PT1129190E

PT1129190E - Adn e polipéptidos de tslp humanos.

Info

Publication number: PT1129190E
Application number: PT99960372T
Authority: PT
Inventors: John E Sims; Stewart Lyman; Hilary Mckenna; Allison Armstrong
Original assignee: Immunex Corp
Priority date: 1998-11-13
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2007-08-08
Also published as: US20100266601A1; EP1129190B2; IL143034A; EP1129190A1; US7304144B2; IL195812A0; NZ512105A; WO2000029581A1; JP2013078331A; US20020146819A1; US20130225490A1; IL195812A; IL143034A0; ES2288036T5; JP2002530079A; US7405058B2; DE69936105T2; DE69936105T3; DK1129190T3; CY1106806T1

Description

DESCRIÇÃO "ADN E POLIPÉPTIDOS DE TSLP HUMANOS"

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica, por este meio, o beneficio do pedido provisório dos Estados Unidos S.N. 60/108452, apresentado em 13 de Novembro de 1998.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção A invenção é dirigida a novos polipéptidos de linfopoietina de estroma timico humano (TSLP) purificados e isolados e seus fragmentos, a ácidos nucleicos codificando esses polipéptidos, processos para a produção de formas recombinantes desses polipéptidos, anticorpos produzidos contra estes polipéptidos, péptidos fragmentados derivados destes polipéptidos, e suas utilizações.

Descrição da Técnica Relacionada

Embora o desenvolvimento de células B tenha sido extensivamente estudado, ainda permanecem falhas na via que

conduz as células estaminais hematopoiéticas em células B 1 maduras. É reconhecido que as citocinas influenciam e desempenham um papel critico no desenvolvimento e crescimento de células B. As citocinas conhecidas que influenciam 0 desenvolvimento de células B incluem IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IFN-gama, e factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF).

Nos últimos anos, um novo factor de crescimento de murino, designado linfopoietina de estroma timico (TSLP), demonstrou desempenhar um papel no desenvolvimento e maturação de células B. A actividade de citocina de TSLP de murino é muito semelhante à de IL-7, que é necessária durante proliferação e sobrevivência de células pré-B (Janeway et al., Immuno Biology, 2a Ed. (1996)) . Ambas estas citocinas demonstraram sustentar células NAG8/7 (Friend et al., Exp. Hematol, 22:321-328 (1994)) e apoiar a linfopoiese de B. Adicionalmente, os linfócitos B maduros não se desenvolvem na ausência quer de IL-7 ou de TSLP de murino. Além disso, foi demonstrado que os TSLP de murino podem substituir IL-7 no sustento de respostas proliferativas de células B (Ray et al., Eur. J. Immunol., 26:10-16 (1996)).

Assim, no sistema de murganho, o TSLP possui uma função significativa no desenvolvimento das células B.

Tal como IL-7, TSLP de murino pode também co-estimular timócitos e células T maduras (Friend et al., Exp. Hematol., 22: 321-328 (1994)) . Estudos com murganhos com o receptor de IL-7 (IL-7R) desactivado indicam que IL-7, TSLP, ou ambos desempenham um papel crucial no controlo do rearranjo do locus do receptor gama de células T (TCRy), presumivelmente por mediação da acessibilidade dos genes TCRy à recombinase de VDJ (Candeias et al., Immunology Letters, 57:9-14 (1997)). Assim, o TSLP de 2 murino também desempenha um papel significativo no desenvolvimento de células T.

Os receptores de TSLP de murino e receptores de IL-7 utilizam ambos a cadeia α de IL-7R como parte dos seus complexos de sinalização (Levin et al.f J. Immunol., 162:677-683 (1999)). Apesar da cadeia α de IL-7R comum, todavia, IL-7 e TSLP parecem mediar os seus efeitos linfopoiéticos através de mecanismos distintos. A IL-7 induz a activação de Stat5 e a familia das cinases de Janus Jakl e Jak3, enquanto que o TSLP de murino induz a activação de Stat5, mas não de qualquer uma das cinases da familia de Janus conhecidas (Levin et al., J. Immunol., 162:677-683 (1999)) .

Dada a função importante do TSLP de murino e a significância do seu papel no desenvolvimento e maturação em células B e células T no sistema de murganho, há uma necessidade na técnica para identificar e isolar TSLP humano e para estudar o seu papel no desenvolvimento e maturação de células B e células T humanas. Adicionalmente, à luz do interesse continuado no desenvolvimento de linfócitos e do sistema imunitário, a descoberta, identificação, e papéis das novas proteínas, tais como TSLP humano e seus receptores, estão na linha da frente da biologia molecular, bioquímica, e imunologia modernas. Apesar do crescente leque de conhecimentos, há ainda uma necessidade na técnica para a identidade e função das proteínas envolvidas nas respostas celulares e imunitárias.

Noutro aspecto, a identificação da estrutura primária, ou sequência, de uma proteína desconhecida é o culminar de um processo árduo de experimentação. De modo a identificar uma proteína desconhecida, o investigador pode basear-se numa 3 comparação da proteína desconhecida para péptidos conhecidos utilizando uma variedade de técnicas conhecidas dos especialistas na técnica. Por exemplo, as proteínas são analisadas de rotina utilizando técnicas, tais como electroforese, sedimentação, cromatografia, sequenciação e espectrometria de massa.

Em particular, a comparação de uma proteína desconhecida com os polipéptidos de peso molecular conhecido permite uma determinação do peso molecular aparente da proteína desconhecida (T.D. Brock e M.T. Madigan, Biology of Microorganisms, pp. 76-77, Prentice Hall, 6a ed., (1991)). Os padrões de peso molecular de proteína estão comercialmente disponíveis para auxiliar na avaliação dos pesos moleculares da proteína desconhecida (New England Biolabs Inc. Catalog: 130-13 (1995)); (J.L. Hartley,

Patente U.S. N° 5 449 758). Todavia, os padrões de peso molecular podem não corresponder rigorozamente, em tamanho, à proteína desconhecida para permitir uma avaliação precisa do peso molecular aparente. A dificuldade na avaliação do peso molecular é agarvada no caso de proteínas que estão sujeitas a fragmentação por meio químico ou enzimático, modificadas por modificação pós-tradução ou processamento, e/ou associadas a outras proteínas em complexos não covalentes.

Adicionalmente, a natureza única da composição de uma proteína no que se refere aos seus constituintes de aminoácidos específicos resulta no posicionamento único de sítios de clivagem na proteína. A fragmentação específica de uma proteína por clivagem química ou enzimática resulta numa "impressão digital de péptido" (D.W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252:1102-1106 (1977); M. Brown et al., J. Gen. Virol. 50:309-316 (1980)). Consequentemente, a clivagem em sítios específicos 4 resulta na fragmentação reprodutível de uma dada proteína em péptidos de pesos moleculares precisos. Além disso, estes péptidos possuem características de carga únicas que determinam o pH isoeléctrico do péptido. Estas características únicas podem ser exploradas utilizando uma variedade de técnicas electroforéticas e outras (T.D. Brock e M.T. Madigan, Biology of Microorganisms, pp. 76-77, Prentice Hall, 6a ed. (1991)). A fragmentação de proteínas é ainda empregue para análise da composição de aminoácidos e sequenciação de proteína (P. Matsudiara, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 (1987); C. Eckerskorn et al., Electrophoresis, 9:830-838 (1988)), particularmente a produção de fragmentos de proteínas com um terminal N "bloqueado". Adicionalmente, as proteínas fragmentadas podem ser utilizadas para imunização, para selecção por afinidade (R.A. Brown, Patente U.S. N° 5151412), para determinação de sítios de modificação (e. g. fosforilação), para a criação de compostos biológicos activos (T.D. Brock e M.T. Madigan, Biology of Microorganisms, 300-301 (Prentice Hall, 6a ed., (1991)), e para a diferenciação de proteínas homólogas (M. Brown et al., J. Gen. Virol., 50:309-316 (1980)).

Adicionalmente, quando é obtida uma impressão digital de péptidos de uma proteína desconhecida, pode ser comparada com uma base de dados de proteínas conhecidas para assistir na identificação da proteína desconhecida utilizando espectrometria de massa (W.J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5011-5015 (1993); D. Fenyo et al., Electrophoresis, 19:998- 1005 (1998)). Uma variedade de programas de software de computador para facilitar estas comparações estão acessíveis através da Internet, tais como Protein Prospector (Sítio da

Internet: prospector.uscf.edu), Multildent (Sítio da Internet: 5 www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (Sitio da Internet: www.mann.embl-heiedelberg.de...deSearch/FR_PeptideSearch Form.html), e ProFound (Sitio da Internet: www.chaitsgi.rockefeller.edu/cgi-bin/protid-frag.html). Estes programas permitem gue o utilizador especifigue o agente de clivagem e os pesos moleculares dos péptidos fragmentados dentro de uma tolerância designada. Os programas comparam estes pesos moleculares com a informação do peso molecular da proteína armazenada em bases de dados para apoiar a determinação da identidade da proteína desconhecida. É necessária informação precisa em relação ao número de péptidos fragmentados e ao peso molecular preciso destes péptidos para uma identificação precisa. Por isso, o aumento da precisão na determinação do número de péptidos fragmentados e o peso molecular preciso deve resultar num aumento da probabilidade de sucesso na identificação de proteínas desconhecidas.

Adicionalmente, as digestões de péptidos da proteína desconhecida podem ser sequenciadas utilizando espectrometria de massa tandem (MS/MS) e a sequência resultante é pesquisada contra as bases de dados (J.K. Eng, et al., J. Am. Soc. Mass Spec. 5:976-989 (1994); M. Mann e M. Wilm, Anal. Chem., 66:4390-4399 (1994); J.A. Taylor e R.S. Johnson, Rapid Comm. Mass Spec., 11:1067-1075 (1997)). Os programas de pesquisa que podem ser utilizados neste processo existem na Internet, tais como Lutefisk 97 (Sítio da internet: www.lsbc.com: 70/Lutefisk97.html), e os programas Protein Prospector, Peptide Search e ProFound descritos acima. Por isso, adicionar a sequência de um gene e a sua sequência de proteína prevista e fragmentos peptídicos a uma base de dados de sequências pode auxiliar na identificação das proteínas desconhecidas utilizando espectrometria de massa tandem. 6

Assim, existe também uma necessidade na técnica para polipéptidos adequados para utilização em estudos de fragmentação de péptidos, para utilização em medições de peso molecular, e para utilização em sequenciação de proteína utilizando espectrometria de massa tandem.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção auxilia no preenchimento destas várias necessidades na técnica ao proporcionar ácidos nucleicos isolados de TSLP humanos e polipéptidos codificados por estes ácidos nucleicos. Formas de realização particulares da invenção são dirigidas a uma molécula de ácido nucleico de TSLP isolada compreendendo a sequência de ADN de SEQ ID N°:l e uma molécula de ácido nucleico de TSLP isolada codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2, assim como moléculas de ácido nucleico complementares a estas sequências. Quer as moléculas de ácido nucleico de ARN e ADN de cadeia simples quer de cadeia dupla estão contempladas pela invenção, assim como as moléculas de ácido nucleico que hibridam com um ADN, de cadeia dupla desnaturado compreendendo a totalidade ou uma porção de SEQ ID N°: 1. Estão também compreendidas moléculas de ácido nucleico isoladas que são derivadas por mutagénese in vitro da molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de SEQ ID N°:l, que são degeneradas da molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de SEQ ID N°:l, e que são variantes alélicas do ADN da invenção. A invenção também abrange vectores recombinantes que dirigem a expressão destas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras transformadas ou transfectadas com estes vectores. 7

Adicionalmente, a invenção abrange métodos de utilização do ácido nucleico acima referido para identificar ácidos nucleicos codificando proteínas possuindo a capacidade para induzir a proliferação de células da linhagem B ou linhagem T; para identificar o cromossoma humano número 5; para mapear genes no cromossoma humano número 5; para identificar genes associados a certas doenças, sindromes, ou outros estados humanos associados ao cromossoma humano número 5; e para estudar a sinalização celular e o sistema imunitário. A invenção também abrange a utilização de oligonucleótidos de sentido ou anti-sentido do ácido nucleico de SEQ ID N°:l para inibir a expressão do polinucleótido codificado pelo gene de TSLP. A invenção também abrange polipéptidos isolados e seus fragmentos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que incluem porções de polipéptido solúveis de SEQ ID N°:2. A invenção abrange ainda métodos para a produção destes polipéptidos, incluindo cultivar uma célula hospedeira em condições que promovem a expressão e recuperando o polipéptido do meio de cultura. Especialmente, a expressão destes polipéptidos em células de bactérias, leveduras, plantas, insectos e animais está abrangida pela invenção.

Em geral, os polipéptidos da invenção podem ser utilizados para estudar processos celulares, tais como regulação imunitária, proliferação celular, diferenciação celular, morte celular, migração celular, interacção célula-a-célula, e respostas inflamatórias. Adicionalmente, Estes polipéptidos podem ser utilizados para identificar proteínas associadas a ligandos de TSLP e receptores de TSLP.

Adicionalmente, a invenção inclui ensaios utilizando estes polipéptidos para pesquisar potenciais inibidores de actividade associados a moléculas de contra-estrutura do polipéptido, e métodos de utilização destes polipéptidos como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças mediadas por moléculas contra-estrutura de polipéptido de TSLP. Além disso, os métodos de utilização destes polipéptidos na concepção dos seus inibidores são também um aspecto da invenção. A invenção inclui, ainda, um método para utilização destes polipéptidos como marcadores de peso molecular que permitem a avaliação do peso molecular de uma proteína ou uma proteína fragmentada, assim como um método para a visualização dos marcadores de peso molecular da invenção destes utilizando electroforese. A invenção abrange ainda métodos para a utilização dos polipéptidos da invenção como marcadores para determinar o ponto isoeléctrico de uma proteína desconhecida, assim como controlos para estabelecer a extensão da fragmentação de uma proteína.

Ainda abrangidos por esta invenção estão kits para auxiliar nestas determinações.

Ainda abrangida por esta invenção está a utilização das sequências de ácido nucleico de TSLP humano, sequências previstas de aminoácidos do polipéptido ou fragmentos deste, ou uma combinação das sequências de aminoácidos previstas do polipéptido e seus fragmentos para utilização na pesquisa de uma 9 base de dados electrónica para auxiliar na identificação de ácidos nucleicos e/ou proteínas da amostra.

Anticorpos isolados policlonais ou monoclonais que se ligam a estes polipéptidos também estão abrangidos pela invenção, assim como a utilização desses anticorpos para auxiliar na purificação do polipéptido de TSLP. Adicionalmente, os anticorpos isolados podem ser utilizados para estabelecer um Ensaio de Imunoabsorção Ligado à Enzima (ELISA) para medir TSLP em amostras, tal como soro.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta a sequência de nucleótidos de ADN de TSLP humano (SEQ ID N°:l), e

Figura 2 apresenta a sequência de aminoácidos de TSLP humano (SEQ ID N°:2).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As moléculas de ácido nucleico abrangidas na invenção incluem a seguinte sequência de nucleótidos: 10

Nome: TSLF 1 GCAGCCAGAA AGCTCTGGAG CATCAÕGGAG ACTCCAACTT AAGGCAACAG 51 CATGGGTGAA TAAGGGCTTC CTGTGGACTG GCAATGAGAG GCAAAACCTG 101 GTGCTTGAGC ACTGGCCCC7 AAGGCAGGCC TTACAGATCT CTTACACTCG 151 TGGTGGGAAG AGTTTAGTGT GAAACTGGGG TGGAATTGGG TGTCCACGTA 201 TGTTCCCnT TGCCTTACTA TATGTTCTGT CAGTTTCTTT CAGGAAAATC 251 TTCATCTTAC AACTTGTAGG GCTGGTGTTA ACTTACGACT TCACTAACTG 301 TGACTTTGAG AAGATTAAAG CAGCCTATCT CAGTACTATT TCTAAAGACC 351 TGATTACATA TATGAGTGGG ACCAAAAGTA CCGAGTTCAA CAACACCGTC 401 TCTTGTAGCA ATCGGCCACA TTGCCTTACT GAAATCCAGA GCCTAACCTT 451 CAATCCCACC GCCGGCTGCG CGTCGCTCGC CAAAGAAATG TTCGCCATGA 501 AMCTAAGGC TGCCTTAGCT ATCTGGTGCC CAGGCTATTC GGAAACTCAG 551 ATAAATGCTA CTCAGGCAAT GAAGAAGAGG AGAAAAAGGA AAGTCACAAC 601 CAATAAATGT CtGGAACAAG TGTCACAATT ACAAGGATTG TGGCGTCGCT 651 TCAATCGACC TTTACTGAAA CAACAGTAAA CCATCTTTAT TATGGTCATA 701 TTTCACAGCC CAÂAATAAAT CATCTTTATT AAGTAAAAAA AAA SEQ ID N°:l A sequência de aminoácidos do polipéptido codificado pela sequência de nucleótidos da invenção inclui:

Nome: TSLP (polipéptido) 1 HFPFALLm SVSFRKIFIL QLVG1VLTYD FTNCDFRKIK AAYLSTISKD 51 LITYMS6TKS TEFNNTVSCS NRPHCLTEIQ SLTFKPTAGC ASLAKEMFAM 101 KTKAALAIWC PGYSETQINA TQ&MKKRRKR KVTTNKCLEQ VSOLOGLWRR 151 FNRPLLKQQ $EQ ID N° : 2 A verificação dos ácidos nucleicos da invenção permite a construção de vectores de expressão compreendendo sequências de ácido nucleico codificando polipéptidos; células hospedeiras transfectadas ou transformadas com os vectores de expressão; polipéptidos isolados e purificados biologicamente activos e 11 seus fragmentos; a utilização dos ácidos nucleicos ou oligonucleótidos destes como sondas para identificar ácido nucleico codificando proteínas possuindo actividade do tipo TSLP (e. g., induzindo a proliferação celular da linhagem B ou linhagem T) , a utilização dos ácidos nucleicos ou oligonucleótidos destes para identificar o cromossoma humano número 5; a utilização dos ácidos nucleicos ou oligonucleótidos destes para mapear genes no cromossoma humano número 5; a utilização do ácido nucleico ou oligonucleótidos deste para identificar genes associados a certas doenças, síndromes ou outros estados humanos associados ao cromossoma humano número 5 e, em particular, à região q21-q22 do cromossoma número 5, incluindo síndrome de Gardner, polipose adenomatosa familiar, doença desmóide hereditária, síndrome de Turcot, e cancro colorrectal; a utilização de oligonucleótidos de cadeia simples de sentido ou anti-sentido dos ácidos nucleicos para inibir a expressão de polinucleótidos codificados pelo gene TSLP; a utilização desses polipéptidos e fragmentos solúveis para induzir a proliferação celular da linhagem B ou linhagem T; a utilização desses polipéptidos e péptidos fragmentados como marcadores de peso molecular; a utilização desses polipéptidos e péptidos fragmentados como controlos para a fragmentação de péptidos, e kits compreendendo estes reagentes; a utilização desses polipéptidos e seus fragmentos para produzir anticorpos; e a utilização dos anticorpos para purificar polipéptidos TSLP.

