SE532251C2 - Nya formuleringar av TSLP för behandling av TH2-medierade inflammatoriska sjukdomar genom vaccinering - Google Patents

Description

532 251 människa främst produceras av epiteliala celler och mastceller. Denna tillväxtfaktor stimulerar myeloida dendritiska celler (mDC) att inducera differentierin g av naiva CD4 positiva T celler till effektorceller av TH2 typ [7]. Dessa TH2 celler producerar sedan de allergi drivande tillväxtfaktorema IL-4, IL-5, IL-13 och TNF-a, men inte IL- l0 och IFN-y [8]. Nya fynd indikerar också att TSLP aktiverade DCs spelar en viktig roll inte enbart i induktionen av TH2 immunitet utan också i upprätthållande och ytterligare polarisering av centrala minnesceller av TH2 typ under allergiska sjukdomar [9]. Keratinocyter i den skadade vävnaden i atopisk demiatit har visats uttrycka höga nivåer av TSLP, som kan vara en av de tillväxtfaktorer som spelar en nyckelroll i utvecklandet av atopisk dennatit [8]. Möss genförändrade för att överuttrycka TSLP i hud utvecklar in också atopisk dermatit och man ser en dramatisk ökning i antalet cirkulerande TH2 celler och en ökning i serum IgE [10].

TSLP är dock inte enbart uttryckt i perifer vävnad utan även i den humana thymusen i "HassalPs corpuscles l Denna vävnad är TSLP inblandad i att instruera dendritiska celler till att konvertera hög affinitets själv-reaktiva T-celler till CD4+CD25+ FoxP3+ regulatoriska T celler. Den heterodimera TSLP receptom tycks vara uttryckt uteslutande på myeloda dendritiska celler (mDCs).

TSLP verkar vara en av de viktigaste reglerarna av TH2-medierad inflammation och är därför en mycket intressant målmolekyl för terapeutisk intervention [ll]. Jag kommer här att beskriva en vaccinationsmetod som är ämnad att nedreglera alltför kraftig TH2-medierad inflarnrnation genom att rikta vaccinets effekt mot TSLP. Detta vaccin kan komma att bli ett nytt viktigt steg i behandlingen av svår astma i människa och atopisk dermatit i hund.

Vad som tidigare va; kan" tingm tältet “Prior A11".

Patentansökningar som beskriver användningen av monoklonala antikroppar eller lösliga receptorer för att reducera aktiviteten av humant TSLP är inlämnade. Dessa strategier för att målsöka TSLP är baserade på injektionen av högrenade rekombinanta proteiner var annan till var fjärde vecka under resten av patientens liv.

Ett vaccin som beskrivs i denna patentansökan kan här komma att bli en avsevärd förbättring över tidigare känd teknik (prior art) p.g.a. att den bygger på injektion av rekombinanta proteiner i mycket mindre mängd, kanske så lite som en 10 000 del av vad som behövs vid behandling med monoklonala antikroppar eller lösliga receptorer.

Ett vaccin kommer troligtvis även att behöva administreras 2-4 gånger om året i jämförelse med de mycket mer frekventa administreringama av monoklonaler och lösliga receptorer som beskrivits här ovan. Användandet av sekvensen från en icke- human primat kan också leda till att immunogeniciteten ökar för vaccinet i människa.

För andra applikationer än vaccin måste det icke modifierad TSLP användas (det humana proteinet) för att inte ge upphov till en immunreaktion mot proteinet vilket skulle avsevärt minska effekten av det injicerade rekombinanta proteinet. fin' e ”l Målet med uppfinningen är att kunna erbjuda en lätt och kostnadseffektiv metod för behandling av olika inflammatoriska sjukdomar orsakade av överdriven TH2- medierad. Vaccination med ett fusionsprotein bestående av TSLP (eller delar av denna cytokin) och ett främmande bärarprotein för att minska nivåerna av fritt TSLP 532 25'l p och därmed mildra symptomen som orsakats av förhöjd frisättning av denna tillväxtfaktor. amm nfattnin avu fi ' n Målet som beskrivits ovan uppnås enligt uppfinningen med hjälp av ett vaccin som karaktäriseras av att det innehåller hela aminosyrasekvensen eller segment större än 5 aminosyror av TSLP från en icke-human primat (om den skall användas för människa) i dess ursprungliga eller multimeriserade form. Vid behandling av domesticerade djur används istället TSLP sekvensen från det djur som skall behandlas Proteinet kan kopplas till ett eller flera bärarprotein och kan även innehålla ett adjuvans. Den TSLP molekyl som används som vaccinantigen kan alternativt vara muterad med en eller flera punktmutationer som förhindrar dess bindning till sin receptor. Proteinet kommer då inte att ha TSLP aktivitet men fortfarande behålla sin förmåga att inducera antikroppar som också reagerar med nativt aktivt TSLP.

Kortfattad beskrivning av figurerna Figur l visar nukleotid och den motsvarande arninosyra sekvensen för schimpansens TSLP.

Beskrivning av uppfinningen Anti-TSLP antikroppar produceras i patienten genom aktiv immunisering, vilket även kallas vaccination. Genom att injicera en modifierad TSLP molekyl så börjar patientens immunsystem att producera ett polyklonalt antikroppssvar riktad mot dess eget TSLP och reducerar därmed effekterna av en för kraftig TSLP produktion. Det är av största vikt att modifiera anti genet så att patientens immunsystem uppfattar vaccinantigenet som ett främmande protein. Detta kan åstadkommas genom kovalent koppling av ett främmande (icke själv) protein eller del av protein till hela eller delar av TSLP från den art som skall behandlas. Peptidregioner inom det främmande, icke kroppsegna proteinet drar då till sig och aktiverar icke toleriserade T celler som kan ge hjälp till potentiellt autoreaktiva B-celler.

