JP2002530079A - ヒトｔｓｌｐｄｎａおよびポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、精製されそして単離されている新規ＴＳＬＰポリペプチド、こうしたポリペプチドをコードする核酸、こうしたポリペプチドの組換え型を産生するための方法、これらのポリペプチドに対し生成された抗体、これらのポリペプチドに由来する断片化ペプチド、および上記の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願に対するクロス・リファレンス 本出願は、１９９８年１１月１３日に提出された米国仮特許出願第６０／１０
８，４５２号の利益を請求し、前記出願の全開示は、本明細書に頼られ、そして
援用される。

【０００２】 発明の背景 発明の分野 本発明は、精製されそして単離されている新規のヒト胸腺間質リンホポエチン
（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）（ＴＳＬＰ）ポリペプチドおよびその断片、こ
うしたポリペプチドをコードする核酸、こうしたポリペプチドの組換え型を産生
するための方法、これらのポリペプチドに対し生成された抗体、これらのポリペ
プチドに由来する断片化ペプチド、およびその使用に関する。

【０００３】 関連技術の説明 Ｂ細胞発生は詳細に研究されてきているが、造血幹細胞から成熟Ｂ細胞につな
がる経路には、いまだに空白がある。サイトカインがＢ細胞発生および増殖に影
響を与え、そして重要な役割を果たすことが認識されている。Ｂ細胞発生に影響
を与える既知のサイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、
ＩＬ−７、ＩＦＮ−ガンマ、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ）が含まれる。

【０００４】 近年、胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）と称される、新規ネズミ増殖因子
が、Ｂ細胞発生および成熟に役割を果たすことが示されてきている。ネズミＴＳ
ＬＰのサイトカイン活性は、ＩＬ−７のものと非常によく似ており、プレＢ細胞
の増殖および生存中に必要とされる（Ｊａｎｅｗａｙら， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ， 第２版（１９９６））。これらのサイトカインはどちらも、ＮＡ
Ｇ８／７細胞を維持し（Ｆｒｉｅｎｄら， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２
２：３２１−３２８（１９９４））、そしてＢリンパ球新生を持続させることが
示されてきている。さらに、成熟Ｂリンパ球は、ＩＬ−７またはネズミＴＳＬＰ
いずれかの非存在下で、発生することができない。さらに、ネズミＴＳＬＰは、
Ｂ細胞増殖反応の維持において、ＩＬ−７の代わりをすることが可能であると示
されてきている（Ｒａｙら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２６：１
０−１６（１９９６））。したがって、マウスの系において、ＴＳＬＰは、Ｂ細
胞発生において重要な機能を有する。

【０００５】 ＩＬ−７同様、ネズミＴＳＬＰはまた、胸腺細胞および成熟Ｔ細胞も共刺激（
ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅ）する（Ｆｒｉｅｎｄら， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ
．， ２２：３２１−３２８（１９９４））。ＩＬ−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）ノ
ックアウトマウスを用いた研究により、ＩＬ−７、ＴＳＬＰ、または両方が、お
そらくＶＤＪ組換え酵素に対するＴ細胞受容体−ガンマ（ＴＣＲγ）遺伝子の接
近可能性を仲介することにより、ＴＣＲγ遺伝子座の再配置の調節に重要な役割
を果たすことが示される（Ｃａｎｄｅｉａｓら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ， ５７：９−１４（１９９７））。したがって、ネズミＴＳＬＰは
また、Ｔ細胞発生にも重要な役割を果たす。

【０００６】 ネズミＴＳＬＰ受容体およびＩＬ−７受容体は、共に、その情報伝達複合体の
一部としてＩＬ−７Ｒ α−鎖を用いる（Ｌｅｖｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．， １６２：６７７−６８３（１９９９））。しかし、ＩＬ−７Ｒ α−鎖
が共通であるのにもかかわらず、ＩＬ−７およびＴＳＬＰは、異なる機構を通じ
、そのリンパ球新生効果を仲介するようである。ＩＬ−７はＳｔａｔ５およびＪ
ａｎｕｓファミリーキナーゼＪａｋ１およびＪａｋ３の活性化を誘導する一方、
ネズミＴＳＬＰはＳｔａｔ５の活性化を誘導するが、既知のＪａｎｕｓファミリ
ーキナーゼのいずれの活性化も誘導しない（Ｌｅｖｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．， １６２：６７７−６８３（１９９９））。

【０００７】 ネズミＴＳＬＰの重要な機能、並びにネズミの系におけるＢ細胞およびＴ細胞
発生および成熟におけるその役割の重要性を考えると、当該技術分野には、ヒト
ＴＳＬＰを同定しそして単離し、そしてヒトＢ細胞およびＴ細胞発生および成熟
におけるその役割を研究する必要性がある。さらに、リンパ球発生および免疫系
における継続する興味を考慮すると、ヒトＴＳＬＰおよびその受容体などの新規
タンパク質の発見、同定、および役割は、現代の分子生物学、生化学、および免
疫学の最前線である。知識が増えているのにもかかわらず、細胞および免疫反応
に関与するタンパク質の同一性および機能に関し、当該技術分野には、いまだに
必要性がある。

【０００８】 別の側面において、未知のタンパク質の一次構造、または配列の同定は、実験
の困難な過程が成就した結果である。未知の試料タンパク質を同定するため、研
究者は、当業者に知られる多様な技術を用い、未知の試料タンパク質の既知のペ
プチドへの比較に頼ることが可能である。例えば、タンパク質は、電気泳動、沈
降、クロマトグラフィー、配列決定および質量分析などの技術を用い、日常的に
解析される。

【０００９】 特に、未知のタンパク質試料を既知の分子量と比較することにより、未知のタ
ンパク質の見かけの分子量を決定することが可能になる（Ｔ．Ｄ． Ｂｒｏｃｋ
およびＭ．Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｓ ｐｐ． ７６−７７， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版
，（１９９１））。タンパク質分子量標準は、未知のタンパク質試料の分子量概
算を援助するため、商業的に入手可能である（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ Ｉｎｃ．カタログ：１３０−１３１（１９９５））；（Ｊ．Ｌ． Ｈ
ａｒｔｌｅｙ、米国特許第５，４４９，７５８号）。しかし、分子量標準は、見
かけの分子量の正確な概算を可能にするには、未知のタンパク質に十分近い大き
さに相当しない可能性がある。化学的または酵素的手段により断片化にさらされ
、翻訳後修飾またはプロセシングにより修飾され、および／または非共有複合体
において他のタンパク質と結合しているタンパク質の場合、分子量概算における
困難の度合いが増す。

【００１０】 さらに、特定のアミノ酸構成要素に関するタンパク質組成の特有の性質は、タ
ンパク質内の切断部位の特有の配置を生じる。化学的または酵素的切断によるタ
ンパク質の特定の断片化は、特有の「ペプチドフィンガープリント」を生じる（
Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：
１１０２−１１０６（１９７７）；Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖ
ｉｒｏｌ． ５０：３０９−３１６（１９８０））。その結果、特定の部位での
切断は、既定のタンパク質の、正確な分子量のペプチドへの、再現可能な断片化
を生じる。さらに、これらのペプチドは、該ペプチドの等電点ｐＨを決定する特
有の電荷特性を持つ。これらの特有の特性は、多様な電気泳動および他の技術を
用い、利用することが可能である（Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ． Ｍａ
ｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ｐｐ
． ７６−７７， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版（１９９１））。

【００１１】 タンパク質の断片化、特に「保護（ｂｌｏｃｋｅｄ）」Ｎ−末端を持つタンパ
ク質由来の断片の産生は、さらに、アミノ酸組成解析およびタンパク質配列決定
に使用される（Ｐ． Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
， ２６２：１００３５−１００３８（１９８７）；Ｃ． Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒ
ｎら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ９：８３０−８３８（１９８８）
）。さらに断片化タンパク質は、免疫感作、親和性選択（Ｒ．Ａ． Ｂｒｏｗｎ
、米国特許第５，１５１，４１２号）、修飾（例えばリン酸化）部位決定、活性
生物学的化合物の生成（Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ．Ｍａｄｉｇａｎ，
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ３００−３０１（
Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版（１９９１））、および相同タンパク質
の区別（Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ５０：３０
９−３１６（１９８０））に用いることが可能である。

【００１２】 さらに、未知のタンパク質のペプチドフィンガープリントが得られたならば、
質量分析を用いた、この未知のタンパク質の同定を援助するため、既知のタンパ
ク質のデータベースに比較してもよい（Ｗ．Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら， Ｐｒｏｃ
． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５０１５（
１９９３）；Ｄ． Ｆｅｎｙｏら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １９
：９９８−１００５（１９９８））。多様なコンピューターソフトウェアプログ
ラム、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（インターネットサイト：
ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓｃｆ．ｅｄｕ）、ＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インター
ネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎ
ｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ（インターネットサイト：ｗｗｗ
．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ
／ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈＦｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏ
ｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅ
ｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）な
どが、こうした比較を容易にするため、インターネットを介し、利用可能である
。これらのプログラムは、使用者が切断剤および指示された許容範囲の断片化ペ
プチドの分子量を特定するのを可能にする。該プログラムは、未知のタンパク質
の同一性の決定を援助するため、これらの分子量をデータベースに保存されてい
るタンパク質分子量情報と比較する。正確な同定には、断片化ペプチドの数およ
びこれらのペプチドの正確な分子量に関する正確な情報が必要である。したがっ
て、断片化ペプチドの数および正確な分子量の決定の正確さが増せば、未知のタ
ンパク質の同定における成功は高まるはずである。

【００１３】 さらに、未知のタンパク質のペプチド消化物は、タンデム型質量分析（ＭＳ／
ＭＳ）を用いて配列決定してもよく、そして生じた配列をデータベースに対し検
索してもよい（Ｊ．Ｋ． Ｅｎｇら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓ
ｐｅｃ． ５：９７６−９８９（１９９４）；Ｍ． ＭａｎｎおよびＭ． Ｗｉ
ｌｍ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６６：４３９０−４３９９（１９９４）；
Ｊ．Ａ． ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｒａｐｉｄ Ｃｏ
ｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．， １１：１０６７−１０７５（１９９７））。
本方法に用いてもよい検索プログラムは、Ｌｕｔｅｆｉｓｋ ９７（インターネ
ットサイト：ｗｗｗ．ｌｓｂｃ．ｃｏｍ：７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７．ｈｔｍ
ｌ）、並びに上述のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ
ＳｅａｒｃｈおよびＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムなど、インターネット上に存在
する。したがって、遺伝子の配列およびその予測されるタンパク質配列およびペ
プチド断片を、配列データベースに添加することは、タンデム型質量分析を用い
た、未知のタンパク質の同定を援助する可能性がある。

【００１４】 このように、当該技術分野にはまた、ペプチド断片化研究における使用に、分
子量測定における使用に、そしてタンデム型質量分析を用いたタンパク質配列決
定における使用に適したポリペプチドに対する必要性もある。

【００１５】 発明の概要 本発明は、単離ヒトＴＳＬＰ核酸およびこれらの核酸にコードされるポリペプ
チドを提供することにより、当該技術分野におけるこれらの多様な必要性を満た
すのを援助する。本発明の特定の態様は、配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離Ｔ
ＳＬＰ核酸分子、および配列番号２のアミノ酸配列をコードする単離ＴＳＬＰ核
酸分子と共に、これらの配列に相補的な核酸分子に関する。一本鎖および二本鎖
ＲＮＡおよびＤＮＡ核酸分子両方と共に、配列番号１のすべてまたは一部を含む
、変性二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする核酸分子が本発明に含まれる。やはり
含まれるのは、配列番号１の配列を含む核酸分子からｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異
誘発により得られる単離核酸分子、配列番号１の配列を含む核酸分子から縮重し
ている単離核酸分子、および本発明のＤＮＡの対立遺伝子変異体である単離核酸
分子である。本発明はまた、これらの核酸分子の発現を指示する組換えベクター
およびこれらのベクターで形質転換またはトランスフェクションされている宿主
細胞も含む。

【００１６】 さらに、本発明は、上述の核酸を用い、Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系譜細胞増殖
を誘導する能力を有するタンパク質をコードする核酸を同定する方法；ヒト染色
体第５番を同定する方法；ヒト染色体第５番上の遺伝子をマッピングする方法；
特定の疾患、症候群、またはヒト染色体第５番に関連する他のヒト異常に関連す
る遺伝子を同定する方法；および細胞情報伝達および免疫系を研究する方法を含
む。

【００１７】 本発明はまた、配列番号１の核酸由来のセンスまたはアンチセンスオリゴヌク
レオチドの、ＴＳＬＰ遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を阻害するため
の使用も含む。

【００１８】 本発明はまた、配列番号２の可溶性ポリペプチド部分を含む、これらの核酸分
子にコードされる単離ポリペプチドおよびその断片も含む。本発明はさらに、こ
れらのポリペプチドを産生するための方法であって、宿主細胞を、発現を促進す
る条件下で培養し、そして培地から該ポリペプチドを回収することを含む、前記
方法を含む。特に、細菌、酵母、植物、昆虫、および動物細胞におけるこれらの
ポリペプチドの発現が、本発明に含まれる。

【００１９】 一般的に、本発明のポリペプチドを用い、細胞過程、例えば免疫制御、細胞増
殖、細胞分化、細胞死、細胞移動、細胞・細胞相互作用、および炎症性反応を研
究することが可能である。さらに、これらのポリペプチドを用い、ＴＳＬＰリガ
ンドおよびＴＳＬＰ受容体と関連するタンパク質を同定することが可能である。

【００２０】 さらに、本発明は、ポリペプチド対構造（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ）分子と関連する活性の潜在的な阻害剤に関しスクリーニングするのに、これ
らのポリペプチドを利用するアッセイ、およびＴＳＬＰポリペプチド対構造分子
に仲介される疾患の治療のための療法剤として、これらのポリペプチドを用いる
方法を含む。さらに、阻害剤の設計にこれらのポリペプチドを用いる方法もまた
、本発明の側面である。

【００２１】 本発明はさらに、タンパク質または断片化タンパク質の分子量の概算を可能に
する分子量マーカーとしてこれらのポリペプチドを使用するための方法と共に、
電気泳動を用い、本発明の分子量マーカーを視覚化するための方法も含む。本発
明はさらに、未知のタンパク質の等電点の決定のためのマーカーとしてと共に、
タンパク質の断片化の程度を確かめるためのコントロールとして、本発明のポリ
ペプチドを用いるための方法を含む。

【００２２】 本発明にさらに含まれるのは、これらの決定を補助するキットである。 本発明にさらに含まれるのは、試料核酸および／またはタンパク質の同定を援
助するコンピューターデータベースの検索における使用のための、ヒトＴＳＬＰ
核酸配列、ポリペプチドまたはその断片の予測されるアミノ酸配列、あるいはポ
リペプチドおよびその断片の予測されるアミノ酸配列の組み合わせの使用である
。

【００２３】 これらのポリペプチドに結合する単離ポリクローナルまたはモノクローナル抗
体、並びに、ＴＳＬＰポリペプチド精製を援助するこれらの抗体の使用もまた、
本発明に含まれる。さらに、単離抗体を用い、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）を確立し、血清などの試料中のＴＳＬＰを測定してもよい。

【００２４】 発明の詳細な説明 本発明に含まれる核酸分子には、以下のヌクレオチド配列： 名称：ＴＳＬＰ

【００２５】

【化１】

【００２６】 が含まれる。 本発明のヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列には： 名称：ＴＳＬＰ（ポリペプチド）

【００２７】

【化２】

【００２８】 が含まれる。 本発明の核酸の発見により、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベ
クターの構築；発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換されている
宿主細胞の構築；単離されそして精製されている、生物学的に活性があるポリペ
プチドおよびその断片；ＴＳＬＰ様活性を有する（例えばＢ細胞系譜またはＴ細
胞系譜細胞増殖を誘導する）タンパク質をコードする核酸を同定するためのプロ
ーブとしての核酸またはそのオリゴヌクレオチドの使用；ヒト染色体第５番を同
定するための、核酸またはそのオリゴヌクレオチドの使用；ヒト染色体第５番上
の遺伝子をマッピングするための、核酸またはそのオリゴヌクレオチドの使用；
ガードナー症候群、線腫様結腸ポリポーシス、遺伝性類線維腫（ｄｅｓｍｏｉｄ
）疾患、ターコット症候群、および結腸直腸癌を含む、ヒト染色体第５番、およ
び特に染色体第５番のｑ２１−ｑ２２領域と関連する、特定の疾患、症候群、ま
たは他のヒト異常と関連する遺伝子を同定するための、核酸またはそのオリゴヌ
クレオチドの使用；ＴＳＬＰ遺伝子にコードされるポリヌクレオチドの発現を阻
害するための、核酸由来の一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド
の使用；Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系譜細胞増殖を誘導するための、こうしたポリ
ペプチドおよび可溶性断片の使用；分子量マーカーとしてのこうしたポリペプチ
ドおよび断片化ペプチドの使用；ペプチド断片化のコントロールとしての、こう
したポリペプチドおよび断片化ペプチド、並びにこれらの試薬を含むキットの使
用；抗体を生成するためのこうしたポリペプチドおよびその断片の使用；並びに
ＴＳＬＰポリペプチドを精製するための抗体の使用が可能になる。

