ES2288036T5

ES2288036T5 - ADN de TSLP humano y polipéptidos

Info

Publication number: ES2288036T5
Application number: ES99960372.3T
Authority: ES
Inventors: John E. Sims; Stewart Lyman; Hilary Mckenna; Allison Armstrong
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1998-11-13
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2017-07-06
Anticipated expiration: 2019-11-12
Also published as: WO2000029581A1; AU755562B2; US7405058B2; JP5632155B2; US20020146819A1; JP4454859B2; EP1129190B1; DE69936105D1; US20150005226A1; US7304144B2; CA2349762C; NZ512105A; DK1129190T4; EP1129190A1; CY1106806T1; DE69936105T2; US20130225490A1; CA2349762A1; IL195812A; ATE362534T2

Description

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DESCRIPCION

ADN de TSLP humano y polipeptidos Referenda cruzada con solicitudes relacionadas

Por medio de la presente esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos S.N. 60/108.452, presentada el 13 de noviembre de 1998.

Antecedentes de la invencion

Campo de la Invencion

La invencion esta dirigida a polipeptidos nuevos purificados y aislados de linfopoyetina estromal tlmica humana y fragmentos de los mismos, a los procesos para la produccion de formas recombinantes de tales polipeptidos, a polipeptidos fragmentados derivados de estos polipeptidos, y a los usos de los mismos.

Descripcion del arte previo relacionado

Aunque se ha estudiado extensamente el desarrollo de celulas B, subsisten aun vaclos en las rutas que conducen desde las celulas madre hematopoyeticas hasta celulas B maduras. Se reconoce que las citoquinas influyen y juegan un papel crltico en el desarrollo y crecimiento de las celulas B. Las citoquinas conocidas que influyen en el desarrollo de las celulas B incluyen IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IFN-gama y al factor de estimulacion de colonias de macrofago-granulocito (GM-CSF).

En anos recientes, se ha demostrado que un nuevo factor de crecimiento murino, designado como linfopoyetina estromal tlmica (TSLP), juega un papel en el desarrollo y maduracion de las celulas B. La actividad de la citoquina de TSLP murina es muy similar a aquella de IL-7, que es requerida durante la proliferacion y la supervivencia de las celulas pre-B (Janeway y colaboradores, Immuno Biology, 2nd Ed. (1996)). Se ha demostrado que estas dos citoquinas mantienen a las celulas NAG8/7 (Friend y colaboradores, Exp. Hematol, 22:321-328 (1994)) y soportan la limfopoyesis de B. Ademas, los linfocitos B maduros fallan en desarrollarse en ausencia ya se a de IL-7 o de TSLP murina. Ademas, se ha demostrado que la TSLP murina puede remplazar a la IL-7 en el mantenimiento de las respuestas proliferativas de las celulas B (Ray y colaboradores, Eur. J. Immunol., 26:10-16 (1996)). Por lo tanto, en el sistema del raton, TSLP tiene una funcion significativa en el desarrollo de las celulas B.

Como al IL-7, la TSLP murina puede coestimular tambien a los timocitos y a las celulas T maduras (Friend y colaboradores, Exp. Hematol., 22:321-328 (1994)). Los estudios con ratones con el receptor de IL-7 desactivado geneticamente (IL-7R) indican que IL-7, TSLP, o ambos juegan un papel crucial en el control del reordenamiento del locus del receptor gama de celulas T (TCRy), presumiblemente por medio de accesibilidad mediada de los genes TCRy a la recombinasa VDJ (Candeias y colaboradores, Immunology Letters, 57:9-14 (1997)). Por lo tanto, la TSLP murina tambien juega un papel significativo en el desarrollo de las celulas T.

Los receptores de TSLP murina y los receptores de IL-7 usan ambos a la cadena a de IL-7R como parte de sus complejos de senalamiento (Levin y colaboradores, J. Immunol., 162:677-683 (1999)). A pesar de la cadena a comun de IL-7R, sin embargo, parece que IL-7 y TSLP median sus efectos linfopoyeticos a traves de distintos mecanismos. IL-7 induce la activacion de Stat5 y a las quinasas de la familia Janus Jak1 y Jak3, mientras que la TSLP murina induce la activacion de Stat5, pero a ninguna de las quinasas conocidas de la familia Janus (Levin y colaboradores, J. Immunol., 162:677-683 (1999)).

Dada la importante funcion de TSLP murina y el significado de su papel en el desarrollo y la maduracion de las celulas B y de las celulas T en el sistema del raton, existe la necesidad en el estado del arte de identificar y aislar la TSLP humana y de estudiar su papel en el desarrollo y la maduracion de las celulas B y de las celulas T humanas. Ademas, en vista del continuo interes en el desarrollo de linfocitos y en el sistema inmune, el descubrimiento, identificacion y el papel de nuevas protelnas, tales como la TSLP humana y sus receptores, estan en primera llnea de la biologla molecular moderna, la bioqulmica y la inmunologla. A pesar del aumento en el conocimiento, todavla existe la necesidad en el estado del arte por conocer la identidad y la funcion de las protelnas involucradas en las respuestas celulares e inmunologicas.

En otro aspecto, la identificacion de la estructura primaria, o secuencia, de una protelna desconocida es la culminacion de un arduo proceso de experimentacion. Con el proposito de identificar una protelna desconocida, el investigador puede confiar en una comparacion de la protelna desconocida con peptidos conocidos utilizando una variedad de tecnicas conocidas por aquellos capacitados en el arte. Por ejemplo, se analizan rutinariamente protelnas utilizando tecnicas tales como electroforesis, sedimentation, cromatografla, secuenciacion y espectrometrla de masas.

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En particular, la comparacion de una protelna desconocida con polipeptidos de peso molecular conocido permite una determinacion del peso molecular aparente de la protelna desconocida (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisms, paginas 76-77, Prentice Hall, 6a edicion, (1991)). Los estandares de peso molecular de protelna se encuentran comercialmente disponibles para ayudar a la estimacion de los pesos moleculares de protelnas desconocidas (New England Biolabs Inc. Catalog: 130-13 (1995)); (J. L. Hartley, patente estadounidense No. 5.449.758). Sin embargo, los estandares de peso molecular puede que no correspondan lo suficientemente en tamano con la protelna desconocida para permitir una estimacion precisa del peso molecular aparente. La dificultad en la estimacion del peso molecular es compuesta en el caso de protelnas que estan sometidas a fragmentacion por medios qulmicos o enzimaticos, modificada por la modificacion o el procesamiento postraduccional, y/o asociada con otras protelnas en complejos no covalentes.

Ademas, la naturaleza unica de la composicion de una protelna con relacion a sus constituyentes aminoacidos especlficos resulta en un posicionamiento unico de los sitios de escision dentro de la protelna. La fragmentacion especlfica de una protelna por medio de escision qulmica o enzimatica resulta en una “huella unica del peptido” (D. W. Cleveland y colaboradores, J. Biol. Chem. 252:_1102-1106 (1977); M. Brown y colaboradores, J. Gen. Virol. 50:309-316 (1980)). Por consiguiente, la escision es sitios especlficos resulta en una fragmentacion reproducible de una protelna dada en peptidos de pesos moleculares precisos. Ademas, estos peptidos poseen una carga unica caracterlstica que determina el pH isoelectrico del peptido. Estas caracterlsticas unicas se pueden explotar utilizando una variedad de tecnicas electroforeticas y de otra Indole (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisms, paginas 76-77, Prentice Hall, 6a edicion. (1991)).

La fragmentacion de protelnas se emplea ademas para el analisis de composicion de aminoacidos y la secuenciacion de protelnas (P. Matsudiara, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 (1987); C. Eckerskorn y colaboradores, Electrophoresis, 9:830-838 (1988)), particularmente la produccion de fragmentos de protelnas con un N terminal "bloqueado". Ademas, las protelnas fragmentadas pueden ser utilizadas para inmunizacion, por medio de seleccion por afinidad (R. A. Brown, patente estadounidense No. 5.151.412), para la determinacion de los sitios de modificacion (por ejemplo, fosforilacion), para generacion de compuestos biologicamente activos (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisms, 300-301 (Prentice Hall, 6a edicion, (1991)), y para diferenciacion de protelnas homologas (M. Brown y colaboradores, J. Gen. Virol., 50:309-316 (1980)).

Ademas, cuando se obtiene una huella digital de un peptido de una protelna desconocida, se puede comparar con una base de datos de protelnas conocidas para ayudar en la identificacion de una protelna desconocida utilizando espectrometrla de masas (W.J. Henzel y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5011-5015 (1993); D. Fenyo y colaboradores, Electrophoresis, 19:998-1005 (1998)). Una variedad e programas de computador para facilitar estas comparaciones se encuentran accesibles a traves de Internet, tales como Protein Prospector (sitio en Internet: prospector.uscf.edu), Multildent (sitio en Internet:
www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (sitio en Internet: www.mann.embl-heiedelberg.de...deSearch/FRPeptideSearch Form.html), y ProFound (sitio en Internet:
www.chaitsgi.rockefeller.edu/cgi-bin/protid-frag.html). Estos programas le permiten al usuario especificar el agente de escision y los pesos moleculares de los peptidos fragmentados dentro de una tolerancia determinada. Los programas comparan estos pesos moleculares con la information del peso molecular de la protelna almacenada en las bases de datos para ayudar a determinar la identidad de la protelna desconocida. Se requiere una informacion precisa referente al numero de peptidos fragmentados y al peso molecular preciso de esos peptidos para una identificacion exacta. Por lo tanto, aumentando la precision en la determinacion del numero de peptidos fragmentados y el peso molecular preciso debe dar como resultado una mayor probabilidad de exito en la identificacion de protelnas desconocidas.

Ademas, las digestiones de peptidos de protelnas desconocidas se pueden secuenciar utilizando espectrometrla de masas en tandem (MS/MS) y la secuencia resultante buscada contra las bases de datos (J.K. Eng, y colaboradores, J. Am. Soc. Mass Spec. 5:976-989 (1994); M. Mann y M. Wilm, Anal. Chem., 66:4390-4399 (1994); J.A. Taylor y R.S. Johnson, Rapid Comm. Mass Spec., 11:1067-1075 (1997)). Los programas de busqueda que se pueden utilizar en este proceso se encuentran en la Internet, tales como Lutefisk 97 (sitio en Internet:
www.lsbc.com: 70/Lutefisk97.html), y los programas Protein Prospector, Peptide Search y ProFound descritos anteriormente. Por lo tanto, la adicion de la secuencia de un gen y su secuencia protelnica predicha y los fragmentos del peptido a una base de datos de secuencia puede ayudar en la identificacion de protelnas desconocidas utilizando espectrometrla de masas en tandem.

De esta manera, existe tambien la necesidad en el estado del arte por peptidos adecuados para ser usados en los estudios de fragmentacion de peptidos, para el uso en las mediciones de peso molecular, y para el uso en la secuenciacion de protelnas utilizando espectrometrla de masas en tandem.

Resumen de la invencion

La invention ayuda a satisfacer estas diferentes necesidades en el estado del arte proveyendo los polipeptidos de TSLP humana codificados por estos acidos nucleicos. Las realizaciones particulares estan dirigidas a una molecula aislada de acido nucleico de TSLP que contiene la secuencia de ADN de la SEQ ID NO: 1 y una molecula aislada de

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acido nucleico de TSLP que codifica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2, as! como a las moleculas de acido nucleico complementarias de esas secuencias. Tanto las moleculas de acido nucleico de ARN y de ADN monocatenario como bicatenario son abarcadas, as! como las moleculas de acido nucleico que hibridan hasta un ADN bicatenario desnaturalizado que contiene el todo o parte de la SEQ ID NO: 1. Tambien estan incluidas las moleculas aisladas de acido nucleico que se derivan por medio de mutagenesis in vitro de la molecula de acido nucleico que contiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1, que estan degeneradas a partir de la molecula de acido nucleico que contiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1, y que son variantes alelicas del ADN de la invention. La description tambien abarca a los vectores recombinantes que dirigen la expresion de estas moleculas de acido nucleico y a las celulas huesped transformadas o transfectadas con estos vectores.

Ademas, la descripcion incluye metodos que se relacionan con el uso del acido nucleico senalado anteriormente para identificar acidos nucleicos que codifican a las protelnas que tienen la capacidad de inducir la proliferation de celulas de linaje B o de linaje T; para identificar al cromosoma humano numero 5; para cartografiar genes sobre el cromosoma humano numero 5; para identificar genes asociados con ciertas enfermedades, slndromes, u otras condiciones humanas asociadas con el cromosoma humano numero 5; y para estudiar la serialization celular y al sistema inmunologico.

La descripcion tambien abarca el uso de oligonucleotidos sentido o antisentido del acido nucleico de la SEQ ID NO: 1 para inhibir la expresion de los polinucleotidos codificados por el gen de TSLP.

La invencion tambien incluye peptidos aislados y fragmentos de los mismos codificados por estas moleculas de acido nucleico que incluyen porciones solubles de polipeptido de la SEQ ID NO: 2. La invencion abarca ademas metodos para la production de estos polipeptidos, incluido el cultivo de celulas huesped bajo condiciones que promuevan la expresion y recuperation del polipeptido del medio de cultivo. Especialmente, la expresion de estos polipeptidos en bacterias, levaduras, plantas, insectos y celulas de animales es abarcada por la invencion.

En general, los polipeptidos de la invencion pueden ser utilizados para estudiar procesos celulares tales como regulation inmunologica, proliferacion celular, diferenciacion celular, muerte celular, migration celular, interaction celula-celula, y respuestas inflamatorias. Ademas, estos polipeptidos se pueden utilizar para identificar protelnas asociadas con ligandos de TSLP y receptores de TSLP.

Ademas, la invencion incluye ensayos que utilizan estos polipeptidos para seleccionar inhibidores potenciales de actividad asociados con moleculas de polipeptido de estructura contraria, y metodos de utilizar estos polipeptidos como agentes terapeuticos para el tratamiento de enfermedades mediadas por moleculas de polipeptido de TSLP de estructura contraria. Ademas, los metodos para utilizar estos polipeptidos en el diseno de inhibidores de los mismos son tambien un aspecto de la invencion.

La invencion incluye ademas un metodo para utilizar estos polipeptidos como marcadores de peso molecular que permiten la estimation del peso molecular de una protelna o de una protelna fragmentada, as! como un metodo para la visualization de los marcadores de peso molecular de la invencion de la misma utilizando electroforesis. La invencion abarca ademas metodos para la utilization de los polipeptidos de la invencion como marcadores para determinar el punto isoelectrico de una protelna desconocida, as! como controles para establecer el grado de fragmentation de una protelna.

Ademas, la invencion incluye los kits para ayudar en estas determinaciones.

La invencion abarca ademas el uso de las secuencias de acido nucleico de TSLP humana, de las secuencias predichas de los aminoacidos del polipeptido o fragmento de las mismas, o una combination de las secuencias predichas de los aminoacidos del polipeptido y fragmentos de los mismos para ser usadas en la busqueda de una base de datos electronica para ayudar en la identification de acidos nucleicos y/o protelnas de la muestra.

Los anticuerpos monoclonales o policlonales aislados que se enlazan a estos polipeptidos tambien son abarcados por la invencion, as! como el uso de estos anticuerpos para ayudar en la purification del polipeptido de TSLP. Ademas, los anticuerpos aislados se pueden utilizar para establecer un Ensayo de Inmunoabsorcion Enzimatica (ELISA) para medir a la TSLP en muestras tales como el suero.

Breve descripcion de las figuras

la figura 1 presenta la secuencia de nucleotidos del adn de tslp humana (seq id no: 1), y la figura 2 presenta la secuencia de aminoacidos de tslp humana (seq id no: 2).

Descripcion detallada de la invencion

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Las moleculas de acido nucleico incluyen la siguiente secuencia de nucleotidos: Nombre: TSLP

1 GCAGCCAGAA AGCTCTGGAG CATCAGGGAG ACTCCAACTT AAGGCAACAG 51 CATGGGTGAA TAAGGGCTTC CTGTGGACTG GCAATGAGAG GCAAAACCTG 101 GTGCTTGAGC ACTGGCCCCT AAGGCAGGCC TTACAGATCT CTTACACTCG 151 TGGTGGGAAG AGTTTAGTGT GAAACTGGGG TGGAATTGGG TGTCCACGTA 201 TGTTCCCTTT TGCCTTACTA TATGTTCTGT CAGTTTCTTT CAGGAAAATC 251 TTCATCTTAC AACTTGTAGG GCTGGTGTTA ACTTACGACT TCACTAACTG 301 TGACTTTGAG AAGATTAAAG CAGCCTATCT CAGTACTATT TCTAAAGACC 351 TGATTACATA TATGAGTGGG ACCAAAAGTA CCGAGTTCAA CAACACCGTC 401 TCTTGTAGCA ATCGGCCACA TTGCCTTACT GAAATCCAGA GCCTAACCTT 451 CAATCCCACC GCCGGCTGCG CGTCGCTCGC CAAAGAAATG TTCGCCATGA 501 AAACTAAGGC TGCCTTAGCT ATCTGGTGCC CAGGCTATTC GGAAACTCAG 551 AT AAATG CT A CTCAGGCAAT GAAGAAGAGG AGAAAAAGGA AAGTCACAAC 601 CAATAAATGT CTGGAACAAG TGTCACAATT ACAAGGATTG TGGCGTCGCT 651 TCAATCGACC TTTACTGAAA CAACAGTAAA CCATCTTTAT TATGGTCATA 701 TTTCACAGCC CAAAATAAAT CATCTTTATT AAGTAAAAAA AAA (SEQ ID NO:1) '

La secuencia de aminoacidos del polipeptido codificado por la secuencia de nucleotidos de la invencion incluye: Nombre: TSLP (polipeptido)

1 MFPFALLYVL SVSFRKIF1L QLVGLVLTYD FTNCDFEKIK

51 LITYMSGTKS TEFNNTVSCS NRPHCLTEIQ SLTFNPTAGC

101 KTKAALAIWC PGYSETQINA TQAMKKRRKR KVTTNKCLEQ

151 FNRPLLKQQ (SEQ ID NO:2) "

AAY1STISKD

ASLAKEMFAM

VSQLQGLWRR

El descubrimiento de los acidos nucleicos permite la construccion de vectores de expresion que comprenden secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos; celulas huesped transfectadas o transformadas con los vectores de expresion; polipeptidos biologicamente activos aislados y purificados y fragmentos de los mismos; el uso de acidos nucleicos o de oligonucleotidos de los mismos como sondas para identificar acidos nucleicos que codifican protelnas que tienen actividad como la de TSLP (por ejemplo, inducir la proliferation de celulas de linaje B o de linaje T), el uso de los acidos nucleicos o de los oligonucleotidos de los mismo para identificar al cromosoma humano numero 5; el uso de los acidos nucleicos o de los oligonucleotidos de los mismos para cartografiar genes sobre el cromosoma humano numero 5; el uso de los acidos nucleicos o de los oligonucleotidos de los mismos para identificar genes asociados con ciertas enfermedades, slndromes u otras condiciones humanas asociadas con el cromosoma humano numero 5 y, en particular, con la region q21-q22 del cromosoma numero 5, incluido el slndrome de Gardner, poliposis coli adenomatosas, enfermedad desmoide hereditaria, slndrome de Turcot, y cancer colorectal; el uso de oligonucleotidos monocatenarios sentido y antisentido de los acidos nucleicos para inhibir la expresion de los polinucleotidos codificados por el de TSLP; el uso de tales polipeptidos y de fragmentos solubles para inducir la proliferacion de celulas de linaje B o de linaje T; el uso de tales polipeptidos y peptidos fragmentados como marcadores de peso molecular; el uso de tales polipeptidos y peptidos fragmentados como controles para fragmentation de peptidos, y de los kits que contienen estos reactivos; el uso de tales polipeptidos y fragmentos de los mismos para generar anticuerpos; y el uso de los anticuerpos para purificar a los polipeptidos de TSLP.

