spalten, die in den Polypeptiden vorkommen (D. W. Cleveland, J. Biol. Chem. 3: 1102–1106 (1977)). Endoproteinase Asp-N kann spezifisch an der Aminoseite der Asparagininreste spalten, die in den Polypeptiden vorkommen. Endoproteinase Lys-C kann spezifisch an der Carboxylseite der Lysinreste spalten, die in den erfindungsgemäßen Polypeptiden vorkommen. Andere enzymatische und chemische Behandlungen können ebenso verwendet werden, um diese Polypeptide in einen einzigartigen Satz an spezifischen Peptiden spezifisch zu fragmentieren.
Selbstverständlich können die Peptide und Fragmente der erfindungsgemäßen Polypeptide auch durch herkömmliche rekombinante Verfahren und synthetische Verfahren hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. In Bezug auf rekombinante Verfahren können die in der Erfindung eingeschlossenen Polypeptide und Peptidfragmente variable Molekulargewichte besitzen, in Abhängigkeit von der Wirtszelle, in der sie exprimiert werden. Glykosylierung von erfindungsgemäßen Polypeptiden und Peptidfragmenten in verschiedenen Zellarten kann zu Variationen des Molekulargewichts dieser Teile führen, abhängig von dem Ausmaß der Modifizierung. Die Größe dieser Teile kann am heterogensten bei Fragmenten des Polypeptids sein, die vom extrazellulären Teil des Polypeptids abstammen. Konsistente Polypeptide und Peptidfragmente können unter Verwendung von Polypeptiden erhalten werden, die vollständig von den Transmembran- und cytoplasmatischen Regionen abgeleitet wurden, die mit N-Glycanase vorbehandelt wurden, um Glykosylierung zu entfernen, oder durch Expression der Polypeptide in bakteriellen Wirten.
Das Molekulargewicht dieser Polypeptide kann auch durch die Fusion von zusätzlichen Peptidsequenzen sowohl an den Amino- als auch an den Carboxyl-terminalen Enden der erfindungsgemäßen Polypeptide variiert werden. Die Fusion von zusätzlichen Peptidsequenzen an die Amino- sowie die Carboxy-terminalen Enden der erfindungsgemäßen Polypeptide kann verwendet werden, um die Expression dieser Polypeptide zu verstärken oder bei der Reinigung des Proteins zu helfen. Außerdem werden Fusionen von zusätzlichen Peptidsequenzen an die Amino- sowie die Carboxyl-terminalen Enden der erfindungsgemäßen Polypeptide einige, aber üblicherweise nicht alle, der fragmentierten Peptide der Polypeptide verändern, die durch enzymatische oder chemische Behandlung erzeugt werden. Selbstverständlich können Mutationen in die erfindungsgemäßen Polypeptide unter Verwendung von bekannten und routinemäßigen Verfahren der Molekularbiologie eingeführt werden. Zum Beispiel kann eine Mutation so entworfen werden, dass sie eine Stelle einer proteolytischen Spaltung durch ein spezifisches Enzym oder eine Spaltungsstelle durch chemisch induzierte Fragmentierungsverfahren eliminieren. Die Eliminierung der Stelle wird den Peptidfingerabdruck der erfindqqungsgemäßen Polypeptide bei der Fragmentierung mit dem spezifischen Enzym oder dem chemischen Verfahren verändern.
Die Polypeptide und die resultierenden fragmentierten Peptide können mittels Verfahren analysiert werden, die Sedimentierung, Elektrophorese, Chromatographie und Massenspektrometrie einschließen, um ihre Molekulargewichte zu bestimmen. Da die einzigartige Aminosäuresequenz von jedem Teil ein Molekulargewicht spezifiziert, können diese Teile anschließend als Molekulargewichtsmarker dienen, unter Verwendung solcher Analysetechniken, um die Bestimmung des Molekulargewichts eines unbekannten Proteins, unbekannter Polypeptide oder Fragmenten davon zu unterstützen. Die erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarker fungieren insbesondere gut als Molekulargewichtsmarker bei der Abschätzung des scheinbaren Molekulargewichts von Proteinen, die ähnliche scheinbare Molekulargewichte haben, und ermöglichen demzufolge eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts von Proteinen.
Wenn die Erfindung die Verwendung von Molekulargewichtsmarker aus fragmentierten Peptiden betrifft, haben diese Marker vorzugsweise eine Größe von mindestens 10 Aminosäuren. Mehr bevorzugt haben diese Molekulargewichtsmarker aus fragmentierten Peptiden eine Größe zwischen 10 und 100 Aminosäuren. Noch mehr bevorzugt haben diese Molekulargewichtsmarker aus fragmentierten Peptiden eine Größe zwischen 10 und 50 Aminosäuren und insbesondere zwischen 10 und 35 Aminosäuren. Am meisten bevorzugt haben diese Molekulargewichtsmarker aus fragmentierten Peptiden eine Größe zwischen 10 und 20 Aminosäuren.
Unter den Verfahren zur Bestimmung des Molekulargewichts sind Sedimentation, Gelelektrophorese, Chromatographie und Massenspektrometrie. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist die denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (U. K. Laemmli, Nature 227: 680–685 (1970)). Herkömmlicherweise verwendet das Verfahren zwei getrennte Bahnen eines Gels, das Natriumlaurylsulfat und eine Konzentration an Acrylamid zwischen 6–20% enthält. Die Fähigkeit, gleichzeitig den Marker und die Probe unter identischen Bedingungen aufzulösen, ermöglicht eine größere Genauigkeit. Es versteht sich, selbstverständlich, dass viele unterschiedliche Techniken für die Bestimmung des Molekulargewichts eines unbekannten Proteins unter Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide verwendet werden können und dass diese Ausführungsform in keiner Weise den Bereich der Erfindung einschränkt.