【００２９】 核酸分子 特定の態様において、本発明は内因性成分の汚染がない、特定の単離ヌクレオ
チド配列に関する。「ヌクレオチド配列」は、別個の断片の形の、またはより大
きな核酸構築物の構成要素としてのポリヌクレオチド分子を指す。核酸分子は、
実質的に純粋な型で、そして標準的生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に略述さ
れているものなど）によるその構成要素ヌクレオチド配列の同定、操作、および
回収を可能にする量または濃度で、少なくとも１度単離されているＤＮＡまたは
ＲＮＡに由来している。好ましくは、こうした配列は、真核遺伝子に典型的に存
在する、内部非翻訳配列、またはイントロンにより中断されない読み枠の形で提
供されおよび/または構築される。非翻訳ＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列がコード
領域の操作または発現に干渉しない、読み枠の５’または３’に存在していても
よい。

【００３０】 本発明の核酸分子は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ並びに、そのＲＮＡ
相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）も含む。ＤＮＡには、例えばｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそ
れらの組み合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号１のｃＤＮＡ
または適切なその断片をプローブとして用い、慣用技術により単離してもよい。

【００３１】 本発明のＤＮＡ分子は、全長遺伝子と共にそのポリヌクレオチドおよび断片を
含む。全長遺伝子はまた、Ｎ−末端シグナルペプチドも含んでもよい。他の態様
は、可溶性型をコードする、例えばシグナルペプチドを含むまたは含まない、該
タンパク質の細胞外ドメインをコードするＤＮＡを含む。

【００３２】 本発明の核酸は、好ましくは、ヒト供給源に由来するが、本発明は、非ヒト種
由来のものもまた含む。

【００３３】 好ましい配列 本発明の特に好ましいヌクレオチド配列は、上述のように、配列番号１である
。配列番号１のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクローンは、実施例１に記載
されるように単離された。配列番号１のＤＮＡにコードされるアミノ酸の配列を
配列番号２に示す。本配列は、ＴＳＬＰポリヌクレオチドを、Ｂ細胞系譜および
Ｔ細胞系譜細胞の増殖に影響を与える因子の群のメンバーと同定する（Ｒａｙら
， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２６：１０−１６（１９９６））；
（Ｆｒｉｅｎｄら， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２２：３２１−３２８（
１９９４））。

【００３４】 さらなる配列 １つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする可能性がある、遺伝暗号の既
知の縮重のため、ＤＮＡ配列は配列番号１に示されるものと異なり、そしてなお
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする可能性がある。こ
うした変異体ＤＮＡ配列は、沈黙（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増
幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発
の産物であってもよい。

【００３５】 したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ配列で
あって：（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）配列番号２
のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｃ）中程度にストリンジェントな条件下
で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であり、そして
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｄ）非常にストリンジェントな条
件下で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であり、そ
して本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ；および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）、または（ｄ）に定義されるＤＮＡに対し遺伝暗号の結果として縮重して
おり、そして本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡより選択される、前記単
離ＤＮＡ配列を提供する。もちろん、こうしたＤＮＡ配列にコードされるポリペ
プチドが本発明に含まれる。

【００３６】 本明細書において、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長
さに基づき、一般の技術を有する当業者により、容易に決定することが可能であ
る。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｖｏｌ． １，
ｐｐ．１．１０１−１０４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に示され、そしてニトロセルロース
フィルターに関し、５ Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、６
Ｘ ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、例えばスターク溶
液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーシ
ョン溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５ Ｘ ＳＳ
Ｃ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。非常にストリンジェントな
条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者により、容易に決定すること
が可能である。一般的に、こうした条件は、上記のようなハイブリダイゼーショ
ン条件、およびおよそ６８℃、０．２ Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を
伴うと定義される。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さなど
の要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを認識するであろう。

【００３７】 本発明の態様としてやはり含まれるのは、以下に記載されるような、不活性化
Ｎ−糖鎖付加部位、不活性化プロテアーゼプロセシング部位、または保存的アミ
ノ酸置換を含む、ポリペプチド断片およびポリペプチドをコードするＤＮＡであ
る。

【００３８】 別の態様において、本発明の核酸分子はまた、天然配列に少なくとも８０％同
一であるヌクレオチド配列も含む。やはり意図されるのは、核酸分子が、天然配
列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少
なくとも９９％同一、または少なくとも９９．９％同一である配列を含む、態様
である。

【００３９】 同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あ
るいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ
． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７（１９８４））に記載され、そしてウ
ィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能な
ＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用い配列情報を比較する
ことにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメー
ターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（
同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよ
びＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）
に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４：６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス
；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に
対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルテ
ィなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、
用いてもよい。

【００４０】 本発明はまた、ポリペプチドの産生に有用な単離核酸も提供する。こうしたポ
リペプチドは、いくつかの慣用技術のいずれにより調製してもよい。ヒトＴＳＬ
Ｐポリペプチド、または望ましいその断片をコードするＤＮＡ配列を、該ポリペ
プチドまたは断片を産生するための発現ベクター内にサブクローニングしてもよ
い。ＤＮＡ配列は、好都合に、適切なリーダーまたはシグナルペプチドをコード
する配列に融合させる。あるいは、既知の技術を用い、望ましい断片を化学的に
合成してもよい。ＤＮＡ断片はまた、全長クローン化ＤＮＡ配列の制限エンドヌ
クレアーゼ消化により産生し、そしてアガロースゲル上の電気泳動により単離し
てもよい。必要であれば、望ましい点まで５’または３’末端を再構築するオリ
ゴヌクレオチドを、制限酵素消化により生成されたＤＮＡ断片に連結してもよい
。こうしたオリゴヌクレオチドはさらに、望ましいコード配列、およびコード配
列のＮ−末端の開始コドン（ＡＴＧ）位の上流に、制限エンドヌクレアーゼ切断
部位を含んでもよい。

【００４１】 周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法もまた、望ましいタンパク質断片を
コードするＤＮＡ配列を単離しそして増幅するのに使用してもよい。ＤＮＡ断片
の望ましい末端を定めるオリゴヌクレオチドを、５’および３’プライマーとし
て使用する。該オリゴヌクレオチドはさらに、発現ベクターへの増幅ＤＮＡ断片
の挿入を容易にするため、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含んでもよい。
ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）
；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ， Ｗｕら監修，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，サンディエゴ， ｐｐ．１８９
−１９６（１９８９）；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓら
監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９０）に記載される
。

【００４２】 ポリペプチドおよびその断片 本発明は、多様な型のポリペプチドおよびその断片を含み、天然発生である、
または組換えＤＮＡ技術を伴う方法などの多様な技術を通じ産生されるものを含
む。こうした型には、限定されるわけではないが、誘導体、変異体、およびオリ
ゴマーと共に、融合タンパク質またはその断片が含まれる。

【００４３】 ポリペプチドおよびその断片 本発明のポリペプチドは、上述のような核酸配列にコードされる全長タンパク
質を含む。特に好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、特
に好ましい断片は、配列番号２のアミノ酸２９ないし１５９（成熟ポリペプチド
配列）を含む。

【００４４】 配列番号２のポリペプチドは、シグナルペプチドとして機能するＮ−末端疎水
性領域を含む。コンピューター解析により、該シグナルペプチドは配列番号２の
残基１ないし２８に相当することが予測される（が、コンピューターが予測する
、その次に最もありうるシグナルペプチド切断部位は（降順に）配列番号２のア
ミノ酸３４および１１６の後ろに現れる）。シグナルペプチドの切断は、したが
って、配列番号２のアミノ酸２９から１５９を含む成熟タンパク質を生じるであ
ろう。

【００４５】 当業者は、ポリペプチドのこうした領域の上述の境界はおよそのものであるこ
とを認識するであろう。例えば、（その目的のために利用可能なコンピューター
プログラムを用いることにより、予測することが可能な）シグナルペプチドの境
界は、上述のものと異なる可能性がある。

【００４６】 本発明のポリペプチドは、膜に結合していても、または分泌されそしてしたが
って可溶性であってもよい。可溶性ポリペプチドは、発現される細胞から分泌さ
れることが可能である。一般的に、可溶性ポリペプチドは、例えば遠心分離など
により、望ましいポリペプチドを発現する、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）
細胞を培地から分離し、そして望ましいポリペプチドの存在に関し培地（上清）
をアッセイすることにより、同定する（そして非可溶性膜結合対応物と区別する
）ことが可能である。培地中にポリペプチドが存在することにより、該ポリペプ
チドが細胞から分泌され、そしてしたがって該タンパク質の可溶性型であること
が示される。

【００４７】 １つの態様において、可溶性ポリペプチドおよびその断片は、細胞外ドメイン
のすべてまたは一部を含むが、細胞膜へのポリペプチドの保持を生じるであろう
膜貫通領域を欠く。可溶性ポリペプチドは、該ポリペプチドが産生細胞から分泌
される限り、細胞質ドメイン、またはその一部を含んでもよい。

【００４８】 他の態様には、アミノ酸２９または３５のＮ−末端およびアミノ酸１５９のＣ
−末端を有する、可溶性断片が含まれる。 一般的に、可溶性型の使用は特定の適用に有益である。可溶性ポリペプチドは
宿主細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が容易
になる。さらに、可溶性ポリペプチドは、一般的に、静脈内投与に、より適して
いる。

【００４９】 本発明はまた、ポリペプチド、および望ましい生物学的活性を保持する細胞外
ドメインの断片も提供する。特定の態様は、ＴＳＬＰ受容体に結合する能力を保
持するポリペプチド断片に関する。こうした断片は、上述のように可溶性ポリペ
プチドであってもよい。別の態様において、ポリペプチドおよび断片は、好都合
に、上述のようなＢ細胞系譜またはＴ細胞系譜細胞の増殖に影響を与えるタンパ
ク質のファミリー中に保存される領域を含む。

【００５０】 本明細書にやはり提供されるのは、配列番号２の配列の隣接アミノ酸を少なく
とも２０、または少なくとも３０含むポリペプチド断片である。細胞質ドメイン
由来の断片は、情報伝達研究において、そして生物学的情報の伝達に関連する細
胞過程の制御において、使用を見出す。ポリペプチド断片はまた、抗体を産生す
る際の免疫原として使用してもよい。

【００５１】 変異体 天然発生変異体と共に、ポリペプチドおよび断片由来変異体が本明細書に提供
される。

【００５２】 変異体は、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を示してもよい。やはり
意図されるのは、ポリペプチドまたは断片が、好ましいポリペプチドまたはその
断片に、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一
、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列
を含む、態様である。同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により
決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅ
ｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ４８：４４３
（１９７０））のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コン
ピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログ
ラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラム
の好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎ
ｉｋｏｆｆ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９
：１０９１５（１９９２））に記載されるような、スコアリング・マトリックス
、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；
および（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用い
られる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。

【００５３】 本発明の変異体には、例えば、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象またはタン
パク質分解切断から生じるものが含まれる。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは
、例えば、一部切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）が生物学的に活性がある
タンパク質を生じる可能性があり、例えば該タンパク質の天然発生可溶性型など
がある。タンパク質分解に起因すると考えられる変動には、例えば、異なる種類
の宿主細胞における発現に際しての、該タンパク質からの１つまたはそれ以上の
末端アミノ酸（一般的に１−５末端アミノ酸）のタンパク質分解的除去によるＮ
−またはＣ−末端の相違が含まれる。アミノ酸配列の相違を遺伝的多型性（該タ
ンパク質を産生する個体の間の対立遺伝子変動）に起因しうるタンパク質もまた
、本明細書に意図される。

【００５４】 本発明の範囲内のさらなる変異体には、他の化学部分、例えばグリコシル基、
脂質、リン酸、アセチル基およびそれらに匹敵するものと共有または凝集結合体
を形成することにより、修飾され、誘導体を生成する可能性があるポリペプチド
が含まれる。共有誘導体は、アミノ酸側鎖上の、あるいはポリペプチドのＮ−末
端またはＣ−末端の、官能基上に、化学部分を連結することにより、調製しても
よい。以下により詳細に論じられるような、結合している診断用剤（検出可能）
または療法剤を含む結合体が本発明に意図される。

【００５５】 他の誘導体には、例えばＮ−末端またはＣ−末端融合体として組換え培養にお
いて合成されることによる、該ポリペプチドと他のタンパク質またはポリペプチ
ドとの共有または凝集結合体が含まれる。融合タンパク質の例は、オリゴマーと
関連し、以下に論じられる。さらに、融合タンパク質は精製および同定を容易に
するため添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、例えば、
ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら， Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４（１９８８）に記載される抗原性同定
ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド
、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番
号３）であり、該ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体
が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速な
アッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリド
ーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるよ
うに、特定の二価金属陽イオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合
するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番
号第ＨＢ ９２５９号下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託
されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、
Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎ
ｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手
可能である。

【００５６】 本明細書に提供される変異体ポリペプチドの中に、天然の生物学的活性を保持
する天然ポリペプチドの変異体または実質的なその同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎ
ｔ）がある。１つの例は、天然型と本質的に同一の結合親和性で結合する変異体
である。結合親和性は、例えば米国特許第５，５１２，４５７号に記載されるよ
うに、そして以下に示されるように、慣用法により測定することが可能である。

【００５７】 変異体には、実質的に天然型と相同であるが、1つまたはそれ以上の欠失、挿
入または置換のため、天然型と異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドが含
まれる。特定の態様には、限定されるわけではないが、天然配列と比較して、ア
ミノ酸残基の１ないし１０の欠失、挿入または置換を含む、ポリペプチドが含ま
れる。

【００５８】 既定のアミノ酸を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換して
もよい。こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌ
ｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ
、ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基
から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ
、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例
えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。

【００５９】 同様に、本発明のＤＮＡには、１つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換の
ため、天然ＤＮＡ配列とは異なるが、生物学的に活性があるポリペプチドをコー
ドする変異体が含まれる。

【００６０】 本発明はさらに、結合する天然パターン糖鎖付加を含むまたは含まないポリペ
プチドを含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７
細胞）で発現されたポリペプチドは、発現系の選択に応じ、分子量および糖鎖付
加パターンにおいて、天然ポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異
なる可能性もある。細菌発現系、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）での本発明の
ポリペプチドの発現は、非糖鎖付加分子を提供する。さらに、既定の調製は、多
数の異なって糖鎖付加されたタンパク質種を含む可能性がある。グリコシル基は
、慣用法、特にグリコペプチダーゼを利用するものを通じ、除去してもよい。一
般的に、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを、モル過剰のグリコペプチダーゼ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベーションしてもよい。

【００６１】 これに対応して、アミノ酸残基または配列の多様な付加または置換、あるいは
末端または内部の残基または配列の欠失をコードする同様のＤＮＡ構築物が、本
発明に含まれる。例えば、ポリペプチド細胞外ドメインのＮ−糖鎖付加部位を修
飾し、糖鎖付加を妨げてもよく、これにより哺乳動物および酵母発現系における
炭水化物減少類似体（ａｎａｌｏｇ）の発現が可能になる。真核ポリペプチドの
Ｎ−糖鎖付加部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、
ここでＸはいかなるアミノ酸でもよく、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。
これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加
または欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合の防止を生じるであろう。例
えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸により置換されるように選択される、単一のヌク
レオチドの改変は、Ｎ−糖鎖付加部位を不活性化するのに十分である。あるいは
、ＳｅｒまたはＴｈｒを別のアミノ酸、例えばＡｌａで置換してもよい。タンパ
ク質のＮ−糖鎖付加部位を不活性化するための既知の方法には、本明細書に援用
される、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ ２７６，８４６に記載さ
れるものが含まれる。

【００６２】 変異体の別の例において、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする
配列を改変し、Ｃｙｓ残基が欠失され、または他のアミノ酸で置換されるように
し、フォールディングまたは再生の際、誤った分子内ジスルフィド架橋が形成さ
れるのを妨げてもよい。

【００６３】 他の変異体は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を亢
進させるため、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾することにより調製される
。ＥＰ ２１２，９１４は、タンパク質のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部
位を不活性化するための部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。ＫＥＸ２プ
ロテアーゼプロセシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙ
ｓ−Ａｒｇ対を改変し、これらの隣接する塩基性残基の発生を除去するため、残
基を欠失させ、付加し、または置換することにより、不活性化される。Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ対はＫＥＸ２切断にかなり感受性が低く、そしてＡｒｇ−ＬｙｓまたはＬ
ｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化する保存的
なそして好ましいアプローチを代表する。