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO

Numa forma de realização particular, a invenção refere-se a certas sequências de nucleótidos isoladas que estão isentas de material contaminante endógeno. Uma "sequência de nucleótidos" 12 refere-se a uma molécula de polinucleótido na forma de um fragmento separado ou como um componente de uma construção de ácido nucleico maior. A molécula de ácido nucleico derivou de ADN ou ARN isolado pelo menos uma vez numa forma substancialmente pura e numa quantidade ou concentração que permite a identificação, manipulação, e recuperação das suas componentes de sequências de nucleótidos por métodos bioquímicos convencionais (tais como aqueles apresentados em (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Essas sequências são, de um modo preferido, proporcionadas e/ou construídas na forma de uma grelha de leitura aberta não interrompida por sequências internas não traduzidas, ou intrões, que estão presentes tipicamente em genes eucarióticos. As sequências de ADN não traduzidas podem estar presentes a 5' ou 3' de uma grelha de leitura aberta, em que as mesmas não interferem com a manipulação ou expressão da região codificante.

Moléculas de ácido nucleico da invenção incluem ADN tanto na forma de cadeia simples como de cadeia dupla, assim como o seu ARN complementar. 0 ADN inclui, por exemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado quimicamente, ADN amplificado por PCR, e combinações destes. 0 ADN genómico pode ser isolado através de técnicas convencionais, e. g., utilizando o ADNc de SEQ ID N°:l, ou um seu fragmento adequado, como uma sonda.

As moléculas de ADN da invenção incluem genes de comprimento total, assim como polinucleótidos e seus fragmentos. 0 gene de comprimento total pode também incluir o péptido sinal N-terminal. Outras formas de realização incluem ADN codificando uma forma solúvel, e. g., codificando o domínio extracelular da proteína, seja com ou sem o péptido sinal. 13

Os ácidos nucleicos da invenção são, de um modo preferido, derivados de fontes humanas, mas a invenção inclui também aqueles que derivam de espécies não humanas.

Sequências Preferidas A sequência de nucleótidos particularmente preferida da invenção é SEQ ID N°:l, como apresentado acima. Um clone de ADNc possuindo a sequência de nucleótidos de SEQ ID N°: 1 foi isolado como descrito no Exemplo 1. A sequência de aminoácidos codificada pelo ADN da SEQ ID N°:l é apresentada em SEQ ID N°:2. Esta sequência identifica o polinucleótido TSLP como um membro de um grupo de factores que influenciam o crescimento de células da linhagem B e linhagem T (Ray et al., Eur. J. Immunol, 26:10-16 (1996)); (Friend et al., Exp. Hematol., 22:321-328 (1994)).

Sequências Adicionais

Devido à degeneração conhecida do código genético, em que mais do que um codão pode codificar os mesmos aminoácidos, a sequência de ADN pode variar em relação aquela apresentada em SEQ ID N°:l, e ainda assim codificar um polipéptido possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2. Essas sequências variantes de ADN podem resultar de mutações silenciosas (e. g., que ocorrem durante a amplificação por PCR), ou pode ser o produto de mutagénese deliberada de uma sequência nativa. A invenção proporciona, assim, sequências de ADN isoladas

codificando polipéptidos da invenção, seleccionadas de: (a) ADN 14

compreendendo a sequência de nucleótidos de SEQ ID N°:l; (b) ADN codificando o polipéptido de SEQ ID N°:2; (c) ADN capaz de hibridação com um ADN de (a) ou (b) em condições de restringência moderada e que codifica polipéptidos da invenção; (d) ADN capaz de hibridação com um ADN de (a) ou (b) em condições de restringência elevada e que codifica polipéptidos da invenção, e (e) ADN que é degenerado como um resultado do código genético para um ADN definido em (a), (b), (c), ou (d) e que codifica polipéptidos da invenção. Certamente, os polipéptidos codificados por essas sequências de ADN estão abrangidas pela invenção.

Como aqui utilizado, as condições de restringência moderada podem ser rapidamente determinada pelos que possuem experiência normal na técnica, com base em, por exemplo, o comprimento do ADN. As condições básicas são apresentadas por (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Vol. 1, pp. 1 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), e incluem a utilização de uma solução de pré-lavagem para filtros de nitrocelulose a 5X SSC, SDS a 0,5%, EDTA a 1,0 mM (pH 8,0), condições de hibridação de cerca de 50% de formamida, 6X SSC a cerca de 42 °C (ou outra solução de hibridação semelhante, tal como solução de Stark, em cerca de 50% de formamida a cerca de 42 °C) , e condições de cerca de 60 °C, 0,5X SSC, SAS a 0,1%. As condições de restringência elevada também podem ser rapidamente determinadas pelo especialista na técnica, com base em, por exemplo, o comprimento do ADN. De um modo geral, essas condições são definidas cornos condições de hibridação, como acima, e com lavagem a aproximadamente 68 °C, 0,2X SSC, SDS a 0,1%. O especialista na técnica reconhece que a temperatura e a concentração salina da solução de lavagem pode ser ajustada como 15 necessário, de acordo com factores, tal como o comprimento da sonda.

Também incluido como uma forma de realização da invenção está o ADN codificando fragmentos de polipéptidos e polipéptidos compreendendo sitio (s) de N-glicosilação, sitio(s) de processamento de protease inactivados, substituição de aminoácidos inactivados ou conservados, como descrito abaixo.

Noutra forma de realização, as moléculas de ácido nucleico da invenção também compreendem sequências de nucleótidos que são, pelo menos, 80% idênticas a uma sequência nativa. Também contempladas estão formas de realização em que uma molécula de ácido nucleico compreende uma sequência que é, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica ou, pelo menos 99,9% idêntica a uma sequência nativa. A percentagem de identidade pode ser determinada por inspecção visual e cálculo matemático. Alternativamente, a percentagem de identidade de duas sequências de ácido nucleico podem ser determinadas comparando a informação da sequência utilizando o programa de computador GAP, versão 6.0 descrita por (Devereux et al., Nucl. Acids Res., 12:387 (1984)) e disponível a partir do University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Os parâmetros preferidos por defeito para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) para nucleótidos, e a matriz de comparação ponderada de (Gribskov e Burgess, Nucl. Acids Res., 14:6745 (1986)), como descrito por (Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and

Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 16 (1979)); (2) uma penalização de 3,0 para cada interrupção e uma penalização adicional de 0,10 para cada simbolo em cada interrupção; e (3) sem penalização para interrupções terminais. Outros programas utilizados por um especialista na técnica de comparação de sequências também podem ser utilizados.

A invenção também proporciona ácidos nucleicos isolados úteis na produção de polipéptidos. Esses polipéptidos podem ser preparados por qualquer uma de várias técnicas convencionais. A sequência de ADN codificando um polipéptido TSLP humano, ou fragmento desejado deste, pode ser subclonado num vector de expressão para a produção do polipéptido ou fragmento. A sequência de ADN é fundida, vantajosamente com uma sequência codificando um sinal lider ou de péptido adequado. Alternativamente, o fragmento desejado pode ser sintetizado quimicamente utilizando técnicas conhecidas. Os fragmentos de ADN também podem ser produzidos por digestão de endonuclease de restrição de uma sequência de ADN clonada de comprimento total, e isolados por electroforese em géis de agarose. Se necessário, os oligonucleótidos que fazem a reconstrução dos terminais 5' ou 3' para um ponto desejado pode ser ligado a um fragmento de ADN produzido por digestão de enzimas de restrição. Esses oligonucleótidos podem conter adicionalmente um sitio de clivagem de endonuclease de restrição a montante da sequência codificante desejada, e posição de um codão de iniciação (ATG) no terminal N da sequência codificante. O processo bem conhecido da reacção da polimerase em cadeia (PCR) também pode ser empregue para isolar e amplificar uma sequência de ADN codificando um fragmento de proteína desejado. Os oligonucleótidos que definem os terminais desejados do fragmento de ADN são empregues como iniciadores 5' e 3' . Os 17 oligonucleótidos podem conter, adicionalmente, sítios de

reconhecimento para endonucleases de restrição, para facilitar a inserção do fragmento de ADN amplificado num vector de expressão. As técnicas de PCR são descritas em (Saiki et al., Science, 239:487 (1988)); (Wu et al., Recombinant DNA

Methodology, eds., Academic Press, Inc., San Diego, pp. 189-196 (1989)); e (Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds., Academic Press, Inc. (1990)).

POLIPÉPTIDOS E SEUS FRAGMENTOS A invenção abrange polipéptidos e seus fragmentos em várias formas, incluindo aqueles que ocorrem naturalmente ou produzidos através de várias técnicas, tais como processos que envolvem tecnologia do ADN recombinante. Essas formas incluem, mas não estão limitadas a, derivados, variantes, e oligómeros, assim como proteínas de fusão ou seus fragmentos.

Polipéptidos e Seus Fragmentos

Os polipéptidos da invenção incluem proteínas de comprimento total codificadas pelas sequências de ácido nucleico apresentadas acima. Polipéptidos particularmente preferidos compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2 com os fragmentos particularmente preferidos compreendendo os aminoácidos 29 a 159 (a sequência de polipéptidos madura) de SEQ ID N°:2 . O polipéptido de SEQ ID N°:2 inclui uma região hidrofóbica N-terminal que funciona como um péptido sinal. A análise de 18 computador prevê que o péptido sinal corresponde aos resíduos la 28 de SEQ ID N°:2 (embora os sítios de clivagem de um péptido sinal mais provável por previsão em computador (por ordem descendente) ocorra após os aminoácidos 34 e 116 de SEQ ID N°:2). A clivagem do péptido sinal produziria assim uma proteína madura compreendendo os aminoácidos 29 até 159 de SEQ ID N°:2 . 0 especialista na técnica reconhecerá que as fronteiras acima descritas dessas regiões do polipéptido são aproximadas. Para ilustrar, as fronteiras do péptido sinal (que podem ser previstas utilizando programas de computador disponíveis para esse objectivo) podem diferir das descritas acima.

Os polipéptidos da invenção podem estar ligados à membrana ou podem ser segregados e assim, serem solúveis. Os polipéptidos solúveis são capazes de serem segregados das células nas quais são expressos. Em geral, os polipéptidos solúveis podem ser identificados (e distinguidos dos seus correspondente não solúveis ligados à membrana) por separação de células intactas que expressam o polipéptido desejado do meio de cultura, e. g., por centrifugação, e ensaiando o meio (sobrenadante) para a presença do polipéptido desejado. A presença de polipéptidos no meio indica que o polipéptido foi segregado das células e, por isso, é uma forma solúvel da proteína.

Numa forma de realização, os polipéptidos solúveis e seus fragmentos compreendem todo ou parte do domínio extracelular, mas falta-lhes a região transmembranar que provocaria retenção do polipéptido numa membrana celular. Um polipéptido solúvel pode incluir o domínio citoplásmico, ou uma sua porção, desde que o polipéptido seja segregado da célula na qual é produzido. 19

Outras formas de realização incluem fragmentos solúveis possuindo um terminal N nos aminoácidos 29 ou 35 e um terminal C no aminoácido 159.

Em geral, a utilização de formas solúveis é vantajosa para certas aplicações. A purificação dos polipéptidos das células hospedeiras recombinantes é facilitada, uma vez que os polipéptidos solúveis são segregados das células. Além disso, os polipéptidos solúveis são geralmente mais adequados para administração intravenosa. A invenção também proporciona polipéptidos e fragmentos do dominio extracelular que retém uma actividade biológica desejada. Formas de realização particulares são dirigidas a fragmentos de polipéptidos que retêm a capacidade para se ligarem a receptores de TSLP. Um tal fragmento pode ser um polipéptido solúvel, como descrito acima. Noutra forma de realização, os polipéptidos e fragmentos incluem vantajosamente regiões que são conservadas entre a família de proteínas que influenciam o crescimento de células da linhagem B ou linhagem T, como descrito acima.

Também proporcionado aqui são fragmentos de polipéptidos compreendendo pelo menos 20, ou pelo menos 30, aminoácidos contíguos da sequência de SEQ ID N°:2. Os fragmentos derivados do domínio citoplásmico encontram utilidade em estudos de transdução de sinal, e em processos de regulação celular associados a transdução de sinais biológicos. Fragmentos de polipéptidos também podem ser empregues como imunogénios, na criação de anticorpos. 20

Variantes São aqui proporcionadas variantes que ocorrem naturalmente, bem como variantes derivadas dos polipéptidos e fragmentos.

As variantes podem exibir sequências de aminoácidos que são, pelo menos, 80% idênticas. São também contempladas formas de realização em que um polipéptido ou fragmento compreende uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 90% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica ou, pelo menos, 99,9% idêntica ao seu polipéptido preferido ou seu fragmento. A percentagem de identidade pode ser determinada por inspecção visual e cálculo matemático. Alternativamente, a percentagem de identidade de duas sequências de proteína pode ser determinada comparando a sequência informação utilizando o programa de computador GAP, com base no algoritmo de (Needlemand e Wunsch, J. Mol. Bio., 48:443 (1970)) e disponível a partir do Genetics Computer Group da University of Wisconsin (LJWGCG). Os parâmetros preferidos por defeito do programa GAP incluem: (1) uma matriz de classificação, blosum62, como descrito por (Henikoff e Henikoff Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:10915 (1992)); (2) um peso de interrupção de 12; (3) um peso do comprimento da interrupção de 4; e (4) sem penalização para interrupções nas extremidades. Outros programas utilizados por um especialista na técnica de comparação de sequências podem também ser utilizados.

As variantes da invenção incluem, por exemplo, aquelas que resultam de eventos de excisão de ARNm aternativa ou de clivagem proteolítica. A excisão de ARNm alternativa pode, por exemplo, produzir uma proteína truncada, mas biologicamente activa, tais 21 como uma forma solúvel da proteína que ocorre naturalmente. Variações atribuíveis a proteólise incluem, por exemplo, diferenças no terminal N ou terminal C após expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido à remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais da proteína (geralmente dos aminoácidos terminais 1-5) . As proteínas nas quais as diferenças em sequências de aminoácidos são atribuíveis a polimorfismo genético (variação alélica entre indivíduos que produzem a proteína) também estão aqui contempladas.

Variantes adicionais dentro do âmbito da invenção incluem polipéptidos que podem ser modificadas para criar derivados destes, formando conjugados covalentes ou agregativos com outras unidades químicas, tais como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo e semelhantes. Derivados covalentes podem ser preparados ligando as unidades químicas a grupos funcionais nas cadeias laterais de aminoácidos ou no terminal N ou terminal C de um polipéptido. Os conjugados compreendendo agentes de diagnóstico (detectáveis) ou terapêuticos ligados a estes estão aqui contemplados, como discutido em maior detalhe abaixo.

Outros derivados incluem conjugados covalentes ou agregativos dos polipéptidos com outras proteínas ou polipéptidos, tais como por síntese em cultura recombinante como fusões N-terminais ou C-terminais. Exemplos de proteínas de fusão são discutidos abaixo em ligação com oligómeros. Além disso, as proteínas de fusão podem compreender péptidos adicionados para facilitar a purificação e identificação. Esses péptidos incluem, por exemplo, poli-His ou os péptidos de identificação antigénica descritos na Patente U.S. N°. 5011912 e em (Hopp et al.r Bio/Technology, 6:1204 (1988)). Um desses péptidos é o péptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, 22 (SEQ ID N°:3) que é altamente antigénico e proporciona um epitopo ligado irreversivelmente por um anticorpo monoclonal específico, permitindo o ensaio rápido e fácil purificação de proteína recombinante expressa. Um hibridoma de murino designado 4E1 produz um anticorpo monoclonal que se liga ao péptido FLAG® na presença de certos catiões metálicos divalentes, como descrito na Patente U.S. 5011912. A linha celular de hibridoma 4E11 foi depositada na American Type Culture Collection com o n° de acesso HB 9259. Os anticorpos monoclonais que se ligam ao péptido FLAG® estão disponíveis da Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Sistemas Division, New Haven, Connecticut.

Entre os polipéptidos variantes aqui proporcionados são variantes de polipéptidos nativos que retêm a actividade biológica nativa ou o seu substancialmente equivalente. Um exemplo é uma variante que se liga com essencialmente a mesma afinidade de ligação da forma nativa. A afinidade de ligação pode ser medida por processos convencionais, e. g., como descrito na Patente U.S. N°. 5512457 e como apresentados abaixo.

Variantes incluem polipéptidos que são substancialmente homólogos à forma nativa, mas que possuem uma sequência de aminoácidos diferente daquela da forma nativa devido a uma ou mais deleções, inserções ou substituições. Formas de realização particulares incluem, mas não estão limitadas a, polipéptidos que compreendem desde uma a dez deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos, quando comparado com uma sequência nativa.

Um dado aminoácido pode ser substituído, por exemplo, por um resíduo possuindo características físico-químicas semelhantes.

Exemplos dessas substituições conservativas incluem substituição 23 de um resíduo alifático por outro, tais como Ile, Vai, Leu, ou Ala por um outro; substituições de um resíduo polar por outro, tais como entre Lys e Arg, Glu e Asp, ou Gin e Asn; ou substituições de um resíduo aromático por outro, tais como Phe, Trp, ou Tyr por um outro. Outras substituições conservativas, e. g., envolvendo substituições de regiões inteiras possuindo caracteristicas de hidrofobicidade semelhantes, são bem conhecidas.

De um modo semelhante, os ADN da invenção incluem variantes que diferem de uma sequência de ADN nativa devido a uma ou mais deleções, inserções ou substituições, mas que codificam um polipéptido biologicamente activo. A invenção inclui ainda polipéptidos da invenção com ou sem glicosilação de padrão nativo associada. Os polipéptidos expressos em sistemas de expressão de levedura ou mamífero (e. g., células COS-1 ou COS-7) podem ser semelhantes a, ou significativamente diferentes de um polipéptido nativo em peso molecular e padrão de glicosilação, dependendo da escolha do sistema de expressão. Expressão de polipéptidos da invenção em sistemas de expressão bacterianos, tais como E. coli, proporcionam moléculas não glicosiladas. Além disso, uma dada preparação pode incluir múltiplas espécies da proteína glicosiladas diferentemente. Os grupos glicosilo podem ser removidos através de métodos convencionais, em particular os que utilizam glicopeptidase. Em geral, os polipéptidos glicosilados da invenção podem ser incubados com um excesso molar de glicopeptidase (Boehringer Mannheim).