Moleculas de acido nucleico

Se describen ciertas secuencias aisladas de nucleotidos que estan libres de material endogeno contaminante. Una “secuencia de nucleotidos” se refiere a una molecula de polinucleotido en la forma de un fragmento separado o como un componente de una construccion mas grande de acido nucleico. La molecula de acido nucleico se ha derivado de ADN o ARN aislado al menos una vez en forma sustancialmente pura y en una cantidad o concentration que permite la identification, manipulation y recuperation de sus secuencias nucleotidas componentes por medio de metodos bioqulmicos estandar (tal como aquellos esbozados en (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Tales secuencias son suministradas y/o construidas preferiblemente en la forma de un marco de lectura abierta no interrumpida por secuencias internas no traducidas, o intrones, que tlpicamente estan presentes en genes de eucariotas. Las

secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes 5' o 3' a partir de un marco de lectura abierta, donde el mismo no interfiere con la manipulation o la expresion de la region de codification.

Las moleculas de acido nucleico incluyen ADN tanto en forma monocatenaria como bicatenaria, as! como el complemento de ARN del mismo, el ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genomico, ADN sintetizado 5 qulmicamente, ADN amplificado por medio de PCR, y combinaciones de los mismos. El ADN genomico se puede aislar por medio de tecnicas convencionales, por ejemplo, utilizando el ADNc de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento adecuado del mismo, como una sonda.

Las moleculas de ADN incluyen genes de longitud completa as! como polinucleotidos y fragmentos de los mismos. El gen de longitud completa puede incluir tambien al peptido senal N-terminal. Otras realizaciones incluyen ADN que 10 codifica una forma soluble, por ejemplo, que codifica al dominio extracelular de la protelna, ya sea con o sin el peptido senal.

Los acidos nucleicos se derivan preferencialmente de fuentes humanas, pero la invention incluye tambien a aquellos derivados de especies no humanas.

Secuencias preferidas

15 La secuencia de nucleotidos particularmente preferida es la SEQ ID NO: 1, como se expuso anteriormente. Se aislo un clon de ADNc que tiene la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1 como se describe en el Ejemplo 1. La secuencia de aminoacidos codificada por el ADN de la SEQ ID NO: 1 se muestra en la SEQ ID NO: 2. Esta secuencia identifica al polinucleotido de TSLP como miembro de un grupo de factores que influencian el crecimiento de celulas de linaje B y de linaje T (Ray y colaboradores, Eur. J. Immunol, 26:10-16 (1996)); (Friend y colaboradores, 20 Exp. Hematol., 22:321-328 (1994)).

Secuencias adicionales

Debido a la degeneration conocida del codigo genetico, en donde mas de un codon puede codificar al mismo aminoacido, una secuencia de ADN puede variar de aquella mostrada en la SEQ ID NO: 1, y codificar aun a un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2. Tales secuencias de variantes de ADN 25 pueden resultar de mutaciones silenciosas (por ejemplo, que ocurren durante la amplification por PCR), o pueden ser el producto de mutagenesis deliberada de una secuencia nativa.

La description provee as! secuencias aisladas de ADN que codifican polipeptidos de la invencion, seleccionadas de:

(a) ADN que contiene la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1; (b) ADN que codifica al polipeptido de la SEQ ID NO: 2; (c) ADN capaz de hibridacion de un ADN de (a) o (b) bajo condiciones restrictivas moderadas y que 30 codifican polipeptidos de la invencion; (d) ADN capaz de hibridacion hasta un ADN de (a) o (b) bajo condiciones altamente restrictivas y que codifican polipeptidos de la invencion, y (e) ADN que esta degenerado como resultado del codigo genetico para un ADN definido en (a), (b), (c), o de (d) y que codifican polipeptidos de la invencion. Desde luego, los polipeptidos codificados por tales secuencias de ADN son abarcados por la invencion.

Como se las utiliza aqul, las condiciones restrictivas moderadas las pueden determinar facilmente aquellos 35 ordinariamente capacitados en la tecnica con base en, por ejemplo, la longitud del ADN. Las condiciones basicas son expuestas por (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edition. Vol. 1, paginas 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), e incluyen el uso de una solution de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridacion aproximadamente del 50% de formamida, 6X SSC aproximadamente a 42°C (u otra solucion similar de hibridacion, tal como la solucion 40 de Stark, en aproximadamente 50% de formamida, aproximadamente a 42°C), y condiciones de lavado

aproximadamente 60°C, 0,5X SSC, 0,1% de SDS. Las condiciones restrictivas altas las puede determinar tambien facilmente el operario capacitado con base en, por ejemplo, la longitud del ADN. Generalmente, tales condiciones se definen como condiciones de hibridacion como anteriormente, y con lavado aproximadamente a 68°C, 0,2X SSC, 0,1% de SDS. El operario capacitado reconocera que la temperatura y la concentration salina de la solucion de

45 lavado se pueden ajustar segun se necesite de acuerdo a factores tales como la longitud de la sonda.

Tambien esta incluido el ADN que codifica fragmentos de polipeptido y polipeptidos que contienen un sitio(s) inactivado(s) de N-glicosilacion, sitio(s) inactivado(s) de procesamiento de proteasa, o sustitucion(es) conservadora(s) de aminoacidos, como se describe mas adelante.

En otra realization, las moleculas de acido nucleico tambien comprenden secuencias de nucleotidos que son al 50 menos 80% identicas a una secuencia nativa. Tambien se contemplan realizaciones en las cuales una molecula de acido nucleico comprende una secuencia que es al menos 90% identica, al menos 95% identica, al menos 98% identica, al menos 99% identica, o al menos 99,9% identica a una secuencia nativa.

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El porcentaje de identidad se puede determinar por medio de inspeccion visual y de calculo matematico. Alternativamente, el porcentaje de identidad de dos secuencias de acido nucleico se puede determinar por medio de la comparacion de la informacion de la secuencia utilizando el programa de computador GAP, version 6.0 descrita por (Devereux y colaboradores, Nucl. Acids Res., 12:387 (1984)) y disponible con el University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parametros preferidos por defecto para el programa gAp incluyen: (1) una matriz unitaria de comparacion (que contienen un valor de 1 para las identidades y de 0 para la falta de identidad) para los nucleotidos, y la matriz de comparacion ponderada de (Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res., 14:6745 (1986)), como lo describen (Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, paginas 353-358 (1979)); (2) una penalizacion de 3,0 por cada vaclo y una penalizacion adicional de 0,10 por cada slmbolo en cada vaclo; y (3) ninguna penalizacion para los vaclos terminales. Alguien capacitado en la tecnica puede utilizar tambien otros programas de comparacion de secuencia.

La descripcion tambien provee acidos nucleicos aislados utiles en la production de polipeptidos. Tales polipeptidos se pueden preparar por medio de cualquier cantidad de tecnicas convencionales. Una secuencia de ADN que codifica a un polipeptido de TSLP humana, o un fragmento deseado de la misma se pueden subclonar dentro de un vector de expresion para la produccion del polipeptido o del fragmento. La secuencia de ADN convenientemente se fusiona a una secuencia que codifica a un peptido senal o llder adecuado. Alternativamente, el fragmento deseado puede ser sintetizado qulmicamente utilizando tecnicas conocidas. Los fragmentos de ADN tambien pueden ser producidos por medio de digestion con una endonucleasa de restriction de una secuencia de ADN clonada de longitud completa, y aislada por medio de electroforesis sobre geles de agarosa. Si es necesario, los oligonucleotidos que reconstruyen al terminal 5' o 3' hasta un punto deseado se pueden ligar a un fragmento de ADN generado por medio de la digestion con una enzima de restriccion. Tales oligonucleotidos pueden contener adicionalmente un sitio de escision para la endonucleasa de restriccion secuencia arriba de la secuencia de codification deseada, y posicionar un codon de initiation (ATG) en el N-terminal de la secuencia de codification.

Tambien se puede emplear el procedimiento conocido de la reaction en cadena de la polimerasa (PCR) para aislar y amplificar una secuencia de ADN que codifica a un fragmento deseado de protelna. Los oligonucleotidos que definen a los terminales deseados del fragmento de ADN se emplean como iniciadores 5' y 3'. Los oligonucleotidos pueden adicionalmente contener sitios de reconocimiento para endonucleasas de restriccion, para facilitar la insertion del fragmento amplificado de ADN dentro de un vector de expresion. Las tecnicas de PCR son descritas en (Saiki y colaboradores, Science, 239:487 (1988)); (Wu y colaboradores, Recombinant DNA Methodology, eds., Academic Press, Inc., San Diego, pp. 189-196 (1989)); y (Innis y colaboradores, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds., Academia Press, Inc. (1990)).

Polipeptidos y fragmentos de los mismos

La invention abarca polipeptidos y fragmentos de los mismos en diferentes formas, incluidas aquellas de ocurrencia natural o producidas a traves de diferentes tecnicas tales como procedimientos que involucran tecnologla de adn recombinante. Tales formas incluyen, pero no se limitan a, derivados, variantes y oligomeros, as! como protelnas de fusion o fragmentos de las mismas.

Polipeptidos y fragmentos de los mismos

Los polipeptidos de la invencion incluyen protelnas de longitud completa codificadas por las secuencias de acido nucleico expuestas anteriormente. Los polipeptidos particularmente preferidos comprenden a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 con fragmentos particularmente preferidos que comprenden a los aminoacidos 29 a 159 (la secuencia madura de polipeptido) de la SEQ ID NO: 2.

El polipeptido de la SEQ ID NO: 2 incluye una region N-terminal hidrofoba que funciona como un peptido senal. El analisis por computador predice que el peptido senal corresponde a los residuos 1 a 28 de la SEQ ID NO: 2 (aunque los siguientes sitios de escision del peptido senal predichos por computador se presentan mas probablemente (en orden descendiente) despues de los aminoacidos 34 a 116 de la SEQ ID NO: 2). La escision del peptido senal producirla as! una protelna madura que contiene a los aminoacidos 29 a 159 de la SEQ ID NO: 2.

El operario capacitado reconocera que los llmites descritos anteriormente de tales regiones del polipeptido son aproximados. Para ilustracion, los llmites del peptido senal (que pueden ser predichos por medio de la utilization de programas de computador disponibles para ese proposito) pueden digerir de aquellos descritos anteriormente.

Los polipeptidos de la invencion pueden ser unidos a la membrana o pueden ser segregados y de este modo ser solubles. Los polipeptidos solubles pueden ser segregados a partir de las celulas en las cuales ellos se expresan. En general, los polipeptidos solubles se pueden identificar (y distinguirse de las contrapartes no solubles unidas a la membrana) por medio de la separation de las celulas intactas que expresan al polipeptido deseada a partir del medio de cultivo, por ejemplo, por medio de centrifugation, y ensayado el medio (sobrenadante) por la presencia del

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polipeptido deseado. La presencia del polipeptido en el medio indica que el polipeptido fue segregado de las celulas y de esta manera es una forma soluble de la protelna.

En una realizacion, los polipeptidos solubles y los fragmentos de los mismos contienen todo o parte del dominio extracelular, pero carecen de la region transmembrana que causarla la retencion del polipeptido sobre una membrana celular. Un polipeptido soluble puede incluir al dominio citoplasmatico, o una porcion del mismo, mientras que el polipeptido es segregado de la celula en la cual se produce.

Otras realizaciones incluyen fragmentos solubles que tienen un N-terminal en los aminoacidos 29 o 35 y un C- terminal en el aminoacido 159.

En general, el uso de formas solubles es conveniente para ciertas aplicaciones. La purificacion de los polipeptidos a partir de celulas huesped recombinantes se facilita, ya que los polipeptidos solubles se segregan a partir de las celulas. Ademas, los polipeptidos solubles son generalmente mas adecuados para administracion intravenosa.

La invencion tambien provee polipeptidos y fragmentos del domino extracelular que retienen una actividad biologica deseada. Las realizaciones particulares estan dirigidas a los fragmentos de polipeptido que retiene la habilidad de unirse a los receptores de TSLP. Tal fragmento puede ser un polipeptido soluble, como se describio anteriormente. En otra realizacion, los polipeptidos y los fragmentos incluyen convenientemente regiones que estan conservadas entre la familia de protelnas que influyen sobre el crecimiento de las celulas de linaje B o de linaje T descritas anteriormente.

Tambien se proveen aqul fragmentos de polipeptido que contiene al menos 20, o al menos 30, aminoacidos contiguos de la secuencia de la SEQ ID NO: 2. Los fragmentos derivados del dominio citoplasmatico encuentran uso en estudios de transduccion de senal, y en procesos de regulacion celular asociados con la transduccion de senales biologicas. Tambien se pueden emplear fragmentos de polipeptido com inmunogenos, en la generacion de anticuerpos.

Variantes

Se proveen aqul las variantes de ocurrencia natural as! como las variantes derivadas de los polipeptidos y de los fragmentos.

Las variantes pueden exhibir secuencias de aminoacidos que son al menos 95% identicas, al menos 98% identica, al menos 99% identica, o al menos 99,9% identica al polipeptido preferido o fragmento del mismo. El porcentaje de identidad se puede determinar por medio de inspeccion visual y de calculos matematicos. Alternativamente, el porcentaje de identidad de dos secuencias de protelna se puede determinar por medio de la comparacion de la information de la secuencia utilizando el programa de computador GAP, con base en los algoritmos de (Needleman y Wunsch, J. Mol. Bio., 48:443 (1970)) y disponible con el University of Wisconsin Genetics Computer Group (LJWGCG). Los parametros preferidos por defecto por el programa GAP incluyen: (1) una matriz de conteo, blosum62, como lo describen (Henikoff y Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1992)); (2) un peso vaclo de 12; (3) un peso de longitud vacla de 4; y (4) ninguna penalization por vaclos en los extremos. Se pueden emplear otros programas para que sean utilizados por una persona capacitada en el arte de comparacion de secuencias.

Las variantes de la invencion incluyen, por ejemplo, aquellas que resultan de eventos alternos de empalme de ARNm o de escision proteolltica. El empalme alterno de ARNm pude, por ejemplo, producir una protelna truncada pero biologicamente activa, tal como una forma soluble de ocurrencia natural de la protelna. Las variaciones atribuibles a la proteolisis incluyen, por ejemplo, diferencias en el N-terminal o en el C-terminal por la expresion en diferentes tipos de celulas huesped, debido a la remocion proteolltica de uno o mas aminoacidos terminales de la protelna (generalmente entre los aminoacidos 1-5 terminales). Las protelnas en las cuales las diferencias en la secuencia de aminoacidos son atribuibles a polimorfismo genetico (variation alelica entre individuos que producen la protelna) tambien se contemplan aqul.

Las variantes adicionales dentro del alcance de la invencion incluyen polipeptidos que se pueden modificar para crear derivados de los mismos por medio ed la formation de conjugados covalentes o de agregacion co otras fracciones qulmicas, tales como grupos glicosilo, llpidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes se pueden preparar por medio del enlazamiento de fracciones qulmicas con grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoacidos o en el N-terminal o en el C-terminal de un polipeptido. Los conjugados que contienen agentes de diagnostico (detectables) o agentes terapeuticos unidos a ellos son contemplados aqul, como se discute con mas detalle mas adelante.

Otros derivados incluyen conjugados covalentes o de agregacion de los polipeptidos con otras protelnas o polipeptidos, tal como por medio de slntesis en un cultivo recombinante como fusiones N-terminales o C-terminales. Ejemplo de protelnas de fusion se discuten mas adelante en conexion con los oligomeros. Ademas, las protelnas de

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fusion pueden contener peptidos anadidos para facilitar la purificacion y la identificacion. Tales peptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los peptidos de identificacion antigenica descritos en la patente estadounidense No. 5.011.912 y en (Hopp y colaboradores, Biol. Technology, 6:1204 (1988)). Un peptido as! es el peptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp- Asp-Asp-Asp-Lys, (SEQ ID NO: 3) que es altamente antigenico y provee un epltopo reversiblemente enlazado por medio de un anticuerpo monoclonal especlfico, que permite un ensayo rapido y facilita la purificacion de la protelna recombinante expresada. Un hibridoma murino designado como 4E1 produce un anticuerpo monoclonal que se enlaza al peptido FLAG® en presencia de ciertos cationes metalicos divalentes, como se describe en la patente estadounidense No. 5.011.912. La llnea celular del hibridoma 4E11 ha sido depositada en la American Type Culture Collection con el numero de acceso No. HB 9259. Los anticuerpos monoclonales que se enlazan al peptido FLAG® se encuentran disponibles con Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut.

Entre las variantes de polipeptidos suministradas aqul estan las variantes de polipeptidos nativos que retienen la actividad biologica nativa o el equivalente sustancial de la misma. Un ejemplo es una variante que se enlaza esencialmente con la misma afinidad de enlazamiento con la que la hace la forma nativa. La afinidad de enlazamiento se puede medir por medio de procedimientos convencionales, por ejemplo como se describe en la patente estadounidense No. 5.512.457 y que se expone mas adelante.

Las variantes incluyen polipeptidos que son sustancialmente homologos a la forma nativa, pero que tienen una secuencia de aminoacidos diferente de aquella de la forma nativa debido a una o mas supresiones, inserciones o sustituciones. Las realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos que contienen de una a diez supresiones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoacidos, cuando se las compara con una secuencia nativa.

Un aminoacido dado se puede remplazar, por ejemplo, por un residuo que tiene caracterlsticas fisicoqulmicas similares. Los ejemplos de tales sustituciones conservadoras incluyen la sustitucion de un residuo alifatico por otro, tal como Ile, Val, Leu, o Ala por otro; las sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg, Glu y Asp, o Gln y Asn; o sustituciones de un residuo aromatico por otro, tal como Phe, Trp o Tyr por otro. Otras sustituciones conservadoras, por ejemplo que involucran sustituciones de regiones enteras que tiene caracterlsticas hidrofobas similares, son bien conocidas.