Jedes nicht glykosylierte Polypeptid oder Fragment davon besitzt einen pI, der intrinsisch durch seine einzigartige Aminosäuresequenz bestimmt wird (wobei der pI von einem Fachmann unter Verwendung von beliebigen, derzeit zugänglichen Computerprogrammen, die zur Vorhersage von pI-Werten entworfen wurden, abgeschätzt, unter Verwendung von beliebigen wohlbekannten pKa-Tabellen für Aminosäuren berechnet oder empirisch gemessen werden kann). Daher können diese Polypeptide und Fragmente davon als spezifische Marker dienen, um die Bestimmung des isoelektrischen Punkts eines unbekannte Proteins, Polypeptids oder fragmentierten Peptids unter Verwendung von Techniken wie beispielsweise isoelektrischer Fokussierung zu unterstützen. Diese Marker für Polypeptide oder fragmentierten Peptide fungieren insbesondere gut bei der Abschätzung der scheinbaren isoelektrischen Punkte von unbekannten Proteinen, deren scheinbare isoelektrische Punkte nahe denen der erfindungsgemäßen Marker aus Polypeptiden oder fragmentierten Peptiden liegen.
Die Technik der isoelektrischen Fokussierung kann des Weiteren mit anderen Techniken wie beispielsweise Gelelektrophorese kombiniert werden, um ein Protein gleichzeitig auf der Grundlage von Molekulargewicht und Ladung abzutrennen. Die Fähigkeit, diese Marker aus Polypeptiden oder fragmentierten Peptiden und das unbekannte Protein unter identischen Bedingungen gleichzeitig aufzulösen, ermöglicht eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren isoelektrischen Punkts des unbekannten Proteins. Dies ist von besonderem Interesse bei Techniken, wie beispielsweise zweidimensionaler Elektrophorese (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microorganisms 76–77, Prentice Hall, 6. Aufl. (1991)), wobei die Natur des Verfahrens vorschreibt, dass jegliche Marker gleichzeitig mit dem unbekannten Protein aufgelöst werden sollten. Außerdem können bei derartigen Verfahren diese Polypeptide und fragmentierte Peptide davon die Bestimmung von sowohl dem isoelektrischen Punkt als auch dem Molekulargewicht eines unbekannten Proteins oder fragmentierten Peptids unterstützen.
Polypeptide und fragmentierte Peptide können unter Verwendung zweier unterschiedlicher Verfahren sichtbar gemacht werden, die eine Unterscheidung zwischen dem unbekannten Protein und den Molekulargewichtsmarkern ermöglicht. In einer Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarker aus Polypeptiden und fragmentierten Peptiden unter Verwendung von Antikörpern sichtbar gemacht werden, die gegen diese Marker erzeugt wurden, und mittels herkömmlicher Immunoblotting-Techniken. Der Nachweis wird unter herkömmlichen Bedingungen ausgeführt, die nicht zum Nachweis des unbekannten Proteins führen. Es versteht sich, dass es vielleicht nicht möglich ist, Antikörper gegen alle erfindungsgemäßen Polypeptid-Fragmente zu erzeugen, da kleine Peptide vielleicht keine immunogenen Epitope enthalten. Es versteht sich des Weiteren, dass nicht alle Antikörper in diesem Assay funktionieren werden, jedoch können solche Antiköper, die an erfindungsgemäße Polypeptide und Fragmente binden können, ohne Weiteres unter Verwendung von herkömmlichen Techniken nachgewiesen werden.
Das unbekannte Protein wird ebenfalls unter Verwendung eines herkömmlichen Färbungsverfahrens sichtbar gemacht. Der molare Überschuss des unbekannten Proteins zum erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarker aus Polypeptid oder fragmentiertem Peptid ist dergestalt, dass das herkömmliche Färbungsverfahren vorwiegend das unbekannte Protein nachweist. Der Spiegel dieser Molekulargewichtsmarker aus Polypeptid oder fragmentiertem Peptid ist dergestalt, dass er nur eine geringe oder gar keinen Nachweis dieser Marker durch das herkömmliche Färbungsverfahren ermöglicht. Der bevorzugte molare Überschuss an unbekanntem Protein zu den erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarkern aus Polypeptid ist zwischen 2- und 100.000fach. Mehr bevorzugt ist der bevorzugte molare Überschuss an unbekanntem Protein zu diesen Molekulargewichtsmarkern aus Polypeptid zwischen 10- und 10.000fach, und insbesondere zwischen 100- und 1.000fach.
Es versteht sich selbstverständlich, dass viele Techniken für die Bestimmung und den Nachweis des Molekulargewichts und des isoelektrischen Punktes eines unbekannten Proteins, unbekannter Polypeptide und fragmentierten Peptiden davon unter Verwendung dieser Molekulargewichtsmarker aus Polypeptid und Peptidfragmenten davon verwendet werden können und dass diese Ausführungsformen in keiner Weise den Bereich der Erfindung einschränkt.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Analyse der progressiven Fragmentierung der erfindungsgemäßen Polypeptide in spezifische Peptide (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106 (1977)), wie beispielsweise durch Veränderung der Dauer oder Temperatur der Fragmentierungsreaktion, als eine Kontrolle für das Ausmaß der Spaltung eines unbekannten Proteins genutzt werden. Zum Beispiel kann die Spaltung der gleichen Menge an Polypeptid und unbekanntem Protein unter identischen Bedingungen einen direkten Vergleich des Ausmaßes der Fragmentierung ermöglichen. Bedingungen, die zu der vollständigen Fragmentierung des Polypeptids führen, können auch zur vollständigen Fragmentierung des unbekannten Proteins führen.
Was die spezifische Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide und fragmentierten Peptide als Molekulargewichtsmarker angeht, so erzeugt die Fragmentierung des Polypeptids von SEQ ID NO:2 mit Bromcyanid einen einzigartigen Satz an Molekulargewichtsmarkern des fragmentierten Peptids. Die Verteilung der Methioninreste bestimmt die Anzahl an Aminosäuren in jedem Peptid und die einzigartige Aminosäurezusammensetzung von jedem Peptid bestimmt sein Molekulargewicht.