De forma correspondente, construções de ADN semelhantes que codificam várias adições ou substituições de resíduos ou 24 sequências de aminoácidos, ou deleções de resíduos ou sequências terminais ou internos estão compreendidos pela invenção. Por exemplo, os sítios de N-glicosilação no domínio extracelular do polipéptido podem ser modificados para eliminar a glicosilação, permitindo a expressão de um análogo de hidrato de carbono reduzido em sistemas de expressão de mamífero e levedura. Os sítios de N-glicosilação em polipéptidos eucarióticos são caracterizados por um tripleto de aminoácidos Asn-X-Y, em que X é qualquer aminoácido e Y é Ser ou Thr. Substituições, adições, ou deleções apropriadas para a sequência de nucleótidos codificando estes tripletos resultarão na prevenção da ligação de resíduos de hidratos de carbono à cadeia lateral de Asn. A alteração de um único nucleótido, seleccionado de modo a que Asn seja substituído popó um aminoácido diferente, por exemplo, é suficiente para inactivar um sítio de N-glicosilação. Alternativamente, o Ser ou Thr podem ser substituídos por outros aminoácidos, tais como Ala. Processos conhecidos para inactivar sítios de N-glicosilação em proteínas incluem aqueles descritos na Patente U.S. 5071972 e EP 276846.

Noutro exemplo de variantes, sequências codificando resíduos Cys que não são essenciais para a actividade biológica podem ser alterados para provocar a deleção dos resíduos Cys ou substituição com outros aminoácidos, prevenindo a formação das ligações persulfureto intramolecular incorrecta após enrolamento ou renaturação.

Outras variantes são preparadas por modificação de resíduos de aminoácidos dibásicos adjacentes, para aumentar a expressão em sistemas de levedura nos quais a actividade da protease KEX2 está presente. 0 documento EP 212 914 revela a utilização de mutagénese específica para um sítio para inactivar os sítios de 25 processamento da protease KEX2 numa proteína. Os sítios de processamento da protease KEX2 são inactivados por remoção, adição ou substituição de resíduos para alterar os pares Arg-Arg, Arg-Lys, e Lys-Arg para eliminar a ocorrência destes resíduos básicos adjacentes. Os emparelhamentos Lys-Lys são consideravelmente menos susceptíveis a clivagem por KEX2, e a conversão de Arg-Lys ou Lys-Arg em Lys-Lys representa uma abordagem conservativa e preferida para inactivar os sítios de KEX2.

Oligómeros

Estão abrangidos pela invenção oligómeros ou proteínas de fusão que contêm polipéptidos de TSLP humanos. Esses oligómeros podem estar na forma de multímeros ligados covalentemente ou não ligados covalentemente, incluindo dímeros, trímeros, ou oligómeros superiores. Como referido acima, polipéptidos preferidos são solúveis e desse modo, estes oligómeros podem compreender polipéptidos solúveis. Num aspecto da invenção, os oligómeros mantêm a capacidade de ligação dos componentes do polipéptido e proporcionam por isso, sítios de ligação bivalentes, trivalentes, etc.

Uma forma de realização da invenção é dirigida a oligómeros compreendendo polipéptidos múltiplos unidos através de interacções covalentes ou não covalentes entre unidades peptídicas fundidas com os polipéptidos. Esses péptidos podem ser ligantes peptídicos (espaçadores), ou péptidos que têm a propriedade de promover oligomerização. Fechos de leucina e certos polipéptidos derivados de anticorpos estão entre os 26 péptidos que podem promover oligomerização dos polipéptidos ligados a este, como descrito em maior detalhe abaixo.

Oligómeros à base de Imunoglobulina

Como uma alternativa, um oligómero é preparado utilizando polipéptidos derivados das imunoglobulinas. A preparação de proteínas de fusão compreendendo certos polipéptidos heterólogos fundidos com várias porções de polipéptidos derivados de anticorpo (incluindo o domínio Fc) foi descrita, e. g., por (Ashkenazi et al., PNAS USA, 88:10535 (1991)); (Byrn et al.,

Nature, 344:677 (1990)); e (Hollenbaugh e Aruffo "Construction of Immunoglobulin Fusion Protein", em Current Protocols in Immunology, Supl. 4, pp. 10.19.1 - 10.19.11 (1992)).

Uma forma de realização da presente invenção é dirigida a um dímero compreendendo duas proteínas de fusão criadas por fusão de um polipéptido da invenção com um polipéptido de Fc derivado de um anticorpo. Uma fusão de genes codificando a proteína de fusão polipéptido/Fc é inserida num vector de expressão apropriado. As proteínas de fusão polipéptido/Fc são expressas em células hospedeiras transformadas com o vector de expressão recombinante, e deixadas a montar, muito como moléculas de anticorpo, após o que se formam ligações de persulfureto intercadeia entre as unidades Fc para produzir moléculas divalentes. O termo "polipéptido Fc", como aqui utilizado, inclui formas nativas e muteína de polipéptidos preparados a partir da região Fc de um anticorpo compreendendo a totalidade dos domínios CH da região Fc. Formas truncadas desses polipéptidos contendo a 27 região da dobra que promovem a dimerização também estão incluídas. Polipéptidos preferidos compreendem um polipéptido Fc derivado de um anticorpo IgGl humano.

Um polipéptido Fc adequado, descrito no Pedido PCT WO 93/10151, é um polipéptido de cadeia única que se estende desde a região da dobra N-terminal até ao terminal C nativo da região Fc de um anticorpo IgGl humano. Outro polipéptido Fc útil é a muteína de Fc descrita na Patente U.S. 5457035, e em (Baum et al., EMBO J., 13:3992-4001 (1994)). A sequência de aminoácidos desta muteína é idêntica a da sequência de Fc nativa apresentada no documento WO 93/10151, excepto que o aminoácido 19 foi substituído de Leu para Ala, o aminoácido 20 foi substituído de Leu para Glu, e o aminoácido 22 foi substituído de Gli para Ala. A muteína exibe afinidade reduzida para os receptores de Fc.

As proteínas de fusão acima descritas compreendendo unidades Fc (e oligómeros formados a partir destas) oferecem a vantagem de fácil purificação por cromatografia de afinidade em relação a colunas de Proteína A ou Proteína G.

Noutras formas de realização, os polipéptidos da invenção podem ser substituídos para a porção variável de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo. Se as proteínas de fusão são preparadas com ambas as cadeias pesada e leve de um anticorpo, é possível formar um oligómero com tantas como quatro regiões extracelulares de TSLP. 28

Oligómeros à base de Péptido-ligante

Alternativamente, o oligómero é uma proteína fusão compreendendo polipéptidos múltiplos, com ou sem ligantes peptidicos (péptidos espaçadores). Entre os ligantes peptidicos adequados estão aqueles descritos nas Patentes U.S. 4751180 e 4b 4935233. A sequência de ADN codificando um ligante peptidico desejado pode ser inserida entre, e na mesma grelha de leitura que, as sequências de ADN da invenção, utilizando qualquer técnica convencional adequada. Por exemplo, um oligonucleótido sintetizado quimicamente codificando o ligante pode ser ligado entre as sequências. Em formas de realização particulares, uma proteína de fusão compreende desde dois a quatro polipéptidos de TSLP solúveis, separados por ligantes peptidicos.

Fechos de Leucina

Outro método para preparar os oligómeros da invenção envolve a utilização de um fecho de leucina. Os domínios de fecho de leucina são péptidos que promovem a oligomerização das proteínas nas quais se encontram. Os fechos de leucina foram originalmente identificados em várias proteínas de ligação a ADN (Landschulz et al.r Science 240:1759 (1988)), e desde então têm sido encontrados numa variedade de proteínas diferentes. Entre os fechos de leucina conhecidos estão os péptidos que ocorrem naturalmente e derivados destes que dimerizam ou trimerizam. O domínio de fecho (também aqui referido como um domínio de oligomerização, ou formador de oligómero) compreende uma rpetição de heptado repetitiva, frequentemente com quatro ou cinco resíduos de leucina entremeados com outros aminoácidos. 29

Exemplos de domínios de fecho são aqueles que se encontram no factor de transcrição de levedura GCN4 e uma proteína de ligação a ADN estável ao aquecimento encontrado no fígado de rato (C/EBP; Landschulz et al., Science, 243:1681 (1989)). Duas proteínas de transformação nucleares, fos e jun, também exibem domínios de fecho, como o faz o produto genético do proto-oncogene de murino, c-myc (Landschulz et al., Science, 240:1759 (1988)). Os produtos dos oncogenes nucleares fos e jun compreendem domínios de fecho que, de um modo preferido, formam heterodímero (0'Shea et al., Science, 245:646 (1989)), (Turner e Tjian, Science, 243:1689 (1989)). O domínio de fecho é necessário para a actividade biológica (ligação a ADN) nestas proteínas.

As proteínas fusogénicas de vários vírus diferentes, incluindo paramixovírus, coronavírus, vírus do sarampo e muitos retrovírus, também possuem domínios de fecho (Buckland e Wild, Nature, 338:547 (1989); (Britton, Nature, 353:394 (1991)); (Delwart e Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses, 6:703 (1990)) . Os domínios de fecho nestas proteínas fusogénicas virais estão próximo da região transmembranar das proteínas; foi sugerido que os domínios de fecho podem contribuir com a estrutura oligomérica das proteínas fusogénicas. A oligomerização de proteínas fusogénicas virais está envolvida na formação de poros de fusão (Spruce et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88:3523 (1991)). Também foram recentemente relatados domínios de fecho como desempenhando um papel na oligomerização de factores transcrição de choque térmico (Rabindran et al., Science 259:230 (1993)).

Os domínios de fecho dobram-se como espirais curtas,

paralelas enroladas. (0'Shea et al., Science 254:539 (1991)). A 30 arquitectura geral da espiral enrolada paralela foi bem caracterizada, com um empacotamento "saliências-em-buracos" como proposto por (Crick, Acta Crystallogr., 6:689)). 0 dímero formado por um domínio de fecho é estabilizado pela repetição de heptado, designada (abcdefg)n de acordo com a anotação de (McLachlan e Stewart, J. Mol. Biol., 98:293 (1975)), em que os resíduos a e d são geralmente resíduos hidrofóbicos, sendo d uma leucina, que alinha com a mesma face de uma hélice. Os resíduos de carga oposta normalmente ocorrem nas posições g e e. Assim, numa espiral enrolada paralela formada pelos dois domínios de fecho em hélice, as "saliências" formadas pelas cadeias laterais hidrofóbicas da primeira hélice estão empacotadas nos "buracos" formados entre as cadeias laterais da segunda hélice.

Os resíduos na posição d (frequentemente leucina) contribuem com grandes energias de estabilização hidrofóbica, e são importantes para a formação de oligómeros (Krystek et al., Int. J. Peptide Res.f 38:229 (1991)). (Lovejoy et al., Science 259:1288 (1993)) recentemente relataram a síntese de um feixe de hélice α de cadeia tripla, em que as hélices correm para cima-cima-baixo. Os seus estudos confirmaram que a energia de estabilização hidrofóbica proporciona a principal força motriz para a formação de espirais enroladas de monómeros de hélice. Estes estudos também indicam que as interacções electrostáticas contribuem para a estequiometria e geometria de espirais enroladas. A discussão adicional da estrutura de fecho de leucinas encontra-se em (Harbury et al., Science, 262:1401 (26 de Novembro de 1993)).

Exemplos de domínios de fecho de leucina adequados para produzir proteínas oligoméricas solúveis são descritas no pedido

PCT WO 94/10308, e o fecho de leucina derivado de proteína D 31 tensioactivo de pulmão (SPD) descrito em (Hoppe et al., FEBS Letters, 344:191 (1994)). A utilização de um fecho de leucina modificado que permite a trimerização estável de uma proteína heteróloga fundida a este é descrita em (Fanslow et al., Semin. Immunol., 6:267-278 (1994)). As proteínas de fusão recombinantes compreendendo um polipéptido solúvel fundido com um péptido de fecho de leucina são expressas em células hospedeiras adequadas, e o oligómero solúvel que forma é recuperado do sobrenadante da cultura.

Certas unidades de fecho de leucina, de um modo preferido, formam trímeros. Um exemplo é um fecho de leucina derivado de proteína D tensioactivo de pulmão (SPD), como descrito em (Hoppe et al., FEBS Letters, 344:191 (1994)) e na Patente U.S. 5716805. Este péptido de fecho de leucina derivado de SPD de pulmão compreende a sequência de aminoácidos Pro Asp Vai Ala Ser Leu Arg Gin Gin Vai Glu Ala Leu Gin Gli Gin Vai Gin His Leu Gin Ala Ala Phe Ser Gin Tyr (SEQ ID N°: 4).

Outro exemplo de um fecho de leucina que promove a trimerização é um péptido compreendendo a sequência de aminoácidos Arg Met Lys Gin Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu

Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu

Ile Gli Glu Arg, (SEQ ID N°: 5), como descrito na Patente U.S. 5716805. Numa forma de realização alternativa, é adicionado um resíduo Asp N-terminal; noutra, o péptido não tem o resíduo Arg N-terminal.

Fragmentos dos péptidos de fecho anteriores que retêm a propriedade de promover a oligomerização também podem ser empregues. Exemplos desses fragmentos incluem, mas não estão limitados a, péptidos que não têm um ou dois dos resíduos 32 N-terminal ou C-terminal apresentados nas sequências de aminoácidos anteriores. Os fechos de leucina podem ser derivados dos péptidos de fecho de leucina que ocorrem naturalmente, e. g., através de substituição (ões) conservativa (s) na sequência de aminoácidos nativa, em que a capacidade do péptido para promover a oligomerização é retida.

Outros péptidos derivados de proteínas triméricas que ocorrem naturalmente podem ser empregues na preparação de oligómeros triméricos. Alternativamente, podem ser empregues péptidos sintéticos que promovem a oligomerização. Em formas de realização particulares, os resíduos de leucina numa unidade de fecho de leucina são substituídos por resíduos de isoleucina. Esses péptidos compreendendo isoleucina podem ser referidos como fechos de isoleucina, mas são compreendidos pelo "fecho de leucinas" como aqui empregue.

PRODUÇÃO DE POLIPÉPTIDOS E SEUS FRAGMENTOS

Expressão, isolamento e purificação dos polipéptidos e fragmentos da invenção podem ser realizados por qualquer técnica adequada, incluindo, mas não estando limitada aos seguintes:

Sistemas de Expressão A presente invenção também proporciona vectores de clonagem e expressão recombinantes contendo ADN, assim como célula hospedeira contendo os vectores recombinantes. Vectores de expressão compreendendo ADN podem ser utilizados para preparar os polipéptidos ou fragmentos da invenção codificados pelo ADN. 33

Um método para produzir polipéptidos compreende cultivar as células hospedeiras transformadas com um vector de expressão recombinante codificando o polipéptido, em condições que promovem a expressão do polipéptido, depois recuperando os polipéptidos expressos da cultura. 0 especialista na técnica reconhecerá que o processo para purificar os polipéptidos expressos variará de acordo com factores, tais como o tipo de células hospedeiras empregues, e se o polipéptido está ligado à membrana ou é uma forma solúvel que é segregada da célula hospedeira.

Qualquer sistema de expressão adequado pode ser empregue. Os vectores incluem um ADN codificando um polipéptido ou fragmento da invenção, ligado operacionalmente a sequências de nucleótidos adequadas reguladoras de transcrição ou tradução, tais como os derivados de um gene de mamífero, microbiano, virai, ou de insecto. Exemplos de sequências reguladoras incluem promotores de transcrição, operadores, ou intensificadores, um sítio de ligação ao ARNm de ribossoma, e sequências apropriadas que controlam a iniciação e terminação de transcrição e tradução. Sequências de nucleótidos estão ligadas operacionalmente quando a sequência reguladora está funcionalmente ligada à sequência de ADN. Assim, uma sequência de nucleótidos do promotor está ligada operacionalmente a uma sequência de ADN se a sequência de nucleótidos promotora controla a transcrição da sequência de ADN. Uma origem de replicação que confere a capacidade para replicar nas células hospedeiras desejadas, e um gene de selecção pelo qual os transformantes são identificados, são geralmente incorporados no vector de expressão.

Adicionalmente, uma sequência codificando um péptido sinal apropriado (nativo ou heterólogo) pode ser incorporado em 34 vectores de expressão. Uma sequência de ADN para um péptido sinal (lider de secreção) pode ser fundida em grelha à sequência de ácido nucleico da invenção de modo a que o ADN é inicialmente transcrito, e o ARNm traduzido, na proteína de fusão compreendendo o péptido sinal. Um péptido sinal que é funcional nas células hospedeiras pretendidas promove a secreção extracelular do polipéptido. 0 péptido sinal é clivado a partir do polipéptido após secreção do polipéptido da célula. 0 especialista na técnica também reconhecerá que a(s) posição (ões) na(s) qual(is) o péptido sinal é clivado pode(m) diferir daquela prevista pelo programa de computador, e pode variar de acordo com factores, tais como o tipo de células hospedeiras empregues na expressão de um polipéptido recombinante. A preparação da proteína pode incluir uma mistura de moléculas de proteína possuindo diferentes aminoácidos N-terminais, resultantes da clivagem do péptido sinal em mais do que um sítio. Formas de realização particulares de proteínas maduras aqui proporcionadas incluem, mas não estão limitadas a, proteínas possuindo o resíduo na posição 16, 29, 35, 95, ou 117 da SEQ ID N°:2 como os aminoácidos N-terminais. Células hospedeiras adequadas para expressão de polipéptidos incluem células procariotas, de levedura ou de eucariotas superiores. São geralmente preferidas células de mamífero ou de insecto para utilização como células hospedeiras. Vectores de expressão e clonagem apropriados e para utilização com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura, e de mamífero são descritos, por exemplo, em (Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nova Iorque, (1985)). Sistemas de tradução livres de células podem também ser 35 empregues para produzir polipéptidos utilizando ARNs derivados de construções de ADN aqui revelados.

Sistemas Procarióticas

Procariotas incluem organismos gram-negativos ou gram-positivos. Células hospedeiras procarióticas adequadas para transformação incluem, por exemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, e várias outras espécies dentro dos géneros Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus. Numa célula hospedeira procariótica, tal como E. coli, um polipéptido pode incluir um resíduo de metionina N-terminal para facilitar a expressão do polipéptido recombinante na célula hospedeira procariótica. Uma Met N-terminal pode ser clivada a partir do polipéptido recombinante expresso.

Os vectores de expressão para utilização em células hospedeiras procariotas compreendem geralmente um ou mais genes marcadores selectivos fenotípicos. Um gene marcador selectivo fenotípico é, por exemplo, um gene codificando uma proteína que confere resistência a antibióticos ou que fornece um requisito autotrófico. Exemplos de vectores de expressão úteis para células hospedeiras procariotas incluem os derivados de plasmídeos comercialmente disponíveis, tal como o vector de clonagem pBR322 (ATCC 37017) . O pBR322 contém genes para resistência a ampicilina e tetraciclina e proporciona deste modo meios simples para identificar células transformadas. Um promotor apropriado e uma sequência de ADN são inseridos no vector pBR322. Outros vectores comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals,

Uppsala, Suécia) e pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA). 36

As sequências normalmente utilizadas para vectores de expressão recombinantes para células hospedeiras procariotas incluem β-lactamase (penicilinase), sistema de promotor da lactose (Chang et al., Nature 275:615 (1978); e (Goeddel et al., Nature 281: 544 (1979)), sistema de promotor do triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057 (1980); e EP-A-36776) e promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412 (1982)). Um sistema de expressão particularmente útil para células hospedeiras procariotas emprega um promotor de fago XPL e uma sequência de repressor termolábil cl857ts. Os vectores de plasmídeos disponíveis na American Type Culture Collection que incorpora derivados do promotor ÀPL incluem o plasmídeo pHUB2 (residente na estirpe de E. coli JMB9, ATCC 37092) e pPLc28 (residente na E. COli RR1, ATCC 53082) .