En forma similar, los ADN incluyen variantes que difieren de una secuencia nativa de ADN debido a una o mas supresiones, inserciones o sustituciones, pero que codifican a un polipeptido biologicamente activo.

La invencion incluye ademas a los polipeptidos de la invencion con o sin glicosilacion asociada a un patron nativo. Los polipeptidos expresados en sistemas de expresion de levadura o de mamlfero (por ejemplo, celulas COS-1 o COS-7) pueden ser similares a, o significativamente diferentes de un polipeptido nativo en peso molecular y en el patron de glicosilacion, dependiendo del sistema de expresion escogido. La expresion de los polipeptidos de la invencion en sistemas de expresion bacteriana, tales como E. coli, proveen moleculas no glicosiladas. Ademas, una preparacion dada puede incluir multiples especies diferencialmente glicosiladas de la protelna. Los grupos glicosilo se pueden remover a traves de metodos convencionales, en particular aquellos que utilizan glicopeptidasa. En general, los polipeptidos glicosilados de la invencion se pueden incubar con un exceso molar de glicopeptidasa (Boehringer Mannheim).

En la misma medida, construcciones similares de ADN que codifican diferentes adiciones o sustituciones de residuos de aminoacidos o de secuencias, o supresiones de residuos terminales o internos o de secuencias son abarcadas por la invencion. Por ejemplo, los sitios de N-glicosilacion en el domino extracelular del polipeptido se pueden modificar para impedir la glicosilacion, permitiendo la expresion de un carbohidrato reducido analogo en sistemas de expresion en mamlferos y en levadura. Los sitios de N-glicosilacion en polipeptidos de eucariotas se caracterizan por un triplete aminoacido Asn-X-Y, en donde X es cualquier aminoacido y Y es Ser o Thr. Las sustituciones, adiciones, o supresiones apropiadas para la secuencia de nucleotidos que codifican estos tripletes resultara en la prevencion de la union de residuos de carbohidrato a la cadena lateral Asn. La alteracion de un solo nucleotido, escogido para que la Asn sea remplazada por un aminoacido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilacion. Alternativamente, la Ser o la Thr se pueden remplazar con otro aminoacido, tal como Ala. Los procedimientos conocidos para la inactivacion de los sitios de N-glicosilacion en protelnas incluyen aquellos descritos en la patente estadounidense No. 5.071.972 y la EP 276.846.

En otro ejemplo de variantes, las secuencias que codifican residuos de Cys que no son esenciales para la actividad biologica se pueden alterar para que causar que los residuos de Cys sean suprimidos o remplazados con otros aminoacidos, previniendo la formacion de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos por plegamiento o renaturalizacion.

Otras variantes se preparan por medio de modificacion de residuos adyacentes de aminoacido dibasico, para mejorar la expresion en sistemas de levadura en los cuales esta presente la actividad de la proteasa KEX2. EP 212.914 divulga el uso de mutagenesis especlfica para el sitio para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en una protelna. Los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 se inactivan por medio de

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supresion, anadiendo o sustituyendo residuos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys para eliminar la ocurrencia de estos residuos basicos adyacentes. Los emparejamientos Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la escision por KEX2, y la conversion de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representa una aproximacion conservadora y preferida para inactivar los sitios de la KEX2.

Oligomeros

Abarcados por la invencion se encuentran los oligomeros o las protelnas de fusion que contienen polipeptidos de TSLP humana. Tales oligomeros pueden estar en la forma de multlmeros enlazados covalentemente o enlazados no covalentemente, incluidos dlmeros, trlmeros, u oligomeros superiores. Como se observo anteriormente, los polipeptidos preferidos son solubles y por lo tanto estos oligomeros pueden comprender polipeptidos solubles. En un aspecto de la invencion, los oligomeros mantienen la habilidad de enlazamiento de los componentes del polipeptido y proveen por lo tanto, sitios de enlazamiento bivalente, trivalente, etc.

Una realizacion de la invencion esta dirigida a oligomeros que comprenden polipeptidos multiples unidos a traves de interacciones covalentes o no covalentes entre fracciones de peptido fusionadas a los polipeptidos. Tales peptidos pueden ser enlazadores de peptido (espaciadores), o peptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerizacion. Los cierres de leucina y ciertos polipeptidos derivados de anticuerpos estan entre los peptidos que pueden promover oligomerizacion de los polipeptidos unidos a ellos, como se describe con mas detalle mas adelante.

Oligomeros basados en Inmunoglobulina

Como una alternativa, un oligomero se prepara utilizando polipeptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparacion de protelnas de fusion comprende ciertos polipeptidos heterologos fusionados a diferentes porciones de polipeptidos derivados de anticuerpo (incluido el dominio Fc), ha sido descrita, por ejemplo por (Ashkenazi y colaboradores, PNAS USA, 88:10535 (1991)); (Byrn y colaboradores, Nature, 344:677 (1990)); y (Hollenbaugh y Aruffo "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, paginas 10.19.1 - 10.19.11 (1992)).

Una realizacion de la presente invencion esta dirigida a un dlmero que comprende dos protelnas de fusion creadas por medio de la fusion de un polipeptido de la invencion a un polipeptido de Fc derivado de un anticuerpo. Una fusion genica que codifica a la protelna de fusion del polipeptido/Fc se inserta en un vector de expresion apropiado. Las protelnas de fusion del polipeptido/Fc se expresan en celulas huesped transformadas con el vector de expresion recombinante, y permitieron reunir moleculas como las del anticuerpo, con lo cual se forman enlaces disulfuro entre cadenas entre las fracciones de Fc para producir moleculas divalentes.

El termino “polipeptido de Fc” como se lo utiliza aqul incluye las formas nativa y mutelna de los polipeptidos integrados por la region Fc de un anticuerpo que comprende a todos los dominios CH de la region Fc. Las formas truncadas de tales polipeptidos que contienen a la region de bisagra que promueve la dimerizacion estan tambien incluidas. Los polipeptidos preferidos comprenden a un polipeptido de Fc derivado de un anticuerpo de IgG1 humana.

Un polipeptido de Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, es un polipeptido de cadena sencilla que se extiende desde la region bisagra N-terminal hasta el C-terminal nativo de la region Fc de un anticuerpo de IgG1 humana. Otro polipeptido util de Fc es la mutelna de Fc descrita en la patente estadounidense No. 5.457.035, y en (Baum y colaboradores, EMBO J., 13:3992-4001 (1994)). La secuencia de aminoacidos de esta mutelna es identica a aquella de una secuencia nativa de Fc presentada en WO 93/10151, excepto por que el aminoacido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, al aminoacido 20 ha sido cambiado de Leu a Glu, y el aminoacido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. La mutelna exhibe una afinidad reducida por los receptores de Fc.

Las protelnas de fusion anteriormente descritas que comprenden fracciones de Fc (y los oligomeros formados de all!) ofrecen la ventaja de una purificacion facil por medio de cromatografla de afinidad sobre columnas de Protelna A o Protelna B.

En otras realizaciones, los polipeptidos de la invencion pueden ser sustituidos por la porcion variable de un anticuerpo de cadena pesada o liviana. Si las protelnas de fusion se elaboran con cadenas tanto pesadas como livianas de un anticuerpo, es posible formar un oligomero hasta con cuatro regiones extracelulares de TSLP.

Oligomeros con base en un enlazador de peptido

Alternativamente, el oligomero es una protelna de fusion que comprende multiples polipeptidos, con o sin enlazadores de peptido (peptidos espaciadores). Entre los enlazadores de peptido adecuado estan aquellos descritos en las patentes estadounidenses Nos. 4.751.180 y 4.935.233. Se puede insertar una secuencia de ADN que codifica a un enlazador de peptido deseado entre, y en el mismo marco de lectura que, las secuencias de ADN

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de la invencion, utilizando cualquier tecnica convencional adecuada. Por ejemplo, un oligonucleotido sintetizado qulmicamente que codifica al enlazador puede estar ligado entre las secuencias. En realizaciones particulares, una protelna de fusion comprende de dos a cuatro polipeptidos adecuados de TSLP, separada por medio de enlazadores de peptido.

Cierres de Leucina

Otro metodo para preparar los oligomeros de la invencion involucra el uso de un cierre de leucina. Los dominios del cierre de leucina son peptidos que promueven la oligomerizacion de las protelnas en las cuales ellos se encuentran. Los cierres de leucina fueron identificados originalmente en diferentes protelnas de enlazamiento al ADN (Landschulz y colaboradores, Science 240:1759 (1988)), y han sido desde entonces encontradas en una variedad de protelnas diferentes. Entre los cierres conocidos de leucina estan los peptidos de ocurrencia natural y los derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan.

El dominio del cierre (tambien denominado aqul como un dominio oligomerizante, o formador de oligomero) comprende una repeticion setena repetitiva, a menudo con cuatro o cinco residuos de leucina intercalados con otros aminoacidos. Ejemplos de dominios de cierre son aquellos encontrados en el factor de trascripcion de levadura GCN4 y una protelna de enlazamiento al ADN estable al calor encontrada en hlgado de rata (C/EBP; Landschulz y colaboradores, Science, 243:1681 (1989)). Dos protelnas nucleares de transformacion, fos y jun, tambien exhiben dominios de cierre, como lo hace el producto genico del protooncogen murino, c-myc (Landschulz y colaboradores, Science, 240:1759 (1988)). Los productos de los oncogenes nucleares fos y jun comprenden los dominios de cierre que forman preferiblemente heterodlmeros (O'Shea y colaboradores, Science, 245:646 (1989)), (Turner y Tjian, Science, 243:1689 (1989)). El dominio de cierre es necesario para la actividad biologica (enlazamiento de ADN) en estas protelnas.

Las protelnas fusogenicas de varios virus diferentes, incluidos paramixovirus, coronavirus, virus de sarampion y muchos retrovirus, tambien poseen dominios de cierre (Buckland y Wild, Nature, 338:547 (1989); (Britton, Nature, 353:394 (1991)); (Delwart y Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses, 6:703 (1990)). Los dominios de cierre en estas protelnas fusogenicas virales estan cerca de la region transmembrana de las protelnas; se ha sugerido que los dominios de cierre podrlan contribuir a la estructura oligomerica de las protelnas fusogenicas. La oligomerizacion de protelnas fusogenicas virales esta involucrada en la formacion de poros por fusion (Spruce y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:3523 (1991)). Se ha reportado recientemente tambien que los dominios de cierre juegan un papel en la oligomerizacion de factores de trascripcion de choque termico (Rabindran y colaboradores, Science 259:230 (1993)).

Los dominios de cierre se pliegan en forma reducida como bobinas paralelas en espiral (O'Shea y colaboradores, Science 254:539 (1991)). La arquitectura general de las bobinas paralelas en espiral ha sido bien caracterizada, con un empaquetamiento como de “botones en agujeros” como lo propusieron (Crick, Acta Crystallogr., 6:689)). El dlmero formado por un dominio de cierre se estabiliza por medio de la repeticion setena, designada (abcdefg)n de acuerdo a la notacion de (McLachlan y Stewart, J. Mol. Biol., 98:293 (1975)), en la cual los residuos a y d son generalmente residuos hidrofobos, con d siendo una leucina, que se alinean sobre la misma cara de una helice. Los residuos cargados en forma opuesta comunmente se presentan en las posiciones g y e. Asl, en una bobina paralela en espiral formada a partir de dos dominios de cierre helicoidales, los “botones” formados por las cadenas laterales hidrofobas de la primera helice estan empacados en los “agujeros” formados entre las cadenas laterales de la segunda helice.

Los residuos en posicion d (a menudo leucina) contribuyen a las grandes energlas hidrofobas de estabilizacion, y son importantes para la formacion de oligomeros (Krystek y colaboradores, Int. J. Peptide Res., 38:229 (1991)). (Lovejoy y colaboradores, Science 259:1288 (1993)) reportaron recientemente la slntesis de un haz tricatenario de helice a en el cual las helices corren hacia arriba-hacia arriba-hacia abajo. Sus estudios confirmaron que la energla hidrofoba de estabilizacion proporciona la fuerza conductora principal para la formacion de bobinas en espiral a partir de monomeros helicoidales. Estos estudios tambien indican que las interacciones electrostaticas contribuyen a la estequiometrla y a la geometrla de las bobinas en espiral. Una discusion adicional sobre la estructura de los cierres de leucina se encuentra en (Harbury y colaboradores, Science, 262:1401 (26 de noviembre de 1993)).

Ejemplos de dominios de cierre de leucina adecuados para producir protelnas oligomericas adecuadas se describen en la solicitud PCT WO 94/10308, y el cierre de leucina derivado de la protelna D tensoactiva del pulmon (SPD) descrita en (Hoppe y colaboradores, FEBS Letters, 344:191 (1994)). El uso de un cierre modificado de leucina que permita una trimerizacion estable de una protelna heterologa fusionada a ella es descrito en (Fanslow y colaboradores, Semin. Immunol., 6:267-278 (1994)). Las protelnas recombinantes de fusion que contienen un polipeptido soluble fusionado a un peptido de cierre de leucina se expresan en celulas huesped adecuadas, y el oligomero soluble que forma se recupera a partir del sobrenadante del cultivo.

Ciertas fracciones de cierre de leucina forman preferencialmente trlmeros. Un ejemplo es un cierre de leucina derivado de la protelna D tensoactiva del pulmon (SPD), como se describe en (Hoppe y colaboradores, FEBS

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Letters, 344:191 (1994)) y en la patente estadounidense No. 5.716.805. Este peptido de cierre de leucina derivado de la SPD del pulmon contiene la secuencia de aminoacidos Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gin Gln Val Glu Ala Leu Gin Gly Gin Val Gin His Leu Gin Ala Ala Phe Ser Gin Tyr (SEQ ID NO: 4).

Otro ejemplo de un cierre de leucina que promueve la trimerizacion es un peptido que contiene la secuencia de aminoacidos Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg, (SEQ ID NO: 5), como se describe en la patente estadounidense No. 5.716.805. En una realizacion alternativa, se anade un residuo de Asp N-terminal; en otra, el peptido carece del residuo de Arg N- terminal.

Se pueden emplear tambien fragmentos de los anteriores peptidos de cierre que retienen la propiedad de promover la oligomerizacion. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, peptidos que carecen de uno o dos de los residuos N-terminales o C-terminales presentes en las anteriores secuencias de aminoacidos. Los cierres de leucina se pueden derivar a partir de los peptidos de cierre de leucina de ocurrencia natural, por ejemplo, a traves de sustitucion(es) conservativa(s) en la secuencia nativa de aminoacidos, en donde se retiene la capacidad del peptido para promover oligomerizacion.

Se pueden emplear otros peptidos derivados de protelnas trimericas de ocurrencia natural en la preparation de oligomeros trimericos. Alternativamente, se pueden emplear peptidos sinteticos que promueven la oligomerizacion. En realizaciones particulares, los residuos de leucina en una fraction de cierre de leucina se reemplazan por residuos de isoleucina. Tales peptidos que contienen isoleucina pueden denominarse como cierres de isoleucina, pero estan abarcados por el termino “cierres de leucina” como se los emplea aqul.

Production de polipeptidos y de fragmentos de los mismos

La expresion, aislamiento y purification de los polipeptidos y fragmentos de la invention se puede lograr por medio de cualquier tecnica adecuada, incluyendo, pero sin limitarse a las siguientes:

Sistemas de expresion

La presente invencion tambien provee donation recombinante y vectores de expresion que contienen ADN, as! como celulas que contienen los vectores recombinantes. Los vectores de expresion que contienen ADN se pueden utilizar para preparar a los polipeptidos o fragmentos de la invencion codificados por el ADN. Un metodo para producir polipeptidos comprende el cultivo de celulas huesped transformadas con un vector de expresion recombinante que codifica al polipeptido, bajo condiciones que promueven la expresion del polipeptido, recuperando luego al polipeptido expresado del cultivo. El operario calificado reconocera que el procedimiento para purificar a los polipeptidos expresados variara de acuerdo a factores tales como el tipo de celulas huesped empleadas, y si el polipeptido esta enlazado a la membrana o es una forma soluble que es segregada a partir de la celula huesped.

Se puede emplear cualquier sistema de expresion adecuado. Los vectores incluyen un ADN que codifica un polipeptido o fragmento de la invencion, operativamente enlazado a secuencias adecuadas de nucleotidos reguladoras de trascripcion o de traduction, tales como aquellas derivadas de un gen de mamlfero, microbiano, viral o de insecto. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores trascripcionales, operadores, o reforzadores, un sitio de enlazamiento ribosomal de ARNm, y secuencias apropiadas que controlan la initiation y la termination de la trascripcion y de la traduccion. Las secuencias de nucleotidos estan operativamente enlazadas cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de ADN. Por lo tanto, una secuencia de nucleotidos promotora esta operativamente enlazada a una secuencia de ADN si la secuencia de nucleotidos promotora controla la trascripcion de la secuencia de ADN. Un origen de replication que confiere la habilidad de replicarse en las celulas huesped deseadas, y un gen de selection por medio del cual se identifican los transformantes, generalmente se incorporan dentro del vector de expresion.

Ademas, se puede incorporar una secuencia que codifique a un peptido senal apropiado (nativo o heterologo) dentro de los vectores de expresion. Una secuencia de ADN para un peptido senal (llder secretor) se puede fusionar en el marco a la secuencia de acido nucleico de la invencion para que el ADN sea inicialmente trascrito, y el ARNm traducido, en una protelna de fusion que contiene al peptido senal. Un peptido senal que es funcional en las celulas huesped deseadas promueve la secretion extracelular del polipeptido. El peptido senal se escinde del polipeptido por secrecion del polipeptido de la celula.

El operario capacitado reconocera tambien que la(s) posicion(es) en la(s) cual(es) se escinde el peptido senal puede(n) diferir de aquella(s) predicha(s) por medio del programa de computador, y puede variar de acuerdo a factores tales como el tipo de celulas huesped empleadas en la expresion de un polipeptido recombinante. Una preparacion de protelna puede incluir una mezcla de moleculas de protelna que tienen diferentes aminoacidos N- terminales, que resultan de la escision del peptido senal en mas de un sitio. Las realizaciones particulares de

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protelnas maduras suministradas aqul incluyen, pero no se limitan a, protelnas que tienen el residuo en la posicion 16, 29, 35, 95 o 117 de la SEQ ID nO: 2, como el aminoacido N-terminal.

Las celulas huesped adecuadas para la expresion de polipeptidos incluyen celulas procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Se prefieren generalmente celulas de mamlfero o de insecto para ser utilizadas como celulas huesped. Se describen vectores apropiados de clonacion y de expresion para ser utilizados con huespedes celulares bacterianos, de hongos, levaduras y de mamlferos, por ejemplo, en (Pouwels y colaboradores, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)). Tambien se podrlan emplear sistemas de traduccion libres de celulas para producir polipeptidos utilizando los ARN derivados de construcciones de ADN divulgadas aqul.