【００６４】 オリゴマー 本発明に含まれるのは、ヒトＴＳＬＰポリペプチドを含むオリゴマーまたは融
合タンパク質である。こうしたオリゴマーは、二量体、三量体、またはより高次
のオリゴマーを含む、共有結合または非共有結合多量体型であってもよい。上述
のように、好ましいポリペプチドは可溶性であり、そしてしたがってこれらのオ
リゴマーは可溶性ポリペプチドを含んでもよい。本発明の１つの側面において、
オリゴマーはポリペプチド構成要素の結合能を維持し、そしてしたがって、二価
、三価などの結合部位を提供する。

【００６５】 本発明の１つの態様は、ポリペプチドに融合しているペプチド部分間の共有ま
たは非共有相互作用を介し結合している多数のポリペプチドを含むオリゴマーに
関する。こうしたペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）であってもよく
、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。以下に
より詳細に記載されるように、ロイシンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペ
プチドが、結合するポリペプチドのオリゴマー化を促進することが可能なペプチ
ドの中にある。

【００６６】 免疫グロブリンに基づくオリゴマー １つの代替物として、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用い、オリゴ
マーを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に
融合している特定の異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチドを含む融
合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
８：１０５３５（１９９１））；Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７（
１９９０））；並びにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中， “Ｃｏｎｓｔｒ
ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ”， Ｓｕｐｐｌ．４， １０．１９．１−１０．１９．１１（１９９
２））に記載されている。

【００６７】 本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチド
に融合させることにより生成される２つの融合タンパク質を含む二量体に関する
。ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベ
クターに挿入する。該組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞でポリペプ
チド／Ｆｃ融合タンパク質を発現し、そして抗体分子によく似た形で集合させ、
その結果、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間に形成され、二価分子を生じる。

【００６８】 本明細書において、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域のＣＨドメ
インのすべてを含む抗体のＦｃ領域から構成される天然および突然変異タンパク
質（ｍｕｔｅｉｎ）型ポリペプチドを含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含
むこうしたポリペプチドの一部切除型もまた含まれる。好ましいポリペプチドは
ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃポリペプチドを含む。

【００６９】 ＰＣＴ出願第ＷＯ ９３／１０１５１号（本明細書に援用される）に記載され
る１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ−末端ヒ
ンジ領域から天然Ｃ−末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポ
リペプチドは、本明細書に援用される米国特許第５，４５７，０３５号およびＢ
ａｕｍら（ＥＭＢＯ Ｊ．， １３：３９９２−４００１（１９９４））に記載
されるＦｃ突然変異タンパク質である。本突然変異タンパク質のアミノ酸配列は
、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕ
に変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば
、ＷＯ ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然
変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少した親和性を示す。

【００７０】 Ｆｃ部分を含む上述の融合タンパク質（およびそれから形成されるオリゴマー
）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラ
フィーによる容易な精製という利点を提供する。

【００７１】 他の態様において、本発明のポリペプチドを、抗体重鎖または軽鎖の可変部に
関し置換してもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されて
いる場合、４つものＴＳＬＰ細胞外領域を持つオリゴマーを形成することが可能
である。

【００７２】 ペプチドリンカーに基づくオリゴマー あるいは、オリゴマーはペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含むまた
は含まない多数のポリペプチドを含む融合タンパク質である。適切なペプチドリ
ンカーの中に、本明細書に援用される米国特許第４，７５１，１８０号および第
４，９３５，２３３号に記載されるものがある。望ましいペプチドリンカーをコ
ードするＤＮＡ配列は、いかなる適切な慣用的技術を用い、本発明のＤＮＡ配列
の間に、そして該ＤＮＡ配列と同じ読み枠で挿入してもよい。例えば、リンカー
をコードする化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを、配列間に連結してもよ
い。特定の態様において、融合タンパク質は、ペプチドリンカーにより分離され
た、２ないし４つの可溶性ＴＳＬＰポリペプチドを含む。

【００７３】 ロイシンジッパー 本発明のオリゴマーを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を
伴う。ロイシンジッパードメインは、該ドメインが見られるタンパク質のオリゴ
マー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮ
Ａ結合タンパク質で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４０：１７５９（１９８８））、そして以来、多様な異なるタンパク質で見出さ
れてきている。既知のロイシンジッパーの中に、二量体化または三量体化する天
然発生ペプチドおよびその誘導体がある。

【００７４】 ジッパードメイン（本明細書において、オリゴマー化、またはオリゴマー形成
ドメインとも呼ばれる）は、繰り返される７残基反復を含み、しばしば４つまた
は５つのロイシン残基が、他のアミノ酸に点在する。ジッパードメインの例には
、酵母転写因子ＧＣＮ４およびラット肝臓に見られる熱安定性ＤＮＡ結合タンパ
ク質（Ｃ／ＥＢＰ； Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１
６８１（１９８９））がある。２つの核トランスフォーミングタンパク質、ｆｏ
ｓおよびｊｕｎもまたジッパードメインを示し、ネズミプロトオンコジーンｃ−
ｍｙｃの遺伝子産物も同様である（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ
， ２４０：１７５９（１９８８））。核発癌遺伝子、ｆｏｓおよびｊｕｎの産
物は、ヘテロ二量体を優先して形成するジッパードメインを含む（Ｏ’Ｓｈｅａ
ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４５；６４６（１９８９）、ＴｕｒｎｅｒおよびＴ
ｉｊａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６８９（１９８９））。ジッパードメ
インは、これらのタンパク質の生物学的活性（ＤＮＡ結合）に必要である。

【００７５】 パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイ
ルスを含む、いくつかの異なるウイルスの融合体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）
タンパク質もまた、ジッパードメインを所有する（ＢｕｃｋｌａｎｄおよびＷｉ
ｌｄ， Ｎａｔｕｒｅ， ３３８：５４７（１９８９））；（Ｂｒｉｔｔｏｎ，
Ｎａｔｕｒｅ， ３５３：３９４（１９９１））；（ＤｅｌｗａｒｔおよびＭ
ｏｓｉａｌｏｓ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔ
ｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， ６：７０３（１９９０））。これらの融合体形成性（ｆ
ｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルスタンパク質のジッパードメインは、該タンパク質の
膜貫通領域の近くにあり；ジッパードメインが、該融合体形成性タンパク質のオ
リゴマー構造に寄与する可能性が示唆されてきている。融合体形成性ウイルスタ
ンパク質のオリゴマー化は、融合孔（ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｒｅ）形成に関与して
いる（Ｓｐｒｕｃｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ
．Ｓ．Ａ． ８８：３５２３（１９９１））。ジッパードメインはまた、最近、
熱ショック転写因子のオリゴマー化に役割を果たしているとも報告されてきてい
る（Ｒａｂｉｎｄｒａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：２３０（１９９３））
。

【００７６】 ジッパードメインは、短い、平行コイルドコイル（ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｉ
ｌｅｄ ｃｏｉｌ）として折りたたまれている（Ｏ'Ｓｈｅａら， Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２５４：５３９（１９９１））。平行コイルドコイルの一般的構造は、Ｃ
ｒｉｃｋにより提唱されたような「ノブを穴へ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌ
ｅｓ）」パッキング（Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．， ６：６８９）に
より、よく特徴付けられている。ジッパードメインにより形成された二量体は、
ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＳｔｅｗｅｒｔ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９
８：２９３（１９７５））の表記にしたがい、（ａｂｃｄｅｆｇ）_nと表される
、７残基反復により安定化される。ここでａおよびｄは一般的に疎水性残基であ
り、ｄはロイシンであり、これらはらせんの同じ面に並ぶ。逆に荷電した残基は
普通、ｇおよびｅ位にある。したがって、２つのらせん状ジッパードメインから
形成される平行コイルドコイルにおいて、第一のらせんの疎水性側鎖により形成
された「ノブ」は、第二のらせんの側鎖間に形成された「穴」にパッキングされ
る。

【００７７】 ｄ位の残基（しばしばロイシン）は、巨大な疎水性安定化エネルギーに寄与し
、そしてオリゴマー形成に重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋら， Ｉｎｔ． Ｊ．
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．， ３８：２２９（１９９１））。Ｌｏｖｅｊｏｙら
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１２８８（１９９３））は最近、らせんが上−上−
下に走る、三重鎖αらせん束合成を報告した。彼らの研究により、疎水性安定化
エネルギーが、らせん単量体からのコイルドコイルの形成のための主要な原動力
を提供していることが裏付けられた。これらの研究はまた、静電相互作用がコイ
ルドコイルの化学量論および形状に寄与していることも示している。ロイシンジ
ッパーの構造のさらなる議論は、Ｈａｒｂｕｒｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６２
：１４０１（２６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９３））に見られる。

【００７８】 可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメイン
の例は、ＰＣＴ出願第ＷＯ ９４／１０３０８号に記載され、そして肺界面活性
物質プロテインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパードメインが、本明細書に援
用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３４４：１９１（１９９
４））に記載される。修飾ロイシンジッパーに融合している異種性タンパク質の
安定した三量体化を可能にする、該修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌ
ｏｗら（Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：２６７−２７８（１９９４）
）に記載されている。ロイシンジッパーペプチドに融合している可溶性ポリペプ
チドを含む組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞で発現し、そして形成される
可溶性オリゴマーを培養上清から回収する。

【００７９】 特定のロイシンジッパー部分は、優先的に三量体を形成する。１つの例は、本
明細書に完全に援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３４４
：１９１（１９９４））および米国特許第５，７１６，８０５号に記載されるよ
うな、肺界面活性物質プロテインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーである。
本肺ＳＰＤ由来ロイシンジッパーペプチドは、アミノ酸配列Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｖ
ａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ（配列番号４）を含む
。

【００８０】 三量体化を促進するロイシンジッパーの別の例は、米国特許第５，７１６，８
０５号に記載されるような、アミノ酸配列Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉ
ｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓ
ｅｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｉ
ｌｅ Ａｌａ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｕ Ａｒｇ（配列番号５）を含むペプチドである。１つの別の態様において、
Ｎ−末端Ａｓｐ残基が付加され；別の態様では、該ペプチドはＮ−末端Ａｒｇ残
基を欠いている。

【００８１】 オリゴマー化を促進する特性を保持する、前述のジッパーペプチドの断片もま
た、使用してもよい。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、前述
のアミノ酸配列に示される１つまたは２つのＮ−末端またはＣ−末端残基を欠く
ペプチドが含まれる。ロイシンジッパーは、天然発生ロイシンジッパーペプチド
から、例えばオリゴマー化を促進するペプチドの能力が保持されるように、天然
アミノ酸配列の保存的置換を介し、得てもよい。

【００８２】 天然発生三量体タンパク質由来の他のペプチドを、三量体オリゴマーを調製す
るのに使用してもよい。あるいは、オリゴマー化を促進する合成ペプチドを使用
してもよい。特定の態様において、ロイシンジッパー部分のロイシン残基を、イ
ソロイシン残基により置換してもよい。イソロイシンを含むこうしたペプチドは
、イソロイシンジッパーと呼んでもよいが、本明細書において「ロイシンジッパ
ー」という用語に含まれる。

【００８３】 ポリペプチドおよびその断片の産生 本発明のポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製は、いかなる適切な
技術により達成してもよく、限定されるわけではないが以下を含む：

【００８４】 発現系 本発明はまた、ＤＮＡを含む組換えクローニング用および発現ベクター、並び
に、該組換えベクターを含む宿主細胞も提供する。ＤＮＡを含む発現ベクターを
用い、該ＤＮＡにコードされる本発明のポリペプチドまたは断片を調製してもよ
い。ポリペプチドを産生するための方法は、ポリペプチドをコードする組換え発
現ベクターで形質転換されている宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を促進する
条件下で培養し、その後培養から発現ポリペプチドを回収することを含む。当業
者は、発現ポリペプチドを精製するための方法は使用する宿主細胞の種類、およ
び該ポリペプチドが膜に結合しているかまたは宿主細胞から分泌される可溶性型
かなどの要因にしたがい、多様であろうことを認識するであろう。

【００８５】 いかなる適切な発現系を使用してもよい。ベクターは、適切な転写または翻訳
制御ヌクレオチド配列、例えば、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝
子由来のものなどに、機能可能であるように連結されている、本発明のポリペプ
チドまたは断片をコードするＤＮＡを含む。制御配列の例には、転写プロモータ
ー、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに
転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド
配列は、制御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連しているとき、機能可能である
ように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロ
モーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮＡ配列に
、機能可能であるように連結されている。望ましい宿主細胞において複製する能
力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現
ベクターに取り込まれている。

【００８６】 さらに、適切なシグナルペプチド（天然または異種性）をコードする配列を、
発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ
配列を、インフレームで本発明の核酸配列に融合させ、ＤＮＡがまず転写され、
そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるようにし
てもよい。意図される宿主細胞で機能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの
細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞からの分泌に
際し、ポリペプチドから切断される。

【００８７】 当業者はまた、シグナルペプチドが切断される位は、コンピュータープログラ
ムに予測されるものと異なる可能性があり、そして組換えポリペプチドを発現す
るのに使用される宿主細胞の種類などの要因にしたがい、多様である可能性があ
ることも認識するであろう。タンパク質調製物は、１つ以上の部位でのシグナル
ペプチドの切断から生じる、異なるＮ−末端アミノ酸を有するタンパク質分子の
混合物を含む可能性がある。本明細書に提供される成熟タンパク質の特定の態様
には、限定されるわけではないが、Ｎ−末端アミノ酸として、配列番号２の１６
、２９、３５、９５、または１１７位の残基を有するタンパク質が含まれる。

【００８８】 ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核、酵母またはより高次の真核
細胞が含まれる。宿主細胞としての使用には、哺乳動物または昆虫細胞が一般的
に好ましい。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用に適したクロ
ーニング用および発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら， Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ニューヨ
ーク州エルセビア（１９８５）に記載されている。細胞不含翻訳系もまた、本明
細書に開示されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用い、ポリペプチドを産生するの
に使用してもよい。

【００８９】 原核発現系 原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適し
た原核宿主細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ス
トレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な他の種が含まれる。大腸菌などの原核宿主
細胞において、組換えポリペプチドの該原核宿主細胞における発現を容易にする
ため、ポリペプチドはＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい。Ｎ−末端Ｍｅｔ
は、発現された組換えポリペプチドから切断してもよい。

【００９０】 原核宿主細胞に用いるための発現ベクターは、一般的に、１つまたはそれ以上
の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例
えば、抗生物質耐性を与える、または独立栄養必要条件を供給するタンパク質を
コードする遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、クロー
ニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）など、商業的に入手可能
なプラスミド由来のものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテト
ラサイクリン耐性を含み、そしてしたがって、形質転換細胞を同定する簡単な手
段を提供する。適切なプロモーターおよびＤＮＡ配列をｐＢＲ３２２ベクター中
に挿入する。他の商業的に入手可能なベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン・ウプサ
ラ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、米国ウィスコンシン州
マディソン）が含まれる。

【００９１】 組換え原核宿主細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーター配列には、β
−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら
， Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５（１９７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌら，
Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４（１９７９））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロ
モーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４
０５７（１９８０）；およびＥＰ−Ａ−３６７７６）およびｔａｃプロモーター
（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ， ｐ．４１２（１９８２））が含まれる。特に有用な原核宿
主細胞発現系は、ファージλＰ_LプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性
リプレッサー配列を使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
から入手可能な、λＰ_Lプロモーターの誘導体を組み込んだプラスミドベクター
には、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９、ＡＴＣＣ ３７０９２に常住
）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１、ＡＴＣＣ ５３０８２に常住）が含まれ
る。

【００９２】 酵母系 あるいは、ポリペプチドは、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来
の酵母宿主細胞において発現してもよい。酵母の他の属、例えばピキア属（Ｐｉ
ｃｈｉａ）またはクロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）もまた使
用してもよい。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点
配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配
列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含むであろう。酵
母ベクターに適したプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−
ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈ
ｅｍ． ２５５：２０７３（１９８０））あるいは、エノラーゼ、グリセルアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキ
シラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３
−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメ
ラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖
酵素（Ｈｅｓｓら， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７：１４９（
１９６８））；および（Ｈｏｌｌａｎｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７：４９０
０（１９７８））のプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適した他の
ベクターおよびプロモーターはＨｉｔｚｅｍａｎ， ＥＰＡ−７３，６５７にさ
らに記載されている。別の代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃ
ｈｅｍ． ２５８：２６７４（１９８２））およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ
３００：７２４（１９８２））に記載されるグルコース抑制可能ＡＤＨ２プロ
モーターである。大腸菌での選択および複製のため、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ
配列（Ａｍｐ^r遺伝子および複製起点）を上述の酵母ベクターに挿入することに
より、酵母および大腸菌両方において複製可能なシャトルベクターを構築しても
よい。