Sistemas de Levedura

Alternativamente, os polipéptidos podem ser expressas em células hospedeiras de levedura, de um modo preferido, do género Saccharomyces (e. g., S. cerevísíae) . Outro género de leveduras, tais como Pichia ou Kluyveromyces, pode também ser empregue. Os vectores de levedura contêm frequentemente uma sequência de origem de replicação de um plasmídeo de levedura 2μ, uma sequência de replicação autónoma (ARS), uma região do promotor, sequências de poliadenilação, sequências de terminação de transcrição, e um gene de marcador selectivo. As sequências de promotor apropriadas para vectores de levedura incluem, entre outros, promotores para a metalotionina, 3-fosfoglicerato cinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 37 (1968)); e (Holland et al., Biochem. 17: 4900 (1978)), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutocinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfo-glucose isomerase, e glucocinase. Outros vectores e promotores adequados para utilização na expressão em leveduras são ainda descritos em (Hitzeman, EPA-73 657) . Outra alternativa é o promotor repressivel pela glucose ADH2 descrito por (Russell et al., J. Biol. Chem. 258: 2674 (1982)) e (Beier et al., Nature 300:724 (1982)). Vectores de vaivém replicáveis tanto em levedura como E. colí podem ser construídos inserindo sequências de ADN de pBR322 para selecção e replicação em E. coli (gene e origem de replicação Amp') nos vectores de levedura acima descritos. A sequência líder do factor α de levedura pode ser empregue para dirigir a secreção do polipéptido. A sequência líder do factor α é frequentemente inserida entre a sequência do promotor e a sequência do gene estrutural. Ver, e. g., (Kurjan et al., Cell 30:933 (1982)) e (Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:5330 (1984)). Outras sequências líder adequadas para facilitar a secreção de polipéptidos recombinantes de hospedeiros de levedura são conhecidas dos especialistas na técnica. Uma sequência líder pode ser modificada próximo da sua extremidade 3' para conter um ou mais sítios de restrição. Isto irá facilitar a fusão da sequência líder ao gene estrutural.

Protocolos de transformação de levedura são conhecidos dos especialistas na técnica. Um desses protocolos é descrito por (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929 (1978)). 0 protocolo de Hinnen et al. selecciona transformantes Trp+ num meio selectivo, em que o meio selectivo consiste em 0,67% de 38 base de azoto de levedura, 0,5% de ácidos casamino, 2% de glucose, 10 mg/mL de adenina e 20 mg/mL de uracilo. Células hospedeiras de levedura transformadas por vectores contendo uma sequência de promotor ADH2 pode ser cultivada para induzir a expressão num meio "rico". Um exemplo de um meio rico é um consistindo em 1% de extracto de levedura, 2% de peptona, e 1% de glucose suplementada com 80 mg/mL de adenina e 80 mg/mL de uracilo. A desrepressão do promotor de ADH2 ocorre quando a glucose é esgotada do médio.

Sistemas de Mamífero ou Insecto

Sistemas de cultura de células hospedeiras de mamífero ou insecto também podem ser empregues para expressar polipéptidos recombinantes. Sistemas de baculovírus para produção de proteínas heterólogas em células de insecto são revistas por (Luckow e Summers, Bio/Technology, 6:47 (1988)). Linhas celulares estabelecidas de origem de mamífero também podem ser empregues. Exemplos de linhas adequadas de células hospedeiras de mamífero incluem a linha COS-7 de células de rim de macaco (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23: 175 (1981)), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, e linhas de células BHK (ATCC CRL 10) , e a linha de células CV1/EBNA derivadas da linha celular de rim de macaco verde Africano CV 1 (ATCC CCL 70) como descrito por (McMahan et al., EMBO J., 10: 2821 (1991)).

Foram descritos métodos estabelecidos para introduzir ADN nas células de mamífero (Kaufman, R.J., Large Scale Mammal Cell

Culture, pp. 15-69 (1990)). Protocolos adicionais utilizando 39 reagentes comercialmente disponíveis, tais como reagente de lípido Lipofectamina (Gibco/BRL) ou reagente de lípido

Lipofectamina-Plus, podem ser utilizados para transfectar células (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7417 (1987)). Adicionalmente, pode ser utilizada electroporação para transfectar células de mamífero utilizando processos convencionais, tais como aqueles em (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). A selecção de transformantes estáveis pode ser realizada utilizando métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, resistência a fármacos citotóxicos. (Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185:487-511 (1990)), descreve vários esquemas de selecção, tais como resistência à redutase de di-hidrofolato (DHFR). Uma estirpe hospedeira adequada para selecção de DHFR pode ser a estirpe de CHO DX-B11, que é deficiente em DHFR (Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220 (1980)). Um plasmídeo que expressa o ADNc de DHFR pode ser introduzido na estirpe DX-Bll, e apenas as células que contêm o plasmídeo podem crescer no meio selectivo apropriado. Outros exemplos de marcadores seleccionáveis que podem ser incorporados num vector de expressão incluem ADNc conferindo resistência a antibióticos, tais como G418 e higromicina B. As células que contêm o vector podem ser seleccionadas com base na resistência a estes compostos.

Sequências de controlo de transcrição e tradução para vectores de expressão de células hospedeiras de mamífero podem ser excisadas dos genomas virais. Sequências de promotor e sequências de intensificador normalmente utilizadas são derivadas de vírus de polioma, adenovírus 2, vírus de símio 40 (SV40), e citomegalovírus humano. Sequências de ADN derivadas do 40 genoma do vírus SV40, por exemplo, origem, promotor precoce e tardio, intensificador, excisão, e sítios de poliadenilação de SV40 podem ser utilizados para proporcionar outros elementos genéticos para expressão de uma sequência de gene estrutural numa célula de mamífero hospedeiro. Os promotores virais precoces e tardios são particularmente úteis porque ambos são facilmente obtidos a partir de um genoma virai como um fragmento, que também pode conter uma origem de replicação virai (Fiers et al., Nature 273:113 (1978)); (Kaufman, Meth. in

Enzymology (1990)). Também podem ser utilizados fragmentos de SV40 menores ou maiores, desde que a sequência de aproximadamente 250 pb que se estende desde o sítio de Hind III em direcção ao sítio Bgl I localizado no sítio da origem de replicação virai de SV40 seja incluída.

Sequências de controlo adicionais que demonstram melhorar a expressão de genes heterólogos de vectores de expressão de mamífero incluem elementos, tais como o elemento de sequência que aumenta a expressão (EASE) derivada das células CHO (Morris et al., Animal Cell Technology, pp. 529-534 e Pedido PCT WO 97/25420 (1997)) e o líder tripartido (TPL) e ARNs do gene VA de Adenovírus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257:13475-13491 (1982)). As sequências do sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) de origem virai permitem que ARNm dicistrónicos sejam traduzidos eficientemente (Oh e Sarnow, Current Opinion in

Genetics and Development 3:295-300 (1993)); (Ramesh et al.,

Nucleic Acids Research 24:2697-2700 (1996)). A expressão de um ADNc heterólogo como parte de um ARNm dicistrónico seguido pelo gene para um marcador de selecção (e. g. DHFR) demonstrou melhorar a transfectabilidade do hospedeiro e expressão do ADNc heterólogo (Kaufman, Meth. in Enzymology (1990)). Vectores de expressão exemplares que empregam ARNm dicistrónicos são 41 pTR-DC/GFP descritos por (Mosser et al., Biotechniques 22:150-161 (1997)), e p2A5l descrito por (Morris et al., Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997)).

Um vector de expressão elevada útil, pCAVNOT, foi descrito por (Mosley et al., Cell 59:335-348 (1989)). Outros vectores de expressão para utilização em células hospedeiras de mamifero podem ser construídos como revelado por (Okayama e Berg, Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)). Um sistema útil para a expressão estável de nível elevado de ADNcs de mamífero em células epiteliais mamárias de murino C127 podem ser construídas substancialmente como descrito por (Cosman et al., Mol. Immunol. 23:935 (1986)). Um vector de expressão elevada útil, PMLSV N1/N4, descrito por (Cosman et al., Nature 312:768 (1984)), foi depositado como ATCC 39890. Vectores de expressão de mamífero adicionais úteis são descritos no documento EP-A-0367566, e no documento WO 91/18982. Ainda noutra alternativa, os vectores podem ser derivados de retrovírus.

Outro vector de expressão útil, pFLAG®, pode ser utilizado. A tecnologia de FLAG® está centrada na fusão do péptido marcador de baixo peso molecular (1 kD) FLAG®, hidrofílico com o terminal N de uma proteína recombinante expressa pelos vectores de expressão pFLAG®. O pDC311 é outro vector especializado utilizado para expressar proteínas em células CHO. O pDC311 é caracterizado por uma sequência bicistrónica contendo o gene de interesse e um gene da redutase de di-hidrofolato (DHFR) com um sítio de ligação ao ribossoma interno para tradução de DHFR, um elemento de sequência de aumento da expressão (EASE), o promotor de CMV humano, uma sequência líder tripartida, e um sítio de poliadenilação. 42

Em relação aos péptidos sinal que podem ser empregues, o péptido sinal nativo pode ser substituído por um péptido sinal heterólogo ou sequência lider, se desejado. A escolha do péptido sinal ou lider pode depender de factores, tais como o tipo de células hospedeiras nos quais o polipéptido recombinante deve ser produzido. Para ilustrar, exemplos de péptidos sinal heterólogos que são funcionais em células hospedeiras de mamífero incluem a sequência sinal para interleucina-7 (IL-7) descrita na Patente dos Estados Unidos 4965195; a sequência sinal para o receptor da interleucina-2 descritas em (Cosman et al., Nâture 312: 768 (1984)); um péptido sinal receptor de interleucina-4 descrito no documento EP 367566; o péptido sinal receptor de interleucina-1 de tipo I descrito na Patente U.S. 4968607; e o péptido sinal receptor de interleucina-1 de tipo II descrito no documento EP 460846.

Purificação A invenção também inclui métodos de isolamento e purificação de polipéptidos e seus fragmentos.

Isolamento e Purificação

Os polipéptidos "isolados" ou os seus fragmentos compreendidos por esta invenção são polipéptidos ou fragmentos que não estão num ambiente idêntico a um ambiente no qual ele ou eles podem ser encontrados na natureza. Os polipéptidos "purificados" ou os seus fragmentos compreendidos por esta invenção estão essencialmente isentos da associação com outras proteínas ou polipéptidos, por exemplo, como um produto de 43 purificação de sistemas de expressão recombinantes, tais como aqueles descritos acima ou como um produto purificado de uma fonte não recombinante, tais como células e/ou tecidos que ocorrem naturalmente.

Numa forma de realização preferida, a purificação de polipéptidos recombinantes ou fragmentos pode ser realizada utilizando fusões de polipéptidos ou fragmentos da invenção com outro polipéptido para auxiliar na purificação de polipéptidos ou fragmentos da invenção. Esses parceiros de fusão podem incluir os poli-His ou outros péptidos de identificação antigénicos descritos acima, assim como as unidades de Fc descritos anteriormente.

Em relação a qualquer tipo de célula hospedeira, como é conhecidos dos especialistas na técnica, processos para purificar um polipéptido recombinante ou fragmento irão variar de acordo com factores, tais como o tipo de células hospedeiras empregues e se o polipéptido recombinante ou fragmento é segregados ou não para o meio de cultura.

Em geral, o polipéptido recombinante ou fragmento pode ser isolado das células hospedeiras se não for secretado, ou do meio ou sobrenadante de for solúvel e secretado, seguido por um ou mais passos de concentração, precipitação salina, permuta iónica, interacção hidrofóbica, purificação de afinidade ou cromatografia de exclusão por tamanho. Em relação a modos específicos para realizar estes passos, o meio de cultura primeiro pode ser concentrado utilizando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Após o passo de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma 44 matriz de purificação, tais como um meio de filtração em gel. Alternativamente, pode ser empregue uma resina de permuta aniónica, por exemplo, uma matriz ou substrato possuindo grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos normalmente empregues na purificação de proteína. Alternativamente, pode ser empregue um passo de permuta catiónica. Permutadores catiónicos adequados incluem várias matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfopropilo ou carboximetilo. Adicionalmente, pode ser empregue um passo de cromatofocagem. Alternativamente, pode ser empregue um passo de cromatografia de interacção hidrofóbica. Matrizes adequadas podem ser unidades de fenilo ou octilo ligados a resinas.

Adicionalmente, pode ser empregue cromatografia de afinidade com uma matriz que se liga selectivamente à proteína recombinante. Exemplos dessas resinas empregues são colunas de lectina, colunas secas, e colunas de quelante de metal. Finalmente, podem ser empregues um ou mais passos de cromatografia líquida de elevado desempenho de fase reversa (RP-HPLC) empregando meios hidrofóbicos de RP-HPLC, (e. g., sílica gel ou resina de polímero possuindo grupos metilo, octilo, octildecilo ou outros alifáticos pendentes) para purificar ainda mais os polipéptidos. Alguns ou todos os passos de purificação anteriores, em várias combinações, são bem conhecidos e podem ser empregues para proporcionar uma proteína recombinante purificada e isolada.

Também é possível utilizar uma coluna de afinidade compreendendo uma proteína de ligação ao polipéptido da invenção, tais como um anticorpo monoclonal produzido contra polipéptidos da invenção, para polipéptidos expressos purificados por afinidade. Estes polipéptidos podem ser removidos de uma coluna de afinidade utilizando técnicas 45 convencionais, e. g., num tampão de eluição de concentração elevada de sais e depois dialisados contra um tampão com concentração de sais mais baixa para utilização ou alterando o pH ou outros componentes, dependendo da matriz de afinidade utilizada, ou serem removidos competitivamente utilizando o substrato que ocorre naturalmente da unidade de afinidade, tais como um polipéptido derivado da invenção.

Neste aspecto da invenção, as proteinas de ligação ao polipéptido, tais como os anticorpos anti-polipéptido da invenção ou outras proteinas que podem interactuar com o polipéptido da invenção, podem ser ligados a um suporte de fase sólida, tais como uma matriz de cromatografia em coluna ou um substrato semelhante adequado para identificação, separação, ou purificando células que expressam polipéptidos da invenção na sua superfície. A aderência das proteínas de ligação ao polipéptido de uma invenção para uma superfície de contacto de fase sólida pode ser realizada por qualquer meio, por exemplo, microesferas magnéticas podem ser revestidas com estas proteínas de ligação ao polipéptido e mantidas no recipiente de incubação através de um campo magnético. As suspensões de misturas de células são colocadas em contacto com a fase sólida que possui essas proteínas de ligação ao polipéptido nelas. As células possuindo polipéptidos da invenção na sua superfície ligam-se à proteína de ligação ao polipéptido fixadas e as células não ligadas são então removidas por lavagem. Este método de ligação por afinidade é útil para purificação, rastreio, ou separação dessas células que expressam polipéptido da solução. Os métodos de libertação de células seleccionadas positivamente da fase sólida são conhecidos na técnica e compreendem, por exemplo, a utilização de enzimas. Essas enzimas são, de um modo preferido, não tóxicas e não lesivas para as células e são, de um modo 46 preferido, dirigidas à clivagem do parceiro de ligação à superfície celular.

Alternativamente, misturas de células suspeitas de conter células que expressam polipéptido da invenção podem primeiro ser incubadas com uma proteína de ligação a polipéptido biotinilada da invenção. Os períodos de incubação são tipicamente, pelo menos, uma hora de duração para assegurar ligação suficiente aos polipéptidos da invenção. A mistura resultante é então passada através de uma coluna empacotada com esferas revestidas com avidina, pela qual a afinidade elevada de biotina para avidina proporciona a ligação das células de ligação a polipéptido às esferas. A utilização de esferas revestidas com avidina é conhecida na técnica. Ver (Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986)). A lavagem de material não ligado e a libertação das células ligadas, é realizada utilizando métodos convencionais. 0 grau desejado de pureza depende da utilização pretendida da proteína. Um grau relativamente elevado de pureza é desejado quando o polipéptido é administrado in vivo, por exemplo. Nesse caso, os polipéptidos são purificados de modo a que não sejam detectáveis nenhumas bandas de proteína correspondentes a outras proteínas, após análise por electroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE). Será reconhecido por um especialista na técnica que bandas múltiplas correspondendo ao polipéptido podem ser visualizadas por SDS-PAGE, devido a glicosilação diferencial, processamento de tradução diferencial pós-tradução, e semelhantes. De um modo mais preferido, o polipéptido da invenção é purificado até homogeneidade substancial, como indicado por uma banda de proteína única após análise por SDS-PAGE. A banda de proteína pode ser visualizada 47 por coloração com prata, coloração com azul de Coomassie, ou (se a proteína for marcada radioactivamente) por autorradiografia.

Ensaios

Os polipéptidos purificados da invenção (incluindo proteínas, polipéptidos, fragmentos, variantes, oligómeros, e outras formas) podem ser testados para a capacidade para ligar receptores de TSLP em qualquer ensaio adequado, tais como um ensaio de ligação convencional. Para ilustrar, o polipéptido pode ser marcado com um reagente detectável (e. g., um radionuclido, cromóforo, enzima que cataliza uma reacção colorimétrica ou fluorométrica, e semelhantes) . 0 polipéptido marcado é colocado em contacto com as células que expressam receptores de TSLP. As células são então lavadas para remover polipéptido marcado não ligado, e a presença de marcador ligado às células é determinada por uma técnica adequada, escolhida de acordo com a natureza do marcador.