Sistemas procariotas

Los procariotas incluyen organismos gram-negativos y gram-positivos. Las celulas huesped procariotas adecuadas para transformacion incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y varias otras especies dentro del genero Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. En una celula huesped procariota, tal como E. coli, un polipeptido puede incluir un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresion del polipeptido recombinante en la celula huesped procariota. La Met N-terminal se puede escindir a partir del polipeptido recombinante expresado.

Los vectores de expresion para ser usados en celulas huesped procariotas generalmente contienen uno o mas gene marcadores seleccionables fenotlpicos. Un gen marcado seleccionable fenotlpico es, por ejemplo, un gen que codifica una protelna que confiere resistencia antibiotica o que suple un requerimiento autotrofico. Los ejemplos de vectores de expresion utiles para celulas huesped procariotas incluyen a aquellos derivados de plasmidos comercialmente disponibles tales como el vector de clonacion pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contiene genes para resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y de esta forma proveen un medio simple para identificar celulas transformadas. Un promotor apropiado y una secuencia de aDn se insertan dentro del vector pBR322. Otros vectores comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, Estados Unidos de America).

Las secuencias promotoras comunmente utilizadas por los vectores de expresion de celulas huesped procariotas recombinantes incluyen p-lactamasa (penicilinasa), un sistema promotor de lactosa (Chang y colaboradores, Nature 275:615 (1978); y (Goeddel y colaboradores, Nature 281:544 (1979)), sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel y colaboradores, Nucl. Acids Res. 8:4057 (1980); y EP-A-36776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412 (1982)). Un sistema de expresion particularmente util de celula huesped procariota emplea un promotor APl de fago y una secuencia represora termolabil cI857ts. Los vectores plasmidos disponibles en la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor APl incluyen al plasmido pHUB2 (residente en la cepa JMB9 de E. coli, ATCC 37092) y al plasmido pPLc28 (residente en la cepa RR1 de E. coli, ATCC 53082).

Sistemas de levadura

Alternativamente, los polipeptidos se pueden expresar en celulas huesped de levadura, preferiblemente del genero Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). Tambien se pueden emplear otros generos de levadura, tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levadura contendran a menudo un origen de secuencia de replicacion de un plasmido de levadura 2p, una secuencia de replicacion autonoma (ARS), una region promotora, secuencias para poliadenilacion, secuencias para termination de la trascripcion, y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para metalotioneina, 3- fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y colaboradores, J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)) u otras enzimas glicollticas (Hess y colaboradores, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968)); y (Holland y colaboradores, Biochem. 17:4900 (1978)), tal como enolasa, gliceraldehldo-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para ser usados en la expresion de levadura se describen adicionalmente en (Hitzeman, EPA-73,657). Otra alternativa es el promotor ADH2 represor de glucosa descrito por (Russell y colaboradores, J. Biol. Chem. 258:2674 (1982)) y (Beier y colaboradores, Nature 300:724 (1982)). Los vectores lanzadera replicables tanto en levadura como en E. coli se pueden construir por medio de la insertion de secuencias de ADN de pBR322 por selection y replicacion en E. coli (gen Amp' y origen de replicacion) dentro de los vectores de levadura anteriormente descritos.

La secuencia llder del factor a de levadura se puede emplear para dirigir la secretion del polipeptido. La secuencia llder del factor a se inserta a menudo entre la secuencia promotora y la secuencia estructural del gen. Ver, por ejemplo, (Kurjan y colaboradores, Cell 30:933 (1982)) y (Bitter y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330 (1984)). Otras secuencias llder adecuadas para facilitar la secrecion de polipeptidos recombinantes a partir de huespedes de levadura son conocidas por aquellos capacitados en el arte. Una Secuencia llder se puede modificar cerca de su extremo 3' para contener uno o mas sitios de restriction. Esto facilitara la fusion de la Secuencia llder al gen estructural.

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Los protocolos de transformacion de la levadura son conocidos por aquellos capacitados en el arte. Uno de tales protocolos es descrito por (Hinnen y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929 (1978)). El protocolo de Hinnen y colaboradores selecciona a los transformantes de Trp+ en un medio selectivo, donde el medio selectivo consta de 0,67% de base nitrogenada de levadura, 0,5% de acidos casamino, 2% de glucosa, 10 mg/ml de adenina y 20 mg/ml de uracilo.

Se pueden desarrollar celulas huesped de levadura, transformadas por medio de vectores que contienen una secuencia promotora ADH2, para inducir la expresion en un medio “rico”. Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste de 1% de extracto de levadura, 2% de peptona, y 1% de glucosa, suplementado con 80 mg/ml de adenina y 80 mg/ml de uracilo. La desrepresion del promotor ADH2 ocurre cuando se agota la glucosa del medio.

Sistemas de mamlfero o de insecto

Los sistemas de cultivo de celulas huesped de mamlfero o de insecto se pueden emplear tambien para expresar polipeptidos recombinantes. Los sistemas de Baculovirus para la produccion de protelnas heterologas en celulas de insectos son revisados por (Luckow y Summers, Bio/Technology, 6:47 (1988)). Tambien se pueden emplear llneas celulares establecidas de origen mamlfero. Los ejemplos de llneas de celulas huesped adecuadas de mamlfero incluyen a la llnea COS-7 de celulas de rinon de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y colaboradores, Cell 23:175 (1981)), celulas L, celulas C127, celulas 3T3 (ATCC CcL 163), celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas HeLa, y llneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y a la llnea celular CV1/EBNA derivada de la llnea de celulas CV1 de rinon de mono verde del Africa (ATCC CCL 70) como lo describen (McMahan y colaboradores, EMBO J., 10: 2821 (1991)).

Los metodos establecidos para introducir ADN en celulas de mamlfero han sido descritos (Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, paginas 15-69 (1990)). Se pueden utilizar protocolos adicionales utilizando reactivos comercialmente disponibles, tales como el reactivo llpido Lipofectamina (Gibco/BRL) o el reactivo llpido Lipofectamina-Plus, para transfectar celulas (Felgner y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987)). Ademas, se puede utilizar electroporacion para transfectar celulas de mamlfero utilizando procedimientos convencionales, tales como aquellos en (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). La selection de transformantes estables se puede llevar a cabo utilizando metodos conocidos en el arte, tales como, por ejemplo, la resistencia a drogas citotoxicas. (Kaufman y colaboradores, Meth. in Enzymology 185:487-511 (1990)), describen varios esquemas de seleccion, tales como la resistencia a la dihidrofolato reductasa (DHFR). Una cepa huesped adecuada para la seleccion de la DHFR puede ser la cepa DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 (1980)). Se puede introducir un plasmido que expresa al ADNc de la DHFR dentro de la cepa DX-B11, y unicamente pueden crecer las celulas que contienen al plasmido en el medio selectivo apropiado. Se pueden incorporar otros ejemplos de marcadores seleccionables dentro de un vector de expresion que incluye los ADNc que confieren resistencia a antibioticos, tales como G418 e higromicina B. Se pueden seleccionar celulas que hospedan al vector con base en la resistencia de estos compuestos.

Las secuencias de control transcripcional y de traduction para los vectores de expresion de celulas huesped de mamlfero se pueden cortar de los genomas virales. Las secuencias promotoras y las secuencias reforzadoras comunmente utilizadas se derivan del virus polioma, del adenovirus 2, del virus simio 40 (SV40), y de citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, el promotor de origen, temprano y tardlo de SV40, los sitios de refuerzo, de empalme, y de poliadenilacion se pueden utilizar para proveer otros elementos geneticos para expresion de una secuencia genica estructural en una celula huesped de mamlfero. Los promotores virales temprano y tardlo son particularmente utiles ya que ambos se obtienen facilmente a partir de un genoma viral como un fragmento, que puede contener tambien un origen viral de replication (Fiers y colaboradores, Nature 273:113 (1978)); (Kaufman, Meth. en Enzymology (1990)). Tambien se pueden utilizar fragmentos mayores y menores de SV40, con tal de que se incluya la Secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I localizado en el origen viral SV40 del sitio de replicacion.

Secuencias adicionales de control que muestran que mejoran la expresion de genes heterologos de vectores de expresion de mamlferos incluyen elementos tales como el elemento de la secuencia que aumenta la expresion (EASE) derivado de celulas CHO (Morris y colaboradores, Animal Cell Technology, paginas 529-534 y la Solicitud PCT WO 97/25420 (1997)) y el llder tripartita (TPL) y los ARN del gen VA del Adenovirus 2 (Gingeras y colaboradores, J. Biol. Chem. 257:13475-13491 (1982)). Las secuencias internas del sitio de entrada del ribosoma (IRES) de origen viral permiten que los ARNm dicistronicos sean traducidos eficientemente (Oh y Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300 (1993)); (Ramesh y colaboradores, Nucleic Acids Research 24:2697-2700 (1996)). La expresion de un ADNc heterologo como parte de un ARNm dicistronico seguido por el gen para un marcador seleccionable (por ejemplo DHFR) ha mostrado que mejora la transfectabilidad del huesped y la expresion del ADNc heterologo (Kaufman, Meth. en Enzymology (1990)). Ejemplos de vectores de expresion que emplean los ARNm dicistronicos son pTR-DC/GFP descritos por (Mosser y colaboradores, Biotechniques 22:150161 (1997)), y p2A5I descrito por (Morris y colaboradores, Animal Cell Technology, paginas 529-534 (1997)).

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Un vector util de expresion alta, pCAVNOT, ha sido descrita por (Mosley y colaboradores, Cell 59:335-348 (1989)). Se pueden construir otros vectores de expresion para uso en celulas huesped de mamlfero como lo divulgaron (Okayama y Berg, Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)). Un sistema util para expresion estable de alto nivel de los ADNc de mamlfero en celulas epiteliales mamarias murinas C127 se pueden construir sustancialmente como lo describen (Cosman y colaboradores, Mol. Immunol. 23:935 (1986)). Un vector util de expresion alta, PMLSV N1/N4, descrito por (Cosman y colaboradores, Nature 312:768 (1984)), ha sido depositado como ATCC 39890. Vectores adicionales utiles de expresion de mamlfero se describen en EP-A-0367566, y en WO 91/18982. En aun otra realization alternativa, los vectores se pueden derivar de retrovirus.

Se puede utilizar otro vector util de expresion, pFLAG®. La tecnologla con FLAG® se centra en la fusion de un peptido marcador FLAG®, hidrofobo, de bajo peso molecular (1kD), con el N-terminal de una protelna recombinante expresada por los vectores de expresion pFLAG®. pDC311 es otro vector especializado utilizado para expresion de protelnas en celulas CHO. pDC311 se caracteriza por una secuencia bicistronica que contiene el gen de interes y un gen para la dihidrofolato reductasa (DHFR) con un sitio interno de enlazamiento al ribosoma para la traduction de la DHFR, un elemento de la secuencia para aumento de la expresion (EASE), el promotor CMV humano, una secuencia llder tripartita, y un sitio de poliadenilacion.

Con relation a los peptidos senal que pueden ser empleados, el peptido senal nativo se puede reemplazar por un peptido senal heterologo o una secuencia llder, si se desea. La escogencia de un peptido senal o llder puede depender de factores tales como el tipo de celulas huesped en las cuales se va a producir el polipeptido recombinante. Para ilustracion, los ejemplos de peptidos senal heterologos que son funcionales en celulas huesped de mamlfero incluyen la secuencia senal para la interleuquina-7 (IL-7) descrita en la patente estadounidense No. 4.965.195; la secuencia senal para el receptor de interleuquina-2 receptor descrita en (Cosman y colaboradores, Nature 312:768 (1984)); el peptido senal del receptor de interleuquina-4 descrito en EP 367.566; el peptido senal tipo I del receptor de interleuquina-4 descrito en la patente estadounidense No. 4.968.607; y el peptido senal tipo II del receptor de interleuquina-1 descrito en EP 460.846.

Purification

La invention tambien incluye metodos de aislamiento y purificacion de los polipeptidos y fragmentos de los mismos. Aislamiento y purificacion

Los polipeptidos “aislados” o fragmentos de los mismos abarcados por esta invencion son polipeptidos o fragmentos que no estan en un ambiente identico al ambiente en el cual el o ellos se pueden encontrar en la naturaleza. Los polipeptidos o los fragmentos de los mismos “purificados” abarcados por esta invencion son esencialmente libres de asociarse con otras protelnas o polipeptidos, por ejemplo, como un producto de purificacion de sistemas de expresion recombinante tal como aquellos descritos anteriormente o como un producto purificado a partir de una fuente no recombinante tal como las celulas y/o los tejidos que se presentan en forma natural.

En una realizacion preferida, la purificacion de los polipeptidos o fragmentos recombinantes se puede lograr utilizando fusiones de polipeptidos o de fragmentos de la invencion con otro polipeptido para ayudar en la purificacion de los polipeptidos o los fragmentos de la invencion. Tales companeros de fusion pueden incluir al poli- His o a otros peptidos antigenicos de identification descritos anteriormente as! como a las fracciones de Fc descritas previamente.

Con respecto a cualquier tipo de celula huesped, como lo sabe un operario calificado, los procedimientos para purificacion de un polipeptido o fragmento recombinante variara de acuerdo a factores tales como el tipo de celulas huesped empleadas y si el polipeptido o fragmente recombinante es secretado dentro del medio de cultivo o no.

En general, el polipeptido o fragmento recombinante se pueden aislar de las celulas huesped si no son secretados, o del medio o sobrenadante si son solubles y secretados, seguida por una o mas etapas de concentration, desestabilizacion salina, intercambio ionico, interaction hidrofoba, cromatografla de purificacion por afinidad o de exclusion por tamano. Como formas especlficas para realizar estas etapas, se puede concentrar primero el medio de cultivo utilizando un filtro para concentracion de protelna comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltracion Pellicon de Amicon o de Millipore. Despues de la etapa de concentracion, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificacion tal como un medio de filtration por gel. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio anionico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) en su estructura. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comunmente empleados en la purificacion de protelnas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio cationico. Los intercambiadores cationicos adecuados incluyen diferentes matrices insolubles que contienen grupos sulfopropilo o carboximetilo. Ademas, se puede emplear una etapa cromatoenfoque. Alternativamente, se puede emplear una etapa de cromatografla de interaccion hidrofoba. Las matrices adecuadas pueden ser fracciones fenilo u octilo enlazadas a resinas. Ademas, se puede emplear cromatografla de afinidad con una matriz que selectivamente

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enlaza a la protelna recombinante. Ejemplos de tales resinas empleadas para columnas de lectina, columnas de coloracion, y columnas de quelacion metalica. Finalmente, se pueden emplear una o mas etapas de cromatografla llquida de alto rendimiento en fase reversa (RP-HPLC) que emplean un medio hidrofobo para RP-HPLC, (por ejemplo, gel de sllice o una resina polimerica que tienen grupos metilo, octilo, octildecilo u otros grupos alifaticos en su estructura) para purificar adicionalmente los polipeptidos. Algunas o todas las etapas de purificacion anteriores, en diferentes combinaciones, son bien conocidas y pueden ser empleadas para proveer una protelna recombinante aislada y purificada.

Tambien es posible utilizar cualquier columna de afinidad que contenga una protelna para enlazamiento del polipeptido de la invencion, tal como un anticuerpo monoclonal generado contra polipeptidos de la invencion, para polipeptidos expresados por purificacion por afinidad. Estos polipeptidos se pueden remover de una columna de afinidad utilizando tecnicas convencionales, por ejemplo, en un amortiguador de elusion de alta concentracion salina, y luego dializados en un amortiguador para uso de concentracion salina mas baja o por medio del cambio del pH o de otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada, o ser completamente removidos utilizando el sustrato de ocurrencia natural de la fraccion de afinidad, tal como un polipeptido derivado de la invencion.

En este aspecto de la invencion, las protelnas para enlazamiento del polipeptido tal como los anticuerpos anti polipeptido de la invencion u otras protelnas que pueden interactuar con el polipeptido de la invencion, se pueden enlazar a un soporte en fase solida tal como una matriz para cromatografla en columna o un sustrato similar adecuado para identificar, separar, o purificar celulas que expresan polipeptidos de la invencion sobre su superficie. La adherencia de las protelnas para enlazamiento del polipeptido de la invencion a una superficie de contacto en fase solida se pude lograr por cualquier medio, por ejemplo, las microesferas magneticas se pueden recubrir con estas protelnas para enlazamiento del peptido y mantenerlas en el vaso de incubacion a traves de un campo magnetico. Las suspensiones de mezclas de celulas se ponen en contacto con la fase solida que tiene tales protelnas de enlazamiento del polipeptido sobre ella. Las celulas que tienen a los polipeptidos de la invencion sobre su superficie enlazados a la protelna fijada para enlazamiento del polipeptido y luego se retiran por medio de lavado las celulas no enlazadas. Este metodo de enlazamiento por afinidad es util para la purificacion, el tamizado, o la separacion de tales celulas que expresan al polipeptido de la solucion. Los metodos de liberacion de las celulas seleccionadas positivamente a partir de la fase solida son conocidos en el arte y abarcan, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas son preferiblemente no toxicas y no lesionan a las celulas, y estan preferiblemente dirigidas a la escision del companero de enlazamiento sobre la superficie de la celula.

Alternativamente, se pueden incubar primero las mezclas de celulas que se sospecha que contienen celulas que expresan al polipeptido de la invencion con una protelna biotinilada para enlazamiento del polipeptido de la invencion. Los perlodos de incubacion son tlpicamente al menos de una hora de duracion para garantizar un enlazamiento suficiente para los polipeptidos de la invencion. La mezcla resultante es pasada luego a traves de una columna empacada con perlas recubiertas de avidina por lo cual la alta afinidad de la biotina por la avidina provee el enlazamiento de las celulas para enlazamiento del polipeptido a las perlas. El uso de perlas recubiertas de avidina es conocido en el arte. Ver (Berenson y colaboradores, J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986)). El lavado del material no enlazado y la liberacion de las celulas enlazadas se lleva a cabo utilizando metodos convencionales.

El grado deseado de pureza depende del uso que se le pretenda dar a la protelna. Se desea un grado relativamente alto de pureza cuando el polipeptido va a ser administrado in vivo, por ejemplo. En tal caso, se purifican los polipeptidos de tal manera que no sean detectables las bandas de protelna correspondientes a otras protelnas despues del analisis por medio de electroforesis en gel de acrilamida-SDS (SDS-PAGE). Alguien capacitado en el campo pertinente reconocera que se pueden visualizar multiples bandas correspondientes al polipeptido por medio de SDS-PAGE, debido a glicosilacion diferencial, a procesamiento postraduccional diferencial, y similares. Mas preferiblemente, el polipeptido de la invencion se purifica hasta homogeneidad sustancial, como se indica por medio de una banda unica de protelna por medio de analisis SDS-PAGE. La banda de protelna se pude visualizar por medio de coloracion con plata, coloracion con azul de Coomassie, o (su la protelna esta radiomarcada) por medio de autoradiografla.