Außerdem weist das bevorzugte gereinigte erfindungsgemäße Polypeptid (SEQ ID NO:2) ein beobachtetes Molekulargewicht von ungefähr 21.000 Daltons auf.
Wo ein vollständiges Protein verwendet wird, ermöglicht die Verwendung dieser Molekulargewichtsmarker aus Polypeptid eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts von Proteinen, die ein scheinbares Molekulargewicht nahe bei 21.000 Daltons haben. Werden Fragmente verwendet, gibt es eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung des Molekulargewichts über den Bereich der Molekulargewichte des Fragments.
Was schließlich Kits angeht, die in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind, können die Bestandteile derartiger Kits variiert werden, enthalten aber typischerweise die Molekulargewichtsmarker aus Polypeptid und dem fragmentierten Peptid. Ebenso können derartige Kits die Polypeptide enthalten, wobei eine für die Fragmentierung notwendige Stelle entfernt wurde. Darüber hinaus können die Kits Reagenzien für die spezifische Spaltung des Polypeptids und des unbekannten Proteins durch chemische oder enzymatische Spaltung enthalten. Die Kits können des Weiteren Antikörper enthalten, die gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide oder Fragmente davon gerichtet sind.
Identifizierung von unbekannten Proteinen
Wie oben dargelegt, kann ein Polypeptid- oder Peptid-Fingerabdruck in eine Datenbank von bekannten Proteinen eingegeben oder mit ihr verglichen werden, um die Identifizierung des unbekannten Proteins unter Verwendung von Massenspektrometrie zu unterstützen (W. J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5011–5015 (1993); D. Fenyo et al., Electrophoresis 19: 998–1005 (1998)). Es ist eine Vielzahl an Softwareprogrammen für Computer zur Erleichterung dieser Vergleiche über das Internet zugänglich, wie beispielsweise Protein Prospector (Internetseite: prospector.uscf.edu), MultiIdent (Internetseite: www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (Internetseite: www.mann.embl-heidelberg.de...deSearch/FR_PeptideSearch Form.html), und ProFound (Internetseite: www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/protid-frag.html). Diese Programme ermöglichen dem Anwender, das Spaltungsmittel und die Molekulargewichte der fragmentierten Peptide innerhalb einer festgelegten Toleranz zu spezifizieren. Die Programme vergleichen diese Molekulargewichte mit Proteindatenbanken, um die Bestimmung der Identität des unbekannten Proteins zu unterstützen.
Außerdem kann ein Polypeptid- oder Peptidaufschlussprodukte unter Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) sequenziert werden und die resultierende Sequenz kann gegen Datenbanken gesucht werden (J. K. Eng, et al., J. Am. Soc. Mass Spec. 5: 976–989 (1994); M. Mann und M. Wilm, Anal. Chem., 66: 4390–4399 (1994); J. A. Taylor und R. S. Johnson, Rapid Comm. Mass Spec., 11: 1067–1075 (1997)). Suchprogramme, die in diesem Prozess verwendet werden können, existieren im Internet, wie beispielsweise Lutefisk 97 (Internetseite: www.lsbc.com:70/Lutefisk97.html), und die oben beschriebenen Programme Protein Prospector, Peptide Search und ProFound. Daher kann die Hinzufügung der Sequenz eines Gens und seiner vorhergesagten Proteinsequenz und Peptidfragmente zu einer Sequenzdatenbank bei der Identifizierung von unbekannten Proteinen unter Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie helfen.
Antikörper
Es werden hierin Antikörper bereitgestellt, die mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden immunreaktiv sind. Solche Antikörper binden über die Antigen-Bindungsstellen des Antikörpers spezifisch an die Polypeptide (im Gegensatz zu nicht spezifischer Bindung). Also können die Polypeptide, Fragmente, Varianten, Fusionsprotein, usw., wie oben dargelegt, als ”Immunogene” bei der Herstellung von Antikörpern eingesetzt werden, die damit eine Immunreaktion eingehen. Insbesondere enthalten die Polypeptide, Fragmente, Varianten, Fusionsproteine usw. antigene Determinanten oder Epitope, welche die Bildung von Antikörpern hervorrufen.
Diese antigenen Determinanten oder Epitope können entweder linear oder konformationell (diskontinuierlich) sein. Lineare Epitope bestehen aus einem einzelnen Abschnitt aus Aminosäuren des Polypeptids, während konformationelle oder diskontinuierliche Epitope aus Abschnitten aus Aminosäuren aus verschiedenen Regionen der Polypeptidkette bestehen, die bei Faltung des Polypeptids in nächste Nachbarschaft gebracht werden (C. A. Janeway, Jr. und P. Travers, Immuno Biology 3: 9, Garland Publishing Inc., 2. Aufl. (1996)). Da gefaltete Proteine komplexe Oberflächen haben, ist die Anzahl an zugänglichen Epitopen recht groß; jedoch ist aufgrund der Konformation des Proteins und sterischer Behinderungen, die Anzahl an Antikörpern, die tatsächlich an die Epitope binden, geringer als die Anzahl an zugänglichen Epitopen (C. A. Janeway, Jr. und P. Travers, Immuno Biology 2: 14, Garland Publishing Inc., 2. Aufl. (1996)). Epitope können mittels jeglichem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren identifiziert werden.
Folglich betrifft ein Aspekt die antigenen Epitope der erfindungsgemäßen Polypeptide. Derartige Epitope sind für die Züchtung von Antikörpern, insbesondere von monoklonalen Antikörpern, von Nutzen, wie unten genauer beschrieben. Außerdem können Epitope aus den erfindungsgemäßen Polypeptiden als Reagenzien für die Forschung verwendet werden, in Assays und um spezifisch bindende Antikörper von Substanzen wie polyklonalen Seren oder Überständen aus kultivierten Hybridomas zu reinigen. Solche Epitope oder Varianten davon können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Techniken wie Festphasensynthese, chemischer oder enzymatischer Spaltung eines Polypeptids oder unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden.