Um exemplo de um processo de ensaio de ligação é como se segue. Um vector de expressão recombinante contendo ADNc de TSLP é construído por métodos conhecidos na técnica. 0 receptor de TSLP de murganho compreende um domínio extracelular N-terminal, uma região transmembranar, e um domínio citoplásmico C-terminal. Células CV1-EBNA-1 em placas de 10 cm2 são transfectadas com o vector de expressão recombinante. Células CV-l/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) expressam constitutivamente antigénio-1 nuclear de EBV dirigido pelo intensificador/promotor imediato-precoce de CMV. CV1-EBNA-1 foi derivado da linha celular de rim de Macaco Verde Africano CV-1 (ATCC CCL 70), como descrito por (McMahan et al., EMBO J. 10:2821 (1991)). 48

As células transfectadas são cultivadas durante 24 horas, e as células em cada placa são então separadas numa placa de 24 poços. Após cultivar durante mais 48 horas, as células transfectadas (cerca de 4 x 104 células/poço) são lavadas com BM-NFDM, que é um meio de ligação (RPMI 1640 contendo 25 mg/mL de albumina de soro bovino, 2 mg/mL de azida de sódio, Hepes a 20 mM pH 7,2) ao qual foi adicionado 50 mg/mL de leite em pó magro. As células são então incubadas durante 1 hora a 37 °C com várias concentrações de, por exemplo, uma proteína de fusão polipéptido solúvel/Fc preparada como apresentado acima. As células são então lavadas e incubadas com uma concentração saturante constante de uma IgG anti-humana 125I-de murganho em meio de ligação, com agitação moderada durante 1 hora a 37 °C. Após lavagem extensiva, as células são libertadas através de tripsinização. O IgG anti-humano de murganho empregue acima é dirigido contra a região Fc de IgG humano e pode ser obtido de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. O anticorpo é marcado com iodo radioactivo utilizando o método convencional de cloramina-T. O anticorpo irá ligar-se à porção Fc de qualquer polipéptido/Fc proteína que se tenha ligado às células. Em todos os ensaios, a ligação não específica de 125I-anticorpo é ensaiada na ausência da proteína de fusão Fc/Fc, bem como na presença da proteína de fusão Fc e um excesso molar de 200 vezes de anticorpo IgG não marcado anti-humano de murganho. O I-anticorpo ligado a célula e quantificado num contador Autogamma Packard. Os cálculos de afinidade (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660 (1949)) são produzidos em RS/1 (BBN Software, Boston, MA) processados num computador Microvax. 49

Outro tipo de ensaio de ligação adequado é um ensaio de ligação competitiva. Para ilustrar, a actividade biológica de uma variante pode ser determinada ensaiando a capacidade da variante para competir com a proteína nativa para ligação a receptores de TSLP.

Podem ser realizados ensaios de ligação competitiva através de metodologia convencional. Os reagentes que podem ser empregues em ensaios de ligação competitiva incluem TSLP marcados radioactivamente e células intactas expressando receptores de TSLP (endógenos ou recombinantes) na superfície celular. Por exemplo, um fragmento de TSLP marcado radioactivamente solúvel pode ser utilizado para competir com uma variante de TSLP solúvel para ligação a receptores de TSLP da superfície celular. Em vez de células intactas, poderia substituir-se um receptor de TSLP/proteína de fusão de Fc solúvel ligado a uma fase sólida através da interacção de

Proteína A ou Proteína G (na fase sólida) com a unidade Fc.

Colunas de cromatografia que contêm Proteína A e Proteína G incluem as disponíveis de Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ.

Outro tipo de ensaio de ligação competitiva utiliza receptor de TSLP solúvel marcado radioactivamente, tais como um receptor de TSLP solúvel/proteína de fusão Fc, e células intactas expressando receptor de TSLP endógeno ou recombinante. 0 receptor de TSLP marcado radioactivamente pode ser utilizado para competir com o receptor de TSLP ligado à membrana para TSLP solúvel. Resultados qualitativos podem ser obtidos por ensaios autorradiográficos de ligação competitiva em placa, embora possam ser utilizadas representações gráficas de Scatchard 50 (Scatchard, Ann. N. Y. Acad Sei. 51:660 (1949)) para gerar resultados quantitativos.

UTILIZAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO OU OLIGONUCLEÓTIDOS DE TSLP HUMANO

Adicionalmente a serem utilizados para expressar polipéptidos como descrito acima, podem ser utilizados os ácidos nucleicos da invenção, incluindo ADN, ARN, ARNm e oligonucleótidos destes: como sondas para identificar ácido nucleico codificando proteínas possuindo a capacidade para induzir a proliferação celular da linhagem B ou linhagem T; para identificar o cromossoma humano número 5; para mapear genes no cromossoma humano número 5; para identificar genes associados a certas doenças, síndromes, ou outros estados associados com o cromossoma humano número 5; como oligonucleótidos de cadeia simples de sentido ou anti-sentido, para inibir a expressão de polipéptido codificado pelo gene TSLP; para auxiliar a detectar genes defeituosos num indivíduo; e para terapia génica.

Sondas

Entre as utilizações de ácidos nucleicos da invenção está a utilização de fragmentos como sondas ou iniciadores. Esses 51 fragmentos compreendem geralmente, pelo menos, cerca de 17 nucleótidos contíguos de uma sequência de ADN. Noutras formas de realização, um fragmento de ADN compreende pelo menos, 30 ou, pelo menos, 60 nucleótidos contíguos de uma sequência de ADN.

Dado que os homólogos de SEQ ID N°:l, de outra espécie de mamífero, estão aqui contemplados, as sondas com base na sequência de ADN humana de SEQ ID N°:l podem ser utilizados para rastrear bibliotecas de ADNc derivadas de outra espécie de mamífero, utilizando técnicas de hibridação convencional em espécies cruzadas.

Utilizando o conhecimento do código genético em combinação com as sequências de aminoácidos apresentadas acima, podem ser preparados conjuntos de oligonucleótidos degenerados. Esses oligonucleótidos são úteis como iniciadores, e. g., em reacções de polimerase em cadeia (PCR), através das quais os fragmentos de ADN são isolados e amplificados.

Mapeamento de Cromossoma

Todos ou uma porção dos ácidos nucleicos de SEQ ID N°:l, incluindo oligonucleótidos, podem ser utilizados pelos especialistas na técnica utilizando técnicas bem conhecidas para identificar o cromossoma humano 5, e o locus específico deste, isso pode conter o ADN de outros membros da família dos TSLP. Técnicas úteis incluem, mas não estão limitadas a, utilização da sequência ou porções, incluindo oligonucleótidos, como uma sonda em várias técnicas bem conhecidas, tais como mapeamento de híbridos de radiação (resolução elevada) , hibridação in situ para espalhamento de cromossoma (resolução moderada), e 52 hibridação de transferência de Southern para linhas de células hibridas contendo cromossomas individuais humanos (baixa resolução) .

Por exemplo, os cromossomas podem ser mapeados utilizanda PCR e hibridação de radiação. A PCR é realizada utilizando o painel de 93 hibridos de radiação de Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research Genebridge4 (http:/lwww-genome. wi.mit.edu/ftp/distribution/human-STS- releases/july97/rhmap/genebridge4.html). São utilizados iniciadores que se situam num exão putativo, ao longo de um intrão, ou através de um fragmento intrão-exão do gene de interesse e que amplifica um produto do ADN genómico humano, mas não amplificam, por exemplo, ADN genómico de hamster de controlo. Os resultados das PCRs são convertidos num vector de dados que é submetido ao sitio de Mapeamento por Radiação do Whitehead/ΜΙΤ na internet (http://www-seq.wi.mit.edu). Os resultados são classificados e a atribuição do cromossoma e localização em relação a marcadores de Sítios de Etiqueta de

Sequência (STS) conhecidos no mapa de híbridos de radiação é fornecido. 0 sítio da web seguinte proporciona informação adicional acerca do mapeamento de híbrido por radiação: (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human-STS-releases/july97/07-97.INTRO.html).

Identificação de Doenças Associadas

Como apresentado abaixo, a SEQ ID N°:l foi mapeada para a região q21-q22 do cromossoma 5 por análise sinténica do gene de murino. Deste modo, o ácido nucleico da SEQ ID N°:l ou um seu fragmento pode ser utilizado por um especialista na técnica 53 utilizando técnicas bem conhecidas para analisar anormalidades associadas com o cromossoma humano número 5 e, em particular, com a região q21-q22 de cromossoma número 5, incluindo sindrome de Gardner, polipose adenomatosa coli, doença desmóide hereditária, sindrome de Turcot, e cancro colorrectal. Isto permite que se distingam condições nas quais este marcador é rearranjado ou removido. Adicionalmente, os nucleótidos da SEQ ID N°:l ou um fragmento deles podem ser utilizados como um marcador posicionai para mapear outros genes de localização desconhecida. 0 ADN pode ser utilizado no desenvolvimento de tratamentos para qualquer distúrbio mediado (directa ou indirectamente) por quantidades defeituosas ou insuficientes dos genes correspondentes aos ácidos nucleicos da invenção. A revelação aqui apresentada de sequências nativas de nucleótidos permite a detecção de genes defeituosos, e a substituição destes por genes normais. Os genes defeituosos podem ser detectados em ensaios de diagnóstico in vitro, e por comparação de uma sequência nativa de nucleótidos aqui divulgada com a de um gene derivado de uma indivíduo suspeito de comportar um defeito neste gene.

Sentido-Anti-Sentido

Outros fragmentos úteis dos ácidos nucleicos incluem oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido compreendendo uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples (quer ARN ou ADN) capaz de se ligar a sequências de ARNm alvo (de sentido) ou ADN (anti-sentido). Os oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido, de acordo com a presente invenção, compreendem um fragmento de ADN (SEQ ID N°: 1). Um tal fragmento compreende geralmente, pelo 54 menos, cerca de 14 nucleótidos, de um modo preferido desde cerca de 14 até cerca de 30 nucleótidos. A capacidade para derivar um oligonucleótido anti-sentido ou um de sentido, com base na sequência de ADNc codificando uma dada proteína é descrito em, por exemplo, (Stein e Cohen, Câncer Res. 48:2659 (1988)) e (van der Krol et al.f BioTechniques 6:958 (1988)). A ligação de oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido a sequências de ácido nucleico alvo resulta na formação de duplexes que bloqueiam ou inibem a expressão da proteína por um de vários meios, incluindo degradação aumentada do ARNm pela RNAseH, inibição de excisão, terminação prematura de transcrição ou tradução, ou através de outros meios. Os oligonucleótidos anti-sentido devem, por isso, ser utilizados para bloquear a expressão de proteínas. Os oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido compreendem ainda oligonucleótidos possuindo esqueletos de açúcar-fosfodiéster modificado (ou outras ligações de açúcar, tais como as descritas no documento WO91/0662 e em que essas ligações de açúcar são resistentes a nucleases endógenas. Esses oligonucleótidos com ligações de açúcar resistentes são estáveis in vivo (i. e., capazes de resistir à degradação enzimática) mas retêm a especificidade da sequência para serem capazes de se ligar a sequências de nucleótidos alvo.

Outros exemplos de oligonucleótidos de sentido ou anti-sentido incluem os oligonucleótidos que estão covalentemente ligados a unidades orgânicas, tais como as descritas no documento WO 90/10448, e outras unidades que aumentam a afinidade do oligonucleótido para uma sequência de ácido nucleico alvo, tal como poli-(L-lisina) . Para além disso, agentes intercalantes, tais como elipticina, e agentes alquilantes ou complexos metálicos podem ser ligados a 55 oligonucleótidos de sentido ou anti-sentido para modificar as especificidades de ligação do oligonucleótido anti-sentido ou de sentido à sequência de nucleótidos alvo.

Os oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido podem ser introduzidos na célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo através de qualquer método de transferência de genes, incluindo, por exemplo, lipofecção, transfecção de ADN mediada por CaP04, electroporação, ou utilizando vectores de transferência de genes, tais como o vírus Epstein-Barr.

Oligonucleótidos de sentido ou anti-sentido também podem ser introduzidos numa célula contendo a sequência de nucleótidos alvo por formação de um conjugado com uma molécula de ligação ao ligando, como descrito no documento WO 91/04753. Moléculas de ligação ao ligando adequadas incluem, mas não estão limitadas a, receptores de superfície celular, factores de crescimento, outras citocinas, ou outros ligandos que se ligam ao receptores de superfície celular. De um modo preferido, a conjugação da molécula de ligação ao ligando não interfere substancialmente com a capacidade da molécula de ligação ao ligando para se ligar à sua molécula ou receptor correspondente, ou bloquear a entrada do oligonucleótido de sentido ou anti-sentido ou sua versão conjugada para a célula.

Alternativamente, um oligonucleótido de sentido ou um de anti-sentido pode ser introduzido numa célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo por formação de um complexo oligonucleótido-lípido, como descrito no documento WO 90/10448. 0 complexo oligonucleótido de sentido ou anti-sentido-lípido é, de um modo preferido, dissociado na célula por uma lipase endógena. 56

UTILIZÇÃO DE POLIPÉPTIDOS E POLIPÉPTIDOS FRAGMENTADOS DE

TSLP HUMANOS

Utilizações incluem, mas não estão limitadas às seguintes:

Purificar proteínas e medição da sua actividade Agentes de Distribuição Reagentes Terapêuticos e de Investigação Marcadores de peso molecular e focagem Isoeléctrica Controlos para fragmentação de péptidos Identificação de proteínas desconhecidas Preparação de Anticorpos

Reagentes de Purificação 0 polipéptido da invenção encontra utilização como um reagente de purificação de proteína. Por exemplo, os polipéptidos podem ser utilizados para purificar parceiros de ligação a TSLP, tal como receptores humanos de TSLP. Em formas de realização particulares, um polipéptido (em qualquer forma aqui descrita que é capaz de ligação aos receptores de TSLP) é ligado a um suporte sólido por processos convencionais. Como um exemplo, estão disponíveis colunas de cromatografia de afinidade contendo grupos funcionais que irão reagir com grupos funcionais em cadeias laterais de aminoácidos de proteínas (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) . Numa alternativa, um polipéptido de TSLP/proteína Fc (como discutido acima) é ligado a colunas de cromatografia contendo Proteína A ou Proteína G através da interacção com a unidade Fc. 57 0 polipéptido também encontra utilização na purificação ou identificação de células que expressam receptores de TSLP na superfície celular. Os polipéptidos são ligados a uma fase sólida, tais como uma matriz de cromatografia em coluna ou um substrato adequado semelhante. Por exemplo, podem ser revestidas microesferas magnéticas com os polipéptidos e mantidas num recipiente de incubação através de um campo magnético. Suspensões de misturas de células contendo células que expressam receptor de TSLP são colocadas em contacto com a fase sólida possuindo nela os polipéptidos. Células que expressam receptor de TSLP na superfície celular ligam-se aos polipéptidos fixados, e as células não ligadas são então removidas por lavagem.

Alternativamente, os polipéptidos podem ser conjugados com uma unidade detectável, depois incubados com células a serem testadas para a expressão do receptor de TSLP. Após incubação, a matéria não ligada marcada é removida e a presença ou ausência da unidade detectável nas células é determinada.

Noutra alternativa, as misturas de células suspeitas de conter receptores de TSLP são incubadas com polipéptidos biotinilados. Os períodos de incubação têm tipicamente, pelo menos, uma hora de duração para assegurar ligação suficiente. A mistura resultante é então passada através de uma coluna empacotada com esferas revestidas com avidina, através da qual a afinidade elevada da biotina para a avidina proporciona ligação das células desejadas às esferas. Processos para utilização de esferas revestidas com avidina são conhecidos (ver Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986)). A lavagem para remover material não ligado, e a libertação das células ligadas, são realizadas utilizando métodos convencionais. 58

Medição da Actividade

Os polipéptidos também encontram utilização na medição da actividade biológica dos receptores de TSLP em termos da sua afinidade de ligação. Os polipéptidos podem, assim, ser empregues por aqueles que coordenam estudos de "garantia de qualidade", e. g., para monitorizar a vida de prateleira e a estabilidade da proteína em diferentes condições. Por exemplo, os polipéptidos podem ser empregues num estudo de afinidade de ligação para medir a actividade biológica de um receptor de TSLP que tinha sido armazenado a diferentes temperaturas, ou produzido em diferentes tipos de células. As proteínas também podem ser utilizadas para determinar se a actividade biológica é retida após modificação de um receptor de TSLP (e. g., modificação química, truncagem, mutação, etc.). A afinidade de ligação do receptor de TSLP modificado é comparado com o de um receptor de TSLP não modificado para detectar qualquer impacto adverso das modificações na actividade biológica de receptores de TSLP. A actividade biológica de um receptor de TSLP pode, assim, ser averiguada antes de ser utilizada num estudo de investigação, por exemplo.

Agentes de Distribuição

Os polipéptidos também encontram utilização como veículos para agentes de distribuição ligados a estes para células que comportam os receptores de TSLP. Células que expressam receptores de TSLP incluem aquelas identificadas no timo, baço, rim, e medula óssea. Os polipéptidos podem ser, assim, utilizados para distribuir agentes de diagnóstico ou terapêuticos para essas células (ou para outros tipos de células 59 que se observa expressarem receptores de TSLP na superfície celular) em processos in vitro ou in vivo.

Agentes detectáveis (de diagnóstico) e terapêuticos que podem ser ligados a um polipéptido incluem, mas não estão limitadas a, toxinas, outros agentes citotóxicos, fármacos, radionuclidos, cromóforos, enzimas que catalizam uma reacção colorimétrica ou fluorométrica, e semelhantes, com o agente particular sendo escolhido de acordo com a aplicação pretendida. Entre as toxinas estão ricina, abrina, toxina da difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas de inactivação ribossómica, micotoxinas, tais como tricotecenos, e derivados e os seus fragmentos (e. g., cadeias simples). Radionuclidos adequados para utilização em diagnóstico incluem, mas não estão limitados a, 123I, 131I, 99mTc, mIn, e 7êBr. Exemplos de radionuclidos adequados para utilização terapêutica são 131I, 211At, 77Br, 186Re, 188Re, 212Pb, 212Bi, 109Pd, 64Cu, e 67Cu.

Esses agentes podem ser ligados ao polipéptido através de qualquer processo convencional adequado. 0 polipéptido compreende grupos funcionais em cadeias laterais de aminoácidos que podem ser reagidos com grupos funcionais num agente desejado para formar ligações covalentes, por exemplo. Alternativamente, a proteína ou agente pode ser derivada para criar ou ligar um grupo funcional reactivo desejado. A derivação pode envolver a ligação de um dos reagentes de acoplamento bifuncional disponível para ligar várias moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois) . São conhecidas várias técnicas para marcar radioactivamente proteínas. Podem ser ligados metais de radionuclidos aos polipéptidos utilizando um agente quelante bifuncional adequado, por exemplo. 60

Conjugados compreendendo polipéptidos e um agente de diagnóstico ou terapêutico adequado (de um modo preferido, ligado covalentemente) são assim preparados. Os conjugados são administrados ou, de outra forma, empregues numa quantidade apropriada para a aplicação particular.

Agentes Terapêuticos

Os polipéptidos da invenção podem ser utilizados no desenvolvimento de tratamentos para qualquer distúrbio mediado (directa ou indirectamente) por polipéptidos defeituosos, ou quantidades insuficientes destes. Estes polipéptidos podem ser administrados a um mamifero padecendo com esse distúrbio.

Os polipéptidos também podem ser empregues na inibição da actividade biológica de receptores de TSLP em processos in vitro ou in vivo. Por exemplo, um polipéptido purificado ou modificado ou um fragmento deste (e. g., polipéptidos TSLP modificados que se ligam ao receptor mas não têm a capacidade para induzir sinalização) podem ser utilizados para inibir a ligação de TSLP endógeno aos receptores da superfície celular. Efeitos biológicos que resultam da ligação do TSLP endógeno aos receptores são assim inibidos.