【００９３】 酵母α−因子リーダー配列を使用し、ポリペプチドを直接分泌させてもよい。
α−因子リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列および構造遺伝子配列の
間に挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎら， Ｃｅｌｌ ３０：９３３（１９８
２）およびＢｉｔｔｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８１：５３３０（１９８４）を参照されたい。酵母宿主からの組換え
ポリペプチドの分泌を容易にするのに適した他のリーダー配列が当業者に知られ
る。リーダー配列を、その３’端近傍に、１つまたはそれ以上の制限部位を含む
よう修飾してもよい。これは、リーダー配列が構造遺伝子に融合するのを容易に
するであろう。

【００９４】 酵母形質転換プロトコルが当業者に知られる。こうしたプロトコルの１つがＨ
ｉｎｎｅｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７
５：１９２９（１９７８）に記載される。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコルは、Ｔｒ
ｐ⁺形質転換体を選択培地中で選択し、ここで該選択培地は０．６７％酵母窒素
基剤、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０ｍｇ／ｍｌアデニンおよび２
０ｍｇ／ｍｌウラシルからなる。

【００９５】 ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞
は、発現を誘導するため「リッチ」培地中で増殖させてもよい。リッチ培地の例
は、８０ｍｇ／ｍｌアデニンおよび８０ｍｇ／ｍｌウラシルを補った、１％酵母
エキス、２％ペプトン、および１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２プ
ロモーターの抑制解除（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、培地からグルコースが
枯渇したとき起こる。

【００９６】 哺乳動物または昆虫系 哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えポリペプチドを発現するの
に使用してもよい。昆虫細胞において異種性タンパク質を産生するためのバキュ
ロウイルス系がＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ６：４７（１９８８）に概説されている。哺乳動物起源の樹立細胞株も
また、使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣ
ＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら， Ｃｅｌｌ
２３：１７５（１９８１））、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞
、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢ
Ｏ Ｊ． １０：２８２１（１９９１））に記載されるようなアフリカミドリザ
ル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ ７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。

【００９７】 哺乳動物細胞内にＤＮＡを導入するための確立された方法が記載されてきてい
る（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．， Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉ
ａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， ｐｐ．１５−６９（１９９０））。商業的
に入手可能な試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／
ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬を用いた、さら
なるプロトコルを用い、細胞をトランスフェクションしてもよい（Ｆｅｌｇｎｅ
ｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４
１３−７４１７（１９８７））。さらに、エレクトロポレーションを用い、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版． Ｖｏｌ．１−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））における
もののような、慣用法を用い、哺乳動物細胞をトランスフェクションしてもよい
。安定形質転換体の選択は、例えば細胞毒性薬剤に対する耐性など、当該技術分
野に知られる方法を用い、行ってもよい。Ｋａｕｆｍａｎら， Ｍｅｔｈ． ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：４８７−５１１（１９９０）は、いくつか
の選択計画、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性を記載する。Ｄ
ＨＦＲ選択に適した宿主株は、ＤＨＦＲ不全であるＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１であっ
てもよい（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０（１９８０））。ＤＨＦ
Ｒ ｃＤＮＡを発現しているプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株に導入してもよく、そ
してプラスミドを含む細胞のみを適切な選択培地中で増殖させてもよい。発現ベ
クターに組み込んでもよい選択可能マーカーの他の例には、Ｇ４１８およびハイ
グロマイシンＢなどの抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。該ベ
クターを宿する細胞を、これらの化合物に対する耐性に基づき選択してもよい。

【００９８】 哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルス
ゲノムより切り出されてもよい。通常用いられるプロモーター配列およびエンハ
ンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０
（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイル
スゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター
、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を用い、哺乳動物
宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供してもよい
。ウイルス初期および後期プロモーターは、どちらもウイルス複製起点をも含む
可能性がある断片として容易にウイルスゲノムから得られるため、特に有用であ
る（Ｆｉｅｒｓら， Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３（１９７８））；（Ｋａｕ
ｆｍａｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９０））。ＳＶ４
０ウイルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄ ＩＩＩ部位からＢｇｌ Ｉ部位に
渡るおよそ２５０ ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きい
ＳＶ４０断片もまた用いてもよい。

【００９９】 哺乳動物発現ベクターからの異種性遺伝子の発現を改善することが示されたさ
らなる調節配列には、ＣＨＯ細胞由来の発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒ
ｒｉｓら， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐｐ．５２９
−５３４およびＰＣＴ出願第ＷＯ ９７／２５４２０号（１９９７））並びにア
デノウイルス２由来の三分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）およ
びＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２５７：１３４７５−１３４９１（１９８２））などの要素が含まれる。ウイル
ス起源の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列により、二シストロン性ｍＲ
ＮＡが効率的に翻訳されることが可能になる（ＯｈおよびＳａｒｎｏｗ， Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ ３：２９５−３００（１９９３））；（Ｒａｍｅｓｈら， Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７−２７００（１９９
６））。選択可能マーカー（例えばＤＨＦＲ）遺伝子が続く、二シストロン性ｍ
ＲＮＡの一部としての異種性ｃＤＮＡの発現は、宿主のトランスフェクション可
能性および異種性ｃＤＮＡの発現を改善することが示されてきている（Ｋａｕｆ
ｍａｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９０））。二シスト
ロン性ｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、Ｍｏｓｓｅｒら， Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０−１６１（１９９７）に記載されるｐＴＲ
−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓら， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，， ｐｐ．５２９−５３４（１９９７）に記載されるｐ２Ａ５Ｉ
である。

【０１００】 有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴがＭｏｓｌｅｙら， Ｃｅｌｌ ５９
：３３５−３４８（１９８９）に記載されてきている。哺乳動物宿主細胞におい
て用いるための他の発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２８０（１９８３））に開示されるように構築
してもよい。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した
高レベル発現に有用な系を、実質的にＣｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． ２３：９３５（１９８６））に記載されるように構築してもよい。Ｃｏｓ
ｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載される有用な高
発現ベクター、ＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ ３９８９０として寄託され
ている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、本明細書に援用される、ＥＰ
−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ ９１／１８９８２に記載されている。さらに
別の代替物として、ベクターは、レトロウイルス由来であってもよい。

【０１０１】 別の有用な発現ベクター、ｐＦＬＡＧ（登録商標）を用いてもよい。ＦＬＡＧ
（登録商標）技術は、低分子量（１ｋＤ）親水性ＦＬＡＧ（登録商標）マーカー
ペプチドを、ｐＦＬＡＧ（登録商標）発現ベクターにより発現される組換えタン
パク質のＮ−末端に融合させることを中心とする。ｐＤＣ３１１は、ＣＨＯ細胞
でタンパク質を発現させるために用いる、別の特殊化ベクターである。ｐＤＣ３
１１は、目的の遺伝子およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を、
ＤＨＦＲ翻訳のための内部リボソーム結合部位、発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）
、ヒトＣＭＶプロモーター、三分割リーダー配列、およびポリアデニル化部位と
共に含む、二シストロン性配列により特徴付けられる。

【０１０２】 使用してもよいシグナルペプチドに関し、望ましいならば、天然シグナルペプ
チドを異種シグナルペプチドまたはリーダー配列に置き換えてもよい。シグナル
ペプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドが産生されるべき宿主細
胞の種類などの要因に依存する可能性がある。例えば、哺乳動物宿主細胞で機能
する異種性シグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載
されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら，
Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載されるインターロイキン−２
受容体のシグナル配列；ＥＰ ３６７，５６６に記載されるインターロイキン−
４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型
インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ ４６０，８４６に
記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。

【０１０３】 精製 本発明はまた、ポリペプチドおよびその断片を単離しそして精製する方法も含
む。

【０１０４】 単離および精製 本発明に含まれる「単離」ポリペプチドまたはその断片は、天然に見られる可
能性がある環境と同一でない環境にあるポリペプチドまたは断片である。本発明
に含まれる「精製」ポリペプチドまたはその断片は、例えば上述のような組換え
発現系の精製産物のように、または天然発生細胞および／または組織などの非組
換え供給源からの精製産物のように、他のタンパク質またはポリペプチドとの結
合を本質的に含まない。

【０１０５】 １つの好ましい態様において、組換えポリペプチドまたは断片の精製は、本発
明のポリペプチドまたは断片の、本発明のポリペプチドまたは断片の精製を援助
する別のポリペプチドへの融合を用い、達成してもよい。こうした融合パートナ
ーは、上述のようなポリ−Ｈｉｓまたは他の抗原性同定ペプチドと共に先に記載
されるＦｃ部分を含んでもよい。

【０１０６】 いかなる種類の宿主細胞に関しても、当業者に知られるように、組換えポリペ
プチドまたは断片を精製するための方法は、使用する宿主細胞の種類および組換
えポリペプチドまたは断片が培地に分泌されるかどうかなどの要因にしたがい、
多様であろう。

【０１０７】 一般的に、組換えポリペプチドまたは断片は、分泌されない場合、宿主細胞か
ら、あるいは可溶性でありそして分泌される場合、培地または上清から単離して
もよく、その後１つまたはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用
、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィー段階が続く。これら
の段階を達成する特定の方法については、培地をまず、商業的に入手可能なタン
パク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅ
ｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用い、濃縮してもよい。濃縮段階に続き、濃縮物を
ゲル濾過媒体などの精製マトリックスに適用してもよい。あるいは、陰イオン交
換樹脂、例えばペンダントな（ｐｅｎｄａｎｔ）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡ
Ｅ）基を有するマトリックスまたは支持体を使用してもよい。マトリックスは、
アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製
に通常使用される他の種類であってもよい。あるいは、陽イオン交換段階を使用
してもよい。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチ
ル基を含む多様な不溶性マトリックスが含まれる。さらに、クロマトフォーカシ
ング段階を使用してもよい。あるいは疎水性相互作用クロマトグラフィー段階を
使用してもよい。適切なマトリックスは、樹脂に結合しているフェニルまたはオ
クチル部分であってもよい。さらに、組換えタンパク質に選択的に結合するマト
リックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーを使用してもよい。使用さ
れるこうした樹脂の例は、レクチンカラム、色素カラム、および金属キレートカ
ラムである。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ）媒体（例えば、ペンダントなメチル、オクチル、オクチルデシルまたは他の
脂肪族基を有するシリカゲルまたはポリマー樹脂）を使用する１つまたはそれ以
上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）段階を使用し、ポリ
ペプチドをさらに精製してもよい。いくつかまたはすべての前記の精製段階の多
様な組み合わせが周知であり、そして単離されそして精製されている組換えタン
パク質を提供するのに使用してもよい。

【０１０８】 本発明のポリペプチド−結合タンパク質、例えば本発明のポリペプチドに対し
生成されたモノクローナル抗体などを含むアフィニティーカラムを利用し、発現
されたポリペプチドをアフィニティー精製することもまた、可能である。これら
のポリペプチドは、慣用的技術を用い、例えば、高塩溶出緩衝液中、そしてその
後、使用のためより低塩緩衝液中に透析することによって、あるいは利用された
アフィニティーマトリックスに応じて、ｐＨまたは他の構成要素を変化させるこ
とによって、あるいは親和性部分の天然発生基質、例えば本発明由来のポリペプ
チドを用い、競合的に除去することによって、アフィニティーカラムから除去し
てもよい。

【０１０９】 本発明の本側面において、ポリペプチド−結合タンパク質、例えば本発明の抗
ポリペプチド抗体または本発明のポリペプチドと相互作用する可能性がある他の
タンパク質を、その表面に本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定し、分離
し、または精製するのに適したカラムクロマトグラフィーマトリックスまたは同
様の支持体などの固相支持体に結合させてもよい。固相接触表面への本発明のポ
リペプチド結合タンパク質の結合は、いかなる手段により達成してもよく、例え
ば磁気微小球体をこれらのポリペプチド結合タンパク質で被覆し、そして磁気場
を通じインキュベーション容器に保持してもよい。細胞混合物の懸濁物を、上に
こうしたポリペプチド結合タンパク質を有する固相と接触させる。本発明のポリ
ペプチドを表面上に有する細胞が固定ポリペプチド結合タンパク質に結合し、そ
してその後非結合細胞を洗い流す。本親和性結合法は、溶液からこうしたポリペ
プチド発現細胞を精製し、スクリーニングし、または分離するのに有用である。
固相から陽性に選択された細胞を遊離させる方法は当該技術分野に知られ、そし
て例えば酵素の使用を含む。こうした酵素は好ましくは細胞に対し非毒性および
非傷害性であり、そして好ましくは細胞表面結合パートナーを切断するよう、指
示される。

【０１１０】 あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含むと疑われる細胞混合物をまず
、ビオチン化した本発明のポリペプチド結合タンパク質とインキュベーションし
てもよい。インキュベーション時間は、本発明のポリペプチドへの十分な結合を
確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。生じた混合物をその
後、アビジン被覆ビーズを充填したカラムに通過させ、それによりアビジンに対
するビオチンの高い親和性が、ポリペプチド結合細胞のビーズへの結合を提供す
る。アビジン被覆ビーズの使用は当該技術分野に知られる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎら
， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ：２３９（１９８６）を参
照されたい。非結合成分の洗浄および結合細胞の遊離は、慣用法を用い行う。

【０１１１】 望ましい純度は、タンパク質の意図される使用に依存する。例えば、タンパク
質がｉｎ ｖｉｖｏで投与されるとき、比較的高い純度が望ましい。こうした場
合、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）による解析に際し、他のタンパク質に相当するタンパク質バンドが検出不
能であるように精製される。当業者は、異なる糖鎖付加、異なる翻訳後プロセシ
ング等により、該ポリペプチドに相当する多数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り視覚化される可能性があることを認識するであろう。最も好ましくは、本発明
のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の際、単一のタンパク質バンド
により示されるように、実質的に均一に精製される。タンパク質バンドは銀染色
、クーマシーブルー染色により、または（タンパク質が放射標識されている場合
は）オートラジオグラフィーにより、視覚化してもよい。

【０１１２】 アッセイ 本発明の精製ポリペプチド（タンパク質、ポリペプチド、断片、変異体、オリ
ゴマー、および他の型を含む）を、慣用的な結合アッセイなど、いかなる適切な
アッセイにおいて、ＴＳＬＰ受容体に結合する能力に関し試験してもよい。例と
して、ポリペプチドを検出可能試薬（例えば、放射性核種、発色団、比色もしく
は蛍光分光反応を触媒する酵素など）で標識してもよい。標識ポリペプチドを、
ＴＳＬＰ受容体を発現している細胞と接触させる。細胞をその後、洗浄し、非結
合標識ポリペプチドを除去し、そして細胞に結合している標識の存在を、標識の
性質にしたがい選択される適切な技術により、決定してもよい。

【０１１３】 結合アッセイ法の１つの例は以下の通りである。当該技術分野に知られる方法
により、ＴＳＬＰ ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターを構築する。マウスＴＳ
ＬＰ受容体は、Ｎ−末端細胞外ドメイン、膜貫通領域、およびＣ−末端細胞質ド
メインを含む。１０ ｃｍ²プレート中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞を該組換え
発現ベクターでトランスフェクションする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ １０４７８）は、ＣＭＶ極初期エンハンサー／プロモーターから
ドライブされるＥＢＶ核抗原１を恒常的に発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、
ＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１（１９９１））に記載され
るように、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）
由来であった。

【０１１４】 トランスフェクション細胞を２４時間培養し、そして各プレート中の細胞をそ
の後、２４ウェルプレートに分ける。さらに４８時間培養した後、トランスフェ
クション細胞（約４ ｘ １０⁴細胞／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。
ＢＭ−ＮＦＤＭは５０ ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳が添加されている結合培地（２５
ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．２を含むＲＰＭＩ １６４０）である。該細胞をその
後、多様な濃度の、例えば上述のように作成された可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融
合タンパク質と、３７℃で１時間インキュベーションする。細胞をその後、洗浄
し、そして結合培地中で、¹²⁵Ｉマウス抗ヒトＩｇＧの一定の飽和濃度で、穏や
かに攪拌しながら３７℃で１時間インキュベーションする。徹底した洗浄の後、
トリプシン処理を介し細胞を遊離させる。

【０１１５】 上に使用されるマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けら
れ、そしてＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウェストグローブから得ることが可能
である。抗体は標準的クロラミン−Ｔ法を用い、放射ヨウ素標識される。該抗体
は、細胞に結合しているいかなるポリペプチド／Ｆｃタンパク質のＦｃ部分にも
結合するであろう。すべてのアッセイにおいて、¹²⁵Ｉ抗体の非特異的結合をＦ
ｃ融合タンパク質／Ｆｃの非存在下でアッセイすると共に、Ｆｃ融合タンパク質
および２００倍のモル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でもアッセ
イする。