Was die Antikörper angeht, die durch die Epitope der erfindungsgemäßen Polypeptide hervorgerufen werden können, gleich ob die Epitope isoliert wurden oder Teil der Polypeptide bleiben, so können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper mittels herkömmlicher Techniken hergestellt werden. Siehe, zum Beispiel, (Kennet et al., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Hrgs., Plenum Press, New York (1980); und Harlow und Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Hrgs., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)).
Hybridoma-Zelllinien, die für die erfindungsgemäßen Polypeptide spezifische monoklonale Antikörper herstellen, werden hierin ebenfalls in Betracht gezogen. Solche Hybridome können mittels herkömmlicher Techniken hergestellt und identifiziert werden. Ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Hybridom-Zelllinie umfasst die Immunisierung eines Tieres mit einem Polypeptid; Ernten von Milzzellen von dem immunisierten Tier; Fusion dieser Milzzellen mit einer Myelom-Zelllinie, wodurch Hybridomzellen erzeugt werden; und Identifizierung einer Hybridom-Zelllinie, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der das Polypeptid bindet. Die monoklonalen Antikörper können durch herkömmliche Techniken gewonnen werden.
Die monoklonalen Antikörper umfassen auch chimäre Antikörper, z. B. humanisierte Versionen von murinen monoklonalen Antikörpern. Solche humanisierten Antikörper können mittels bekannter Techniken hergestellt werden und bieten den Vorteil einer verminderten Immunisierungskraft, wenn die Antikörper Menschen verabreicht werden. In einer Ausführungsform umfasst ein humanisierter monoklonaler Antikörper die variable Region eines murinen Antikörpers (oder nur die Antigen-Bindungsstelle davon) und eine konstante Region, die von einem humanen Antikörper stammt. Alternativ kann ein humanisiertes Antikörperfragment die Antigen-Bindungsstelle eines murinen monoklonalen Antikörpers und ein Fragment einer variablen Region (der die Antigen-Bindungsstelle fehlt) enthalten, die von einem humanen Antikörper stammt. Verfahren für die Herstellung von chimären und weiterhin gentechnisch hergestellten monoklonalen Antikörpern umfassen solche, die beschrieben werden in (Riechmann et al. Nature 332: 323, 1988), Liu et al., PNAS 84: 3439, (1987), Larrick et al., Bio/Technology 7: 934, (1989), und Winter und Harris TIPS 14: 139, (Mai 1993)). Verfahren, um Antikörper transgen zu erzeugen, können in GB 2,272,440 , US Patent Nr. 5,569,825 und 5,545,806 und verwandten Patenten gefunden werden, von denen Priorität beansprucht wird.
Antigen-Bindungsfragmente der Antikörper, die mittels herkömmlicher Techniken hergestellt werden können, sind ebenfalls beschrieben. Beispiele für derartige Fragmente umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Fab und F(ab')₂-Fragmente. Antikörperfragmente und Derivate, die durch Gentechnologie-Techniken hergestellt werden, werden ebenfalls bereitgestellt.
Die Antikörper sind spezifisch für die erfindungsgemäßen Polypeptide und gehen keine Kreuzreaktion mit anderen Proteinen ein. Screening-Verfahren, durch die derartige Antikörper identifiziert werden können, sind wohlbekannt und können Immunaffinitätschromatographie umfassen, zum Beispiel.
Verwendungen davon
Die Antikörper können auch in Assays verwendet werden, um die Gegenwart der erfindungsgemäßen Polypeptide oder deren Fragmente, entweder in vitro oder in vivo, nachzuweisen. Die Antikörper können auch zur Reinigung von erfindungsgemäßen Polypeptiden oder deren Fragmenten durch Immunaffinitätschromatographie eingesetzt werden.
Solche Antikörper, die außerdem die Bindung der erfindungsgemäßen Polypeptide an die TSLP-Rezeptoren blockieren können, können verwendet werden, um eine biologische Aktivität, die aus einer solchen Bindung resultiert, zu inhibieren. Derartige blockierende Antikörper können unter Verwendung von jeglichem geeignetem Assay-Verfahren identifiziert werden, wie beispielsweise der Untersuchung von Antikörpern auf ihre Fähigkeit, die Bindung von TSLP an bestimmte Zellen, welche die TSLP-Rezeptoren exprimieren, zu hemmen. Beispiele für derartige Zellen sind die B- und T-Lymphoid-Zelllinen 70Z/3 bzw. 7B9. Alternativ können blockierende Antikörper in Assays bezüglich der Fähigkeit identifiziert werden, eine biologische Wirkung zu hemmen, die eine Folge der Bindung von TSLP an TSLP-Rezeptoren auf Zielzellen ist. Antikörper können auf ihre Fähigkeit hin untersucht werden, die TSLP vermittelte Lyse von TSLP-Rezeptoren exprimierenden Zellen zu inhibieren, zum Beispiel.
Ein derartiger Antikörper kann in einem in vitro Verfahren eingesetzt werden oder in vivo verabreicht werden, um eine biologische Aktivität zu inhibieren, die durch die Einheit vermittelt wird, die den Antikörper erzeugt hat. Störungen, die (direkt oder indirekt) durch die Wechselwirkung von TSLP mit TSLP-Rezeptoren auf der Zelloberfläche verursacht oder verschlimmert werden, können so behandelt werden. Ein therapeutisches Verfahren umfasst die Verabreichung eines blockierenden Antikörpers in vivo an ein Säugetier in einer Menge, die für eine Inhibierung der durch TSLP vermittelten biologischen Aktivität wirksam ist. Monoklonale Antikörper sind im Allgemeinen für die Verwendung in derartigen therapeutischen Verfahren bevorzugt. In einer Ausführungsform wird ein Antigen bindendes Antikörperfragment verwendet.