Adicionalmente, podem ser administrados polipéptidos de receptor de TSLP a um mamífero para tratar um distúrbio mediado por receptor de TSLP. Esses distúrbios mediados por receptor de TSLP incluem estados provocados (directa ou indirectamente) ou exacerbados por receptores de TSLP. 61

Composições da presente invenção podem conter um polipéptido em qualquer forma aqui descrita, tais como proteínas nativas, variantes, derivados, oligómeros, e fragmentos biologicamente activos. Em formas de realização particulares, a composição compreende um polipéptido de TSLP solúvel ou um oligómero compreendendo polipéptidos de TSLP solúveis. São aqui proporcionadas, composições compreendendo uma quantidade eficaz de um polipéptido da presente invenção, em combinação com outros componentes tais como um diluente, veiculo, ou excipiente fisiologicamente aceitável. Os polipéptidos podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos utilizados para preparar composições farmaceuticamente úteis. Eles podem ser combinados em mistura, quer como o único material activo ou com outros materiais activos conhecidos adequados para uma dada indicação, com diluentes farmaceuticamente aceitáveis (e. g-, soro fisiológico,

Tris-HCl, acetato, e soluções tamponadas com fosfato), conservantes (e. g., timerosal, álcool benzilico, parabenos), emulsificadores, solubilizadores, adjuvantes e/ou veículos. Formulações adequadas para composições farmacêuticas incluem aquelas descritas em (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980)).

Adicionalmente, essas composições podem ser complexadas com polietilenoglicol (PEG), iões metálicos, ou incorporados em compostos poliméricos, tais como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogéis, dextrano, etc., ou incorporados em lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, eritrócitos ou esferoblastos fantasmas. Essas composições irão influenciar o estado físico, solubilidade, estabilidade, taxa de libertação in vivo, e taxa de eliminação 62 in vivo, e são deste modo escolhidos de acordo com a aplicação pretendida.

As composições da invenção podem ser administradas de qualquer modo adequado, e. g., topicamente, parentericamente, ou por inalação. 0 termo "parentérico" inclui injecção, e. g., por via subcutânea, intravenosa, ou intramuscular, incluindo também administração localizada, e. g., num local de doença ou lesão. A libertação sustentada para implantes também está contemplada. Um especialista na técnica pertinente reconhecerá que as dosagens adequadas irão variar, dependendo de factores, tais como a natureza do distúrbio a ser tratado, o peso corporal do doente, idade, e estado geral, e a via de administração. Podem ser determinadas doses preliminares de acordo com testes em animais, e o aumento de escala de dosagens para administração humana é realizada de acordo com práticas aceites na técnica.

Composições compreendendo ácidos nucleicos em formulações fisiologicamente aceitáveis estão também contempladas. 0 ADN pode ser formulado para injecção, por exemplo.

Agentes de Investigação

Outra utilização do polipéptido da presente invenção é como uma ferramenta de investigação para estudar os efeitos biológicos que resultam da inibição de interacções do receptor de TSLP/TSLP em diferentes tipos de células. Os polipéptidos também podem ser empregues em ensaios in vitro para detectar TSLP ou receptores de TSLP ou as interacções destes. 63

Outra forma de realização da invenção refere-se a utilizações de TSLP humano para estudar a transdução de sinal de células B ou células T. TSLP humano e outras citocinas desempenham um papel central no desenvolvimento de células B e células T e respostas imunitárias, incluindo sinais de transdução celular, estimulando as células para segregar citocinas, e induzir a proliferação celular de células B e T. Como tal, as alterações na expressão e/ou activação de TSLP pode possuir efeitos profundos numa abundância de processos celulares, incluindo, mas não limitados a, activação ou inibição de respostas e proliferação especificas para a célula. A expressão de TSLP clonado ou de mutantes de TSLP cataliticamente inactivos têm sido utilizados para identificar o papel que uma proteína particular desempenha na mediação de eventos de sinalização específicos. A sinalização celular envolve, frequentemente, uma cascata de activação molecular, durante a qual um receptor propaga um sinal mediado por ligando-receptor activando especificamente cinases intracelulares que fosforilam substratos alvo. Estes substratos podem ser, eles próprios, cinases que se tornam activadas após fosforilação. Alternativamente, eles podem ser moléculas adaptadoras que facilitam a sinalização a jusante através de interacção proteína-proteína após fosforilação. Independentemente da natureza da(s) molécula(s) de substrato, podem ser utilizadas versões expressas cataliticamente activas dos receptores de ligando de TSLP para identificar qual(is) o(s) substrato(s) que foi(ram) reconhecidos e activado(s) pelo(s) receptor(es) de ligando de TSLP. Como tal, estes novos receptores de TSLP podem ser utilizados como reagentes para identificar novas moléculas envolvidas na vias de transdução de sinal. 64

Adicionalmente, pode ser utilizado TSLP por um especialista na técnica utilizando técnicas bem conhecidas para estimular a proliferação de células da linhagem B ou linhagem T (Ray et al., Eur. J. Immunology 26, 10-16 (1996)) e (Namikawa et al., Blood 87:1881-1890 (1996)), para clonar a expressão do receptor de TSLP humano (Sims et al., Science 241:585-589 (1988)), para clonar uma proteina relacionada (Kozlosky et. al., Citocine 9:540-549 (1997)) e (Lyman et al., Blood 10:2795-2801 (1994)), e para expandir células ex vivo (Piacibello et al., Blood 89:2644-2653 (1997) ) .

Suas Utilizações

Assim, a presente invenção abrange métodos de estimulação da proliferação de linfócitos B e T, em que o método compreende incubar linfócitos com TSLP humana. Ainda noutra forma de realização, o método compreende incubar linfócitos com TSLP humano e pelo menos uma outra citocina ín vivo ou in vitro. De um modo preferido, a citocina é seleccionada do grupo de IL-7, Factor Steel, Factor de Células Estaminais, Factor de

Crescimento de Mastócitos ou flt3-Ligando. De um modo mais preferido, a citocina é IL-7. A presente invenção também abrange métodos de estimulação do desenvolvimento de linfócitos ou linfopoiese, em que o método compreende incubar células progenitoras, tais como células mononucleares derivadas da medula óssea, com TSLP humano in vivo ou in vitro. Noutra forma de realização, o método compreende incubar linfócitos com TSLP humano e, pelo menos, uma outra citocina. De um modo preferido, a citocina é seleccionada a partir do grupo de IL-7, Factor Steel, Factor de Células 65

Estaminais, Factor de Crescimento de Mastócitos ou flt3-Ligando. De um modo mais preferido a citocina é IL-7.

Marcadores de Peso Molecular e Ponto Isoeléctrico

Os polipéptidos da presente invenção podem ser sujeitos a fragmentação em péptidos mais pequenos por meios químicos e enzimáticos, e os fragmentos peptídicos assim produzidos podem ser utilizados na análise de outras proteínas ou polipéptidos. Por exemplo, esses fragmentos peptídicos podem ser utilizados como péptidos marcadores de peso molecular, péptidos marcadores de ponto isoeléctrico, ou na análise do grau de fragmentação de péptidos. Deste modo, a invenção também inclui estes polipéptidos e fragmentos peptídicos, bem como kits para auxiliar na determinação do peso molecular aparente e ponto isoeléctrico de uma proteína desconhecida e kits para avaliar o grau de fragmentação de uma proteína desconhecida.

Embora todos os métodos de fragmentação sejam compreendidos pela invenção, a fragmentação química é uma forma preferida de realização, e inclui a utilização de brometo de cianogénio para clivar em condições neutras ou acídicas, de modo a que a clivagem especifica ocorra nos resíduos de metionina (E. Gross, Methods in Enz. 11:238-255 (1967)). Isto pode ainda incluir passos adicionais, tais como um passo de carboximetilação para converter resíduos de cisteína em espécies não reactivas. A fragmentação enzimática é outra forma de realização preferida, e inclui a utilização de uma protease, tal como Asparaginilendo-peptidase, Arginilendo-peptidase, protease I de

Achromobacter, Tripsina, protease de Staphlococcus aureus V8, 66

Endoproteinase Asp-N, ou Endoproteinase Lys-C em condições convencionais para resultar na clivagem em resíduos de aminoácidos específicos. A asparaginilendo-peptidase pode clivar especificamente no lado carboxilo dos resíduos de asparagina presentes nos polipéptidos da invenção. A arginilendo-peptidase pode clivar especificamente no lado carboxilo dos resíduos de arginina presentes nestes polipéptidos. A protease I de Achromobacter pode clivar especificamente no lado carboxilo dos resíduos de lisina presentes nos polipéptidos (Sakiyama e Nakat, Patente U.S. N°. 5248599; T. Masaki et al.r Biochim. Biophys.

Acta 660:44-50 (1981); T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660:51-55 (1981)). A tripsina pode clivar especificamente no lado carboxilo dos resíduos de arginina e lisina presentes nos polipéptidos da invenção. A fragmentação enzimática também ocorrer com uma protease que cliva em múltiplos resíduos de aminoácidos. Por exemplo, a protease de Staphlococcus aureus V8 pode clivar especificamente no lado carboxilo dos resíduos de ácido aspártico e glutâmico presentes nos polipéptidos (D. w.

Cleveland, J. Biol. Chem. 3:1102-1106 (1977)). A endoproteinase Asp-N pode clivar especificamente no lado amino dos resíduos de asparagina presentes nos polipéptidos. A endoproteinase Lys-C pode clivar especificamente no lado carboxilo dos resíduos de lisina presentes nos polipéptidos da invenção. Outros tratamentos enzimáticos e químicos podem, de igual modo, ser utilizados para fragmentar especificamente estes polipéptidos num conjunto único de péptidos específicos.

Certamente, os péptidos e fragmentos dos polipéptidos da invenção podem também ser produzidos por processos recombinantes convencionais e processos sintéticos bem conhecidos na técnica. Em relação a processos recombinantes, os polipéptidos e fragmentos peptídicos compreendidos pela invenção podem possuir 67 pesos moleculares variáveis, dependendo da célula hospedeira na qual são expressos. A glicosilação de polipéptidos e fragmentos peptídicos da invenção em vários tipos de células podem resultar em variações do peso molecular destes fragmentos, dependendo da extensão da modificação. 0 tamanho destes fragmentos pode ser muito heterogéneo com fragmentos de polipéptido derivados da porção extracelular do polipéptido. Polipéptidos e fragmentos peptídicos consistentes podem ser obtidos utilizando polipéptidos derivados inteiramente das regiões transmembrana e citoplásmica, pré-tratando com N-glicanase para remover a glicosilação, ou expressando os polipéptidos em hospedeiros bacterianos. 0 peso molecular destes polipéptidos também pode ser variado fundindo sequências peptídicas adicionais para ambas as extremidades dos terminais amino e carboxilo de polipéptidos da invenção. Fusões de sequências de péptidos adicionais nas extremidades amino e carboxilo dos polipéptidos da invenção podem ser utilizadas para aumentar a expressão destes polipéptidos ou auxiliar na purificação da proteína. Adicionalmente, fusões de sequências peptídicas adicionais nas extremidades dos terminais amino e carboxilo dos polipéptidos da invenção irão alterar alguns, mas normalmente não todos, os péptidos fragmentados dos polipéptidos gerados por tratamento enzimático ou químico. Certamente, podem ser introduzidas mutações nos polipéptidos da invenção utilizando técnicas de rotina e conhecidas de biologia molecular. Por exemplo, uma mutação pode ser concebida de modo a eliminar um sítio de clivagem proteolítica por uma enzima específica ou um sítio de clivagem por um processo de fragmentação específica induzida quimicamente. A eliminação do sítio irá alterar a impressão 68 digital peptidica dos polipéptidos da invenção após fragmentação com a enzima especifica ou processo químico.

Os polipéptidos e os péptidos fragmentados resultantes podem ser analisados por métodos incluindo sedimentação, electroforese, cromatografia, e espectrometria de massa para determinar os seus pesos moleculares. Dado que a sequência de aminoácidos única de cada fragmento especifica um peso molecular, estes fragmentos podem, posteriormente, servir como marcadores de peso molecular utilizando essas técnicas de análise para auxiliar na determinação do peso molecular de uma proteína desconhecida, polipéptidos ou seus fragmentos. Os marcadores de peso molecular da invenção servem particularmente bem como marcadores de peso molecular para estimar o peso molecular aparente de proteínas que possuem pesos moleculares aparentes semelhantes e, consequentemente, permitem precisão aumentada na determinação do peso molecular aparente de proteínas.

Quando a invenção se refere à utilização de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados, estes marcadores têm, de um modo preferido, pelo menos, 10 aminoácidos de comprimento. De um modo mais preferido, estes marcadores peptídicos fragmentados de peso molecular estão entre 10 e 100 aminoácidos em comprimento. De um modo ainda mais preferido, são marcadores de peso molecular de péptido fragmentados entre 10 e 50 aminoácidos em comprimento e especialmente entre 10 e 35 aminoácidos em tamanho. De um modo muito preferido são marcadores de peso molecular peptídicos fragmentados entre 10 e 20 aminoácidos de comprimento. 69

Entre os métodos para determinar o peso molecular estão sedimentação, electroforese em gel, cromatografia, e espectrometria de massa. Uma forma de realização particularmente preferida é a electroforese em gel em poliacrilamida desnaturante (U.K. Laemmli, Nature 227:680-685 (1970)). Convencionalmente, o método utiliza duas pistas separadas de um gel contendo dodecil sulfato de sódio e uma concentração de acrilamida entre 6-20%. A capacidade para resolver simultaneamente o marcador e a amostra em condições idênticas permite um aumento da precisão. É compreendido, certamente, que podem ser utilizadas muitas técnicas diferentes para a determinação do peso molecular de uma proteína desconhecida utilizando polipéptidos da invenção, e que esta forma de realização não limita, de modo algum, o âmbito da invenção.

Cada polipéptido não glicosilado ou o seu fragmento tem um pi que é determinado intrinsecamente pela sua sequência de aminoácidos única (cujo pi pode ser estimado pelo especialista na técnica utilizando qualquer um dos programas de computador concebidos para prever valores de pi presentemente disponíveis, calculados utilizando qualquer tabela de pKa de aminoácidos bem conhecida, ou medidos empiricamente). Por isso, estes polipéptidos e seus fragmentos podem servir como marcadores específicos para auxiliar na determinação do ponto isoeléctrico de uma proteína desconhecida, polipéptido, ou péptido fragmentado utilizando técnicas, tais como focagem isoeléctrica. Estes polipéptidos ou marcadores de péptidos fragmentados servem particularmente bem para estimar os pontos isoeléctricos aparentes de proteínas desconhecidas que possuem pontos isoeléctricos aparentes próximo dos de marcadores de polipéptido ou péptidos fragmentados da invenção. 70 A técnica de focagem isoeléctrica pode ser ainda combinada com outras técnicas, tal como electroforese em gel para separar simultaneamente uma proteína com base no peso molecular e carga. A capacidade para resolver simultaneamente estes marcadores de polipéptido ou péptido fragmentado e a proteína desconhecida em condições idênticas permite o aumento da precisão na determinação do ponto isoeléctrico aparente da proteína desconhecida. Isto é de particular interesse em técnicas, tais como electroforese a duas dimensões (T.D. Brock e M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77, Prentice Hall, 6a ed. (1991)), em que a natureza do processo dita que quaisquer marcadores devem ser resolvidos simultaneamente com a proteína desconhecida. Adicionalmente, com esses métodos, estes polipéptidos e os seus péptidos fragmentados podem assistir na determinação tanto do ponto isoeléctrico como do peso molecular de uma proteína desconhecida ou péptido fragmentado.

Polipéptidos e péptidos fragmentados podem ser visualizados utilizando dois métodos diferentes que permitem uma discriminação entre a proteína desconhecida e os marcadores de peso molecular. Numa forma de realização, os marcadores de peso molecular de polipéptido e péptido fragmentado da invenção podem ser visualizados utilizando anticorpos produzidos contra estes marcadores e técnicas imunotransferência convencionais. Esta detecção é realizada sob condições convencionais que não resultam na detecção da proteína desconhecida. É entendido que pode não ser possível criar anticorpos contra todos os fragmentos de polipéptidos da invenção, uma vez que péptidos pequenos podem não conter epitopos imunogénicos. É ainda entendido que nem todos os anticorpos funcionarão deste modo; todavia, aqueles anticorpos que são capazes de se ligarem a 71 polipéptidos e fragmentos da invenção podem ser prontamente determinados utilizando técnicas convencionais. A proteína desconhecida é também visualizada utilizando um processo de coloração convencional. 0 excesso molar de proteína desconhecida em relação aos marcadores de peso molecular de polipéptido ou péptido fragmentado da invenção é tal que o processo de coloração convencional detecta predominantemente a proteína desconhecida. 0 nível destes marcadores de peso molecular de polipéptido ou péptido fragmentado é tal que permite pouca ou nenhuma detecção destes marcadores pelo método de coloração convencional. 0 excesso molar preferido de proteína desconhecida em relação a marcadores de peso molecular de polipéptido da invenção está entre 2 e 100 000 vezes. De um modo mais preferido, o excesso molar preferido de proteína desconhecida em relação a estes marcadores de peso molecular de polipéptido está entre 10 e 10 000 vezes e especialmente entre 100 e 1 000 vezes. É entendido, obviamente, que podem ser utilizadas muitas técnicas para a determinação e detecção do peso molecular e ponto isoeléctrico de uma proteína desconhecida, polipéptidos, e os seus péptidos fragmentados utilizando estes marcadores de peso molecular de polipéptido e fragmentos peptídicos destes e que essas formas de realização não limitam, de modo algum, o âmbito da invenção.

Noutra forma de realização, a análise da fragmentação progressiva dos polipéptidos da invenção em péptidos específicos (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252:1102-1106 (1977)), tais como por alteração do tempo ou temperatura da reacção de fragmentação, podem ser utilizados como um controlo para a 72 extensão da clivagem de uma proteína desconhecida. Por exemplo, a clivagem da mesma quantidade de polipéptido e proteína desconhecida em condições idênticas pode permitir uma comparação directa da extensão da fragmentação. As condições que resultam na fragmentação completa do polipéptido também podem resultar na fragmentação completa da proteína desconhecida.

Em relação à utilização específica dos polipéptidos e péptidos fragmentados da invenção como marcadores de peso molecular, a fragmentação do polipéptido da SEQ ID N°:2 com brometo de cianogénio cria um conjunto único de marcadores de peso molecular de péptido fragmentado. A distribuição dos resíduos de metionina determina o número de aminoácidos em cada péptido e a composição de aminoácidos única de cada péptido determina o seu peso molecular.

Adicionalmente, o polipéptido purificado preferido da invenção (SEQ ID N°:2) possui um peso molecular observado de, aproximadamente, 21000 Daltons.