【０１１６】 細胞結合¹²⁵Ｉ抗体は、Ｐａｃｋａｒｄ Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンターで定
量化する。親和性計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０（１９４９））はＭｉｃｒｏｖａｘコンピュータ
ー上で実行されるＲＳ／１（ＢＢＮ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、マサチューセッツ州ボ
ストン）上で生み出される。

【０１１７】 別の種類の適切な結合アッセイは、競合結合アッセイである。例えば、変異体
の生物学的活性は、該変異体が、ＴＳＬＰ受容体への結合に関し、天然タンパク
質と競合する能力をアッセイすることにより、決定してもよい。

【０１１８】 競合結合アッセイは、慣用的方法論により、行いうる。競合結合アッセイに使
用してもよい試薬には、放射標識ＴＳＬＰ、およびＴＳＬＰ受容体（内因性また
は組換え）を細胞表面に発現している、損なわれていない細胞が含まれる。例え
ば、放射標識可溶性ＴＳＬＰ断片を用い、細胞表面ＴＳＬＰ受容体への結合に関
し、可溶性ＴＳＬＰ変異体と競合させてもよい。損なわれていない細胞の代わり
に、（固相上の）プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ部分との相互作用を通
じ固相に結合している可溶性ＴＳＬＰ受容体／Ｆｃ融合タンパク質で代用しても
よい。プロテインＡおよびプロテインＧを含むクロマトグラフィーカラムには、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカ
タウェイより入手可能なものが含まれる。

【０１１９】 別の種類の競合結合アッセイは、放射標識可溶性ＴＳＬＰ受容体、例えばＴＳ
ＬＰ受容体／Ｆｃ融合タンパク質、および内因性または組換えＴＳＬＰ受容体を
発現する、損なわれていない細胞を利用する。放射標識ＴＳＬＰ受容体を用い、
可溶性ＴＳＬＰに関し、膜結合ＴＳＬＰ受容体と競合させてもよい。定性的結果
は、競合オートラジオグラフプレート結合アッセイにより得てもよく、一方、定
量的結果を生成するのにＳｃａｔｃｈａｒｄプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，
Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０（１９４９））を
利用してもよい。

【０１２０】 ヒトＴＳＬＰ核酸またはオリゴヌクレオチドの使用 上述のように、ポリペプチドを発現するのに用いられるほか、ＤＮＡ、ＲＮＡ
、ｍＲＮＡを含む本発明の核酸およびそのオリゴヌクレオチドを以下に用いても
よい： Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系譜細胞増殖を誘導する能力を有するタンパク質をコ
ードする核酸を同定するためのプローブとして； ヒト染色体第５番を同定するため ヒト染色体第５番上の遺伝子をマッピングするため ヒト染色体第５番と関連する、特定の疾患、症候群、または他の異常に関連す
る遺伝子を同定するため； 一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ＴＳＬＰ遺伝子
にコードされるポリペプチドの発現を阻害するため； 個体において不全遺伝子を検出するのを補助するため；および 遺伝子治療のため。

【０１２１】 プローブ 本発明の核酸の使用の中に、プローブまたはプライマーとしての断片の使用が
ある。こうした断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１７の隣接するヌ
クレオチドを含む。他の態様において、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも
３０、または少なくとも６０の隣接するヌクレオチドを含む。

【０１２２】 他の哺乳動物種由来の配列番号１の相同体が本明細書に意図されるため、配列
番号１のヒトＤＮＡ配列に基づくプローブを用い、慣用的な種間（ｃｒｏｓｓ−
ｓｐｅｃｉｅｓ）ハイブリダイゼーション技術を用い、他の哺乳動物種由来のｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよい。

【０１２３】 遺伝暗号の知識を、上に示されるアミノ酸配列と組み合わせて用い、縮重オリ
ゴヌクレオチドの組を調製してもよい。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えば
ＤＮＡ断片を単離しそして増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、
プライマーとして有用である。

【０１２４】 染色体マッピング 配列番号１のすべてまたは一部は、オリゴヌクレオチドを含め、当業者により
、周知の技術を用い、ヒト染色体第５番、および他のＴＳＬＰファミリーメンバ
ーのＤＮＡを含む可能性がある、特定のその遺伝子座を同定するのに用いてもよ
い。有用な技術には、限定されるわけではないが、放射ハイブリッド（ｒａｄｉ
ａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ）マッピング（高解像度）、染色体伸展（ｓｐｒｅａ
ｄ）に対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（中程度の解像度）、およ
び個々のヒト染色体を含むハイブリッド細胞株に対するサザンブロットハイブリ
ダイゼーション（低解像度）などの、多様な周知の技術におけるプローブとして
、オリゴヌクレオチドを含む、配列または部分を使用することを含む。

【０１２５】 例えば、染色体はＰＣＲおよび放射ハイブリダイゼーションを用いることによ
りマッピングしてもよい。９３の放射ハイブリッドのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４パネルを用い、ＰＣＲを行う（ｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏ
ｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／ｒｈｍａｐ／ｇｅ
ｎｅｂｒｉｄｇｅ４．ｈｔｍｌ）。目的の遺伝子の推定上のエクソン内にあり、
イントロンに渡り、またはイントロン・エクソン断片に渡り、そしてヒトゲノム
ＤＮＡから産物を増幅するが、例えばコントロール・ハムスターゲノムＤＮＡを
増幅しないプライマーを用いる。ＰＣＲの結果をデータベクトルに変換し、イン
ターネット上のＷｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ放射マッピングサイト（ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ−ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に提出する。該データはスコア化
され、そして放射ハイブリッドマップ上の既知の配列タグ部位（ＳＴＳ）マーカ
ーに比べた染色体割り当ておよび配置が提供される。以下のウェブサイトは、放
射ハイブリッドマッピングに関し、さらなる情報を提供する： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓ
ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／
０７−９７．ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ。

【０１２６】 関連する疾患の同定 以下に示すように、ネズミ遺伝子のシンテニー解析（ｓｙｎｔｅｎｉｃ ａｎ
ａｌｙｓｉｓ）により、配列番号１は染色体第５番のｑ２１−ｑ２２領域にマッ
ピングされている。したがって、当業者は、周知の技術を用い、ガードナー症候
群、線腫様結腸ポリポーシス、遺伝性類線維腫疾患、ターコット症候群、および
結腸直腸癌を含む、ヒト染色体第５番、および特に染色体第５番のｑ２１−ｑ２
２領域に関連する異常を解析するのに、配列番号１の核酸またはその断片を用い
てもよい。これにより本マーカーが再配置または欠失されている状態を識別する
ことが可能になる。さらに、配列番号１のヌクレオチドまたはその断片は、未知
の位置の他の遺伝子をマッピングする、位置マーカーとして用いてもよい。

【０１２７】 本発明の核酸に相当する遺伝子の不全または不十分な量により（直接または間
接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのに、該ＤＮＡを用い
てもよい。天然ヌクレオチド配列の本明細書の開示により、不全遺伝子の検出、
および正常遺伝子でのその置換が可能になる。不全遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
診断アッセイにおいて、そして本明細書に開示される天然ヌクレオチド配列と、
本遺伝子に不全を宿すると疑われるヒト由来の遺伝子のものとを比較することに
より、検出してもよい。

【０１２８】 センス−アンチセンス 核酸の他の有用な断片には、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセ
ンス）配列に結合することが可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡいずれ
か）を含む、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチ
センスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明にしたがい、ＤＮＡの断片（
配列番号１）を含む。こうした断片は、一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチ
ド、好ましくは約１４ないし約３０ヌクレオチドを含む。既定のタンパク質をコ
ードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチド
を得る能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
４８：２６５９（１９８８））およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８（１９８８））に記載されている。

【０１２９】 アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、Ｒ
ＮアーゼＨによるｍＲＮＡ分解の亢進、スプライシングの阻害、転写または翻訳
の未成熟な終結、あるいは他の手段によるものを含む、いくつかの手段の１つに
より、タンパク質発現を遮断するまたは阻害する二重鎖の形成を生じる。このよ
うに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、タンパク質の発現を遮断するこ
とが可能である。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドはさらに、修飾
糖−ホスホジエステル骨格（または、ＷＯ ９１／０６６２９に記載されるもの
など、他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、そしてこのような糖結
合は内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性糖結合を持つこうしたオリゴヌクレ
オチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで安定である（すなわち酵素分解に抵抗することが可
能である）が、標的ヌクレオチド配列に結合することが可能な配列特異性を保持
する。

【０１３０】 センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ ９０／１
０４４８に記載されるものなどの有機部分、およびポリ−（Ｌ−リジン）などの
標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に共有
結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。さらに、エリプチシンなどの挿入
剤、およびアルキル化剤または金属錯体がセンスまたはアンチセンスオリゴヌク
レオチドに結合し、標的ヌクレオチド配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴ
ヌクレオチドの結合特異性を修飾してもよい。

【０１３１】 アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、リポフェクション
、ＣａＰＯ₄仲介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む
、いかなる遺伝子トランスファー法により、あるいはエプスタイン・バーウイル
スなどの遺伝子トランスファーベクターを用いることにより、標的核酸配列を含
む細胞に導入してもよい。

【０１３２】 センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ ９１／０４７５
３に記載されるように、リガンド結合分子との結合体の形成により、標的ヌクレ
オチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子には、限定さ
れるわけではないが、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細
胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分
子の結合体化は、実質的にリガンド結合分子がその対応する分子または受容体に
結合する能力に干渉せず、あるいはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドまたはその結合体型が細胞内に入るのを遮断しない。

【０１３３】 あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／１
０４４８に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、
標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センスまたはアンチセンスオリゴヌ
クレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼにより、細胞内で分離
される。

【０１３４】 ヒトＴＳＬＰポリペプチドおよび断片化ポリペプチドの使用 使用には、限定されるわけではないが、以下が含まれる： タンパク質の精製およびその活性の測定 搬送剤 療法および研究用試薬 分子量および等電点電気泳動マーカー ペプチド断片化のコントロール 未知のタンパク質の同定 抗体の調製。

【０１３５】 精製試薬 本発明のポリペプチドは、タンパク質精製試薬として使用を見出す。例えば、
該ポリペプチドは、ＴＳＬＰ結合パートナー、例えばヒトＴＳＬＰ受容体を精製
するのに用いてもよい。特定の態様において、ポリペプチド（ＴＳＬＰ受容体に
結合することが可能な、本明細書に記載されるいかなる型でもよい）を、慣用法
により固体支持体に結合させる。１つの例として、タンパク質のアミノ酸側鎖上
の官能基と反応するであろう官能基を含む、アフィニティークロマトグラフィー
カラムが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．、
ニュージャージー州ピスカタウェイ）。あるいは、ＴＳＬＰポリペプチド／Ｆｃ
タンパク質（上述のようなもの）を、Ｆｃ部分との相互作用を通じ、プロテイン
ＡまたはプロテインＧ含有クロマトグラフィーカラムに結合させる。

【０１３６】 該ポリペプチドはまた、細胞表面上にＴＳＬＰ受容体を発現する細胞を精製す
る、または同定するのに使用を見出す。ポリペプチドを、カラムクロマトグラフ
ィーマトリックスまたは同様の適切な支持体などの固相に結合させる。例えば、
磁気微小球体をポリペプチドで被覆し、そして磁気場を通じインキュベーション
容器に保持してもよい。ＴＳＬＰ受容体発現細胞を含む細胞混合物の懸濁物を、
ポリペプチドをその上に有する固相と接触させる。細胞表面上にＴＳＬＰ受容体
を発現する細胞を固定ポリペプチドに結合させ、そしてその後、非結合細胞を洗
い流す。

【０１３７】 あるいは、ポリペプチドを検出可能な部分に結合させ、その後、ＴＳＬＰ受容
体発現に関し試験しようとする細胞とインキュベーションしてもよい。インキュ
ベーション後、非結合標識成分を除去し、そして細胞上の検出可能部分の存在ま
たは非存在を測定する。

【０１３８】 さらに別の代替物において、ＴＳＬＰ受容体を含むと疑われる細胞混合物をビ
オチン化ポリペプチドとインキュベーションする。インキュベーション時間は、
十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。生じた
混合物をその後、アビジン被覆ビーズを装填したカラムに通過させ、これにより
ビオチンのアビジンに対する高い親和性が、望ましい細胞のビーズへの結合を提
供する。アビジン被覆ビーズを用いる方法が知られる（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，
Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ：２３９（１９８６）を参照さ
れたい）。非結合成分を除去するための洗浄、および結合細胞の遊離は、慣用法
を用い行う。

【０１３９】 活性測定 ポリペプチドはまた、その結合親和性に関しＴＳＬＰ受容体の生物学的活性を
測定するのにも使用を見出す。したがって、ポリペプチドは、例えば異なる条件
下でのタンパク質の貯蔵寿命および安定性をモニターするための、「品質保証」
研究を行うものにより、使用してもよい。例えば、ポリペプチドを結合親和性研
究に使用し、異なる温度で保存されている、または異なる細胞種で産生されたＴ
ＳＬＰ受容体の生物学的活性を測定してもよい。該タンパク質はまた、ＴＳＬＰ
受容体の修飾（例えば、化学的修飾、一部切除、突然変異など）後、生物学的活
性が保持されているかどうか決定するのにも用いてもよい。修飾ＴＳＬＰ受容体
の結合親和性を非修飾ＴＳＬＰ受容体のものと比較し、ＴＳＬＰ受容体の生物学
的活性に対する該修飾のいかなる不利な影響も検出する。したがって、例えばＴ
ＳＬＰ受容体の生物学的活性を、調査研究において用いる前に確認することが可
能である。

【０１４０】 搬送剤 該ポリペプチドはまた、結合する剤を、ＴＳＬＰ受容体を持つ細胞に搬送する
ためのキャリアーとしての使用も見出す。ＴＳＬＰ受容体発現細胞には、胸腺、
脾臓、腎臓、および骨髄に同定されるものが含まれる。したがって、該ポリペプ
チドを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法において、診断用剤また
は療法剤をこうした細胞に（または細胞表面上にＴＳＬＰ受容体を発現すること
が見出されている他の細胞種に）搬送してもよい。

【０１４１】 ポリペプチドに結合させてもよい検出可能な剤（診断用剤）および療法剤には
、限定されるわけではないが、毒素、他の細胞毒性剤、薬剤、放射性核種、発色
団、比色もしくは蛍光分光反応を触媒する酵素等が、意図される適用にしたがっ
て選択される特定の剤と共に含まれる。毒素の中には、リシン、アブリン、ジフ
テリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素
Ａ、リボソーム不活性化タンパク質、トリコセセンなどのマイコトキシン、並び
にそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）がある。診断使用に適した放射性
核種には、限定されるわけではないが、¹²³Ｉ、¹³¹Ｉ、^99mＴｃ、¹¹¹Ｉｎ、およ
び⁷⁶Ｂｒがある。療法使用に適した放射性核種の例には、¹³¹Ｉ、²¹¹Ａｔ、⁷⁷Ｂ
ｒ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹²Ｐｂ、²¹²Ｂｉ、¹⁰⁹Ｐｄ、⁶⁴Ｃｕ、および⁶⁷Ｃｕが
ある。

【０１４２】 こうした剤は、いかなる適切な慣用法により、ポリペプチドに結合させてもよ
い。ポリペプチドは、例えば、望ましい剤上の官能基と反応し、共有結合を形成
することが可能である、アミノ酸側鎖上の官能基を含む。あるいは、タンパク質
または剤を誘導体化し、望ましい反応性官能基を生成し、または結合させてもよ
い。誘導体化には、多様な分子をタンパク質に結合させるのに利用可能である、
二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
、イリノイ州ロックフォード）の１つの結合を伴ってもよい。タンパク質を放射
標識するためのいくつかの技術が知られる。放射性核種金属を、例えば適切な二
官能性キレート剤を用いることにより、ポリペプチドに結合させてもよい。

【０１４３】 ポリペプチドおよび適切な診断用剤または療法剤を含む（好ましくは共有結合
している）結合体をこのように調製する。特定の適用に適した量で、該結合体を
投与し、またはそうでなければ使用してもよい。

【０１４４】 療法剤 本発明のポリペプチドを、ポリペプチドの不全、または不十分な量により（直
接または間接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのに用いて
もよい。これらのポリペプチドを、こうした障害を患う哺乳動物に投与してもよ
い。

【０１４５】 ポリペプチドはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法において、Ｔ
ＳＬＰ受容体の生物学的活性を阻害するのにも使用してもよい。例えば、精製ま
たは修飾ポリペプチドまたはその断片（例えば、受容体に結合するが、情報伝達
を誘導する能力を欠く、修飾ＴＳＬＰポリペプチド）を用い、内因性ＴＳＬＰの
細胞表面受容体への結合を阻害してもよい。こうして、内因性ＴＳＬＰの受容体
への結合から生じる生物学的影響を阻害する。