Antikörper können auf agonistische Eigenschaften (d. h. Liganden-Nachahmung) gescreent werden. Derartige Antikörper können bei Bindung an TSLP-Rezeptoren auf der Zelloberfläche biologische Wirkungen (z. B., Transduktion von biologischen Signalen) induzieren, die den biologischen Effekten ähneln, die induziert werden, wenn TSLP an TSLP-Rezeptoren auf der Zelloberfläche bindet. Agonistische Antikörper können zur Induzierung der Zellproliferation in der B-Linie oder T-Linie verwendet werden.
Zusammensetzungen, die einen gegen humanes TSLP gerichteten Antikörper enthalten, und ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel, Hilfsmittel oder Träger, werden hierin bereitgestellt. Geeignete Bestandteile derartiger Zusammensetzungen werden oben für Zusammensetzungen beschrieben, die humane TSLP-Proteine enthalten.
Ebenfalls hierin bereitgestellt werden Konjugate, die ein nachweisbares (z. B., diagnostisches) oder therapeutisches Mittel enthalten, das an den Antikörper geknüpft ist. Beispiele für derartige Mittel werden oben vorgestellt. Die Konjugate finden in in-vitro- oder in-vivo-Verfahren Anwendung.
Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Darstellung von bestimmten Ausführungsformen der Erfindung gegeben und sollen nicht als den Bereich der vorliegenden Erfindung einschränkend ausgelegt werden.
BEISPIEL 1: Isolierung der Nukleinsäure
Die Nukleinsäuresequenz von humanem TSLP wurde durch Sequenzierung des EST IMAGE Klons 1407260, Zugang #AA889581 erhalten. Diese Sequenz legte nahe, dass der EST-Klon im Vergleich zu der murinen TSLP-Sequenz ein partieller Klon war. Es wurde eine Anzahl an cDNA-Bibliotheken mit internen Primern gescreent, um eine Quelle für cDNA zu bestimmen, die verwendet werden könnte, um das fehlende 3'-Ende des TSLP cDNA-Klons zu erhalten. Nach 60 PCR-Zyklen unter Verwendung zweier interner Primer der humanen TSLP-Sequenz waren die folgenden cDNA-Bibliothek positiv auf TSLP-Sequenzen: humane Testis, humane Vorhaut-Fibroblasten und fötales Gehirn (schwach positiv); während MoT, HS431, Knochenmark, HPT4, HBT3, W126, Hut102, PBT, Sk Hep, humane dermale Fibroblasten, Raji, humane Plazenta und KB-Bibliotheken alle negativ waren.
Bei Verwendung von PCR an der humanen Testis λgt10-Bibliothek mit einem internen TSLP-Primer und einem λgt10-Vektorprimer, wurden zwei Klone (19E und 19F) mit Sequenzen isoliert, die identisch zu internen humanen TSLP-Sequenzen sind. Beide Klone hatten identische 5'-Enden, aber unterschiedlich lange 3'-Enden. Die kodierenden sowie die nicht kodierenden Sequenzen von Klon 19E waren identisch zum Klon 19F; diese Klone unterschieden sich in der Länge der nicht kodierenden 3'-Region, wobei der Klon 19F etwa 34 bp länger war als 19E. Daher wurden Sequenzen von 19F verwendet, um die kodierende 3'-Sequenz des humanen TSLP-Proteins zu vervollständigen. Dies ermöglichte die Identifizierung der 15 C-terminalen Aminosäuren, die nicht in dem EST vorkamen. Die PCR wurde gemäß herkömmlicher Verfahren ausgeführt.
BEISPIEL 2: Reinigung des TSLP-Polypeptids
TSLP-spezifische ELISA:
Serielle Verdünnungen von TSLP enthaltenden Proben (in 50 mM NaHCO₃, mit NaOH auf pH 9 gebracht) werden mit 100:1/Well auf E. I. A. Mikrotiterplatten mit 96 Wells und Flachboden von Linbro/Titertek beschichtet (ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH). Nach Inkubation bei 4°C für 16 Stunden werden die Wells sechsmal mit 200:1 PBS gewaschen, enthaltend 0,05% Tween-20 (PBS-Tween). Die Wells werden dann mit FLAG^®-TSLP-Rezeptor von 1 μg/ml in PBS-Tween mit 5% fötalem Kälberserum (FCS) für 90 Min. (100:1 pro Well) inkubiert und anschließend wie oben beschrieben gewaschen. Danach wird jedes Well mit anti-FLAG^® (monoklonaler Antikörper M2) von 1 μg/ml in PBS-Tween mit 5% FCS für 90 Min. (100:1 pro Well) inkubiert und anschließend wie oben beschrieben gewaschen. Im Anschluss werden die Wells mit einem polyklonalen anti-mIgGl spezifischen, mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Antikörper aus Ziege (eine 1:5000 Verdünnung der kommerziellen Lösung in PBS-Tween enthaltend 5% FCS) für 90 Minuten (100:1 pro Well) inkubiert. Der HRP konjugierte Antikörper wird erhalten von Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama. Die Wells werden anschließend sechsmal gewaschen, wie oben.
Für die Entwicklung des ELISA, wird eine Substratmischung [100:1 pro Well einer 1:1 Vormischung des TMB-Peroxidase Substrats und Peroxidase Lösung B (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland)] zu den Wells gegeben. Nach ausreichender Farbreaktion wird die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 2N H₂SO₄ (50:1 pro Well) beendet. Farbintensität (die auf TSLP/TSLP-Rezeptorbindung hindeutet) wird bestimmt durch Messung der Extinktion bei 450 nm auf einem V Max Plattenleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
BEISPIEL 3: Aminosäuresequenz
Die Aminosäuresequenz von humanem TSLP wurde durch Translation der vollständigen Nukleotidsequenz von humanem TSLP bestimmt. Der Leserahmen wurde auf der Grundlage der Homologie von humanem TSLP mit murinem TSLP ausgewählt.