Ensayos

Los polipeptidos preferidos de la invencion (incluidas protelnas, polipeptidos, fragmentos, variantes, oligomeros, y otras formas) pueden ser analizados por la capacidad para enlazar receptores de TSLP en cualquier analisis adecuado, tal como un ensayo de enlazamiento convencional. Para ilustracion el polipeptido puede ser marcado con un reactivo detectable (por ejemplo, un radionuclido, un cromoforo, una enzima que catalice una reaccion colorimetrico o fluorometrica, y similares). El polipeptido marcado se pone en contacto con celulas que expresen a los receptores de TSLP. Se lavan entonces las celulas para remover al polipeptido marcado no enlazado, y se determina la presencia de marcadores enlazados a las celulas por medio de una tecnica adecuada, escogida de acuerdo con la naturaleza del marcador.

Un ejemplo de un procedimiento de ensayo de enlazamiento es el siguiente. Se construye un vector de expresion recombinante que contiene ADNc de TSLp por medio de metodos conocidos en el arte. El receptor de TSLP de

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raton contiene un dominio extracelular N-terminal, una region transmembrana, y un dominio citoplasmatico C- terminal. Se transfectan celulas CV1-EBNA-1 en placas de 10 cm2 con el vector de expresion recombinante. Las celulas CV1-EBNA-1 (ATCC CRL 10478) expresan constitutivamente al antlgeno-1 nuclear EBV dirigido desde el promotor/reforzador temprano-inmediato de CMV. CV1-EBNA-1 se derivo de la llnea celular CV-1 (ATCC CCL 70) de rinon de Mono Verde Africano, como lo describieron (McMahan y colaboradores, EMBO. J. 10:2821 (1991)).

Las celulas transfectadas se cultivan durante 24 horas, y luego se dividen las celulas en cada placa en una placa de 24 pozos. Despues de cultivar durante 48 horas adicionales, se lavan las celulas transfectadas (aproximadamente 4 x 104 celulas/pozo) con BM-NFDM, que es un medio de enlazamiento (RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albumina de suero bovino, 2 mg/ml de azida de sodio, Hepes 20 mM pH 7,2) a los cuales se les ha anadido 50 mg/ml de leche seca libre de grasa. Se incuban liego las celulas durante 1 hora a 37°C con diferentes concentraciones de, por ejemplo, un polipeptido soluble/una protelna de fusion Fc elaborados como se expuso anteriormente. Se lavan entonces las celulas y se incuban con una concentracion de saturacion constante de una IgG antihumana de raton-125I en medio de enlazamiento, con agitacion suave durante 1 hora a 37°C. Despues de un extensivo lavado, se liberan las celulas a traves de tripsinizacion.

La IgG antihumana de raton empleada anteriormente se dirige contra la region Fc de IgG humana y se puede obtener de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. Se marca en forma radioactiva al anticuerpo utilizando el metodo estandar de la cloramina-T. El anticuerpo se enlazara a la porcion de Fc de cualquier polipeptido/protelna de Fcque se haya enlazado a las celulas. En todos los ensayos, se analiza el enlazamiento no especlfico de anticuerpo-125I en ausencia de la protelna de fusion Fc/Fc, as! como en presencia de la protelna de fusion Fc y un exceso molar de 200 veces del anticuerpo IgG antihumano de raton no marcado.

Se cuantifica el anticuerpo-125I enlazado a la celula sobre un contador Packard Autogamma. Los calculos de afinidad (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660 (1949)) se generan sobre RS/1 (BBN Software, Boston, MA) que corre sobre un computador Microvax.

Otro tipo de ensayo adecuado de enlazamiento es un ensayo de enlazamiento competitivo. Para ilustrarlo, se pude determinar la actividad biologica de una variante evaluando la habilidad de la variante para competir con la protelna nativa por el enlazamiento a los receptores de TSLP.

Los ensayos de enlazamiento competitivo se pueden llevar a cabo por medio de metodologla convencional. Los reactivos que se pueden emplear en los ensayos de enlazamiento competitivo incluyen a la TSLP marcada en forma radioactiva y a celulas intactas que expresan a los receptores de TSLP (endogenos o recombinantes) sobre la superficie de la celula. Por ejemplo, se puede utilizar un fragmento soluble marcado en forma radioactiva de TSLP para competir con una variante soluble de TSLP por el enlazamiento a los receptores de TSLP de la superficie de la celula. En vez de celulas intactas, se podrla sustituir un receptor soluble de TSLP/protelna de fusion Fc enlazada a una fase solida a traves de la interaccion de la Protelna A o de la Protelna G (sobre la fase solida) con la fraccion Fc. Las columnas cromatograficas que contienen Protelna A y Protelna G incluyen a aquellas disponibles con Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ.

Otro tipo de ensayo de enlazamiento competitivo utiliza al receptor soluble de TSLP, tal como un receptor soluble de TSLP/protelna de fusion, y celulas intactas que expresan un receptor endogeno o recombinante de TSLP. El receptor marcado en forma radiactiva de TSLP puede ser utilizado para competir con el receptor de TSLP enlazado a la membrana para TSLP soluble. Los resultados cuantitativos se pueden obtener por medio de ensayos de enlazamiento competitivo en placa autorradiografica, mientras que se pueden utilizar graficas Scatchard (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660 (1949)) para generar resultados cuantitativos.

Uso del acido nucleico o de los oligonucleotidos de la TSLP humana

Ademas de ser utilizados para expresar polipeptidos como se describio anteriormente, se pueden utilizar los acidos nucleicos de la invention, incluidos ADN, ARN, ARNm y los oligonucleotidos de los mismos:

- como sondas para identificar al acido nucleico que codifica a las protelnas que tienen la capacidad de inducir la proliferation de celulas de linaje B o de linaje T;

- para identificar al cromosoma humano numero 5;

- para cartografiar genes sobre el cromosoma humano numero 5;

- para identificar a los genes asociados con ciertas enfermedades, slndromes, u otras condiciones asociadas con el cromosoma humano numero 5;

- como oligonucleotidos monocatenarios sentido o antisentido, para inhibir la expresion del polipeptido codificado por el gen de TSLP;

- para ayudar a detectar a los genes defectuosos en un individuo; y

- para terapia genica.

5 Sondas

Entre los usos de los acidos nucleicos esta el uso de fragmentos como sondas o iniciadores. Tales fermentos generalmente contienen al menos aproximadamente 17 nucleotidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras realizaciones, un fragmento de ADN contiene al menos 30, o al menos 60, nucleotidos contiguos de una secuencia de ADN.

10 Debido a que se contemplan aqul homologos de la SEQ ID NO: 1, de otras especies de mamlferos, se pueden

utilizar sondas basadas en la secuencia de ADN humano de la SEQ ID NO: 1 para seleccionar las bibliotecas de ADNc derivadas de otras especies de mamlferos, utilizando tecnicas convencionales de hibridacion cruzada entre especies.

Utilizando el conocimiento del codigo genetico en combinacion con las secuencias de aminoacidos expuestas 15 anteriormente, se pueden preparar juegos de oligonucleotidos degenerados. Tales oligonucleotidos son utiles como iniciadores, por ejemplo, en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), por medio de las cuales se alslan y amplifican fragmentos de ADN.

Cartografla del cromosoma

Todos o una porcion de los acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 1, incluidos los oligonucleotidos, pueden ser 20 utilizados por aquellos capacitados en el arte utilizando tecnicas conocidas para identificar al cromosoma humano 5,

y al locus especlfico del mismo, que puede contener al ADN de otros miembros de la familia de TSLP. Las tecnicas

utiles incluyen, pero no se limitan a, utilizar la secuencia o porciones, incluidos los oligonucleotidos, como una sonda en diferentes tecnicas conocidas tales como la cartografla del hlbrido por radiacion (alta resolucion), hibridacion in situ para extensiones del cromosoma (resolucion moderada), hibridacion de transferencia de Southern para llneas 25 celulares hibridas que contienen cromosomas humanos individuales (baja resolucion).

Por ejemplo, los cromosomas se pueden cartografiar por medio del uso de PCR e hibridacion por radiacion. La PCR se lleva a cabo utilizando el panel del Center for Genome Research Genebridge4 del Whitehead Institute/MIT de 93 hlbridos por radiacion (
http://www.genome.wi.mit.

edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/rhmap/genebridge4.html). Se utilizan los iniciadores que caen 30 dentro de un exon putativo, a traves de un intron, o a traves de un fragmento intron-exon del gen de interes y que amplifican a un producto del ADN genomico humano, pero no amplifican, por ejemplo, al ADN genomico del hamster de control. Los resultados de los PCR se convierten en un vector de datos que se somete al sitio de Cartografiado por Radiacion en el Whitehead/MIT en Internet (
http://www.seq.wi.mit.edu). Se anotan los datos y se provee la asignacion cromosomica y la ubicacion relativa para los marcadores conocidos del Sequence Tag Site (STS) sobre 35 el mapa del hlbrido por radiacion. El siguiente sitio web proporciona informacion adicional acerca del mapeo del hlbrido por radiacion: (
http://www.genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/ 07-

97.INTRO.html).

Identification de enfermedades asociadas

Como se expone mas adelante, se ha cartografiado la SEQ ID NO: 1 para la region q21-q22 del cromosoma 5 por 40 medio de analisis sintenico del gen de murino. De este modo, alguien capacitado en el arte puede utilizar el acido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento del mismo utilizando tecnicas conocidas para analizar las anormalidades asociadas con el cromosoma humano numero 5 y, en particular, con la region q21-q22 del cromosoma numero 5, incluido el slndrome de Gardner, poliposis coli adenomatosa, enfermedad desmoide hereditaria, slndrome de Turcot, y cancer colorectal. Esto permite distinguir las condiciones en las cuales este 45 marcador es reordenado o suprimido. Ademas, se pueden utilizar nucleotidos de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de los mismos como un marcador de position para cartografiar otros genes de ubicacion desconocida.

Se puede utilizar el ADN en el desarrollo de tratamientos para cualquier trastorno mediado (directa o indirectamente) por cantidades deficientes o insuficientes de los genes correspondientes a los acidos nucleicos de la invention. La divulgation que se hace aqul de las secuencias nativas de nucleotidos permite la detection de genes defectuosos y 50 el remplazo de los mismos con genes normales. Los genes defectuosos se pueden detectar por medio de ensayos de diagnostico in vitro, y por medio de la comparacion de una secuencia nativa de nucleotidos divulgada aqul con aquella de un gen derivado de una persona de la que se sospecha que alberga un defecto en este gen.

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Sentido-Antisentido

Otros fragmentos utiles de los acidos nucleicos incluyen oligonucleotidos sentido o antisentido que contienen una secuencia monocatenaria de acido nucleico (ya sea ARN o ADN) capaz de enlazarse a secuencias objetivo de ARNm (sentido) o de ADN (antisentido). Los oligonucleotidos sentido o antisentido, de acuerdo con la presente invencion, contiene un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 1). Tal fragmento generalmente contiene al menos aproximadamente 14 nucleotidos, preferiblemente aproximadamente desde 14 hasta aproximadamente 30 nucleotidos. La habilidad para derivar un oligonucleotido sentido o uno antisentido, con base en una secuencia de ADNc que codifica a una protelna dada se describe, por ejemplo en (Stein y Cohen, Cancer Res. 48:2659 (1988)) y (van der Krol y colaboradores, BioTechniques 6:958 (1988)).

El enlazamiento de oligonucleotidos sentido o antisentido a secuencias objetivo de acido nucleico resulta en la formacion de dobletes que bloquean o inhiben la expresion de la protelna por medio de una o varias formas, incluida la degradacion mejorada del ARNm por medio de ARNasaH, inhibicion del empalme, terminacion prematura de la trascripcion o de la traduccion, o por otros medios. Por lo tanto se pueden utilizar oligonucleotidos antisentido para bloquear la expresion de las protelnas. Los oligonucleotidos sentido o antisentido comprenden ademas oligonucleotidos que tienen columnas vertebrales azucar-fosfodiester modificadas (u otros enlaces por azucar, tal como aquellos descritos en WO 91/0662) y en donde tales enlaces de azucar son resistentes a las nucleasas endogenas. Tales oligonucleotidos con enlaces de azucar resistentes son estables in vivo (esto es, capaces de resistir degradacion enzimatica) pero retienen la especificidad de la secuencia que es capaz de enlazarse a secuencias de nucleotidos objetivo.

Otros ejemplos de oligonucleotidos sentido o antisentido incluyen a aquellos oligonucleotidos que estan covalentemente enlazados a fracciones organicas, tales como aquellas descritas en WO 90/10448, y otras fracciones que incrementan la afinidad del oligonucleotido por una secuencia de acido nucleico objetivo, tal como poli-(L-lisina). Aun mas, agentes de intercalacion, tales como la elipticina, y agentes de alquilacion o complejos metalicos se pueden unir a oligonucleotidos sentido o antisentido para modificar la especificidad de enlazamiento del oligonucleotido sentido o antisentido para la secuencia nucleotida objetivo.

Se pueden introducir oligonucleotidos sentido o antisentido en una celula que contiene la secuencia objetivo de acido nucleico por medio de cualquier metodo de transferencia genica, incluida, por ejemplo, lipofeccion, transfeccion de ADN mediada por CaPO4, electroporacion, o por medio del uso de vectores para transferencia genica tales como el virus de Epstein-Barr.

Tambien se pueden introducir oligonucleotidos sentido o antisentido dentro de una celula que contiene la secuencia de nucleotidos objetivo por medio de la formacion de un conjugado con una molecula de enlazamiento al ligando, como se describe en WO 91/04753. Las moleculas adecuadas de enlazamiento al ligando incluyen, pero no se limitan a, receptores en la superficie de la celula, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se enlazan a receptores en la superficie de la celula. Preferiblemente, la conjugacion de la molecula de enlazamiento no interfiere sustancialmente con la habilidad de la molecula de enlazamiento al ligando para enlazarse a su correspondiente molecula o receptor, o para bloquear la entrada del oligonucleotido sentido o antisentido o su version conjugada dentro de la celula.

Alternativamente, se puede introducir un oligonucleotido sentido o uno antisentido en una celula que contiene a la secuencia de acido nucleico objetivo por medio de la formacion de un complejo oligonucleotido-llpido, como el descrito en WO 90/10448. El complejo oligonucleotido sentido o antisentido-llpido se disocia preferiblemente dentro de la celula por medio de una lipasa endogena.

Uso de polipeptidos de la TSLP humana y de polipeptidos fragmentados Los usos incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente:

- Purificacion de protelnas y medicion de la actividad de las mismas.

- Agentes de suministro.

- Reactivos Terapeuticos y de Investigation.

- Marcadores de peso molecular y de enfoque isoelectrico.

- Controles para fragmentation de peptidos.

- Identification de protelnas desconocidas.

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- Preparacion de Anticuerpos.

Reactivos de purification

El polipeptido de la invention encuentra uso como reactivo de purificacion de protelna. Por ejemplo, el polipeptido se puede utilizar para purificar companeros de enlazamiento de TSLP, tales como los receptores de TSLP humana. En realizaciones particulares, un polipeptido (en cualquiera de las formas descritas aqul que sea capaz de enlazar receptores de TSLP) se une a un soporte solido por medio de procedimientos convencionales. Como ejemplo, estan disponibles columnas de cromatografla de afinidad que contiene grupos funcionales que reaccionaran con grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoacidos de protelnas (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). En una alternativa, se une un polipeptido de TSLP/protelna Fc (como se discutio anteriormente), a columnas de cromatografla que contienen Protelna A o Protelna G a traves de la interaction con la fraction de Fc.

El polipeptido tambien encuentra uso en la purificacion o identification de celulas que expresan a los receptores de TSLP sobre la superficie de la celula. Los polipeptidos se enlazan a una fase solida tal como a una matriz de una columna cromatografica o a un sustrato similar adecuado, por ejemplo, se pueden recubrir microesferas magneticas con los polipeptidos y mantenerlas en un vaso de incubation a traves de un campo magnetico. Se ponen en contacto las suspensiones de mezclas de celulas que contienen a las celulas que expresan al receptor de TSLP con la fase solida que tiene a los polipeptidos sobre ella. Las celulas que expresan al receptor de TSLP sobre la superficie de la celula se enlazan a los polipeptidos fijos, y se lavan luego las celulas no enlazadas.

Alternativamente, se pueden conjugar los polipeptidos a una fraccion detectable, luego incubarlos con las celulas que van a ser analizadas por la expresion del receptor de TSLP. Despues de la incubacion, se renueve la materia marcada no enlazada y se determina la presencia o la ausencia de la fraccion detectable sobre las celulas.

En una alternativa adicional, se incuban las mezclas de celulas sospechosas de contener receptores de TSLP con polipeptidos biotinilados. Los perlodos de incubacion son tlpicamente al menos de una hora de duration para garantizar enlazamiento suficiente. Se pasa luego la mezcla resultante a traves de una columna empacada con perlas recubiertas con avidina, con lo cual la alta afinidad de la biotina por la avidina permite el enlazamiento de las celulas deseadas a las perlas. Los procedimientos para utilizar las perlas recubiertas con avidina son conocidos (ver, Berenson, y colaboradores, J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986)). El lavado para remover el material no enlazado, y la liberation de las celulas enlazadas, se lleva a cabo utilizando metodos convencionales.

Medicion de la actividad

Los polipeptidos tambien encuentran uso en la medicion de la actividad biologica de los receptores de la TSLP en terminos de su afinidad de enlazamiento. Se pueden emplear entonces los polipeptidos para aquellos estudios que conducen al “aseguramiento de la calidad”, por ejemplo, para monitorear la vida en estanterla y la estabilidad de la protelna bajo condiciones diferentes. Por ejemplo, se pueden emplear los polipeptidos en un estudio de afinidad de enlazamiento para medir la actividad biologica del receptor de TSLP que ha sido almacenado a diferentes temperaturas o producido en diferentes tipos de celulas. Tambien se pueden utilizar las protelnas para determinar si se retiene la actividad biologica despues de la modification de un receptor de TSLP (por ejemplo, modification qulmica, truncamiento, mutation, etc.). La afinidad de enlazamiento del receptor modificado de TSLP se compara con aquella de un receptor no modificado de TSLP para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones sobre la actividad biologica de los receptores de TSLP. Se puede averiguar entonces la actividad biologica de un receptor de TSLP antes de utilizarlo en un estudio de investigation, por ejemplo.

Agentes de suministro

Los polipeptidos tambien encuentran uso como portadores para agentes de suministro unidos a ellos con celulas que soportan a los receptores de TSLP. Las celulas que expresan a los receptores de TSLP incluyen a aquellas identificadas en el timo, el bazo, el rinon y la medula osea. Por lo tanto, los polipeptidos pueden ser utilizados para suministrar agentes terapeuticos o de diagnostico a tales celulas (o a otros tipos de celulas que se ha encontrado que expresan a los receptores de TSLP sobre la superficie de la celula) en procedimientos in vitro o in vivo.