【０１４６】 さらに、ＴＳＬＰ受容体ポリペプチドを哺乳動物に投与し、ＴＳＬＰ受容体が
仲介する障害を治療してもよい。こうしたＴＳＬＰ受容体仲介障害には、ＴＳＬ
Ｐ受容体により（直接または間接的に）引き起こされるまたは悪化される異常が
含まれる。

【０１４７】 本発明の組成物は、本明細書に記載されるいかなる型のポリペプチド、例えば
天然タンパク質、変異体、誘導体、オリゴマー、および生物学的に活性がある断
片を含んでもよい。特定の態様において、該組成物は、可溶性ポリペプチド、ま
たは可溶性ＴＳＬＰポリペプチドを含むオリゴマーを含む。

【０１４８】 本発明のポリペプチドの有効量を、生理学的に許容しうる希釈剤、キャリアー
、または賦形剤などの他の構成要素と組み合わせて含む組成物が、本明細書に提
供される。薬学的に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたが
い、ポリペプチドを処方してもよい。これらは、単一の活性成分として、または
既定の徴候に適した他の既知の活性成分と共に、薬学的に許容しうる希釈剤（例
えば、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、およびリン酸緩衝液）、保存剤（
例えば、チメロサル、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、
アジュバントおよび／またはキャリアーと混合して組み合わせてもよい。薬剤組
成物に適した処方には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１６版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ， ペンシルバニア州イーストン（１９８０）に記載されるものが含
まれる。

【０１４９】 さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオン
と複合体化していてもよく、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、
デキストランなどのポリマー化合物に取り込まれていてもよく、またはリポソー
ム、微小乳剤、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェ
ロブラストに取り込まれていてもよい。こうした組成物は、物理的状態、可溶性
、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に
影響を与えるであろうし、そしてしたがって意図される適用にしたがい、選択さ
れる。

【０１５０】 本発明の組成物は、例えば局所、非経口、または吸入によるなど、いかなる適
切な方式で、投与してもよい。「非経口」という用語には、例えば皮下、静脈内
、または筋内経路による注射が含まれ、また例えば疾患または損傷の部位での局
所化投与も含まれる。移植物からの持続放出もまた、意図される。当業者は、適
切な投薬量が、治療しようとする障害の性質、患者の体重、年齢、および全身状
態、並びに投与経路などの要因に応じ、多様であろうことを認識するであろう。
予備的用量は動物試験にしたがい決定してもよく、そしてヒト投与のための投薬
量の見積もりを、当該技術分野に認められる実施にしたがい、行う。

【０１５１】 生理学的に許容しうる処方中の核酸を含む組成物もまた、意図される。ＤＮＡ
は、例えば注射のため処方してもよい。

【０１５２】 研究用剤 本発明のポリペプチドの別の使用は、異なる細胞種上のＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ受
容体相互作用を阻害することから生じる生物学的影響を研究するための研究ツー
ルとしての使用である。ポリペプチドはまた、ＴＳＬＰまたはＴＳＬＰ受容体あ
るいはそれらの相互作用を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに使用して
もよい。

【０１５３】 本発明の別の態様は、Ｂ細胞またはＴ細胞情報伝達を研究するためのヒトＴＳ
ＬＰの使用に関する。ヒトＴＳＬＰおよび他のサイトカインは、細胞シグナルを
伝達し、細胞を刺激しサイトカインを分泌させ、そしてＢ細胞およびＴ細胞増殖
を誘導することを含め、Ｂ細胞およびＴ細胞発生、並びに免疫反応に中心的な役
割を果たす。こうしたものとして、ＴＳＬＰの発現および／または活性化におけ
る改変は、限定されるわけではないが、細胞特異的反応および増殖の活性化また
は阻害を含む、多くの細胞過程に激しい影響を有する可能性がある。クローン化
ＴＳＬＰまたはＴＳＬＰの触媒的に不活性な突然変異体の発現は、特定のタンパ
ク質が特定の情報伝達事象を仲介するのに果たす役割を同定するために用いられ
てきている。

【０１５４】 細胞情報伝達は、しばしば、分子活性化カスケードを伴い、該カスケード中、
受容体が、標的基質をリン酸化する細胞内キナーゼを特異的に活性化することに
より、リガンド−受容体仲介シグナルを伝達する。これらの基質は、それ自体キ
ナーゼであってもよく、該基質がリン酸化後活性化されてもよい。あるいは、該
基質は、リン酸化後、タンパク質−タンパク質相互作用を通じ、下流情報伝達を
容易にするアダプター分子であってもよい。基質分子の性質に関係なく、発現さ
れたＴＳＬＰリガンド受容体の触媒的に活性である型を用い、ＴＳＬＰリガンド
受容体により、どの基質が認識されそして活性化されるか同定してもよい。この
ようなものとして、これらの新規ＴＳＬＰ受容体は、情報伝達経路に関与する新
規分子を同定する試薬として用いてもよい。

【０１５５】 さらに、ＴＳＬＰを用い、当業者により、Ｂ細胞系譜およびＴ細胞系譜細胞増
殖を刺激する周知の技術（Ｒａｙら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
２６、 １０−１６（１９９６）およびＮａｍｉｋａｗａら， Ｂｌｏｏｄ
８７：１８８１−１８９０（１９９６））を用い、ヒトＴＳＬＰ受容体を発現ク
ローニング（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｅ）し（Ｓｉｍｓら， Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４１：５８５−５８９（１９８８））、関連タンパク質をクローニン
グし（Ｋｏｚｌｏｓｋｙら， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９：５４０−５４９（１９９
７）およびＬｙｍａｎら， Ｂｌｏｏｄ １０：２７９５−２８０１（１９９４
））、そして細胞をｅｘ ｖｉｖｏ拡大し（Ｐｉａｃｉｂｅｌｌｏら， Ｂｌｏ
ｏｄ ８９：２６４４−２６５３（１９９７））てもよい。

【０１５６】 その使用 したがって、本発明は、ＢおよびＴリンパ球増殖を刺激する方法であって、ヒ
トＴＳＬＰとリンパ球をインキュベーションすることを含む前記方法を含む。さ
らなる態様において、該方法は、ヒトＴＳＬＰおよび少なくとも１つの他のサイ
トカインとリンパ球を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベー
ションすることを含む。好ましくは、サイトカインは、ＩＬ−７、スチール因子
、幹細胞因子、マスト細胞増殖因子またはｆｌｔ３リガンドの群より選択される
。より好ましくは、サイトカインはＩＬ−７である。

【０１５７】 本発明はまた、リンパ球発生またはリンパ球新生を刺激する方法であって、ヒ
トＴＳＬＰと、前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、例えば骨髄由来
単核細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションする
ことを含む、前記方法も含む。さらなる態様において、該方法は、ヒトＴＳＬＰ
および少なくとも１つの他のサイトカインとリンパ球をインキュベーションする
ことを含む。好ましくは、サイトカインは、ＩＬ−７、スチール因子、幹細胞因
子、マスト細胞増殖因子またはｆｌｔ３リガンドの群より選択される。より好ま
しくは、サイトカインはＩＬ−７である。

【０１５８】 分子量および等電点マーカー 本発明のポリペプチドは、化学的および酵素的手段により、より小さいペプチ
ドへの断片化に供してもよく、そしてこうして産生されたペプチド断片を、他の
タンパク質またはポリペプチドの解析に用いてもよい。例えば、こうしたペプチ
ド断片を、ペプチド分子量マーカー、ペプチド等電点マーカーとして、またはペ
プチド断片化の度合いの解析において、用いてもよい。したがって、本発明はま
た、これらのポリペプチドおよびペプチド断片並びに、未知のタンパク質の見か
けの分子量および等電点の決定を援助するキット、および未知のタンパク質の断
片化の度合いを評価するキットも含む。

【０１５９】 断片化の方法すべてが本発明に含まれるが、化学的断片化が好ましい態様であ
り、そして特異的な切断がメチオニン残基で起こるように、中性または酸性条件
下で切断する臭化シアンの使用が含まれる（Ｅ． Ｇｒｏｓｓ， Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚ． １１：２３８−２５５（１９６７））。これは、システイ
ン残基を非反応種に変換するカルボキシメチル化段階などのさらなる段階を、さ
らに含んでもよい。

【０１６０】 酵素的断片化には、アスパラギン・エンドペプチダーゼ、アルギニン・エンド
ペプチダーゼ、アクロモバクター・プロテアーゼＩ、トリプシン、黄色ブドウ球
菌（Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ、エンドプ
ロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、またはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃなどのプロテ
アーゼの、特定のアミノ酸残基での切断を生じる慣用的な条件下での使用が含ま
れる。アスパラギン・エンドペプチダーゼは、本発明のポリペプチド内に存在す
るアスパラギン残基のカルボキシル側を特異的に切断することが可能である。ア
ルギニン・エンドペプチダーゼは、これらのペプチド内に存在するアルギニン残
基のカルボキシル側を特異的に切断することが可能である。アクロモバクター・
プロテアーゼＩは、該ポリペプチド内に存在するリジン残基のカルボキシル側を
特異的に切断することが可能である（ＳａｋｉｙａｍａおよびＮａｋａｔ、米国
特許第５，２４８，５９９号；Ｔ． Ｍａｓａｋｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６６０：４４−５０（１９８１）；Ｔ． Ｍａｓａ
ｋｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６６０：５１−５
５（１９８１））。トリプシンは、本発明のポリペプチド内に存在するアルギニ
ンおよびリジン残基のカルボキシル側を特異的に切断することが可能である。酵
素的断片化はまた、多数のアミノ酸残基で切断するプロテアーゼでも起こる可能
性がある。例えば、黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼは、ポリペプチド内に存在
するアスパラギン酸およびグルタミン酸残基のカルボキシル側を特異的に切断す
ることが可能である（Ｄ． Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ３：１１０２−１１０６（１９７７））。エンドプロテイナーゼＡ
ｓｐ−Ｎは、ポリペプチド内に存在するアスパラギン残基のアミノ側を特異的に
切断することが可能である。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃは、本発明のポリ
ペプチド内に存在するリジン残基のカルボキシル側を特異的に切断することが可
能である。他の酵素的および化学的処理を、同様に用い、これらのポリペプチド
を特定のペプチドの特有の組に断片化してもよい。

【０１６１】 もちろん、本発明のペプチドおよびポリペプチドの断片はまた、当該技術分野
に周知の慣用的な組換え法および合成法により産生してもよい。組換え法に関し
、本発明に含まれるポリペプチドおよびペプチド断片は、これらが発現される宿
主細胞に応じ、多様な分子量を有する可能性がある。多様な細胞種における本発
明のポリペプチドおよびペプチド断片の糖鎖付加は、修飾の度合いに応じ、これ
らの片（ｐｉｅｃｅ）の分子量の変動を生じる可能性がある。これらの片の大き
さは、該ポリペプチドの細胞外部分由来のポリペプチド断片で最も雑多である可
能性がある。一貫したポリペプチドおよびペプチド断片は、完全に膜貫通および
細胞質領域由来のポリペプチドを用いる、Ｎ−グリカナーゼで前処理し、糖鎖付
加を除く、または細菌宿主でポリペプチドを発現させることにより、得ることが
可能である。

【０１６２】 これらのポリペプチドの分子量はまた、本発明のポリペプチドのアミノおよび
カルボキシル末端両方に、さらなるペプチド配列を融合させることにより、変化
させてもよい。本発明のポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端でのさら
なるペプチド配列の融合を用い、これらのポリペプチドの発現を亢進し、または
該タンパク質の精製を援助してもよい。さらに、本発明のポリペプチドのアミノ
およびカルボキシル末端でのさらなるペプチド配列の融合は、酵素的または化学
的処理により生成されるポリペプチドの断片化ペプチドを、通常すべてではない
がいくつか、改変するであろう。もちろん、分子生物学の日常的でそして既知の
技術を用い、本発明のポリペプチドに、突然変異を導入してもよい。例えば、特
定の酵素によるタンパク質分解切断の部位または特定の化学的に誘導される断片
化法による切断の部位を除去するように、突然変異を設計してもよい。該部位の
除去は、特定の酵素または化学的方法での断片化に際し、本発明のポリペプチド
のペプチドフィンガープリントを改変するであろう。

【０１６３】 ポリペプチドおよび生じた断片化ペプチドは、沈降、電気泳動、クロマトグラ
フィー、および質量分析を含む方法により解析し、それらの分子量を決定しても
よい。各片の特有のアミノ酸配列が分子量を特定するため、これらの片はその後
、未知のタンパク質、ポリペプチドまたはその断片の分子量決定を援助するこう
した解析技術を用い、分子量マーカーとして利用することが可能である。本発明
の分子量マーカーは、同様の見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子
量概算のための分子量マーカーとして特によく働き、そしてその結果、タンパク
質の見かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能になる。

【０１６４】 本発明が断片化ペプチド分子量マーカーの使用に関する場合、これらのマーカ
ーは、好ましくは大きさが少なくとも１０アミノ酸である。より好ましくは、こ
れらの断片化ペプチド分子量マーカーは、大きさが１０および１００アミノ酸の
間である。さらにより好ましいのは、大きさが１０および５０アミノ酸の間の断
片化ペプチド分子量マーカーであり、そして特に大きさが１０および３５アミノ
酸の間のものである。最も好ましいのは、大きさが１０および２０アミノ酸の間
の断片化ペプチド分子量マーカーである。

【０１６５】 分子量測定法の中に、沈降、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、および質量
分析がある。特に好ましい態様は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕ．
Ｋ． Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９７０）
）である。慣用的には、該方法は、ドデシル硫酸ナトリウムおよび６−２０％の
間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個のレーンを用いる。マーカー
および試料を、同一の条件下で同時に分離する能力により、正確さを増加させる
ことが可能になる。もちろん、本発明のポリペプチドを用いた未知のタンパク質
の分子量測定には、多くの異なる技術を用いてもよく、そして本態様はいかなる
点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。

【０１６６】 各非糖鎖付加ポリペプチドまたはその断片は、その特有のアミノ酸配列により
本質的に決定されるｐＩを有する（このｐＩは、当業者により、現在利用可能な
ｐＩ値を予測するよう設計されたいかなるコンピュータープログラムを用い概算
しても、いかなる周知のアミノ酸ｐＫａ表を用い計算しても、または実験により
測定してもよい）。したがって、これらのポリペプチドおよびその断片は、等電
点電気泳動などの技術を用い、未知のタンパク質、ポリペプチド、または断片化
ペプチドの等電点測定を援助する、特定のマーカーとして利用することが可能で
ある。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーは、本発明のポリペ
プチドまたは断片化ペプチドマーカーのものと近い見かけの等電点を有する未知
のタンパク質の見かけの等電点概算に、特によく働く。

【０１６７】 等電点電気泳動技術は、さらに、ゲル電気泳動などの他の技術と組み合わせ、
分子量および電荷に基づき、タンパク質を同時に分離してもよい。これらのポリ
ペプチドまたは断片化ペプチドマーカーおよび未知のタンパク質を、同一の条件
下で同時に分離する能力により、未知のタンパク質の見かけの等電点測定の正確
さを増加させることが可能になる。これは、方法の性質が、いかなるマーカーも
未知のタンパク質と同時に分離されることを指令する、二次元電気泳動（Ｔ．Ｄ
． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ７６−７７， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，
第６版（１９９１））などの技術に特有の目的である。さらに、こうした方法を
用い、これらのポリペプチドおよびその断片化ペプチドは、未知のタンパク質ま
たは断片化ペプチドの等電点および分子量両方の測定を援助することが可能であ
る。

【０１６８】 ポリペプチドおよび断片化ペプチドは、未知のタンパク質および分子量マーカ
ー間の区別を可能にする２つの異なる方法を用い、視覚化してもよい。１つの態
様において、本発明のポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーは、こ
れらのマーカーに対して生成された抗体および慣用的なイムノブロッティング技
術を用い、視覚化してもよい。本検出は、未知のタンパク質の検出を生じない慣
用的な条件下で行われる。小さなペプチドは免疫原性エピトープを含まない可能
性があるため、本発明のすべてのポリペプチド断片に対する抗体を生成すること
は不可能である可能性があることが理解される。さらに、本アッセイにおいて、
すべての抗体が働くわけではないであろうことが理解される；が、本発明のポリ
ペプチドおよび断片に結合することが可能な抗体は、慣用的技術を用い、容易に
決定することが可能である。