BEISPIEL 4: DNA- und Aminosäuresequenzen
Die Nukleinsäuresequenz von humanem TSLP wurde durch standardmäßiges Sequenzieren des Doppelstrangs der Kompositsequenz des EST IMAGE Klons 1407260, Zugang #AA889581, und der zusätzlichen 3'-Sequenz von Klon 19F bestimmt. Die Nukleotidsequenz der isolierten DNA von humanem TSLP und die dadurch kodierte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NOs:1 und 2 dargestellt. Die Sequenz des durch PCR isolierten vollständigen DNA-Fragments von humanem TSLP entspricht den Nukleotiden 1 bis 767 von SEQ ID NO:1, die für die Aminosäuren 1 bis 159 von SEQ ID NO:2 kodieren.
Die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:2 trägt deutliche Ähnlichkeit (49%) und Identität (43%) mit murinem TSLP und eine schwache Homologie zu IL-7.
BEISPIEL 5: Monoklonale Antikörper, die TSLP binden
Dieses Beispiel erläutert ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die TSLP binden. Geeignete Immunogene, die zur Erzeugung derartiger Antikörper eingesetzt werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, gereinigtes humanes TSLP-Polypeptid oder einem immunogenen Fragment davon, wie beispielsweise die extrazelluläre Domäne, oder Fusionsproteine, die humanes TSLP enthalten (z. B., ein lösliches TSLP/Fc-Fusionsprotein).
Gereinigtes humanes TSLP kann verwendet werden, um monoklonale Antikörper zu erzeugen, die damit immunreaktiv sind, unter Verwendung von herkömmlichen Techniken wie solchen, die in U.S. Patent 4,411,993 beschrieben werden. Kurz gesagt, werden Mäuse mit einem humanen TSLP-Immunogen immunisiert, das in vollständigem Freundschem Adjuvans emulgiert wurde und in Mengen in einem Bereich von 10–100 μg subkutan oder intraperitoneal injiziert wurde. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem humanem TSLP reimmunisiert, das in unvollständigem Freundschem Adjuvans emulgiert wurde. Die Mäuse werden danach periodisch nach einem wöchentlichen bis zweiwöchentlichen Immunisierungszeitplan reimmunisiert. Es werden periodisch Serumproben durch retroorbitalen Aderlass oder Entfernung der Schwanzspitze entnommen, um durch Dot-Blot-Assay, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) oder Hemmung der TSLP-Rezeptorbindung auf TSLP-Antikörper zu testen.
Im Anschluss an den Nachweis eines geeigneten Antikörpertiters wird positiven Tieren eine letzte intravenöse Injektion von humanem TSLP in Kochsalzlösung gegeben. Drei bis vier Tage später werden die Tiere geopfert, die Milzzellen geerntet und die Milzzellen mit einer murinen Myeloma-Zelllinie fusioniert, z. B., NS1 oder vorzugsweise P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Die Fusionen erzeugen Hybridom-Zellen, die auf multiplen Mikrotiterplatten in einem HAT-(Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) selektiven Medium ausplattiert wurden, um Proliferation von nicht fusionierten Zellen, Myelomahybriden und Milzzellenhybriden zu hemmen.
Die Hybridoma-Zellen werden mittels ELISA nach Reaktivität gegen gereinigtes TSLP gescreent, durch Anpassungen der Techniken, die in (Engvall et al., Immunochem. 8: 871, 1971) und im U.S. Patent 4,703,004 beschrieben werden. Eine bevorzugte Screening-Technik ist die in (Beckmann et al., J. Immunol. 144: 4212, (1990)) beschriebene Antikörper-Fangmethode. Positive Hybridom-Zellen können intraperitoneal in syngeneische BALB/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites-Tumore herzustellen, die hohe Konzentrationen von monoklonalen anti-TSLP-Antikörpern enthalten. Alternativ können Hybridom-Zellen in vitro in Kolben oder Rollflaschen mittels verschiedener Techniken vermehrt werden. Monoklonale Antikörper, die in Maus-Aszites-Tumoren hergestellt wurden, können durch Ammoniumsulfat-Fällung, gefolgt von Gelausschlusschromatographie gereinigt werden. Alternativ kann auch Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung eines Antikörpers an Protein A oder Protein G verwendet werden, sowie Affinitätschromatographie, basierend auf der Bindung an TSLP.
BEISPIEL 6: Northern-Blot-Analyse
Die Gewebeverteilung von mRNA von humanem TSLP wurde mittels Northern Blot Analyse wie folgt untersucht. Ein Aliquot einer radioaktiv markierten Sonde wurde zu zwei Northern Blots mit unterschiedlichen multiplen humanen Geweben gegeben (Clontech, Palo Alto, CA; Biochain, Palo Alto, CA). Die Blots wurden in 10x Denhardts Lösung, 50 mM Tris pH 7,5, 900 mM NaCl, 0,1% Na-Pyrophosphat, 1% SDS, 200 μg/ml Lachssperma-DAN hybridisiert. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 63°C in 50%igem Formamid durchgeführt, wie bereits beschrieben (March et al., Nature 315: 641–647 (1985)). Die Blots wurden anschließend mit 2xSSC, 0,1% SDS bei 68°C für 30 Minuten gewaschen.
Ein einzelnes Transkript mit 1,4 kilobasen (kb) kam in Herz, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, Bauchspeicheldrüse, Milz, Thymus, Prostata, Testes, Ovarien, Dünndarm, Dickdarm vor. Negative Gewebe waren Hirn, Plazenta und periphere Blutleukozyten. Die Zellen und Gewebe mit den höchsten mRNA-Spiegeln von TSLP sind Herz, Leber, Prostata und Testes, wie durch Vergleich mit einer Kontrollsonde mit einer (3-Actin spezifischen Sonde gezeigt.
BEISPIEL 7: Bindungsassay
Humanes Volllängen-TSLP kann exprimiert und auf die Fähigkeit, TSLP-Rezeptoren zu binden, untersucht werden. Das Bindungsassay kann wie folgt durchgeführt werden.