Quando é utilizada uma proteína intacta, a utilização destes marcadores de peso molecular de polipéptido permite a precisão aumentada na determinação do peso molecular aparente de proteínas que possuem pesos moleculares aparentes próximo de 21 000 Daltons. Quando são utilizados fragmentos, há um aumento da precisão na determinação do peso molecular ao longo do intervalo de pesos moleculares do fragmento.

Finalmente, em relação aos kits que são compreendidos pela invenção, os constituintes desses kits podem ser variados mas, tipicamente, contêm os marcadores de peso molecular de polipéptido e péptido fragmentado. Também, esses kits podem 73 conter os polipéptidos em que um sítio necessário para fragmentação foi removido. Além disso, os kits podem conter reagentes para a clivagem específica do polipéptido e a proteína desconhecida por clivagem quimica ou enzimática. Os kits podem ainda conter anticorpos dirigidos contra polipéptidos ou seus fragmentos da invenção.

Identificação de Proteínas Desconhecidas

Como apresentado acima, uma impressão digital de polipéptido ou péptido pode entrar em ou ser comparada com uma base de dados de proteínas conhecidas para auxiliar na identificação da proteína desconhecida utilizando espectrometria de massa (W.J. Henzel et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5011-5015 (1993); D. Fenyo et al., Electrophoresis 19:998-1005 (1998)). Estão acessíveis através da Internet uma variedade de programas informáticos de computador para facilitar estas comparações, tais como Protein Prospector (Sítio da internet: prospector.uscf.edu), Multildent (Sítio da internet: www.expasy.ch/sprot/multiident.html), Peptidesearch (Sítio da internet: www.mann.embl-heiedelberg.de...deSearch/FR_Peptidesearch Form.html), e ProFound (Sítio da internet: www.chaitsgi. rockefeller.edu/cgi-bin/protid-frag.html). Estes programas permitem ao utilizador especificar o agente de clivagem e os pesos moleculares dos péptidos fragmentados numa tolerância designada. Os programas comparam estes pesos moleculares com bases de dados de proteínas para auxiliar na determinação da identidade da proteína desconhecida. 74

Adicionalmente, uma digestão de polipéptido ou péptido pode ser sequenciada utilizando espectrometria de massa tandem (MS/MS) e a sequência resultante pesquisada contra bases de dados (J.K. Eng, et al., J. Am. Soc. Mass Spec. 5:976-989 (1994); M. Mann e M. Wilm, Anal. Chem. 66:4390-4399 (1994); J.A. Taylor e R.S. Johnson, Rapid Comm. Mass Spec. 11: 1067-1075 (1997)). Programas de pesquisa que podem ser utilizados neste processo existem na Internet, tais como Lutefisk 97 (Sitio da internet: www.lsbc.com:70/Lutefisk97.html), e os programas Protein Prospector, Peptide Search e ProFound como descrito acima. Por isso, adicionar a sequência de um gene e sua sequência de proteína prevista e fragmentos peptídicos a uma base de dados de sequências pode auxiliar na identificação de proteínas desconhecidas utilizando espectrometria de massa tandem.

Anticorpos

Os anticorpos que são imunorreactivos com os polipéptidos da invenção são aqui proporcionados. Esses anticorpos ligam-se especificamente aos polipéptidos através dos sítios de ligação ao antigénio do anticorpo (em oposição a ligação não específica). Assim, os polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusão, etc., como apresentados acima, podem ser empregues como "imunogénios" na produção de anticorpos imunorreactivos com estes. Mais especificamente, os polipéptidos, fragmento, variantes, proteínas de fusão, etc. contêm determinantes antigénicos ou epitopos que induzem a formação de anticorpos. 75

Estes determinantes antigénicos ou epitopos podem ser quer lineares ou conformacionais (descontínuos). Epitopos lineares são compostos por uma única secção de aminoácidos do polipéptido, enquanto que os epitopos conformacionais ou descontínuos são compostos por secções de aminoácidos de diferentes regiões da cadeia de polipéptido que são colocados em proximidade estreita após a dobragem da proteína (C. A. Janeway, Jr. e P. Travers, Immuno Biology 3:9, Garland Publishing Inc., 2a ed. (1996)). Devido às proteínas dobradas possuírem superfícies complexas, o número de epitopos disponíveis é bastante numeroso; todavia, devido à conformação da proteína e impedimentos estéricos, o número de anticorpos que na verdade se ligam aos epitopos é menor do que o número de epitopos disponíveis (C. A. Janeway, Jr. e P. Travers, Immuno Biology 2:14, Garland Publishing Inc., 2a ed. (1996)). Os epitopos podem ser identificados por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica.

Assim, um aspecto da presente invenção refere-se a epitopos antigénicos dos polipéptidos da invenção. Esses epitopos são úteis para criar anticorpos, em particular anticorpos monoclonais, como descrito em maior detalhe abaixo. Adicionalmente, os epitopos dos polipéptidos da invenção podem ser utilizados como reagentes de pesquisa, em ensaios, e para purificar anticorpos de ligação específica de substâncias, tais como soros policlonais ou sobrenadantes de hibridomas cultivados. Esses epitopos ou variantes destes podem ser produzidos utilizando técnicas bem conhecidas na técnica, tais como síntese de fase sólida, clivagem química ou enzimática de um polipéptido, ou utilizando tecnologia do ADN recombinante. 76

Em relação aos anticorpos que podem ser induzidos pelos epitopos dos polipéptidos da invenção, quer os epitopos tenham sido isolados ou permaneçam parte dos polipéptidos, ambos os anticorpos policlonais e monoclonais podem ser preparados por técnicas convencionais. Ver, por exemplo, (Kennet et al., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, eds., Plenum Press, Nova Iorque (1980); e Harlow e Land, Antibodies: A Laboratory Manual, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)).

As linhas celulares de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais específicos para os polipéptidos da invenção estão também aqui contempladas. Esses hibridomas podem ser produzidos e identificados por técnicas convencionais. Um método para produzir uma tal linha celular de hibridoma compreende imunizar um animal com um polipéptido; recolhendo células do baço do animal imunizado; fundir as referidas células do baço com uma linha celular de mieloma, criando assim células de hibridoma; e identificando uma linha celular de hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que se liga ao polipéptido. Os anticorpos monoclonais podem ser recuperados por técnicas convencionais.

Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem anticorpos quiméricos, e. g., versões humanizadas de anticorpos monoclonais de murino. Esses anticorpos humanizados podem ser preparados por técnicas conhecidas e oferecem a vantagem de reduzir a imunogenicidade quando os anticorpos são administrados a humanos. Numa forma de realização, um anticorpo monoclonal humanizado compreende a região variável de um anticorpo de murino (ou apenas o seu sítio de ligação ao antigénio) e uma região constante derivada de um anticorpo humano.

Alternativamente, um fragmento de anticorpo humanizado pode 77 compreender o sítio de ligação ao antigénio de um anticorpo monoclonal de murino e um fragmento da região variável (que não tem o sítio de ligação ao antigénio) derivado de um anticorpo humano. Processos para a produção de anticorpos monoclonais quiméricos e outros modificados incluem aqueles descritos em (Riechmann et al.f Nature 332:323 (1988), Liu et al.r PNAS 84:3439 (1987), Larrick et al., Bio/Technology 7:934 (1989), e Winter e Harris, TIPS 14:139 (Maio de 1993)). Processos para criar anticorpos transgenicamente podem ser encontrados no documento GB 2272440, Patentes U.S. Nos. 5569825 e 5545806 e patentes relacionadas que reivindicam prioridade sobre estas.

Fragmentos de ligação ao antigénio dos anticorpos, que podem ser produzidos por técnicas convencionais, também estão compreendidos pela presente invenção. Exemplos desses fragmentos incluem, mas não estão limitadas a, fragmentos Fab e F(ab')2· Fragmentos de anticorpo e derivados produzidos por técnicas de engenharia genética também são proporcionados.

Numa forma de realização, os anticorpos são específicos para os polipéptidos da presente invenção e não apresentam reacção cruzada com outras proteínas. Os processos de rastreio pelos quais esses anticorpos podem ser identificados são bem conhecidos, e podem envolver cromatografia de imunoafinidade, por exemplo.

Suas Utilizações

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados em ensaios para detectar a presença dos polipéptidos ou fragmentos da invenção, quer in vitro ou in vivo. Os anticorpos também podem 78 ser empregues na purificação de polipéptidos ou fragmentos da invenção por cromatografia de imunoafinidade.

Os anticorpos gue, adicionalmente, podem bloguear a ligação dos polipéptidos da invenção aos receptores de TSLP podem ser utilizados para inibir a actividade biológica que resulta dessa ligação. Esses anticorpos bloqueadores podem ser identificados utilizando qualquer processo de ensaio adequado, tal como por teste de anticorpos para a sua capacidade para inibir a ligação de TSLP a certas células que expressam os receptores de TSLP. Exemplos dessas células são as linhas celulares de linfóides B e T 70Z/3 e 7B9, respectivamente. Alternativamente, os anticorpos bloqueadores podem ser identificados em ensaios para a capacidade para inibir um efeito biológico que resulta da ligação de TSLP aos receptores de TSLP nas células alvo. Os anticorpos podem ser ensaiados quanto à capacidade para inibir a lise mediada por TSLP de células que expressam receptores de TSLP, por exemplo.

Um tal anticorpo pode ser empregue num processo in vitro, ou administrado in vivo para inibir a actividade biológica mediada pela entidade que cria o anticorpo. Distúrbios provocados ou exacerbados (directa ou indirectamente) pela interacção de TSLP com receptores de TSLP da superfície celular podem ser assim tratados. Um método terapêutico envolve a administração in vivo de um anticorpo bloqueador a um mamífero numa quantidade eficaz na inibição da actividade biológica mediada por TSLP. Os anticorpos monoclonais são geralmente preferidos para utilização nesses métodos terapêuticos. Numa forma de realização, é empregue um fragmento de anticorpo de ligação ao antigénio. 79

Os anticorpos podem ser rastreados para propriedades agonisticas (i. e., mimetizando o ligando). Esses anticorpos, após ligação aos receptores de TSLP da superfície celular, induzem efeitos biológicos (e. g., transdução de sinais biológicos) semelhantes aos efeitos biológicos induzidos quando o TSLP se liga a receptores de TSLP da superfície celular. Podem ser utilizados anticorpos agonísticos para induzir a proliferação celular da linhagem B ou linhagem T. São aqui proporcionadas, composições compreendendo um anticorpo que é dirigido contra TSLP humano, e um diluente, excipiente, ou veículo fisiologicamente aceitável. Componentes adequados dessas composições são como descrito acima para composições contendo proteínas de TSLP humanas. São também aqui proporcionados conjugados compreendendo um agente detectável (e. g., diagnóstico) ou terapêutico, ligado ao anticorpo. Exemplos desses agentes são apresentados acima. Os conjugados encontram utilização em processos in vitro ou in vi vo.

Os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar ainda formas de realização particulares da invenção, e não pretendem ser encarados como limitantes do âmbito da presente invenção. EXEMPLO 1: Isolamento do Ácido Nucleico

Foi obtida uma sequência de ácido nucleico de TSLP humano por sequenciação do clone EST IMAGE 1407260, número de acesso #AA889581. Esta sequência sugere, em comparação com a sequência de TSLP de murino, que o clone EST era um clone parcial. Foram 80 rastreadas várias bibliotecas de ADNc com iniciadores internos para determinar uma fonte de ADNc que possa ser utilizada para obter a extremidade 3' em falta do clone de ADNc de TSLP. Após 60 ciclos de PCR utilizando dois iniciadores internos da sequência de TSLP de humano, as seguintes bibliotecas de ADNc foram positivas para as sequências de TSLP: testículos humanos, fibroblastos de prepúcio humano, e cérebro fetal (fracamente positivos); enquanto que MoT, HS431, medula óssea, HPT4, HBT3, W126, Hutl02, PBT, Sk Hep, fibroblasto dérmico humano, Raji, placenta humana, e bibliotecas KB foram todos negativos.

Utilizanda PCR na biblioteca de ÀgtlO de testículo humano com um iniciador interno de TSLP e um iniciador do vector ÀgtlO, foram isolados dois clones (19E e 19F) com sequências idênticas a sequências internas de TSLP humano. Ambos os clones tinham extremidades 5' idênticas, mas diferentes comprimentos das extremidades 3' . As sequências codificantes, bem como as não codificantes do clone 19E eram idênticas ao clone 19F; estes clones diferiam no comprimento da região 3' não codificante, em que o clone 19F era cerca de 34 pb mais comprida do que 19E. Por isso, as sequências de 19F foram utilizadas para completar a sequência codificante 3' da proteína de TSLP humana. Isto permitiu a identificação dos 15 aminoácidos C-terminais não presentes na EST. A PCR foi realizada de acordo com processos convencionais. 81

EXEMPLO 2: Purificação de Polipéptido de TSLP elisa específica para TSLP:

Diluições seriadas de amostras contendo TSLP (em NaHC03 a 50 mM, ajustado até pH 9 com NaOH) são revestidas em placas de microtitulação Linbro/Titertek E.I.A. de 96 poços de fundo redondo (ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) a 100:1/poço. Após incubação a 4°C durante 16 horas, os poços são lavados seis vezes com 200:1 de PBS contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween). Os poços são então incubados com FLAG®-receptor de TSLP a 1 pg/mL em PBS-Tween com 5% de soro fetal de vitela (FCS) durante 90 minutos (100:1 por poço), seguido de lavagem como acima. A seguir, cada poço foi incubado com o anti-FLAG® (anticorpo monoclonal M2 a 1 pg/mL em PBS-Tween contendo 5% de FCS durante 90 minutos (100:1 por poço), seguido de lavagem como acima. Subsequentemente, os poços foram incubados com um anticorpo policlonal de cabra anti-mlgGl-especico conjugado com peroxidase de rábano (uma diluição 1:5000 da solução de armazenamento comercial em PBS-Tween contendo 5% FCS) durante 90 minutos (100:1 por poço) . O anticorpo conjugado com HRP é obtido de Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama. Os poços foram então lavados seis vezes, como acima.

Para o desenvolvimento da ELISA, uma mistura de substratos [100:1 por poço de uma pré-mistura 1:1 do Substrato de Peroxidase TMB e Solução B de Peroxidase (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland)] foi adicionada aos poços. Após um reacção de coloração suficiente, a reacção enzimática é terminada pela adição de H2S04 a 2 N (50:1 por poço). A intensidade de cor (indicando a ligação TSLP-receptor de TSLP) 82 foi determinada pela medição da extinção a 450 nm num leitor de placas V Max (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). EXEMPLO 3: Sequência de Aminoácidos A sequência de aminoácidos da TSLP humana foi determinada por tradução da sequência de nucleótidos completa da TSLP humana. A grelha de leitura escolhida foi baseada na homologia da TSLP humana com a TSLP de murino. EXEMPLO 4: Sequências de ADN e Aminoácidos A sequência de ácido nucleico de TSLP humana foi determinada por sequenciação convencional de cadeia dupla da sequência compósito do clone EST IMAGE 1407260, número de Acesso #AA889581, e a sequência 3' adicional do clone 19F. A sequência de nucleótidos do ADN de TSLP humana isolado e a sequência de aminoácidos por ela codificada, são apresentadas nas SEQ ID Nos:l e 2. A sequência do fragmento de ADN da TSLP humana completa isolada por PCR corresponde aos nucleótidos 1 a 767 de SEQ ID N°:l, que codifica os aminoácidoss 1 a 159 de SEQ ID N°:2. A sequência de aminoácidos na SEQ ID N°:2 comporta uma semelhança (49%) e identidade (43%) significativas com a TSLP de murino e homologia fraca com IL-7. 83

EXEMPLO 5: Anticorpos Monoclonais que Ligam TSLP

Este exemplo ilustra um método para preparação de anticorpos monoclonais que ligam TSLP. Os imunogénios adequados que podem ser empregues na produção destes anticorpos incluem, mas não estão limitados a, polipéptido TSLP humano purificado ou um seu fragmento imunogénico tal como o domínio extracelular, ou proteínas de fusão contendo TSLP humana (e. g., uma proteína de fusão solúvel TSLP/Fc). 0 TSLP humano purificado pode ser utilizado para produzir anticorpos monoclonais imunorreactivos contra este, utilizando técnicas convencionais, tais como as descritas na Patente U.S. 4411993. Em resumo, os murganhos são imunizados com TSLP imunogénico humano emulsificado em adjuvante completo de Freund, e injectados em quantidades variando desde 10-100 pg subcutaneamente ou intraperitonealmente. Dez a doze dias mais tarde, os animais imunizados são reforçados com TSLP humano adicional emulsificado em adjuvante de Freund incompleto. Os murganhos são periodicamente reforçados a seguir num esquema de imunização semanal ou bi-semanal. As amostras de soro são periodicamente retiradas por sangramento retro-orbital ou excisão na ponta da cauda para testar anticorpos TSLP através de ensaio de transferência, ELISA (Ensaio de Imunoabsorção Ligado a Enzima) ou inibição da ligação ao receptor de TSLP.

Após a detecção de um título apropriado de anticorpo, aos animais positivos é proporcionada uma última injecção intravenosa de TSLP humana em soro fisiológico. Três a quatro dias mais tarde, os animais são sacrificados, as células de baço recolhidas, e as células de baço são fundidas com uma linha de células de mieloma de murino, e. g., NS 1 ou, de um modo 84 preferido, P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). As fusões produzem células de hibridoma, que são plaqueadas em placas de microtitulação num meio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridos de mieloma, e híbridos de células de baço.

As células de hibridoma são rastreadas por ELISA para reactividade contra TSLP purificado através de adaptações de técnicas divulgadas em (Engvall et al., Immunochem. 8: 871 (1971)) e na Patente U.S. 4703004. uma técnica de rastreio preferida é a técnica de captura de anticorpo descrita em (Beckmann et al., J. Immunol. 144: 4212 (1990)). As células de hibridoma positivas podem ser injectadas intraperitonealmente em murganhos singeneicos BALB/c para produzir ascites contendo concentrações elevadas de anticorpos monoclonais anti-TSLP. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vitro em frascos ou frascos de rolo por várias técnicas. Os anticorpos monoclonais produzidos em ascites de murganho podem ser purificados por precipitação com sulfato de amónio, seguidos por cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente, a cromatografia de afinidade com base na ligação do anticorpo a Proteína A ou Proteína G pode também ser utilizada, assim como a cromatografia de afinidade com base na ligação a TSLP. EXEMPLO 6: Análise de Transferência de Northern A distribuição em tecido do ARNm de TSLP humana foi investigada por análise de transferência de Northern, como se segue. Uma fracção de uma sonda radioactivamente marcada foi adicionada a duas transferências de Northern diferentes de múltiplos tecidos humanos (Clontech, Paio Alto, CA; Biochain, 85

Paio Alto, CA). As transferências foram hibridadas em 10X Denhardts, 50 mM de Tris a pH 7,5, 900 mM de NaCl, 0,1% de pirofoafato de Na, 1% de SDS, 200 pg/mL de ADN de esperma de salmão. A hibridação foi conduzida durante a noite a 63 °C em 50% de formamida como previamente descrito (March et al., Nature 315: 641-647 (1985)). As transferências foram então lavadas com 2X SSC, 0,1% de SDS a 68 °C durante 30 minutos.