【０１６９】 未知のタンパク質もまた、慣用的染色法を用い、視覚化する。本発明のポリペ
プチドまたは断片ペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質のモル過剰
は、慣用的な染色法が、主に未知のタンパク質を検出する程度である。これらの
ポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーレベルは、慣用的染色法によ
り、これらのマーカーがほとんどまたはまったく検出されない程度である。本発
明のポリペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好ましいモル過剰
は、２および１００，０００倍の間である。より好ましくは、これらのポリペプ
チド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好ましいモル過剰は、１０およ
び１０，０００倍の間であり、そして特に１００および１，０００倍の間である
。

【０１７０】 もちろん、これらのポリペプチド分子量マーカーおよびそのペプチド断片を用
いた未知のタンパク質、ポリペプチド、およびその断片化ペプチドの分子量およ
び等電点の測定および検出に、多くの技術を用いてもよく、そしてこれらの態様
はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。

【０１７１】 別の態様において、例えば断片化反応の時間または温度を改変することによる
、本発明のポリペプチドの特定のペプチドへの進行性断片化の解析（Ｄ．Ｗ．
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−
１１０６（１９７７））を、未知のタンパク質の切断の度合いのコントロールと
して用いてもよい。例えば、同量のポリペプチドおよび未知のタンパク質の、同
一の条件下での切断により、断片化の度合いの直接比較が可能になる。ポリペプ
チドの完全な断片化を生じる条件はまた、未知のタンパク質の完全な断片化をも
生じる可能性がある。

【０１７２】 分子量マーカーとしての本発明のポリペプチドおよび断片化ペプチドの特定の
使用に関しては、臭化シアンを用いた配列番号２のポリペプチドの断片化は、断
片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生じる。メチオニン残基の分布が各ペ
プチドのアミノ酸数を決定し、そして各ペプチドの特有のアミノ酸組成がその分
子量を決定する。

【０１７３】 さらに、本発明の好ましい精製ポリペプチド（配列番号２）は、およそ２１，
０００ダルトンの観察分子量を有する。 損なわれていないタンパク質を用いる場合、これらのポリペプチド分子量マー
カーの使用は、２１，０００ダルトンに近い見かけの分子量を有するタンパク質
の見かけの分子量の決定の正確さの増加を可能にする。断片を用いる場合、断片
の分子量の範囲にわたる分子量決定の正確さが増加する。

【０１７４】 最後に、本発明に含まれるキットに関しては、こうしたキットの構成要素は、
多様である可能性があるが、典型的には、ポリペプチドおよび断片化ペプチド分
子量マーカーを含む。また、こうしたキットは、断片化に必要な部位が除去され
ているポリペプチドを含んでもよい。さらに、キットは、ポリペプチドおよび未
知のタンパク質の化学的または酵素的切断による、特異的切断のための試薬を含
んでもよい。キットはさらに、本発明のポリペプチドまたはその断片に対して向
けられる抗体を含んでもよい。

【０１７５】 未知のタンパク質の同定 上述のように、ポリペプチドまたはペプチドフィンガープリントを、既知のタ
ンパク質のデータベースに入力しまたは該データベースと比較し、質量分析を用
いた未知のタンパク質の同定を補助してもよい（Ｗ．Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５
０１５（１９９３）；Ｄ． Ｆｅｎｙｏら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
１９：９９８−１００５（１９９８））。これらの比較を容易にする多様なコ
ンピューターソフトウェアプログラム、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃ
ｔｏｒ（インターネットサイト：ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓｃｆ．ｅｄｕ）、
ＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／
ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ
（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒ
ｇ．ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ Ｆｏｒ
ｍ．ｈｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃ
ｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏ
ｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）などが、インターネットを介し利用可能である
。これらのプログラムは、使用者が切断剤および指示された許容範囲の断片化ペ
プチドの分子量を特定するのを可能にする。該プログラムは、未知のタンパク質
の同定の決定を援助するため、これらの分子量をタンパク質データベースと比較
する。

【０１７６】 さらに、タンデム型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を用い、ポリペプチドまたはペ
プチド消化物を配列決定し、そして生じた配列をデータベースに対し検索しても
よい（Ｊ．Ｋ． Ｅｎｇら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．
５：９７６−９８９（１９９４）；Ｍ． ＭａｎｎおよびＭ． Ｗｉｌｍ，
Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６：４３９０−４３９９（１９９４）；Ｊ．Ａ．
ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍ
ａｓｓ Ｓｐｅｃ． １１：１０６７−１０７５（１９９７））。本方法に用い
てもよい検索プログラムは、Ｌｕｔｅｆｉｓｋ ９７（インターネットサイト：
ｗｗｗ．ｌｓｂｃ．ｃｏｍ：７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７．ｈｔｍｌ）、並びに
上述のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ
およびＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムなど、インターネット上に存在する。したが
って、遺伝子配列並びにその予測されるタンパク質配列およびペプチド断片を配
列データベースに添加することにより、タンデム型質量分析を用いた未知のタン
パク質の同定を援助することが可能である。

【０１７７】 抗体 本発明のポリペプチドに免疫反応性である抗体が本明細書に提供される。こう
した抗体は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介し、該ポリペ
プチドに特異的に結合する。したがって、上述のようなポリペプチド、断片、変
異体、融合タンパク質などを、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免
疫原」として使用してもよい。より詳細には、ポリペプチド、断片、変異体、融
合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含む。

【０１７８】 これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもコンホメーション性（ｃｏ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。直鎖エピトープは
、該ポリペプチドのアミノ酸の単一の部分から構成されるが、コンホメーション
性または断続的エピトープは、タンパク質フォールディングに際し接近する、ポ
リペプチド鎖の異なる領域由来のアミノ酸部分から構成される（Ｃ．Ａ． Ｊａ
ｎｅｗａｙ， Ｊｒ．およびＰ． Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ３：９， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， 第２
版（１９９６））。フォールディングされたタンパク質は、複雑な表面を有する
ため、利用可能なエピトープの数は非常に多い；が、タンパク質のコンホメーシ
ョンおよび立体障害のため、実際にエピトープに結合する抗体の数は、利用可能
なエピトープの数より少ない（Ｃ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ， Ｊｒ．およびＰ．
Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１４， Ｇａｒｌａ
ｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， 第２版（１９９６））。エピトープ
は、当該技術分野に知られるいかなる手段により同定してもよい。

【０１７９】 したがって、本発明の１つの側面は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトー
プに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体
、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のポリペ
プチド由来のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル血清また
は培養ハイブリドーマ由来の上清などの材料から特異的に結合する抗体を精製す
る研究試薬として用いてもよい。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相
合成、ポリペプチドの化学的または酵素的切断などの、当該技術分野に周知の技
術を用い、あるいは組換えＤＮＡ技術を用い、産生してもよい。

【０１８０】 本発明のポリペプチドのエピトープにより引き出される可能性がある抗体に関
しては、エピトープが単離されていてもまたはポリペプチドの一部のままであっ
ても、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術により
調製することが可能である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ． Ｋｅｎｎｅｔら（監修）， Ｐｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８０）； およびＡｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＨａｒｌｏｗおよびＬａ
ｎｄ（監修）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を
参照されたい。

【０１８１】 本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技
術により産生しそして同定してもよい。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生す
るための１つの方法は、動物をポリペプチドで免疫感作し；免疫感作された動物
から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハ
イブリドーマ細胞を生成し；そして該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体
は、慣用的技術により回収してもよい。

【０１８２】 本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナ
ル抗体のヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既
知の技術により調製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少と
いう利点を提供してもよい。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は
、ネズミ抗体の可変部（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定
常部を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結
合部位およびヒト抗体由来の可変部断片（抗原結合部位を欠く）を含んでもよい
。キメラおよび工学技術で作成されるさらなるモノクローナル抗体の産生法には
、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８））、 Ｌ
ｉｕら（ＰＮＡＳ ８４：３４３９（１９８７））、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４（１９８９））、およびＷｉｎｔｅｒおよ
びＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９（Ｍａｙ １９９３））に記載される
ものが含まれる。導入遺伝子的に抗体を生成する方法は、ＧＢ ２，２７２，４
４０、米国特許第５，５６９，８２５号および５，５４５，８０６号並びにそれ
らから優先権を請求する関連特許に見出すことが可能であり、該特許はすべて本
明細書に援用される。

【０１８３】 慣用的技術により産生されてもよい、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含
まれる。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（
ａｂ’）₂断片が含まれる。遺伝子工学技術により産生される抗体断片および誘
導体もまた提供される。

【０１８４】 １つの態様において、抗体は本発明のポリペプチドに特異的であり、そして他
のタンパク質と交差反応しない。こうした抗体を同定することが可能なスクリー
ニング法が周知であり、そして例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィー
を伴ってもよい。

【０１８５】 抗体の使用 本発明の抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、本発明のポリペ
プチドまたは断片の存在を検出するアッセイにおいて用いてもよい。抗体はまた
、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより本発明のポリペプチドまたは断
片を精製するのに使用してもよい。

【０１８６】 さらに本発明のポリペプチドのＴＳＬＰ受容体への結合を遮断することが可能
な、これらの抗体を用い、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害してもよ
い。こうした遮断抗体は、ＴＳＬＰ受容体を発現している特定の細胞へのＴＳＬ
Ｐの結合を阻害する能力に関し、抗体を試験することによるなど、いかなる適切
なアッセイ法を用い、同定してもよい。こうした細胞の例は、ＢおよびＴリンパ
球細胞株、それぞれ７０Ｚ／３および７Ｂ９である。あるいは、遮断抗体は、Ｔ
ＳＬＰの標的細胞上のＴＳＬＰ受容体への結合から生じる生物学的影響を阻害す
る能力に関するアッセイにおいて同定してもよい。抗体は、例えば、ＴＳＬＰ受
容体発現細胞の、ＴＳＬＰ仲介溶解を阻害する能力に関しアッセイしてもよい。

【０１８７】 こうした抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法で使用し、またはｉｎ ｖｉｖｏで投与
し、抗体を生成した実体により仲介される生物学的活性を阻害してもよい。この
ように、ＴＳＬＰと細胞表面ＴＳＬＰ受容体との相互作用により、（直接または
間接的に）引き起こされるまたは悪化される障害を治療してもよい。療法は、Ｔ
ＳＬＰ仲介生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ
ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクロ
ーナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。

【０１８８】 抗体は、アゴニスト性（すなわちリガンド模倣性）特性に関しスクリーニング
してもよい。こうした抗体は、細胞表面ＴＳＬＰ受容体への結合に際し、ＴＳＬ
Ｐが細胞表面ＴＳＬＰ受容体に結合する際に誘導される生物学的影響と同様の生
物学的影響（例えば生物学的シグナルの伝達）を誘導する。アゴニスト性抗体を
用い、Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系譜細胞増殖を誘導してもよい。

【０１８９】 ヒトＴＳＬＰに対して向けられる抗体、および生理学的に許容しうる希釈剤、
賦形剤、またはキャリアーを含む組成物が、本明細書に提供される。こうした組
成物の適切な構成要素は、ヒトＴＳＬＰタンパク質を含む組成物に関し、上述さ
れた通りである。

【０１９０】 やはり本明細書に提供されるのは、抗体に結合している検出可能（例えば診断
用剤）または療法剤を含む結合体である。こうした剤の例は、上に示される。該
結合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法に使用を見出す。

【０１９１】 以下の実施例は、本発明の特定の態様をさらに例示するため提供され、そして
本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。

【０１９２】

【実施例】

実施例１：核酸の単離 ヒトＴＳＬＰ核酸配列は、ＥＳＴ ＩＭＡＧＥクローン１４０７２６０、寄託
番号ＡＡ８８９５８１を配列決定することにより、得た。ネズミＴＳＬＰ配列と
の比較により、本配列は、ＥＳＴクローンが部分的クローンであることを示唆し
た。内部プライマーを用い、いくつかのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、ＴＳＬＰ ｃＤＮＡクローンの失われている３’端を得るために用いること
が可能なｃＤＮＡの供給源を決定した。ヒトＴＳＬＰ配列の２つの内部プライマ
ーを用いた６０サイクルのＰＣＲの後、以下のｃＤＮＡライブラリーがＴＳＬＰ
配列に関し陽性であった：ヒト精巣、ヒト包皮線維芽細胞、および胎児脳（弱陽
性）；一方、全ＭｏＴ、ＨＳ４３１、骨髄、ＨＰＴ４、ＨＢＴ３、Ｗ１２６、Ｈ
ｕｔ１０２、ＰＢＴ、Ｓｋ Ｈｅｐ、ヒト真皮線維芽細胞、Ｒａｊｉ、ヒト胎盤
、およびＫＢライブラリーはすべて陰性であった。

【０１９３】 内部ＴＳＬＰプライマーおよびλｇｔ１０ベクタープライマーを用いた、ヒト
精巣λｇｔ１０ライブラリーに対するＰＣＲを用い、内部ヒトＴＳＬＰ配列と同
一の配列を持つ２つのクローン（１９Ｅおよび１９Ｆ）を単離した。両クローン
は同一の５’端を有したが、異なる長さの３’端を有した。クローン１９Ｅのコ
ード配列及び非コード配列は、クローン１９Ｆと同一であり；これらのクローン
は、３’非コード領域の長さが異なり、クローン１９Ｆは１９Ｅより、約３４
ｂｐ長かった。したがって、１９Ｆ由来の配列を用い、ヒトＴＳＬＰタンパク質
の３’コード領域配列を完成させた。これにより、ＥＳＴに存在しないＣ−末端
１５アミノ酸の同定が可能になった。ＰＣＲは慣用法にしたがい、行った。

【０１９４】 実施例２：ＴＳＬＰポリペプチドの精製 ＴＳＬＰ特異的ＥＬＩＳＡ： ＴＳＬＰ含有試料の連続希釈（ＮａＯＨでｐＨ ９にした５０ ｍＭ ＮａＨ
ＣＯ₃中）で、Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｅｒｔｅｋ ９６ウェル平底Ｅ．Ｉ．Ａ．
マイクロタイトレーションプレート（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ
．、オハイオ州オーロラ）を、１００：１／ウェルで被覆する。４℃で１６時間
インキュベーションした後、２００：１の０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む
ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）でウェルを６回洗浄する。その後、５％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ）を含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１μｇ／ｍｌのＦＬＡＧ（登録商
標）−ＴＳＬＰ受容体と、ウェルを９０分間インキュベーションし（ウェル当た
り１００：１）、その後、上述のように洗浄する。次に、各ウェルを、抗ＦＬＡ
Ｇ（登録商標）（５％ ＦＣＳを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１μｇ／ｍｌのモ
ノクローナル抗体Ｍ２）と、ウェルを９０分間インキュベーションし（ウェル当
たり１００：１）、その後、上述のように洗浄する。続いて、ポリクローナルヤ
ギ抗ｍＩｇＧ１特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体（５％ ＦＣＳを含
むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、商業的ストックの１：５０００希釈）と、ウェルを９
０分間インキュベーションする（ウェル当たり１００：１）。ＨＲＰ結合抗体は
、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，
Ｉｎｃ．、アラバマ州バーミンガムから得る。その後、ウェルを上述のように６
回洗浄する。

【０１９５】 ＥＬＩＳＡの発色（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）のため、基質混合物［ＴＭＢペ
ルオキシダーゼ基質およびペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ Ｐ
ｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）の１
：１プレミックスのウェル当たり１００：１］をウェルに添加する。十分な呈色
反応後、２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄の添加（ウェル当たり５０：１）により、酵素反応を終
結させる。呈色強度（ＴＳＬＰ−ＴＳＬＰ受容体結合を示す）は、Ｖ Ｍａｘプ
レート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州
サニーベール）上で、４５０ｎｍの消光を測定することにより、決定する。

【０１９６】 実施例３：アミノ酸配列 ヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列は、完全ヒトＴＳＬＰヌクレオチド配列の翻訳に
より、決定した。選択された読み枠は、ヒトＴＳＬＰとネズミＴＳＬＰの相同性
に基づいた。

【０１９７】 実施例４：ＤＮＡおよびアミノ酸配列 ヒトＴＳＬＰ核酸配列は、ＥＳＴ ＩＭＡＧＥクローン１４０７２６０、寄託
番号ＡＡ８８９５８１、およびクローン１９Ｆ由来のさらなる３’配列の合成配
列の標準的二本鎖配列決定により、決定した。

【０１９８】 単離ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれによりコードされる
アミノ酸配列は、配列番号１および２に示される。ＰＣＲにより単離された全ヒ
トＴＳＬＰ ＤＮＡ断片の配列は、配列番号１のヌクレオチド１ないし７６７に
相当し、該配列は配列番号２のアミノ酸１ないし１５９をコードする。