In dem Assay wird ein Fusionsprotein, das ein Leucin-Zipper-Peptid fusioniert an den N-Terminus eines löslichen humanen TSLP-Polypeptids (LZ-TSLP) enthält, eingesetzt. Es wird ein Expressionskonstrukt hergestellt, im Wesentlichen wie für die Herstellung des FLAG^®(TSLP)-Expressionskonstrukts in (Wiley et al., Immunity, 3: 673–682 (1995)) beschrieben, außer dass DNA, die für das FLAG^®-Peptid kodiert, durch eine Sequenz ersetzt wurde, die für einen modifizierten Leucin-Zipper kodiert, der eine Trimerisierung ermöglicht. Das Konstrukt in Expressionsvektor pDC409 kodiert für eine Leadersequenz, die vom humanen Cytomegalovirus abstammt, gefolgt von der Leucin-Zipper-Einheit, die an den N-Terminus eines löslichen humanen TSLP-Polypeptids fusioniert ist. Das LZ-TSLP wird in CHO-Zellen exprimiert und aus dem Kulturüberstand gereinigt.
Der mit pDC409 bezeichnete Expressionsvektor ist ein Säugetier-Expressionsvektor, der vom pDC406-Vektor abstammt, beschrieben in (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821–2832 (1991)). Zu pDC409 hinzugefügte Merkmale (verglichen mit pDC406) umfassen zusätzliche einzigartige Restriktionsstellen in den multiplen Klonierungsstellen (mcs); drei Stopcodons (eines in jedem Leserahmen), positioniert nachstehend hinter den mcs; und einen T7-Polymerase Promotor, nachstehend hinter den mcs, der die Sequenzierung von in die mcs insertierter DNA erleichtert.
Für die Expression von humanem Volllängen-TSLP-Protein wird die gesamte kodierende Region (d. h., die in SEQ ID NO:1 vorgestellte DNA-Sequenz) mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die in der PCR eingesetzte Matrize ist der cDNA-Klon, der aus einer humanen Testis-cDNA-Bibliothek isoliert wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die isolierte und amplifizierte DNA wird in den Expressionsvektor pDC409 insertiert, um eine mit pDC409-TSLP bezeichnetes Konstrukt zu ergeben.
LZ-TSLP-Polypeptid wird eingesetzt, um die Fähigkeit zu untersuchen, Wirtszellen, die rekombinante oder endogene TSLP-Rezeptoren exprimieren, zu binden, wie oben diskutiert. TSLP-Rezeptor exprimierende Zellen werden in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, Penicillin, Streptomycin und Glutamin, kultiviert. Die Zellen werden mit LZ-TSLP (5 mg/ml) für etwa 1 Stunde inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation werden die Zellen gewaschen, um ungebundenes LZ-TSLP zu entfernen, und mit einem biotinylierten monoklonalen anti-LZ Antikörper (5 mg/ml) und mit Phycoerythrin konjugiertem Streptavidin (1:400) inkubiert, bevor sie mittels fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) analysiert werden. Die zytometrische Analyse wurde auf einem FACscan (Beckton Dickinson, San Jose, CA) ausgeführt.
Die TSLP-Rezeptoren exprimierenden Zellen zeigten eine deutlich verstärkte Bindung von LZ-TSLP, verglichen mit den Kontrollzellen, die keine TSLP-Rezeptoren exprimierten.
BEISPIEL 8: Induktion von T-Zellwachstum aus Knochenmark durch TSLP und IL-7
Humanes TSLP induziert, in Kombination mit IL-7, den Auswuchs der T-Zellen aus humanem Knochenmark.
Humane, vom Knochenmark abgeleitete mononukleäre Zellen (BM MNC) wurden mittels Zentrifugieren von ganzem Knochenmark über Ficoll isoliert. BM MNC wurden in McCoy-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und Aminosäure- und Vitaminergänzungen, bei einer Konzentration im Bereich zwischen 4,5–10 × 10⁵ Zellen/ml in einem Gesamtvolumen von 6 oder 7 ml pro Kolben (T25) kultiviert. An Tag 0 wurde humanes TSLP (20 ng/ml) und andere Zytokine, d. h. IL-7, SLF (d. h. Steel Factor oder Stem Cell Factor oder Mast Cell Growth Factor) oder flt3L, entweder allein oder in Kombination, zu den Kulturen gegeben. Nach 14 Tagen und anschließend wöchentlich wurde die Hälfte der Kultur für eine Zählung entfernt. Es wurden frisches Medium und Zytokine zu den Kulturen gegeben, um zum Gesamtvolumen von 6 oder 7 ml zurückzukehren.
Geerntete Zellen wurden auch mittels Durchflußzytometrie vierzehn Tage nach der Kultur und anschließend wöchentlich analysiert, unter Verwendung von Antikörpern, die für die Zelloberflächenantigene spezifisch sind. Die verwendeten Antikörper waren spezifisch für T-Zellantigene (d. h. den αβ-T-Zellrezeptor, γδ-T-Zellrezeptor und CD3), B-Zellantigene (d. h. CD19 und Oberflächen-IgM), Antigene von Natürlichen Killerzellen (d. h. CD56), Monozytenantigene (d. h. CD14) und Granulozytenantigene (d. h. CD15).