Los agentes terapeuticos y detectables (de diagnostico) que se pueden unir a un polipeptido incluyen, pero no se limitan a, toxinas, otros agentes citotoxicos, drogas, radionuclidos, cromoforos, enzimas que catalizan una reaction colorimetrica o fluorometrica, y similares, siendo el agente particular escogido de acuerdo a la aplicacion pretendida. Entre las toxinas estan las toxinas ricina, abrina, de la difteria, endotoxina A d Pseudomonas aeruginosa, protelnas ribosomales inactivantes, micotoxinas tales como tricotecenes, y derivados y fragmentos (por ejemplo, cadenas sencillas) de los mismos. Los radionuclidos adecuados para uso diagnostico incluyen, pero no se limitan a, 123I, 131I, 99mTc, 111In, y 76Br. Ejemplos de radionuclidos adecuados para uso terapeutico son 131I, 211At, 77Br, 186Re, 188Re, 212Pb, 212Bi, 109Pd, 64Cu, y 67Cu.

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Tales agentes se pueden unir al polipeptido por medio de cualquier procedimiento convencional adecuado. El polipeptido contiene grupos funcionales sobre las cadenas laterales de aminoacidos que pueden reaccionar con grupos funcionales sobre un agente deseado para formar enlaces covalentes, por ejemplo. Alternativamente, se pueden derivatizar la protelna o el agente para generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La derivatizacion puede involucrar la union de uno de los reactivos bifuncionales de acoplamiento disponibles para unir diferentes moleculas a protelnas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen un gran numero de tecnicas para marcar protelnas en forma radioactiva. Metales radionuclidos se pueden unir a polipeptidos por medio del uso de un agente adecuado de quelacion bifuncional, por ejemplo.

Se preparan entonces conjugados que comprenden polipeptidos y un agente terapeutico adecuado o de diagnostico (preferiblemente covalentemente enlazado). Los conjugados se administran o bien se emplean en una cantidad apropiada para la aplicacion particular.

Agentes terapeuticos

Los polipeptidos de la invencion se pueden utilizar en el desarrollo de tratamientos para cualquier trastorno mediado (directa o indirectamente) por cantidades deficientes o insuficientes de los polipeptidos. Estos polipeptidos se pueden administrar a un mamlfero afligido con un trastorno de esta clase.

Los polipeptidos se pueden emplear tambien en la inhibicion de la actividad biologica de los receptores de TSLP en procedimientos in vitro o in vivo. Por ejemplo, se puede utilizar un polipeptido purificado o modificado o un fragmento del mismo (por ejemplo, polipeptidos modificados de TSLP que se enlazan al receptor pero que carecen de la habilidad para inducir senalizacion) para inhibir el enlazamiento de TSLP endogeno con receptores de la superficie de la celula. Se inhiben por lo tanto los efectos biologicos que resultan del enlazamiento de TSLP endogena con receptores.

Ademas, se pueden administrar polipeptidos receptores de TSLP a un mamlfero para tratar un trastorno mediado por el receptor de TSLP. Tales trastornos mediados por el receptor de TSLP incluyen condiciones causadas (directa o indirectamente) o exacerbadas por receptores de TSLP.

Las composiciones de la presente invencion pueden contener un polipeptido en cualquiera de las formas descritas aqul, tal como protelnas nativas, variantes, derivados, oligomeros, y fragmentos biologicamente activos. En realizaciones particulares, la composicion comprende un polipeptido soluble de TSLP o un oligomero comprende polipeptidos de TSLP.

Se proveen aqul composiciones que contienen una cantidad efectiva de un polipeptido de la presente invencion, en combinacion con otros componentes tal como diluyentes, portadores, o excipientes. Los polipeptidos se pueden formular de acuerdo a metodos conocidos utilizados para preparar composiciones utiles farmaceuticamente aceptables. Ellos se pueden combinar en una mezcla, ya sea del material activo solo o con otros materiales activos conocidos adecuados para una indicacion dada, con diluyentes farmaceuticamente aceptables (por ejemplo, solucion salina, Tris-HCl, soluciones de acetato y amortiguadas con fosfato), preservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencllico, parabenos), emulgentes, solubilizantes, adyuvantes y/o portadores. Las formulaciones adecuadas para composiciones farmaceuticas incluyen a aquellas descritas en (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ava ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980)).

Ademas, tales composiciones pueden acomplejarse con polietilen glicol (PEG), iones metalicos, o incorporarse en compuestos polimericos tales como acido poliacetico, acido poliglicolico, hidrogeles, dextrano, etc., o incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelas, veslculas unilaminares o multilaminares, imagenes de eritrocitos o esferoblastos. Tales composiciones influiran el estado flsico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberacion in vivo, y velocidad de aclaramiento in vivo, y se escogen por lo tanto de acuerdo con la aplicacion pretendida.

Las composiciones de la invencion se pueden administrar en cualquier forma adecuada, por ejemplo, en forma topica, en forma parenteral, o por inhalacion. El termino “parenteral” incluye inyeccion, por ejemplo por via subcutanea, intravenosa, o intramuscular, tambien incluyen administracion localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o lesion. La liberacion sostenida a partir de implantes esta contemplada tambien. Alguien capacitado en el arte pertinente reconocera que las dosis adecuadas variaran, dependiendo de factores tales como la naturaleza del trastorno que va a ser tratado, del peso corporal del paciente, la edad, y de la condition general, y de la via de administracion. Las dosis preliminares se pueden determinar de acuerdo con las pruebas en animales, y el escalado de dosis para administracion en humanos se lleva a cabo de acuerdo con practicas aceptadas en el arte.

Tambien se contemplan las composiciones que contienen acidos nucleicos en formulaciones fisiologicamente aceptables. El ADN se puede formular por medio de inyeccion, por ejemplo.

Agentes para Investigation

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Otro uso del polipeptido de la presente invencion es como herramienta de investigation para estudiar los efectos biologicos que resultan de inhibir las interacciones TSLP/receptor de TSLP sobre diferentes tipos de celulas. Tambien se pueden emplear polipeptidos en ensayos in vitro para detectar TSLP o a los receptores de TSLP o a las interacciones de los mismos.

Otra realization de la invencion se relaciona con los usos de TSLP humana para estudiar la transduction de senal de celulas B o de celulas T. La TSLP humana y otras citoquinas juegan un papel central en el desarrollo de las celulas B y de las celulas T y en las respuestas inmunologicas, incluidas las senales de transduccion celular, estimulacion de celulas para secretar citoquinas, e inducir la proliferation de celulas B y de celulas T. Como tal, las alteraciones en la expresion y/o la activation de TSLP pueden tener profundos efectos sobre una pletora de procesos celulares, incluyendo, pero sin limitarse a, la activacion o inhibition de respuestas especlficas de la celula y proliferacion. La expresion de TSLP clonada o de mutantes catallticamente inactivos de TSLP ha sido utilizada para identificar el papel que juega una protelna particular en la mediation de eventos de senalacion especlficos.

La senalacion secular a menudo involucra una cascada de activacion molecular, durante la cual un receptor propaga una senal mediada por el receptor del ligando por medio de la activacion especlfica de quinasas intracelulares que fosforilan a sustratos objetivo. Estos sustratos pueden ser por si mismos quinasas que llegan a activarse despues de la fosforilacion. Alternativamente, pueden ser moleculas adaptadoras que facilitan la serialization secuencia abajo a traves de la interaction protelna-protelna despues de la fosforilacion. Independientemente de la naturaleza de la(s) molecula(s) de sustrato, se pueden utilizar versiones activas catallticamente expresadas de los receptores del ligando de TSLP para identificar que sustrato(s) fue(ron) reconocido(s) y activado(s) por el(los) receptor(es) del ligando de TSLP. Como tal, estos nuevos receptores de TSLP se pueden utilizar como reactivos para identificar moleculas nuevas involucradas en las rutas de transduccion de la senal.

Ademas, alguien capacitado en el arte puede utilizar TSLP utilizando tecnicas conocidas para estimular la proliferacion de celulas de linaje B o de linaje T (Ray y colaboradores, Eur. J. Immunology 26, 10-16 (1996)) y (Namikawa y colaboradores, Blood 87:1881-1890 (1996)), para la expresion del clon del receptor de TSLP humana (Sims y colaboradores, Science 241:585-589 (1988)), para clonar una protelna relacionada (Kozlosky y colaboradores, Cytokine 9:540-549 (1997)) y (Lyman y colaboradores, Blood 10:2795-2801 (1994)), y para expandir celulas ex vivo (Piacibello y colaboradores, Blood 89:2644-2653 (1997)).

Usos de los Mismos

Por lo tanto, la presente invencion abarca metodos para estimular la proliferacion de linfocitos B y linfocitos T, donde el metodo comprende incubar linfocitos con TSLP humana. En una realizacion adicional, el metodo comprende incubar linfocitos con TSLP humana y al menos otra citoquina in vivo o in vitro. Preferiblemente, la citoquina se selecciona del grupo de IL-7, Factor de Acero, Factor de Celula Madre, Factor de Crecimiento de Mastocitos o Ligando flt3. Mas preferiblemente, la citoquina es IL-7.

La presente invencion tambien abarca metodos para estimular el desarrollo de linfocitos o limfopoyesis, donde el metodo comprende incubar celulas progenitoras, tales como celulas mononucleares derivadas de la celula osea, con TSLP humana in vivo o in vitro. En una realizacion adicional, el metodo comprende incubar linfocitos con TSLP humana y al menos otra citoquina. Preferiblemente, la citoquina se selecciona del grupo de IL-7, Factor de Acero, Factor de Celula Madre, Factor de Crecimiento de Mastocitos o Ligando flt3. Mas preferiblemente, la citoquina es IL- 7.

Marcadores de Punto Isoelectrico y de Peso Molecular

Los polipeptidos de la presente invencion se pueden someter a fragmentation para producir peptidos mas pequenos por medios qulmicos y enzimaticos, y se pueden utilizar los fragmentos de peptido as! producidos en el analisis de otras protelnas o polipeptidos. Por ejemplo, se pueden utilizar tales fragmentos de peptidos como marcadores de peso molecular de peptidos, marcadores de punto isoelectrico de peptidos, o en el analisis del grado de fragmentacion de los peptidos. Por lo tanto, la invencion tambien incluye a estos polipeptidos y a los fragmentos de peptido, as! como los kits para ayudar en la determination del peso molecular aparente y del punto isoelectrico de una protelna desconocida, y kits para evaluar el grado de fragmentacion de una protelna desconocida.

Aunque todos los metodos de fragmentacion son abarcados por la invencion, la fragmentacion qulmica es una realizacion preferida, e incluye el uso de bromuro de cianogeno para romper bajo condiciones neutras o acidas de tal manera que ocurra una escision especlfica en los residuos de metionina (E. Gross, Methods in Enz. 11:238-255 (1967)). Esto puede incluir ademas etapas adicionales, tales como una etapa de carboximetilacion para convertir residuos de cistelna en una especie no reactiva.

La fragmentacion enzimatica es otra realizacion preferida, e incluye el uso de una proteasa tal como Asparaginilendo peptidasa, Arginilendo peptidasa, Acromobacter proteasa I, Tripsina, proteasa V8 de Staphylococcus aureus,

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Endoproteinasa Asp-N, o Endoproteinasa Lys-C bajo condiciones convencionales para resultar en la escision en residuos de aminoacidos especlficos. La Asparaginilendo peptidasa puede escindir especlficamente sobre el costado del carboxilo de los residuos de asparagina presentes dentro de los polipeptidos de la invencion. La Acromobacter proteasa I puede escindir especlficamente sobre el costado del carboxilo de los residuos de lisina presentes dentro de los polipeptidos (Sakiyama y Nakat, patente estadounidense No. 5.248.599; T. Masaki y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 660:44-50 (1981); T. Masaki y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 660:5155 (1981)). La tripsina puede escindir especlficamente sobre el costado del carboxilo de los residuos de arginina y de lisina presentes dentro de los polipeptidos de la invencion. La fragmentacion enzimatica puede ocurrir tambien con una proteasa que escinde en multiples residuos de aminoacidos. Por ejemplo, la proteasa V8 de Staphylococcus aureus puede escindir especlficamente sobre el costado del carboxilo de los residuos de acido aspartico y glutamico presentes dentro de los polipeptidos (D. W. Cleveland, J. Biol. Chem. 3:1102-1106 (1977)). La Endoproteinasa Asp- N puede escindir especlficamente sobre el costado amino de los residuos de asparagina presentes dentro de los polipeptidos. La Endoproteinasa Lys-C puede escindir especlficamente sobre el costado del carboxilo de los residuos de lisina presentes dentro de los polipeptidos de la invencion. Otros tratamientos enzimaticos y qulmicos pueden ser usados igualmente para fragmentar especlficamente estos polipeptidos en un juego unico de peptidos especlficos.

Desde luego, los peptidos y fragmentos de los polipeptidos de la invencion tambien se pueden producir por medio de procesos recombinantes convencionales y procesos de slntesis conocidos en el arte. Con relacion a los procesos recombinantes, los peptidos y fragmentos de peptidos abarcados por la invencion pueden tener pesos moleculares variables, dependiendo de la celula huesped en la cual se expresen. La glicosilacion de polipeptidos y de fragmentos de peptido de la invencion en diferentes tipos de celulas puede resultar en variaciones del peso molecular de estos pedazos, dependiendo del grado de modificacion. El tamano de estos pedazos puede ser mas heterogeneo con fragmentos de polipeptido derivados de la porcion extracelular del polipeptido. Se pueden obtener polipeptidos y fragmentos de peptido consistentes por medio del uso de polipeptidos completamente derivados de las regiones transmembrana y citoplasmatica, pretratando con N-glicanasa para remover la glicosilacion, o expresando los polipeptidos en los huespedes bacterianos.

Tambien se puede variar el peso molecular de estos polipeptidos por medio de la fusion de secuencias adicionales de peptido a ambos extremos amino y carboxilo terminales de polipeptidos de la invencion. Las fusiones de secuencias adicionales de peptido en los extremos amino y carboxilo terminales de polipeptidos de la invencion pueden ser utilizadas para reforzar la expresion de estos polipeptidos o ayudaren la purification de la protelna. Ademas, las fusiones de secuencias adicionales de peptido en los extremos amino y carboxilo terminales de polipeptidos de la invencion alteraran algo, pero usualmente no todo, de los peptidos fragmentados de los polipeptidos generados por tratamiento enzimatico o qulmico. Desde luego, se pueden introducir mutaciones en los polipeptidos de la invencion utilizando tecnicas conocidas y de rutina de biologla molecular. Por ejemplo, se puede disenar una mutation a fin de eliminar un sitio de escision proteolltica por medio de una enzima especlfica o un sitio de escision por medio de un procedimiento especlfico de fragmentacion qulmicamente inducido. La elimination del sitio alterara la huella peptldica de los polipeptidos de la invencion por fragmentacion con la enzima especlfica o por procedimiento qulmico.

Los polipeptidos y los peptidos fragmentados resultantes se pueden analizar por medio de metodos que incluyen sedimentation, electroforesis, cromatografla, y espectrometrla de masas para determinar sus pesos moleculares. Ya que la unica secuencia de aminoacidos de cada pedazo especifica un peso molecular, estos pedazos pueden servir despues como marcadores de peso molecular utilizando tales tecnicas de analisis para ayudar en la determination del peso molecular de una protelna desconocida, polipeptidos o fragmentos de los mismos. Los marcadores de peso molecular de la invencion sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular para la estimation del peso molecular aparente de protelnas que tiene pesos moleculares aparentes similares y, en consecuencia, permiten una mayor precision en la determinacion del peso molecular aparente de las protelnas.

Cuando la invencion se relaciona con el uso de marcadores de peso molecular de un peptido fragmentado, esos marcadores tienen preferiblemente al menos un tamano de 10 aminoacidos. Mas preferiblemente, esos marcadores de peso molecular de peptido fragmentado tienen un tamano entre 10 y 100 aminoacidos. Aun mas preferibles son los marcadores de peso molecular de peptido fragmentado tienen un tamano entre 10 y 50 aminoacidos y especialmente un tamano entre 10 y 35 aminoacidos. Lo mas preferible son los marcadores de peso molecular de peptido fragmentado con un tamano entre 10 y 20 aminoacidos.

Entre los metodos para determinar el peso molecular estan la sedimentacion, la electroforesis sobre gel, la cromatografla y la espectrometrla de masas. Una realization particularmente preferida es la electroforesis desnaturalizante sobre gel de poliacrilamida (U. K. Laemmli, Nature 227:680-685 (1970)). Convencionalmente, el metodo utiliza dos sendas separadas de un gel que contiene dodecil sulfato de sodio y una concentration de acrilamida entre 6-20%. La habilidad para resolver simultaneamente al marcador y a la muestra bajo identicas condiciones permite una mayor precision, Por su puesto se entiende, que se pueden utilizar muchas tecnicas diferentes para la determinacion del peso molecular de una protelna desconocida utilizando polipeptidos de la invencion, y que esta realizacion no limita de ninguna manera el alcance de la invencion.

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Cada polipeptido no glicosilado o fragmento del mismo tiene un pl que se determina intrlnsecamente por medio de su unica secuencia de aminoacidos (cuyo pl lo puede estimar el operario calificado utilizando cualquiera de los programas de computador disenados para predecir los valores de pl actualmente disponibles, calculados utilizando cualquier tabla conocida de pKa para aminoacidos o medido emplricamente). Por lo tanto, estos polipeptidos y fragmentos de los mismos pueden servir como marcadores especlficos para ayudar en la determinacion del punto isoelectrico de una protelna desconocida, polipeptido, o peptido fragmentado utilizando tecnicas tales como el enfoque isoelectrico. Estos marcadores de polipeptido o de peptido fragmentado sirven particularmente bien para la estimacion de los puntos isoelectricos aparentes de protelnas desconocidas que tienen puntos isoelectricos aparentes cercanos a aquellos de los marcadores de polipeptido o peptido fragmentado de la invencion.

La tecnica de enfoque isoelectrico se puede combinar ademas con otras tecnicas tales como la electroforesis sobre gel para separar simultaneamente una protelna con base en el peso molecular y la carga. La habilidad para resolver simultaneamente estos marcadores de polipeptido o de peptido fragmentado y la protelna desconocida bajo identicas condiciones permite una mayor precision en la determinacion del punto isoelectrico aparente de la protelna desconocida. Esto es de particular interes en tecnicas, tales como la electroforesis en dos dimensiones (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77, Prentice Hall, 6d ed. (1991)), donde la naturaleza del procedimiento dicta que cualquiera de los marcadores debe ser resuelto simultaneamente con la protelna desconocida. Ademas, con tales metodos, estos polipeptidos y los peptidos fragmentados de los mismos pueden ayudar en la determinacion tanto del punto isoelectrico como del peso molecular de una protelna desconocida o peptido fragmentado.