【０１９９】 配列番号２のアミノ酸配列は、ネズミＴＳＬＰに有意な類似性（４９％）およ
び同一性（４３％）を持ち、そしてＩＬ−７に弱い相同性を持つ。

【０２００】 実施例５：ＴＳＬＰに結合するモノクローナル抗体 本実施例は、ＴＳＬＰに結合するモノクローナル抗体を調製するための方法を
例示する。こうした抗体を生成するのに使用してもよい適切な免疫原には、限定
されるわけではないが、精製ヒトＴＳＬＰポリペプチドまたはその免疫原性断片
、例えば細胞外ドメイン、またはヒトＴＳＬＰを含む融合タンパク質（例えば可
溶性ＴＳＬＰ／Ｆｃ融合タンパク質）が含まれる。

【０２０１】 精製ヒトＴＳＬＰを用い、慣用的な技術、例えば、米国特許第４，４１１，９
９３号に記載される技術を用い、ＴＳＬＰに免疫反応性であるモノクローナル抗
体を生成してもよい。簡潔には、ヒトＴＳＬＰ免疫原を完全フロイントアジュバ
ント中に乳化し、そして１０−１００μｇの範囲の量を皮下または腹腔内注射し
て、マウスを免疫する。１０ないし１２日後、不完全フロイントアジュバント中
に乳化したさらなるヒトＴＳＬＰで、免疫動物に追加免疫する。その後、毎週な
いし隔週の免疫スケジュールで、マウスに定期的に追加免疫する。後眼窩出血ま
たは尾先端切除により、血清試料を定期的に採取し、ドットブロットアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）またはＴＳＬＰ受容体結合の阻害によ
り、ＴＳＬＰ抗体に関し試験する。

【０２０２】 適切な抗体力価の検出後、陽性動物に最後に一度、生理食塩水中のヒトＴＳＬ
Ｐを静脈内注射する。３から４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、そして
脾臓細胞をネズミ骨髄腫細胞株、例えばＮＳ１または好ましくはｐ３ｘ６３Ａｇ
８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）に融合させる。融合によりハイブリ
ドーマ細胞が生成され、これを非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細
胞ハイブリッドの増殖を阻害するため、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、およびチミジン）選択培地中、多重マイクロタイタープレート中に蒔く。

【０２０３】 ハイブリドーマ細胞をＥｎｇｖａｌｌら， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ． ８：８
７１（１９７１）および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術を適
合させることにより、精製ＴＳＬＰに対する反応性に関し、ＥＬＩＳＡによりス
クリーニングする。好ましいスクリーニング技術はＢｅｃｋｍａｎｎら（Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４：４２１２（１９９０））に記載される抗体捕捉技術
である。陽性ハイブリドーマ細胞を、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射し、
高濃度の抗ＴＳＬＰモノクローナル抗体を含む腹水を産生してもよい。あるいは
、ハイブリドーマ細胞を、多様な技術によりフラスコまたは回転ビン（ｒｏｌｌ
ｅｒ ｂｏｔｔｌｅ）中でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させてもよい。マウス腹水中
に産生されたモノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈澱に続くゲル排除クロ
マトグラフィーにより精製してもよい。あるいは、抗体がプロテインＡまたはプ
ロテインＧに結合することに基づくアフィニティークロマトグラフィーもまた用
いてもよく、ＴＳＬＰに結合することに基づくアフィニティークロマトグラフィ
ーも用いてもよい。

【０２０４】 実施例６：ノーザンブロット解析 ヒトＴＳＬＰ ｍＲＮＡの組織分布を、以下のように、ノーザンブロット解析
により調べた。放射標識プローブのアリコットを、２つの異なるヒト多数組織ノ
ーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト；Ｂｉｏｃｈ
ａｉｎ、カリフォルニア州パロアルト）に添加した。ブロットを、１０ Ｘ Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔｓ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、９００ ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、０．１％ ピロリン酸Ｎａ、１％ ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ サケ精子
ＤＮＡ中でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、先に記載されるよ
うに（Ｍａｒｃｈら， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６４１−６４７（１９８５））
、５０％ホルムアミドで、６３℃で一晩行った。その後、ブロットを、２ ｘ
ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで、６８℃で３０分間、洗浄した。

【０２０５】 １．４キロ塩基（ｋｂ）の単一の転写物が、心臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、
膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸に存在した。陰性組織は、
脳、胎盤、および末梢血白血球であった。ＴＳＬＰ ｍＲＮＡが最も高いレベル
の細胞および組織は、β−アクチン特異的プローブで探査した（ｐｒｏｂｅ）コ
ントロールとの比較により示されるように、心臓、肝臓、前立腺、および精巣で
ある。

【０２０６】 実施例７：結合アッセイ 全長ヒトＴＳＬＰを発現させ、そしてＴＳＬＰ受容体に結合する能力に関し、
試験してもよい。結合アッセイは、以下のように行うことが可能である。

【０２０７】 本アッセイでは、可溶性ヒトＴＳＬＰポリペプチドのＮ−末端に融合している
ロイシンジッパーペプチドを含む融合タンパク質（ＬＺ−ＴＳＬＰ）を使用する
。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドをコードするＤＮＡを、三量体化を可能にする
修飾ロイシンジッパーをコードする配列と置き換えた以外は、本質的に、本明細
書に援用されるＷｉｌｅｙら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ３：６７３−６８２（１９
９５））において、ＦＬＡＧ（登録商標）（ＴＳＬＰ）発現構築物を調製するた
めに記載されるように、発現構築物を調製する。発現ベクターｐＤＣ４０９中の
該構築物は、ヒト・サイトメガロウイルス由来のリーダー配列に続き、可溶性ヒ
トＴＳＬＰポリペプチドのＮ−末端に融合しているロイシンジッパー部分をコー
ドする。ＬＺ−ＴＳＬＰをＣＨＯ細胞中で発現させ、そして培養上清から精製す
る。

【０２０８】 ｐＤＣ４０９と称される発現ベクターは、本明細書に援用される、ＭｃＭａｈ
ａｎら， ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１−２８３２（１９９１）に記載され
るｐＤＣ４０６ベクター由来の哺乳動物発現ベクターである。（ｐＤＣ４０６と
比較し）ｐＤＣ４０９に付加された特徴には、マルチクローニングサイト（ｍｃ
ｓ）中のさらなる特有の制限部位；ｍｃｓの下流に位置する３つの停止コドン（
各読み枠に１つ）；およびｍｃｓに挿入されたＤＮＡの配列決定を容易にする、
ｍｃｓの下流のＴ７ポリメラーゼプロモーターが含まれる。

【０２０９】 全長ヒトＴＳＬＰタンパク質の発現のため、全コード領域（すなわち配列番号
１に示されるＤＮＡ配列）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する
。ＰＣＲに使用するテンプレートは、実施例１に記載されるような、ヒト精巣ｃ
ＤＮＡライブラリーから単離したｃＤＮＡクローンである。単離されそして増幅
されたＤＮＡを発現ベクターｐＤＣ４０９に挿入し、ｐＤＣ４０９−ＴＳＬＰと
称される構築物を得る。

【０２１０】 ＬＺ−ＴＳＬＰポリペプチドを使用し、上に論じられるように、組換えまたは
内因性ＴＳＬＰ受容体を発現している宿主細胞に結合する能力を試験する。ＴＳ
ＬＰ受容体を発現している細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプ
トマイシン、およびグルタミンを補ったＤＭＥＭ中で培養する。細胞をＬＺ−Ｔ
ＳＬＰ（５ ｍｇ／ｍｌ）と、約１時間インキュベーションする。インキュベー
ション後、細胞を洗浄し、非結合ＬＺ−ＴＳＬＰを除去し、そしてビオチン化抗
ＬＺモノクローナル抗体（５ ｍｇ／ｍｌ）、およびフィコエリトリン結合スト
レプトアビジン（１：４００）とインキュベーションした後、蛍光活性化細胞分
取（ＦＡＣＳ）により解析する。細胞数測定解析は、ＦＡＣｓｃａｎ（Ｂｅｃｋ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）上で行った。

【０２１１】 ＴＳＬＰ受容体を発現している細胞は、ＴＳＬＰ受容体を発現していないコン
トロール細胞と比較し、有意に亢進したＬＺ−ＴＳＬＰ結合を示した。

【０２１２】 実施例８：ＴＳＬＰおよびＩＬ−７による骨髄からのＴ細胞増殖の誘導 ヒトＴＳＬＰは、ＩＬ−７と組み合わせると、ヒト骨髄からＴ細胞の増殖を誘
導する。

【０２１３】 ヒト骨髄由来単核細胞（ＢＭ ＭＮＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ上の全骨髄の遠心分
離により単離した。ＢＭ ＭＮＣを、１０％ウシ胎児血清、並びにアミノ酸およ
びビタミン補足剤を補ったＭｃＣｏｙの培地中で、４．５−１０ ｘ １０⁵細
胞／ｍｌの間の濃度範囲で、フラスコ（Ｔ２５）当たり総体積６または７ ｍｌ
中で培養した。ヒトＴＳＬＰ（２０ ｎｇ／ｍｌ）および他のサイトカイン、す
なわちＩＬ−７、ＳＬＦ（すなわちスチール因子または幹細胞因子、またはマス
ト細胞増殖因子）、またはｆｌｔ３Ｌを、単独でまたは組み合わせて、第０日に
培養に添加した。１４日後およびそれから毎週、培養の半分を除き、計数した。
培養に新鮮な培地およびサイトカインを添加し、総体積６または７ ｍｌに戻し
た。

【０２１４】 採取細胞はまた、培養１４日後およびそれから毎週、細胞表面抗原に特異的な
抗体を用い、フローサイトメトリーを介し、解析した。用いた抗体は、Ｔ細胞抗
原（すなわちαβ Ｔ細胞受容体、δγ Ｔ細胞受容体、およびＣＤ３）、Ｂ細
胞抗原（すなわちＣＤ１９および表面ＩｇＭ）、ナチュラルキラー細胞抗原（す
なわちＣＤ５６）、単球抗原（すなわちＣＤ１４）、および顆粒球抗原（すなわ
ちＣＤ１５）に特異的であった。

【０２１５】 ＢＭ ＭＮＣ培養へのヒトＴＳＬＰおよびＩＬ−７の添加は、表１に示される
ように、細胞増殖を誘導した。第０日には、ＢＭ ＭＮＣのおよそ５％がＴ細胞
であった。ＴＳＬＰおよびＩＬ−７を用いた培養の２週間後には、培養は７０％
ＣＤ３⁺ Ｔ細胞からなった。第２１日には、細胞の８６％がＣＤ３⁺ Ｔ細胞
であった。培養は、第４２日の実験終了まで、主にＴ細胞であった。

【０２１６】

【表１】

【０２１７】 別の実験組では、細胞生存および拡大に影響を与える能力に関し、Ｈｉｓ／Ｆ
ＬＡＧ（登録商標）でタグをつけた、３つの別個のバッチのヒトＴＳＬＰ（ＴＳ
ＬＰ ７４８９、ＴＳＬＰ ７８１１、またはＴＳＬＰ ７８１２）を単独でま
たはＩＬ−７と組み合わせて試験した。ＢＭ ＭＮＣ培養は、２つの別個の新鮮
な骨髄試料から得て、そして５ ｘ １０⁵細胞／ｍｌ（群１）または１０ ｘ
１０⁵細胞／ｍｌ（群２）いずれかの濃度で植え付けた。Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（
登録商標）タグＴＳＬＰ（２０ ｍｇ／ｍｌ）およびＩＬ−７を上述のように培
養に添加した。ＩＬ−７と組み合わせたＴＳＬＰは、表２（骨髄試料１）および
表３（骨髄試料２）に示されるように、ＢＭ ＭＮＣ培養の拡大を生じた。第２
１日までに、拡大細胞集団の８０％は、ＣＤ４⁺ αβ⁺またはＣＤ８⁺ αβ⁺
Ｔ細胞からなった。ＩＬ−７およびＴＳＬＰで処理した培養のうち４つでは、細
胞は、４−５週の実験終了まで、培養が主にＴ細胞を含むように拡大した。

【０２１８】

【表２】

【０２１９】

【表３】

【０２２０】 本明細書は、本明細書に援用される、本明細書中に引用される参考文献の解説
を考慮に入れると、最も完全に理解される。本明細書中の態様は、本発明の態様
の例示を提供し、そして本発明の範囲を限定するとみなしてはならない。当業者
は、多くの他の態様が本発明に含まれることを容易に認識する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１
）を示す。

【図２】 図２は、ヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年５月２３日（２００１．５．２３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/06 5/00 Ａ 5/10 Ｅ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マッケンナ，ヒラリー アメリカ合衆国ワシントン州98199，シア トル，サーティフィフス・アベニュー・ノ ース・ウエスト 2645 (72)発明者 アームストロング，アリソン アメリカ合衆国ワシントン州98109，シア トル，クイーン・アン・アベニュー・ナン バー 205 1321 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 4B064 AG02 CA19 CC24 4B065 AA01X AA57X AA87X AA94X AA94Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA18 CA25 DA01 NA14 ZA662 ZB261 ZB262 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号１のＤＮＡ配列； （ｂ）配列番号２の配列を含むアミノ酸配列をコードする単離核酸分子； （ｃ）６０℃、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件を伴う、５０％ホ
   ルムアミドおよび６ＸＳＳＣ、４２℃の、中程度にストリンジェントな条件下で
   、（ａ）または（ｂ）の核酸配列を含む、変性二本鎖ＤＮＡのどちらかの鎖にハ
   イブリダイズする単離核酸分子； （ｄ）配列番号１からｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により得られる単離核酸分
   子； （ｅ）配列番号１から遺伝暗号の結果、縮重している単離核酸分子；および （ｆ）ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡ、ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡの対立遺伝子変異体、およ
   びＴＳＬＰ ＤＮＡの種相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）からなる群より選択される単
   離核酸分子 からなる群より選択される、単離核酸分子。
2. 【請求項２】 配列番号１のＤＮＡ配列を含む、請求項１の核酸分子。
3. 【請求項３】 請求項１の核酸分子の発現を指示する組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項１の核酸分子にコードされる単離ポリペプチド。
5. 【請求項５】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるように、およそ２１，
   ０００ダルトンの分子量を有する、請求項４記載の単離ポリペプチド。
6. 【請求項６】 非糖鎖付加型の請求項４記載の単離ポリペプチド。
7. 【請求項７】 請求項４のポリペプチドに結合する単離抗体。
8. 【請求項８】 抗体がモノクローナル抗体である、請求項７記載の抗体。
9. 【請求項９】 ａ）配列番号２のＴＳＬＰポリペプチド；および ｂ）（ａ）のポリペプチドの断片であって、ＴＳＬＰ受容体に結合することが可
   能な前記断片 からなる群より選択される、精製ＴＳＬＰポリペプチド。
10. 【請求項１０】 配列番号２に示されるアミノ酸配列に、少なくとも８０
    ％同一であるアミノ酸配列を含む、単離ＴＳＬＰポリペプチド。
11. 【請求項１１】 配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項９のＴＳＬＰ
    ポリペプチド。
12. 【請求項１２】 請求項４のポリペプチド、および生理学的に許容しうる
    希釈剤、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）、またはキャリアーを含む、組成物。
13. 【請求項１３】 請求項３のベクターでトランスフェクションまたは形質
    導入されている、宿主細胞。
14. 【請求項１４】 ＴＳＬＰポリペプチドを産生するための方法であって、
    請求項１３の宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養し、そして培地から該ポ
    リペプチドを回収することを含む、前記方法。
15. 【請求項１５】 宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動
    物細胞からなる群より選択される、請求項１４の方法。
16. 【請求項１６】 リンパ球増殖を刺激する方法であって、請求項４記載の
    ポリペプチドとリンパ球をインキュベーションすることを含む、前記方法。
17. 【請求項１７】 ＩＬ−７とリンパ球をインキュベーションすることをさ
    らに含む、請求項１６の方法。
18. 【請求項１８】 スチール（Ｓｔｅｅｌ）因子、幹細胞因子、マスト細胞
    増殖因子またはｆｌｔ３リガンドからなる群より選択されるサイトカインとリン
    パ球をインキュベーションすることをさらに含む、請求項１６の方法。
19. 【請求項１９】 リンパ球発生またはリンパ球新生（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉ
    ｅｓｉｓ）を刺激する方法であって、請求項４記載のポリペプチドと前駆細胞を
    インキュベーションすることを含む、前記方法。
20. 【請求項２０】 前駆細胞が骨髄由来単核細胞である、請求項１９の方法
    。
21. 【請求項２１】 ＩＬ−７と骨髄由来単核細胞をインキュベーションする
    ことをさらに含む、請求項２０の方法。
22. 【請求項２２】 請求項４記載のポリペプチドおよびＩＬ−７とリンパ球
    をインキュベーションすることを含む、リンパ球増殖を刺激する方法。
23. 【請求項２３】 リンパ球発生またはリンパ球新生を刺激する方法であっ
    て、請求項４記載のポリペプチドおよびＩＬ−７と前駆細胞をインキュベーショ
    ンすることを含む、前記方法。