Die Addition von humanem TSLP und IL-7 zu BM MNC-Kulturen induzierte zelluläres Wachstum, wie in Tabelle 1 angegeben. An Tag 0 waren ungefähr 5% der BM MNC T-Zellen. Nach 2 Wochen in Kultur mit TSLP und IL-7, bestanden die Kulturen aus 70% CD3⁺ T-Zellen. An Tag 21, waren 86% der Zellen CD3⁺ T-Zellen. Die Kulturen enthielten vorwiegend T-Zellen bis zur Beendigung des Experiments an Tag 42. TABELLE 1

	Gesamte Zellausbeute (×10⁵)
Behandlung	Tag 0	Tag 14	Tag 21	Tag 28	Tag 42	insgesamt
	13,5
Medium		6	1,1	0,4	0,9	8,4
TSLP		3,9	2,1	1	2,9	9,9
IL-7		4,2	7,4	4,4	4,6	20,6
IL-7 + TSLP		10,3	12,1	17,2	7,5	47,1
SLF		3,7	4,3	1,1	0,9	10
SLF + TSLP		5,4	6,9	1	1,6	14,9
flt3L		6,3	2,3	2,8	1,8	13,2
flt3L + TSLP		7,7	4,7	2,7	3,1	18,2

In einem weiteren Satz an Experimenten wurden drei getrennte Ansätze von humanem TSLP, das mit His/FLAG^® getaggt wurde (TSLP 7489, TSLP 7811 oder TSLP 7812) allein oder in Kombination mit IL-7 auf die Fähigkeit untersucht, sich auf Zellüberleben und -wachsen auszuwirken. Es wurden aus zwei getrennten, frischen Knochenmarksproben BM MNC-Kulturen erhalten und mit einer Konzentration von entweder 5 × 10⁵ Zellen/ml (Gruppe 1) oder 10 × 10⁵ Zellen/ml (Gruppe 2) ausgesät. Mit His/FLAG^® getaggtes TSLP (20 mg/ml) und IL-7 wurden wie oben beschrieben zu den Kulturen gegeben. TSLP in Kombination mit IL-7 führte zum Wachsen von BM MNC-Kulturen, wie in Tabelle 2 (Knochenmarksprobe 1) und Tabelle 3 (Knochenmarksprobe 2) angegeben. Bis Tag 21, bestanden 80% der gewachsenen Zellpopulation aus CD4⁺ αβ⁺ oder CD8⁺ αβ⁺ T-Zellen. In vier der mit IL-7 und TSLP behandelten Kulturen, wuchsen die Zellen so, dass die Kulturen bis zur Beendigung der Experimente nach 4 – 5 Wochen vorwiegend T-Zellen enthielten. TABELLE 2

	Gesamte Zellausbeute (×10⁵)
Behandlung	Tag 0	Tag 14	Tag 21	Tag 28	Tag 35	insgesamt
Gruppe 1 (5 × 10⁵)	17,5
Medium		4	1,3	1,4	ND*	6,7
IL-7		8,4	6,5	7,1	ND*	22
TSLP 7489		4,4	1,5	1,2	ND*	7,1
TSLP 7811		5,2	1,7	1,2	ND*	8,1
TSLP 7812		2,8	1,4	2,3	ND*	6,5
IL-7 + T7489		12,4	9,1	8,3	ND*	29,8
IL-7 + T7811		10,5	5,3	8,4	ND*	24,2
IL-7 + T7812		9,7	6,5	4,7	ND*	20,9
Gruppe 2 (10 × 10⁵)	35
Medium		6,6	3,1	2,2	ND*	11,9
IL-7		14,8	10,1	3,7	ND*	32,3
TSLP 7489		11,5	3,3	2,9	ND*	17,7
TSLP 7811		13,3	2,8	3,1	ND*	19,2
TSLP 7812		13	3,2	2,6	ND*	18,8
IL-7 + T7489		25,6	17,7	8	10,9	62,2
IL-7 + T7811		18,8	16,8	10	15,7	61,3
IL-7 + T7812		22,4	13,5	10,4	11,6	57,9
*ND = nicht bestimmt (Kultur erschöpft)

TABELLE 3

	Gesamte Zellausbeute (×10⁵)
Behandlung	Tag 0	Tag 14	Tag 21	Tag 23	Tag 28	Tag 35	zusammengefasst
Gruppe 1 (5 × 10⁵)	17,5
Medium		3,1	0,9	ND*	0,8	ND*	4,8
IL-7		3,8	8,9	ND*	8	ND*	20,7
TSLP 7489		3	1,1	ND*	0,8	ND*	4,9
TSLP 7811		2,6	1,3	ND*	ND*	ND*	3,9
TSLP 7812		3,8	1,2	ND*	0,9	ND*	5,9
IL-7 + T7489		8,9	80	39,4	18,2	21	167,5
IL-7 + T7811		6,2	12,5	ND*	16,7	14,3	49,7
IL-7 + T7812		7,1	14,5	ND*	11,1	11,6	44,3
Gruppe 2 (10 × 10⁵)	35
Medium		6,6	1,9	ND*	1,8	ND*	10,3
IL-7		10,7	19	ND*	16,5	29,2	75,4
TSLP 7489		6,8	3,2	ND*	3,3	ND*	13,3
TSLP 7811		8,7	3,3	ND*	3,4	ND*	15,4
TSLP 7812		7,1	3,1	ND*	2,7	ND*	12,9
IL-7 + T7489		18,1	31,4	20	16,7	20,4	106,6
IL-7 + T7811		13,9	26,2	46,8	17,9	19,2	124
IL-7 + T7812		15,1	24,4	88,4	20,6	26,6	175,1
*ND = nicht bestimmt (Kultur erschöpft)

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein gereinigtes TSLP Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) dem TSLP Polypeptid der SEQ ID NO:2; b) einem Fragment des Polypeptids (a), von Aminosäure 29 bis Aminosäure 159, und Aminosäure 35 bis Aminosäure 159 von SEQ ID NO:2; c) ein TSLP Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2; und d) ein TSLP Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 95% identisch mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2 ist.
Das TSLP Polypeptid der SEQ ID NO:2.
Das isolierte Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 in unglykosylierter Form.
Ein Fusionsprotein umfassend das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, welches am C- oder N-Terminus mit einem anderen Protein oder einem Peptid oder Polypeptid fusioniert ist.
Eine Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und ein physiologisch verträgliches Verdünnungmittel oder einen physiologisch veträglichen Hilfsstoff oder Träger.