Det finns minst fyra olika sätt att göra denna modifiering av självproteinet. En metod är att producera vaccinantigenet som ett fusionsprotein mellan ett främmande protein och hela eller en utvald del på mer än 5 aminosyror i längd av själv-TSLP i ett prokaryot eller eukaryot expressions system. Den öppna läsramen för TSLP, t.ex. hund eller schimpans TSLP som kan ses i figur 1 klonas först in i bakteriell, svamp eller eukaryot fusionsproteinvektor. Denna vektorkonstruktion transfekteras sedan in i en eukaryot eller prokaryot värdcell (beroende på vald vektor) för produktion av det önskade fusionsproteinet. Denna fusionspartner kan här vara vilket för kroppen främmande protein som helst av en storlek från 10 aminosyror till flera hundra kD.

Det är dock vanligen bäst att använda en fusionspartner av liknande storlek som självproteinet.

Alternativt kan en immunodominant peptid sättas in i den valda TSLP sekvensen vilket resulterar i ett fusionsprotein med själv TSLP sekvenser på båda sidor om den främmande peptiden.

Som ett tredje alternativ kan det icke modifierade TSLP produceras i en eukaryots eller prokaryot värd eller värdcell och sedan kovalent kopplas till ett bärarprotein genom kemisk koppling. 532 251 H Det fjärde alternativet som i vår mening är mindre fördelaktigt är att producera en utvald del av TSLPs aminosyrasekvens som en syntetisk peptid och sedan koppla denna peptid till ett främmande bärarprotein genom kemisk koppling. Detta alternativ resulterar normalt, efter injektion i patienten, i antikroppssvar som uppvisar låg bindningsaktivitet mot nativt rätt veckat protein vilket därmed ger sämre klinisk effekt.

Efter produktion av vaccinantigenet skall det sedan testas för pyrogeninnehåll och möjligt innehåll av andra kontaminerande ämnen. För att erhålla ett tillräckligt starkt immunsvar mot självproteinet kan det blandas med en immunstimnlerande substans, ett adjuvans före injektion i patienten. Efter injektion i patienten induceras vaccinet ett immunsvar mot vaccinantigenet. På grund av närvaron av självepitoper i vaccinantigenet så inducerar detta protein ett antikroppssvar mot denna målmolekyl, i detta fall TSLP, vilket leder till en sänkning av nivåerna av detta protein i patienten.

Referenser [1] Hellman L. Profound reduction in allergen sensitivity following treatment with a novel allergy vaccine. Eur J Immunol l994;24(2):415-20. [2] Hellman L. Is vaccination against IgE possible? Adv Exp Med Biol 1996;409:337-42. [3] Hellman L, Carlsson M. Allergy vaccines: A review of developments. Clin Immunotherapeutics l996;6(2): 130-42. [4] Hellman L. Vaccines against allergies. In: Perlmann P, Wigzell H, editors.

Handbook of Experimental Pharmacology, Vol133, Vaccines. Berlin, Springer- Verlag, 1999: 499-526. [5] Vernersson M, Ledin A, Johansson J, Hellman L. Generation of therapeutic antibody responses against IgE through vaccination. Faseb J 2002;16(8):875-7. [6] Ledin A, Bergvall K, Salmon-Hillbertz N, Hansson H, Andersson G, Hedhammar Ã, et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine 2006;24, 66-74. [7] Liu YJ. Thymic stromal lymphopoietin: master switch for allergic inflammation. J Exp Med 2006;203(2):269-73. [8] Soumelis V, Reche PA, Kanzler H, Yuan W, Edward G, Homey B, et al.

Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP. Nat Immunol 2002;3(7):673-80. [9] Wang YH, lto T, Wang YH, Homey B, Watanabe N, Martin R, et al.

Maintenance and polarization of human TH2 central memory T cells by thymic stromal lymphopoietin-activated dendritic cells. Immunity 2006;24(6):827-38.

[10] Yoo J, Omori M, Gyarmati D, Zhou B, Aye T, Brewer A, et al. Spontaneous atopic dermatitis in mice expressing an inducible thymic stromal lymphopoietin transgene specifically in the skin. J Exp Med 2005;202(4):54l-9. [ll] Huston DP, Liu YJ. Thymic stromal lymphopoietinza potential therapeutic target for allergy and asthma. Curr Allergy Asthma Rep 2006;6(5):372-6.

Claims (4)

532 251 J» Patentkrav

1. Vaccin innehållande TSLP eller ett fragment därav i dess ursprungliga eller multimeriserade form kopplad till en icke kroppsegen bärarmolekyl som företrädesvis administreras tillsammans med ett farmakologiskt accepterbart adjuvant.

2. Vaccin enligt patentkrav 1 där TSLP är från en icke human primat, hund, katt eller häst.

3. Vaccin mot TSLP enligt patentkrav l och 2 för behandling av allergi, astma och andra inflammatoriska tillstånd.

4. Användning av ett fusionsprotein innehållande hela eller delar av TSLP från den art som skall behandlas (eller en nära besläktad art) kopplat till ett främmande bärarprotein för framställning av ett vaccin för behandling av allergi, astma eller andra inflammatoriska tillstånd.