Um único transcrito de 1,4 quilobases (kb) estava presente no coração, pulmão, fígado, músculo esquelético, rim, pâncreas, baço, timo, próstata, testículos, ovários, intestino delgado, cólon. Os tecidos negativos foram o cérebro, placenta, e leucócitos do sangue periférico. As células e tecidos com os níveis mais elevados de ARNm de TSLP são o coração, fígado, próstata, e testículos, como apresentado em comparação com a hibridação de controlo com um sonda específica para a β-actina. EXEMPLO 7: Ensaio de Ligação A TSLP humana de comprimento total pode ser expressa e testada quanto à sua capacidade para ligar receptores TSLP. O ensaio de ligação pode ser controlado como se segue. A proteína de fusão compreendendo um péptido fecho de leucina em fusão com o terminal N de um polipéptido solúvel humano TSLP (LZ-TSLP) foi empregue no ensaio. Uma construção de expressão é preparada, essencialmente como descrito para a preparação da construção de expressão FLAG®(TSLP) em (Wiley et al., Immunity, 3: 73-682 (1995)), excepto que o ADN codificando o péptido FLAG® foi substituído com a sequência codificando um

fecho de leucina modificado que permite a trimerização. A 86 construção, no vector de expressão pDC409, codifica uma sequência lider derivada de citomegalovirus humano, seguido por uma unidade de fecho de leucina em fusão com o terminal N de um polipéptido solúvel humano TSLP. 0 LZ-TSLP é expresso em células CHO, e purificadas a partir do sobrenadante da cultura. 0 vector de expressão designado pDC409 é um vector de expressão de mamífero derivado do vector pDC406 descrito em (McMahan et al.r EMBO J. 10: 2821-2832 (1991)). As características adicionadas a pDC409 (em comparação com pDC406) incluem sítios de restrição únicos adicionais no sítio de clonagem múltipla (mcs); três codões de interrupção (um em cada grelha de leitura) posicionada a jusante do mcs; e um promotor de polimerase de T7, a jusante do mcs, que facilita a seguenciação de ADN inserida no mcs.

Para a expressão da proteína TSLP humana de comprimento total, a região codificante completa (i. e., a sequência de ADN apresentada em SEQ ID N°:l) foi amplificada por reacção de polimerase em cadeia (PCR) . O molde empregue na PCR foi o clone de ADNc isolado a partir de uma biblioteca de ADNc de testículos humanos, como descrito no Exemplo 1.0 ADN isolado e amplificado foi inserido no vector de expressão pDC409, para produzir uma construção designada pDC409-TSLP. 0 polipéptido LZ-TSLP foi empregue para testar a capacidade para se ligar a células hospedeiras que expressam os receptores TSLP ou endógenos, como discutido acima. As células que expressam o receptor TSLP são cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino, penicilina, estreptomicina, e glutamina. As células são incubadas com LZ-TSLP (5 mg/mL) durante cerca de 1 hora. Após a incubação, as células são 87 lavadas para remover LZ-TSLP não ligado e incubadas com um anticorpo monoclonal anti-LZ biotinilado (5 mg/mL), e estreptavidina conjugada com ficoeritrina (1:400), antes da análise por digitalização de células de fluorescência activada (FACS). A análise citométrica foi conduzida num FACscan (Beckton Dickinson, San Jose, CA).

As células que expressam os receptores de TSLP apresentaram uma ligação significativamente melhorada de LZ-TSLP, em comparação com as células controlo que não expressavam os receptores de TSLP. EXEMPLO 8: Indução de Crescimento de Células T a partir de Medula Óssea através de TSLP e IL-7 A TSLP humana, em combinação com IL-7, induz o sobrecrescimento de células T a partir de medula óssea humana.

As células mononucleares humanas derivadas de medula óssea (BM MNC) foram isoladas por centrifugação de medula óssea total sobre Ficoll. As BM MNC foram cultivadas em meio McCoy suplementado com 10% de soro fetal de bovino, e aminoácidos e suplementos de vitamina, a uma concentração variando entre 4,5-10 x 105 células/mL num volume total de 6 ou 7 mL por frasco (T25). A TSLP humana (20 ng/mL) e outras citocinas, i. e., IL-7, SLF (i. e., factor steel ou factor de células estaminais, ou factor de crescimento de mastócitos), ou flt3L, isolado ou em combinação, foram adicionados às culturas no dia 0. Após 14 dias e depois semanalmente, metade da cultura foi removida para contagem. Foram adicionados às culturas meio fresco e citocinas para voltarem ao volume total de 6 ou 7 mL. 88

As células recolhidas foram também analisadas através de citometria de fluxo catorze dias após a cultura e depois semanalmente, utilizando anticorpos específicos para os antigénios celulares de superfície. Os anticorpos utilizados eram específicos para antigénios de células T (i. e., o receptor de célula T αβ, o receptor de célula T γδ, e CD3), antigénios de células B (i. e., CD19 e IgM de superfície), antigénios de células Assassinas Naturais (i. e., CD56), antigénios de monócitos (i. e., CD14), e antigénios de granulócitos (i. e., CD15). A adição de TSLP humana e IL-7 a culturas BM MNC induziu crescimento celular como indicado na Tabela 1. No dia 0, aproximadamente 5% de BM MNC eram células T. Após 2 semanas de cultura com TSLP e IL-7, as culturas consistiram em 70% de células T CD3+. No dia 21, 86% das células eram células T CD3+.

As culturas continham predominantemente células T até ao final da experiência no dia 42. 89 TABELA 1

Rendimento Celular Total (xlO5)

Tratamento Dia 0 13,5 Dia 14 Dia 21 Dia 28 Dia 42 Cumulativo Meios 6 1,1 0,4 0,9 8,4 TSLP 3,9 2,1 1 2,9 9,9 IL-7 4,2 7,4 4,4 4,6 20,6 IL-7+TSLP 10,3 12,1 17,2 7,5 47,1 SLF 3,7 4,3 1,1 0,9 10 SLF+TSLP 5,4 6,9 1 1,6 14, 9 flt3L 6,3 2,3 2,8 1,8 13,2 f lt3L+TSLP 7,7 4,7 2,7 3,1 18,2 Noutro conjunto de experiências , três conjuntos separados TSLP humana marcada com His/FLAG® (TSLP 7489, TSLP 7811, ou TSLP 7812) foram testados isolados ou em combinação com IL-7 quanto à capacidade para afectar a sobrevivência e expansão celulares. Foram obtidas culturas de BM MNC a partir de duas amostras, separadas, de medula óssea fresca e inoculadas a uma concentração de 5 x 105 células/mL (Grupo 1) ou 10 x 105 células/mL (Grupo 2). Foram adicionadas TSLP marcada com His/FLAG® (20 mg/mL) e IL-7 às culturas como descrito acima. A TSLP combinada com IL-7 resultou na expansão de culturas BM MNC como indicado na Tabela 2 (amostra de medula óssea 1) e Tabela 3 (amostra de medula óssea 2) . No dia 21, 80% da população de células expandidas consistia em células T CD4+ αβ+ ou CD8+ αβ+. Em quatro das culturas tratadas com IL-7 e TSLP, as células expandidas nestas culturas continham predominantemente células T até à finalização das experiências às 4-5 semanas. 90 TABELA 2

Rendimento Celular Total (xlO5)

Tratamento Grupo 1 (5 x Dia 0 17,5 Dia 14 Dia 21 Dia 28 Dia 35 Cumulativo 105) Meios 4 1,3 1,4 ND* 6,7 IL-7 8,4 6,5 7,1 ND* 22 TSLP 7489 4,4 1,5 1,2 ND* 7,1 TSLP 7811 5,2 1,7 1,2 ND* 8,1 TSLP 7812 2,8 1,4 2,3 ND* 6, 5 IL-7 + T7489 12,4 9,1 8,3 ND* 29,8 IL-7 + T7811 10,5 5,3 8,4 ND* 24,2 IL-7 + T7812 9,7 6,5 4,7 ND* 20, 9 Tratamento Grupo 2 Dia 0 35 Dia 14 Dia 21 Dia 28 Dia 35 Cumulativo (10xl05) Meios 6,6 3,1 2,2 ND* 11,9 IL-7 14,8 10,1 3,7 ND* 32,3 TSLP 7489 11,5 3,3 2,9 ND* 17,7 TSLP 7811 13,3 2,8 3,1 ND* 19,2 TSLP 7812 13 3,2 2,6 ND* 18,8 IL-7 + T7489 25,6 17,7 8 10,9 62,2 IL-7 + T7811 18,8 16,8 10 15,7 61,3 IL-7 + T7812 22,4 13,5 10,4 11,6 57,9 (*ND = não determinado (cultura esgotada) 91 TABELA 3

Tratamento Dia 0 Dia 14 Rendimento Dia 21 Celular Dia 23 Total (xlO5 Dia 28 ) Dia 35 Cumulativo Grupo 1 (5 x 105) Meios 17,5 3,1 0,9 ND* 0,8 ND* 4,8 IL-7 3,8 8,9 ND* 8 ND* 20,7 TSLP 7489 3 1,1 ND* 0,8 ND* 4, 9 TSLP 7811 2,6 1,3 ND* ND* ND* 3, 9 TSLP 7812 3,8 1,2 ND* 0,9 ND* 5,9 IL-7 + 8,9 80 39,4 18,2 21 167, 5 T7489 IL-7 + 6,2 12,5 ND* 16, 7 14,3 49,7 17811 IL-7 + 7,1 14,5 ND* 11, 1 11,6 44,3 T7812 Tratamento Dia 0 Dia 14 Dia 21 Dia 23 Dia 28 Dia 35 Cumulativo Grupo 2 (10xl05) Meros 35 6, 6 1,9 ND* 1,8 ND* 10,3 IL-7 10, 7 19 ND* 16, 5 29,2 75,4 TSLP 7489 6,8 3,2 ND* 3, 3 ND* 13,3 TSLP 7811 8,7 3,3 ND* 3,4 ND* 15, 4 TSLP 7812 7,1 3,1 ND* 2,7 ND* 12, 9 IL-7 + 18, 1 31,4 20 16, 7 20,4 106, 6 T7489 IL-7 + 13, 9 26,2 46,8 17, 9 19,2 124 17811 IL-7 + 15, 1 24,4 88,4 20, 6 26, 6 175, 1 T7812 (*ND = não determinado (cultura esgotada) 92 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Sims, John Lyman, Stewart,

Armstrong Allison McKenna, Hilary <120> ADN e Polipéptidos de TSLP Humano <130> 03260.0087-00304 <140> <141> <150> 60/108.452 <151> 1998-11-13 <160> 5 <170> Patent In Ver. 2.0

<210> 1 <211> 743 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1 93 pápeapâ âgetttgpg pfceâgfpg ictcCMCtt as§ppa§ catgggtgp 1$ taagggcttc ctgtgpctg gcaatpgag gcaasaecig gtgettgagc actggcecct 120 aaggcôggcc ttacaptct cttacsctcg tggtS9gaa§ agíttagtgt gaaactgggg ISO tggaatlggg igtceaçgU igttcccUt tgccttact® tatgttctgt cagtttettt ‘M Cággáâaatc ttcatçttac aaettgtagg gctggtgtta aeítaegact tcactaactg 300 tgactttgag aagatieaag cagcctateí cagtactatt tctaaagacc tgattacata 360 tatgagtggg accaaaagta ccpgttcaa caacaccgtc tcttgtagca atcggccaca 420 ttgççttact gaaatccag» gcctaaccti caatcccãce gecggctgcg cgtcgctcgc 480 eaaagaaaig ttcgccatga aaacteaggc tgccttagei atctggfcgcc caggetsttc §40 ggaaôetceg ataaatgcia cicaggcaat gaagaagagg agaaaaágp aagttacaac 600 caataaatgt ctgpacaag tgtcacaatt aeaaggattg tggcgtcgct tcaatcgacc 660 tttactpaa eaacagteaa ccatetttat mggtcata mcacagec caaaaisaat 720 catctttett aagtaaaaaa aaa ?43

<210> 2 <2ll> 159 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 94

Met Phe Pro Fhe Ala leu Leu lyf Vai Leu Ser Vai Ser Phç Arg Lys ] $ 10 15 lie Phe 11« la» 6'ín Leu Vsl 61 y La» Vai Leu Thr Tyr Asp Phe Thr 20 25 38

Asn Cys Asp Phe 61 e Lys Π® Lys Ala Ala Tyr Lsu Ser Thr !le Ser 3$ 30 35

Lys Asp Leu Me Thr Tyr «et Ser 61 y Thr Lys Ser Thr Slu Phe Asn se 55 m

Asn Thr vai Ser Cys Ser fm Arg Pro Hls Cys leu Thr Glu lie 61 n 65 n 75 68

Ser Leu Thr Phe Asn Pre Thr Ala 61y Cys· Ala Ser Leu Ala lys Glu 85 90 95 «et Phe Ala «et lys Thr lys Ala Ala leu Ala Me Trp Cys Pro Gly JOÓ 1DS 110

Tyr Ser GUi Thr Gin Me Asn Ala Thr Gin Ala Het Lys Lys Arg Arg MS 120 125 lys Arg lys Vai Thr Thr Asn lys Cys leu Glu 61» Vai Ser 6)n Leu 130 135 140 61« Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg í¥o leu teu lys Gin Gin 345 ISÒ 155 95 <210> 3

<211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: péptido antigénico utilizado em proteínas de fusão < 4 0 0 > 3

Asp lyr Ly$ Asp Asp Asp Asp Lys

<210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: polipéptido de fecho de leucina < 4 0 0 > 4

Pro Asp Vsl Ala Ser l®ti Ar§ 61«' 61» Vai Slu Ata Leu Gl>,: 61n ] 5 30 1¾

Vai Gin Hls teu 61« Ala Ala Pine Ser 61r> Tyf 20 & 96 <210> 5

<211> 33 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <2 2 3> Descrição da Sequência Artificial: polipéptido de fecho de leucina < 4 0 0 > 5

Arg Met Lys Sln ile 61« A$p lys Me 61« 61» He 1«» $ér lys Jl« 1 & W 16 tyr His ílç 61« Asn 61« He Ate Arg Ite Lys Lys Leu ilç 61« 20 2h 30

Arg

Lisboa, 27 de Julho de 2007 97

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico isolada codificando um polipéptido que estimula a proliferação de linfócitos seleccionada a partir do grupo consistindo de: (a) um polinucleótido compreendendo a sequência de SEQ ID N0:1; (b) um polinucleótido codificando uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de SEQ ID N°:2; (c) um polinucleótido isolado consistindo em SEQ ID N 0 :1; e (d) um polinucleótido compreendendo uma sequência de nucleótidos que é, pelo menos, 90% idêntica à SEQ ID N°:1.
2. Molécula de ácido nucleico isolada da reivindicação 1, em que o polinucleótido codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2.
3. Vector recombinante que dirige a expressão da molécula de ácido nucleico das reivindicações 1 ou 2.
4. Célula hospedeira transfectada ou transduzida com o vector da reivindicação 3.
5. Polipéptido isolado codificado pela molécula de ácido nucleico das reivindicações 1 ou 2. 1
6. Polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 5 possuindo um peso molecular de, aproximadamente, 21000 Daltons conforme determinado por SDS-PAGE.
7. Polipéptido TSLP purificado seleccionado a partir do grupo consistindo de: a) o polipéptido TSLP de SEQ ID N°:2; b) um fragmento do polipéptido de (a), do aminoácido 29 ao aminoácido 159, e aminoácido 35 ao aminoácido 159 de SEQ ID N°: 2; c) um polipéptido TSLP compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2; e d) um polipéptido TSLP compreendendo uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°:2.
8. Polipéptido TSLP de SEQ ID N°:2.
9. Polipéptido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8 numa forma não glicosilada.
10. Anticorpo isolado que se liga a um polipéptido de qualquer uma das reivindicações 5-9.
11. Anticorpo de acordo com reivindicação 10, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
12. Proteína de fusão compreendendo o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-9 fundida no terminal C ou N com outra proteína ou um péptido ou polipéptido. 2
13. Composição compreendendo um polipéptido de qualquer uma das reivindicações 5 a 9 ou um anticorpo de acordo com as reivindicações 10 ou 11, e um diluente, excipiente ou veiculo fisiologicamente aceitável.
14. Método para a produção de um polipéptido TSLP compreendendo o cultivo da célula hospedeira da reivindicação 4 sob condições que promovem a expressão, e recuperando o polipéptido do meio de cultura.
15. Método da reivindicação 14, em que a célula hospedeira é seleccionada do grupo consistindo de células bacterianas, células de levedura, células vegetais e células animais.
16. Método in vitro de estimulação da proliferação de linfócitos, compreendendo a incubação de linfócitos com o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9.
17. Método da reivindicação 16, compreendendo ainda a incubação dos linfócitos com IL-7.
18. Método da reivindicação 16, compreendendo ainda a incubação de linfócitos com uma citocina seleccionada do grupo consistindo de Factor Steel, Factor de Células Estaminais, Factor de Crescimento de Mastócitos e ligando flt3-ligando.
19. Método in vitro de estimulação do desenvolvimento de linfócitos ou linfopoiese compreendendo a incubação de células progenitoras com o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9. 3
20. Método da reivindicação 19, compreendendo ainda a incubação de células progenitoras com IL-7.
21. Método das reivindicações 19 ou 20, em que as células progenitoras são células mononucleares derivadas da medula óssea.
22. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 5 a 9, para utilização num método de estimulação da proliferação de linfócitos in vivo, em que o referido método compreende a incubação de linfócitos com o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9.
23. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 5 a 9, para utilização num método de acordo com reivindicação 22, em que o método compreende ainda a incubação de linfócitos com IL-7 .
24. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 5 a 9, para utilização num método de estimulação do desenvolvimento de linfócitos ou linfopoiese in vivo, em que o referido método compreende a incubação de células progenitoras com o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9.
25. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 5 a 9, para utilização num método de acordo com reivindicação 24, em que o método compreende ainda a incubação das células progenitoras com IL-7.
26. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 5 a 9, para utilização num método de acordo com as reivindicações 24 ou 4 25, em que as células progenitoras são células mononucleares derivadas da medula óssea.
27. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 5 a 9 para utilização em terapia.
28. Utilização do polipéptido de qualquer uma das reivindicações 5 a 9, para a preparação de uma composição farmacêutica para estimulação da proliferação ou desenvolvimento de linfócitos ou para estimulação de linfopoiese. Lisboa, 27 de Julho de 2007 5