Los polipeptidos y peptidos fragmentados se pueden visualizar utilizando dos metodos diferentes que permiten una discriminacion entre la protelna desconocida y los marcadores de peso molecular. En una realizacion, los marcadores de peso molecular del polipeptido y del peptido fragmentado de la invencion se pueden visualizar utilizando anticuerpos generados contra estos marcadores y tecnicas convencionales de inmunotransferencia. Esta deteccion se lleva a cabo bajo condiciones convencionales que no resultan en la detection de la protelna desconocida. Se entiende que puede que no sea posible generar anticuerpos contra todos los fragmentos de polipeptido de la invencion, ya que los peptidos pequenos pueden no contener epltopos inmunogenos. Se entiende ademas que no todos los anticuerpos trabajaran en este ensayo; sin embargo, aquellos anticuerpos que son capaces de enlazar polipeptidos y fragmentos de la invencion se pueden determinar facilmente utilizando tecnicas convencionales.

La protelna desconocida se visualiza tambien por medio del uso de un procedimiento convencional de coloration. El exceso molar de protelna desconocida para los marcadores de peso molecular del polipeptido o del peptido fragmentado de la invencion es tal que el procedimiento convencional de coloracion detecta predominantemente la protelna desconocida. El nivel de estos marcadores de peso molecular del polipeptido o del peptido fragmentado es tal que permite una pequena deteccion o ninguna deteccion de estos marcadores por medio del metodo convencional de coloracion. El exceso molar preferido de protelna desconocida con respecto a los marcadores de peso molecular del polipeptido de la invencion esta entre 2 y 100.000 veces. Mas preferiblemente, el exceso molar preferido de la protelna desconocida con respecto a estos marcadores de peso molecular del polipeptido esta entre 10 y 10.000 veces y especialmente entre 100 y 1000 veces.

Se entiende por supuesto que se pueden utilizar muchas tecnicas para la determinacion y la deteccion del peso molecular y del punto isoelectrico de una protelna desconocida, de polipeptidos, y de peptidos fragmentados de los mismos utilizando estos marcadores de peso molecular del polipeptido y fragmentos de peptido del mismo, y que estas realizaciones no limitan de ninguna manera el alcance de la invencion.

En otra realizacion, los analisis de la fragmentation progresiva de los polipeptidos de la invencion en peptidos especlficos (D. W. Cleveland y colaboradores, J. Biol. Chem. 252:1102-1106 (1977)), tal como por medio de la alteration del tiempo o de la temperatura de la reaction de fragmentacion, se pueden utilizar como un control para el grado de escision de una protelna desconocida. Por ejemplo, la escision de la misma cantidad de polipeptido y de protelna desconocida bajo identicas condiciones puede permitir una comparacion directa del grado de fragmentacion. Las condiciones que resultan en la fragmentacion completa del polipeptido pueden tambien resultar en la fragmentacion completa de la protelna desconocida.

Como para el uso especlfico de los polipeptidos y peptidos fragmentados de la invencion como marcadores de peso molecular, la fragmentacion del polipeptido de la SEQ ID NO: 2 con bromuro de cianogeno genera un juego unico de marcadores de peso molecular de peptido fragmentado. La distribution de residuos de metionina determina el numero de aminoacidos en cada peptido y la composition unica de aminoacidos de cada peptido determina su peso molecular.

Ademas, el polipeptido purificado preferido de la invencion (SEQ ID NO: 2) tiene un peso molecular observado aproximadamente de 21.000 Daltons.

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Donde se utiliza una protelna intacta, el uso de estos marcadores de peso molecular de polipeptido permite una mayor precision en la determinacion del peso molecular aparente de protelnas que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 21.000 Daltons. Donde se utilizan los fragmentos, existe una mayor precision en la determinacion del peso molecular sobre el rango de los pesos moleculares del fragmento.

Finalmente, como para los kits que son abarcados por la invencion, los constituyentes de tales kits se pueden variar, pero tlpicamente contienen a los marcadores de peso molecular del polipeptido y del peptido fragmentado. Tambien, tales kits pueden contener a los polipeptidos en donde un sitio necesario para fragmentacion ha sido removido. Ademas, los kits pueden contener reactivos para la escision especlfica del polipeptido y la protelna desconocida por medio de escision qulmica o enzimatica. Los kits pueden contener ademas anticuerpos dirigidos contra polipeptidos o fragmentos de los mismos de la invencion.

Identification de Protelnas Desconocidas

Como se expuso anteriormente, se puede ingresar un polipeptido o una huella digital de un peptido en una base de datos o compararlos con una base de datos de protelnas conocidas para ayudar en la identificacion de una protelna desconocida utilizando espectrometrla de masas (W.J. Henzel y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:50115015 (1993); D. Fenyo y colaboradores, Electrophoresis, 19:998-1005 (1998)). Una variedad de programas de ordenador para facilitar estas comparaciones se encuentran accesibles a traves de Internet, tales como Protein Prospector (sitio en Internet: prospector.uscf.edu), Multildent (sitio en Internet:
www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (sitio en Internet: www.mann.embl-heiedelberg.de...deSearch/FR_PeptideSearch Form.html), y ProFound (sitio en Internet:
www.chaitsgi.rockefeller.edu/cgi-bin/protid-frag.html). Estos programas le permiten al usuario especificar el agente de escision y los pesos moleculares de los peptidos fragmentados dentro de una tolerancia determinada. Los programas comparan estos pesos moleculares con las bases de datos de protelna para ayudar a determinar la identidad de la protelna desconocida.

Ademas, las digestiones de peptidos de protelnas desconocidas se pueden secuenciar utilizando espectrometrla de masas en tandem (MS/MS) y la secuencia resultante buscada contra las bases de datos (J.K. Eng, y colaboradores, J. Am. Soc. Mass Spec. 5:976-989 (1994); M. Mann y M. Wilm, Anal. Chem., 66:4390-4399 (1994); J.A. Taylor y R.S. Johnson, Rapid Comm. Mass Spec., 11:1067-1075 (1997)). Los programas de busqueda que se pueden utilizar en este proceso se encuentran en la Internet, tales como Lutefisk 97 (sitio en Internet:

www.lsbc.com: 70/Lutefisk97.html), y los programas Protein Prospector, Peptide Search y ProFound descritos anteriormente. Por lo tanto, la adicion de la secuencia de un gen y su secuencia protelnica predicha y los fragmentos del peptido a una base de datos de secuencia puede ayudar en la identificacion de protelnas desconocidas utilizando espectrometrla de masas en tandem.

Anticuerpos

Se proveen aqul anticuerpos que son inmunoreactivos con los polipeptidos de la invencion. Tales anticuerpos se enlazan especlficamente a los polipeptidos a traves de los sitios de enlazamiento del antlgeno de anticuerpo (en forma opuesta al enlazamiento no especlfico). Por lo tanto, los polipeptidos, fragmentos, variantes, protelnas de fusion, etc., como se expuso anteriormente, se pueden emplear como “inmunogenos” en la production de anticuerpos inmunoreactivos con estos. Mas especlficamente, los polipeptidos, fragmentos, variantes, protelnas de fusion, etc., contienen determinantes antigenicos o epltopos que producen la formation de anticuerpos.

Estos determinantes antigenicos o epltopos pueden ser o bien lineales o conformacionales (discontinuos). Los epltopos lineales se componen de una section unica de aminoacidos del polipeptido, mientras que los epltopos conformacionales o discontinuos se componen de secciones de aminoacidos de diferentes regiones de la cadena del polipeptido que son traldas muy cerca sobre el pliegue de la protelna (C. A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 3:9, Garland Publishing Inc., 2da ed. (1996)). Debido a que las protelnas plegadas tienen superficies complejas, el numero de epltopos disponibles es muy numeroso; sin embargo, debido a la conformation de la protelna y de los impedimentos estericos, el numero de anticuerpos que realmente se enlaza a los epltopos es menor que el numero de epltopos disponible (C. A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 2:14, Garland Publishing Inc., 2da ed. (1996)). Los epltopos pueden ser identificados por medio de cualquiera de los metodos conocidos en el arte.

Por lo tanto, un aspecto se relaciona con los epltopos antigenicos de los polipeptidos de la invencion. Tales epltopos son utiles para elevar los anticuerpos, en particular los anticuerpos monoclonales, como se describe con mas detalle mas adelante. Adicionalmente, los epltopos de los polipeptidos de la invencion se pueden utilizar como reactivos de investigation, en ensayos y para purificar anticuerpos de enlazamiento especlfico de sustancias tales como sueros policlonales o sobrenadantes de hibridomas cultivados. Tales epltopos o variantes de los mismos se pueden producir utilizando tecnicas conocidas en el arte tal como la slntesis en fase solida, escision qulmica o enzimatica de un polipeptido, o utilizando tecnologla de ADN recombinante.

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Como para los anticuerpos que pueden ser producidos por los epltopos de los polipeptidos de la invention, ya sea que los epltopos hayan sido aislados o que permanezca parte de los polipeptidos, tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales se pueden preparar por medio de tecnicas convencionales. Ver, por ejemplo (Kennet y colaboradores, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, eds., Plenum Press, New York (1980); y Harlow y Land, Antibodies: A Laboratory Manual, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)).

Las llneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales especlficos para los polipeptidos de la invencion tambien son contempladas aqul. Tales hibridomas se pueden producir e identificar por medio de tecnicas convencionales. Un metodo para producir tales llneas celulares de hibridoma comprende la inmunizacion de un animal con un polipeptido; recoger las celulas del bazo del animal inmunizado; fusionar dichas celulas del bazo a una llnea celular de mieloma, generando as! celulas de hibridoma; e identificar una llnea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que enlaza al polipeptido. Los anticuerpos monoclonales se pueden recuperar por medio de tecnicas convencionales.

Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos quimericos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Tales anticuerpos humanizados se pueden preparar por medio de tecnicas conocidas y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando se administran los anticuerpos a humanos. En una realization, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la region variable de un anticuerpo murino (o justamente el sitio de enlazamiento del antlgeno del mismo) y una region constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitioenlazamiento del antlgeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de region variable (que carece del sitio de enlazamiento del antlgeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la production de anticuerpos monoclonales quimericos y ademas modificados por ingenierla genetica incluyen a aquellos descritos en (Riechmann y colaboradores, Nature 332:323 (1988), Liu y colaboradores, PNAS 84:3439 (1987), Larrick y colaboradores, Bio/Technology 7:934 (1989), y Winter y Harris, TIPS 14:139 (Mayo 1993)). Se pueden encontrar procedimientos para generar anticuerpos transgenicamente en GB 2.272.440, en las patentes estadounidenses Nos. 5.569.825 y 5.545.806 y en patentes relacionadas que reivindiquen prioridad de las mismas.

Son tambien descritos los fragmentos de enlazamiento del antlgeno de los anticuerpos, que pueden ser producidos por medio de tecnicas convencionales. Ejemplos de tale fragmentos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab y F(ab')2. Tambien se proveen fragmentos de anticuerpo y derivados producidos por medio de tecnicas de ingenierla genetica.

Los anticuerpos son especlficos para los polipeptidos de la presente invencion y no reaccionan en forma cruzada con otras protelnas. Los procedimientos de selection por medio de los cuales se pueden identificar tales anticuerpos son conocidos, y pueden involucrar cromatografla de inmunoafinidad, por ejemplo.

Usos de los mismos

Los anticuerpos se pueden utilizar en ensayos para detectar la presencia de los polipeptidos o fragmentos de la invencion, ya se in vitro o in vivo. Los anticuerpos se pueden emplear tambien en la purification de polipeptidos o de fragmentos de la invencion por medio de cromatografla de inmunoafinidad.

Aquellos anticuerpos que adicionalmente pueden bloquear el enlazamiento de los polipeptidos de la invencion a los receptores de TSLP se pueden utilizar para inhibir una actividad biologica que resulta de tal enlazamiento. Tales anticuerpos bloqueadores se pueden identificar utilizando cualquier procedimiento adecuado de analisis, tal como por medio del analisis de los anticuerpos por la habilidad para inhibir el enlazamiento de TSLP a ciertas celulas que expresan a los receptores de TSLP. Ejemplos de tale celulas son las llneas celulares linfoides B y T 70Z/3 y 7B9, respectivamente. Alternativamente, los anticuerpos bloqueadores se pueden identificar en ensayos para la habilidad de inhibir un efecto biologico que resulte del enlazamiento de TSLP a receptores de TSLP sobre celulas objetivo. Los anticuerpos se pueden analizar por la habilidad para inhibir la destruction de las celulas mediada por TSLP que expresan los receptores de TSLP, por ejemplo.

Tal anticuerpo se puede emplear en un procedimiento in vitro, o ser administrado in vivo para inhibir una actividad biologica mediada por la entidad que genero el anticuerpo. Se pueden tratar as! los trastornos causados o exacerbados (directa o indirectamente) por la interaction de TSLP con los receptores de TSLP sobre la superficie de la celula. Un metodo terapeutico involucra la administration in vivo de un anticuerpo bloqueador a un mamlfero en una cantidad efectiva en la inhibition de la actividad biologica mediada por TSLP. Se prefiere generalmente el uso de anticuerpos monoclonales en tale metodos terapeuticos. En una realizacion, se emplea un fragmento de anticuerpo para enlazamiento del antlgeno.

Los anticuerpos se pueden seleccionar por las propiedades agonistas (esto es, imitation del ligando). Tales anticuerpos, por el enlazamiento a los receptores de TSLP sobre la superficie de la celula, inducen efectos

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biologicos (por ejemplo, la transduccion de senales biologicas) similares a los efectos biologicos inducidos cuando TSLP se enlaza a los receptores de TSLP sobre la superficie de la celula. Los anticuerpos agonistas se pueden utilizar para inducir proliferacion celular de linaje B o de linaje T.

Se proveen aqul composiciones que comprenden un anticuerpo que esta dirigido contra TSLP humano, y un diluyente, excipiente, o portador fisiologicamente aceptable. Los componentes adecuados de tales composiciones son como se describio anteriormente para composiciones que contienen protelnas TSLP humanas.

Tambien se proveen aqul conjugados que contienen un agente detectable (por ejemplo, diagnostico) o terapeutico, unido al anticuerpo. Ejemplos de tales agentes se presentaron anteriormente. Los conjugados encuentran uso en procedimientos in vitro o in vivo.

Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar mas realizaciones particulares de la invencion, y no pretenden limitar el alcance de la presente invencion.

EJEMPLO 1: Aislamiento del acido nucleico

Se obtuvo una secuencia de acido nucleico de TSLP humana por medio de la secuenciacion del clon 1407260 de EST IMAGE, con acceso # AA889581. Esta secuencia sugirio, en comparacion con la secuencia TSLP murina, que el clon EST era un clon parcial. Se seleccionaron un cierto numero de bibliotecas de ADNc con iniciadores internos para determinar una fuente de ADNc que pudiera ser utilizada para obtener al extremo 3' perdido del clon de ADNc de TSLP. Despues de 60 ciclos de PCR utilizando dos iniciadores internos de la secuencia de TSLP humana, fueron positivas las siguientes bibliotecas de ADNc para secuencias de TSLP: testlculo humano, fibroblastos de prepucio humano y cerebro fetal (debilmente positivo); mientras que MoT, HS431, medula osea, HPT4, HBT3, W126, Hut102, PBT, Sk Hep, fibroblastos dermicos humanos, Raji, placenta humana, y bibliotecas KB fueron todos negativos.

Utilizando PCR sobre la biblioteca Agt10 de testlculo humano con un iniciador interno de TSLP y un iniciador del vector de Agt10, se aislaron dos clones (19E y 19F) con secuencias identicas a las secuencias internas de TSLP humana. Ambos clones tenlan extremos 5' identicos pero extremos 3' de diferente longitud. Las secuencias de codificacion as! como las de no codificacion del clon 19E eran identicas a las del clon 19F; estos clones diferlan en la longitud de la region 3' de no codificacion, donde el clon 19F era aproximadamente 34 pb mas largo que el de 19E. Por lo tanto, se utilizaron las secuencias de 19F para completar la secuencia de codificacion 3' de la protelna TSLP humana. Esto permitio la identificacion de los 15 aminoacidos C-terminales que no estan presentes en el EST. La PCR se llevo a cabo de acuerdo a procedimientos convencionales.

EJEMPLO 2: Purificacion del polipeptido de TSLP

ELISA especlfico para TSLP:

Se colocan diluciones seriales de muestras que contienen TSLP (en NaHCO3 50 mM, llevadas hasta pH 9 con NaOH) sobre placas de microtitulacion E.I.A. de fondo plano de 96 pozos Linbro/Titertek (ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) en una proporcion de 100:1/pozo. Despues de incubacion a 4°C durante 16 horas, se lavan los pozos seis veces con PBS 200:1 que contiene Tween-20 al 0,05% (PBS-Tween). Se incuban luego los pozos con receptor de TSLP-FLAG® a razon de 1 pg/ml en PBS-Tween con suero fetal de ternero (FCS) durante 90 minutos (100:1 por pozo), seguido por lavado como anteriormente. Luego, se incuba cada pozo con el anti-FLAG® (anticuerpo monoclonal M2 a razon de 1 pg/ml en PBS-Tween que contiene FCS al 5% durante 90 minutos (100:1 por pozo), seguido por lavado como anteriormente. Posteriormente, se incubaron los pozos con un anticuerpo policlonal conjugado con peroxidasa de rabano picante especlfico para anti-mIgG1 de cabra (una dilucion 1:5000 del patron comercial en PBS-Tween que contiene FCS al 5%) durante 90 minutos (100:1 por pozo). El anticuerpo conjugado con HRP se obtiene de Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama. Se lavan luego los pozos seis veces, como anteriormente.

Para el desarrollo del ELISA, se anade a los pozos una mezcla de sustrato [100:1 por pozo de una premezcla 1:1 del Sustrato de Peroxidasa TMB y Solucion B de Peroxidasa (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland)]. Despues de una suficiente reaccion de color, se termina la reaccion enzimatica por medio de la adicion de H2SO4 2 N (50:1 por pozo). Se determina la intensidad del color (que indica el enlazamiento del receptor de TSLP a TSLP) midiendo la extincion a 450 nm sobre un lector de placas V Max (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

EJEMPLO 3: Secuencia de aminoacidos

La secuencia de aminoacidos de TSLP humana se determino por medio de traduccion de la secuencia de nucleotidos de TSLP humana. El marco de lectura escogido se baso en la homologla de TSLP humana con TSLP murina.

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EJEMPLO 4. Secuencias de aminoacidos y de ADN

La secuencia de acido nucleico de TSLP humana se determino por medio de secuenciacion bicatenaria estandar de la secuencia compuesta del clon 1407260 de EST IMAGE, acceso #AA889581, y la secuencia adicional 3' del clon 19F. La secuencia de nucleotidos del ADN aislado de TSLP humana y la secuencia de aminoacidos codificada asl, se presentan en las SEQ ID NOs: 1 y 2. La secuencia del fragmento completo de ADN de TSLP humana aislada por medio de PCR corresponde a los nucleotidos 1 a 767 de la SEQ ID NO: 1, que codifica a los aminoacidos 1 a 159 de la SEQ ID NO: 2.

La secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 muestra una significativa similitud (49%) e identidad (43%) con la TSLP murina y homologla debil con IL-7.

EJEMPLO 5: Anticuerpos Monoclonales que se enlazan a TSLP

Este ejemplo ilustra un metodo para preparar anticuerpos monoclonales que se enlazan a TSLP. Los inmunogenos adecuados que se pueden emplear en la generation de tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, un polipeptido de TSLP humana purificada o a un fragmento inmunogenico del mismo tal como el dominio extracelular, o las protelnas de fusion que contienen a la TSLP humana (por ejemplo, una protelna soluble de fusion TSLP/Fc).

Se puede utilizar la TSLP humana purificada para generar anticuerpos monoclonales inmunoreactivos con ella, utilizando tecnicas convencionales tales como aquellas descritas en la patente estadounidense No. 4.411.993. En resumen se inmunizan los ratones con inmunogeno de TSLP humana y emulsionado en adyuvante completo de Freund, y se lo inyecta en el rango de cantidades entre 10 y 100 pg en forma subcutanea o intraperitoneal. Diez a doce dlas despues, se les inyecta un refuerzo a los animales inmunizados con TSLP humana adicional emulsionada con adyuvante de Freund incompleto. Se les suministra una dosis de refuerzo periodicamente a los ratones tiempo despues en un cronograma de inmunizacion semanal o bisemanal. Se toman periodicamente muestras de suero por medio de sangrado retroorbital o de un corte en la punta de la cola para analizar los anticuerpos de TSLP por medio del ensayo de transferencia de punto, ELISA (Ensayo de Inmunoabsorcion Enzimatica) o inhibition de enlazamiento al receptor de TSLP.

Despues de la detection del tltulo de un anticuerpo apropiado, a los animales positivos se les suministra una ultima inyeccion intravenosa de TSLP humana en solution salina. Tres a cuatro dlas despues, se sacrifican los animales, se recolectan las celulas del bazo, y se las fusiona con una llnea de celulas de mieloma murino, por ejemplo, NS 1 o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan celulas de hibridoma, que se siembran en multiples placas de microtitulacion en un medio selectivo de HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferation de celulas no fusionadas, de hlbridos de mieloma, y de hlbridos de celulas de bazo.

Las celulas de hibridoma se seleccionan por medio de ELISA por la reactividad contra TSLP purificada por medio de adaptaciones de las tecnicas divulgadas en (Engvall y colaboradores, Immunochem. 8:871 (1971)) y en la patente estadounidense No. 4.703.004. Una tecnica de selection preferida es la tecnica de captura de anticuerpos descrita en (Beckmann y colaboradores, J. Immunol. 144:4212 (1990)). Las celulas de hibridoma positivo se pueden inyectar en forma intraperitoneal en ratones BALB/c singeneicos para producir ascites que contienen altas concentraciones de anticuerpos monoclinales anti-TSLP. Alternativamente, las celulas de hibridoma se pueden cultivar in vitro en frascos o en botellas rodantes por medio de diferentes tecnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascites de raton se pueden purificar por precipitation con sulfato de amonio, seguido por cromatografla de exclusion en gel. Alternativamente, se puede utilizar tambien cromatografla de afinidad que se basa en el enlazamiento de anticuerpo a Protelna A o a Protelna G, asl como la cromatografla de afinidad con base en el enlazamiento a TSLP.

EJEMPLO 6: Analisis de transferencias Northern

Se investigo la distribution en el tejido de ARNm de TSLP humana por medio de analisis de transferencias de Northern, de la siguiente manera. Se anadio una allcuota marcada en forma radioactiva a dos diferentes transferencias de Northern de tejido humano multiple (Clontech, Palo Alto, CA; Biochain, Palo Alto, CA). Se hibridaron las trasferencias en 10X Denhardts, Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 900 mM, pirofosfato de Na al 0.1 %, SDS al 1%, 200 pg/mL de ADN de esperma de salmon. La hibridacion se llevo a cabo durante la noche a 63 °C en formamida al 50% como se describio anteriormente (March y colaboradores, Nature 315:641-647 (1985)). Se lavaron luego las transferencias con 2X SSC, SDS al 0.1 % a 68 °C durante 30 minutos.

Una trascripcion unica de 1,4 kilobases (kb) estaba presente en corazon, pulmon, hlgado, musculo esqueletico, rinon, pancreas, bazo, timo, prostata, testlculo, ovario, intestino delgado, colon. Los tejidos negativos fueron cerebro, placenta, y leucocitos en sangre periferica. Las celulas y los tejidos con los niveles mas altos de ARNm de TSLP son corazon, hlgado, prostata y testlculo, como se observa por medio de la comparacion para controlar explorando con una sonda especlfica para p-actina.

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EJEMPLO 7: Ensayo de Enlazamiento

habilidad para enlazar a los receptores

leucina fusionado al N-terminal de un polipeptido soluble de TSLP humana (LZ-TSLP) en el ensayo. Se prepara una construction de expresion, esencialmente como se describio para la preparation de la construccion de expresion FLAG® (TSLP) en (Wiley y colaboradores, Immunity, 3:673-682 (1995)), excepto que el ADN que codifica al peptido FLAG® fue reemplazado con una secuencia que codifica a un cierre modificado de leucina que permite la trimerizacion. La construccion, en el vector de expresion pDC409, codifica una secuencia llder derivada de citomegalovirus humano, seguido por la fraction de cierre de leucina fusionada al N-terminal de un polipeptido soluble de TSLP humana. El LZ-TSLP se expresa en celulas CHO, y se purifican a partir del sobrenadante del cultivo.

El vector de expresion designado como pDC409 es un vector de expresion de mamlfero derivado del vector pDC406 descrito en (McMahan y colaboradores, EMBO J. 10:2821-2832 (1991)). Las caracterlsticas anadidas a pDC409 (comparadas con las de pDC406) incluyen sitios de restriction adicionales unicos en el sitio de donation multiple (mcs); tres codones de detention (uno en cada marco de lectura) posicionados secuencia abajo del mcs; y un promotor polimerasa T7, secuencia abajo del mcs, que facilita la secuenciacion del ADN insertado en los mcs.

Para la expresion de la protelna de TSLP humana de longitud completa, la region entera de codification (esto es, la secuencia de ADN presentada en la SEQ ID NO: 1) se amplifica por medio de la reaction en cadena de la polimerasa (PCR). El molde empleado en la PCR es el clon de ADNc aislado de una biblioteca de ADNc de testlculo humano, como se describio en el Ejemplo 1. El ADN aislado y amplificado se inserta en el vector de expresion pDC409, para producir una construccion designada como pDC409-TSLP.

El polipeptido de LZ-TSLP se emplea para analizar la habilidad para enlazarse a las celulas huesped que expresan a los receptores recombinantes o endogenos de TSLP, como se describio anteriormente. Se cultivan las celulas que expresan al receptor de TSLP en DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina, estreptomicina y glutamina. Las celulas se incuban con LZ-TSLP (5 mg/ml) aproximadamente durante 1 hora. Despues de la incubation, se lavan las celulas para remover la LZ-TSLP no enlazada y se incuba con anticuerpo monoclonal anti- LZ biotinilado (5 mg/ml), y estreptavidina conjugada con ficoeritrina (1:400), antes del analisis por medio de escaneo de las celulas activadas por fluorescencia (FACS). El analisis citometrico se llevo a cabo sobre un FACscan (Beckton Dickinson, San Jose, CA).

Las celulas que expresan a los receptores de TSLP mostraron un enlazamiento significativamente mejorado de LZ- TSLP, comparado con las celulas de control que no expresan a los receptores de TSLP.

EJEMPLO 8: Induction del desarrollo de celulas T a partir de medula osea por medio de TSLP e IL-7

La TSLP humana, en combination con IL-7, induce la excretion de celulas T a partir de medula osea human.

Se aislaron celulas mononucleares derivadas de medula osea humana (BM MNC) por medio de centrifugation de medula osea entera sobre Ficoll. Se cultivaron las BM MNC en medio de McCoy suplementado con suero fetal bovino al 10% y, suplementos de aminoacido y vitamina, en una concentration en el rango entre 4,5-10 x 105 celulas/ml en un volumen total de 6 o 7 ml por frasco (T25). La TSLP humana (20 ng/ml) y otras citoquinas, por ejemplo, IL-7, SLF (esto es factor de acero o factor de celulas madre, o factor de crecimiento de mastocitos), o flt3L, ya sea solos o en combinacion, fueron anadidas a los cultivos el dla 0. Despues de 14 dlas y despues semanalmente, se removio la mitad del cultivo para recuento. Se anadieron medio fresco y citoquinas a los cultivos para restituir el volumen total a 6 o 7 ml.

Las celulas cultivadas fueron analizadas tambien por medio de citometrla de flujo catorce dlas despues del cultivo y luego semanalmente, utilizando anticuerpos especlficos para los antlgenos en la superficie de la celula. Los anticuerpos utilizados fueron especlficos para los antlgenos de celulas T (esto es, las celulas T ap CD56), antlgenos de monocito (esto es, CD14), y antlgenos de granulocito (esto es, CD15).

La adicion de TSLP humana e IL-7 a cultivos de BM MNC indujo el crecimiento celular como se indica en la Tabla 1. El dla 0, aproximadamente el 5% de BM MNC eran celulas T. Despues de 2 semanas de cultivo con TSLP e IL-7, los cultivos consistlan de 70% de celulas T CD3+. El dla 21, 86% de las celulas eran celulas T CD3+. Los cultivos contenlan predominantemente celulas T hasta la termination del experimento el dla 42.

La TSLP humana de longitud completa se puede expresar y analizar por la de TSLP. El ensayo de enlazamiento se puede llevar a cabo como sigue.

Se emplea una protelna de fusion que contiene un peptido de cierre de

TABLA 1

: Rendimiento Total de Celulas (x 105)

Tratamiento: Dla 0 Dla 14 Dla 21 Dla 28 Dla 42 Acumulado

: 13,5

Medio: 6 1,1 0,4 0,9 8,4

TSLP: 3,9 2,1 1 2,9 9,9

IL-7: 4,2 7,4 4,4 4,6 20,6

IL-7+TSLP: 10,3 12,1 17,2 7,5 47,1

SLF: 3,7 4,3 1,1 0,9 10

SLF+TSLP: 5,4 6,9 1 1,6 14,9

flt3L: 6,3 2,3 2,8 1,8 13,2

flt3L+TSLP: 7,7 4,7 2,7 3,1 18,2

En otro conjunto de experimentos, tres lotes separados de TSLP humana marcados con His/FLAG® (TSLP 7489, TSLP 7811, o TSLP 7812) fueron analizados solos o en combinacion con IL-7 por la habilidad para afectar la 5 supervivencia y expansion de las celulas. Los cultivos de BM MNC se obtuvieron a partir de dos muestras separadas de medula osea fresca y sembrados en una concentracion ya sea de 5 x 105 celulas/ml (Grupo 1) o 10 x 105 celulas/ml (Grupo 2). Se anadio TSLP marcado con His/FLAG® (20 mg/ml) e IL-7 a cultivos como se describio anteriormente. La TSLP combinada con IL-7 resulto en la expansion de los cultivos de BM MNC como se indica en la Tabla 2 (muestra 1 de medula osea) y en la Tabla 3 (muestra 2 de medula osea). Hacia el dla 21, 80% de la 10 poblacion expandida de celulas consistla de celulas T CD4+ ap+ o CD8+ ap+. En cuatro de los cultivos tratados con IL-7 y TSLP, las celulas se expandieron en los cultivos que contenlan predominantemente celulas T hasta la terminacion de los experimentos en las semanas 4-5.

TABLA 2

: Rendimiento Total de Celulas (x 105)

Tratamiento: Dla 0 Dla 14 Dla 21 Dla 28 Dla 35 Acumulado

Grupo 1 (5 x 105): 17,5

Medio: 4 1,3 1,4 ND* 6,7

IL-7: 8,4 6,5 7,1 ND* 22

TSLP 7489: 4,4 1,5 1,2 ND* 7,1

TSLP 7811: 5,2 1,7 1,2 ND* 8,1

TSLP 7812: 2,8 1,4 2,3 ND* 6,5

IL-7 + T7489: 12.4 9,1 8,3 ND* 29,8

IL-7 + T7811: 10.5 5,3 8,4 ND* 24,2

IL-7 + T7812: 9,7 6,5 4,7 ND* 20,9

Tratamiento: Dla 0 Dla 14 Dla 21 Dla 28 Dla 35 Acumulado

Grupo 2 (10 x 105): 35

Medio: 6,6 3,1 2,2 ND* 11,9

IL-7: 14,8 10,1 3,7 ND* 32,3

TSLP 7489: 11,5 3,3 2,9 ND* 17,7

TSLP 7811: 13,3 2,8 3,1 ND* 19,2

TSLP 7812: 13 3,2 2,6 ND* 18,8

IL-7 + T7489: 25,6 17,7 8 10,9 62,2

IL-7 + T7811: 18,8 16,8 10 15,7 61,3

IL-7 + T7812: 22,4 13,5 10,4 11,6 57,9

*ND= no se determino (cultivo agotado)

TABLA 3

: Rendimiento Total de Celulas (x 105)

Tratamiento: Dla 0 Dla 14 Dla 21 Dla 23 Dla 28 Dla 35 Acumulado

Grupo 1 (5 x 105): 17,5

Medio: 3,1 0,9 ND* 0,8 ND* 4,8

IL-7: 3,8 8,9 ND* 8 ND* 20,7

TSLP 7489: 3 1,1 ND* 0,8 ND* 4,9

TSLP 7811: 2,6 1,3 ND* ND* ND* 3,9

TSLP 7812: 3,8 1,2 ND* 0,9 ND* 5,9

IL-7 + T7489: 8,9 80 39,4 18,2 21 167,5

IL-7 + T7811: 6,2 12,5 ND* 16,7 14,3 49,7

IL-7 + T7812: 7,1 14,5 ND* 11,1 11,6 44,3

Tratamiento: Dla 0 Dla 14 Dla 21 Dla 23 Dla 28 Dla 35 Acumulado

Grupo 2 (10 x 105): 35

Medio: 6,6 1,9 ND* 1,8 ND* 10,3

IL-7: 10,7 19 ND* 16,5 29,2 75,4

TSLP 7489: 6,8 3,2 ND* 3,3 ND* 13,3

TSLP 7811: 8,7 3,3 ND* 3,4 ND* 15,4

TSLP 7812: 7,1 3,1 ND* 2,7 ND* 12,9

IL-7 + T7489: 18,1 31,4 20 16,7 20,4 106,6

IL-7 + T7811: 13,9 26,2 46,8 17,9 19,2 124

IL-7 + T7812: 15,1 24,4 88,4 20,6 26,6 175,1

*ND= no se determino (cultivo agotado)

LISTADO DE SECUENCIA <110> Sims, John Lyman, Stewart 5 Armstrong, Allison McKenna, Hilary

<120> ADN de TSLP Humana y Polipeptidos

<130> 03260.0087-00304

<140>

10 <141>>

<150> 60/108.452 <151 > 1998-11-13 <160> 5

<170> Patent In Ver. 2.0 15 <210> 1

<211 > 743 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1

gcagccagaa agctctggag catcagggag actccaactt aaggcaacag catgggtgaa 60

taagggcttc ctgtggactg gcaatgagag gcaaaacctg gtgcttgagc actggcccct 120

aaggcaggcc ttacagatct cttacactcg tggtgggaag agtttagtgt gaaactgggg 180

tggaattggg tgtccacgta tgttcccttt tgccttacta tatgttctgt cagtttcttt 240

caggaaaatc ttcatcttac aacttgtagg gctggtgtta ecttacgact tcactaactg 300

tgactttgag aagattaaag cagcctatct cagtactatt tctaaagacc tgattacata 360

tatgagtggg accaaaagta ccgagttcaa caacaccgtc tcttgtagca atcggccaca 420

ttgccttact gaaatccaga gcctaacctt caatcccacc gccggctgcg cgtcgctcgc 4BQ

caaagaaatg ttcgccatga aaactaaggc tgccttagct atctggtgcc caggctattc 540

ggaaactcag ataaatgcta ctcaggcaat gaagaagagg agaaaaagga aagtcacaac 600

caataaatgt ctggaacaag tgtcacaatt acaaggattg tggcgtcgct tcaatcgacc 660

tttactgaaa caacagtaaa ccatctttat tatggtcata tttcscagcc caaaataaat 720

catctttatt aagtaaaaaa aaa 743

<210>2 <211> 159 <212> PRT

5 <213> Homo sapiens

<400>2

Met Phe Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Val Leu Ser Val Ser Phe Arg Lys

15 10 15

lie Phe lie Leu Gin Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp Phe Thr

20 25 30

Asn Cys Asp Phe Glu Lys lie Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr lie Ser

35 40 45

Lys Asp Leu He Thr Tyr Met Ser Gly Tbr Lys Ser Thr Glu Phe Asn

50 55 60

Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu lie Gin

65 70 75 80

Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu

85 90 95

Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala lie Trp Cys Pro Gly 100 105 110

Tyr Ser Glu Thr Gin lie Asn Ala Thr Gin Ala Met Lys Lys Arg Arg

115 120 125

Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gin Val Ser Gin Leu 130 135 140

Gin Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gin Gin 145 150 155

<210>3 <211>8 <212> PRT

5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: peptido antigenico utilizado en protelnas de fusion <400>3

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

<210>4 <211> 27 <212> PRT

5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: polipeptido de cierre de leucina <400> 4

Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gin Gin Val Glu Ala Leu Gin Gly Gin 15 10 15

Val Gin His Leu Gin Ala Ala Phe Ser Gin Tyr 20 25

10 <210>5

<211> 33 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

15 <223> Descripcion de la Secuencia Artificial: polipeptido de cierre de leucina

<400> 5

Arg Met Lys Gin lie Glu Asp Lys lie Glu Glu He Leu Ser Lys lie 15 10 15

Tyr His lie Glu Asn Glu lie Ala Arg He Lys Lys Leu lie Gly Glu 20 25 30

Arg

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipeptido purificado de TSLP seleccionado del grupo que consiste de:

a) el polipeptido de TSLP de la SEQ ID NO: 2;

b) un fragmento del polipeptido de (a), desde el aminoacido 29 hasta el aminoacido 159, y desde el aminoacido 35 5 hasta el aminoacido 159 de la SEQ ID NO: 2;

c) un polipeptido de TSLP que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2; y

d) un polipeptido de TSLP que comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 95% identica a la secuencia de aminoacidos presentada en la SEQ ID NO: 2.
2. El polipeptido de TSLP de la SEQ ID NO: 2.

10 3. El polipeptido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en una forma no glicosilada.
4. Una protelna de fusion que comprende el polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 fusionada al C-terminal o N-terminal a otra protelna o un peptido o polipeptido.
5. Una composicion que comprende un polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un diluyente, excipiente, o portador fisiologicamente aceptable.

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