KR101898739B1 - 조작된 항－ｔｓｌｐ 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 결합 화합물, 뿐만 아니라 그의 용도, 예를 들어, 염증성 장애 및 알레르기성 염증성 반응의 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

조작된 항－ＴＳＬＰ 항체 {ENGINEERED ANTI-ＴＳＬＰ ANTIBODY}

본 출원은 2010년 1월 21일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/297,008; 및 2009년 11월 4일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/258,051에 대한 유익을 주장하며, 이들 가특허 출원 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP) 특이 항체, 및 그의 용도, 특히, 염증성, 및 알레르기성 염증성 장애에서의 그의 용도에 관한 것이다.

TSLP는 전동종 표현형을 가진 수지상 세포-매개 CD4⁺ T 세포 반응을 유도하는 면역 시토카인이다. TSLP에 의해 활성화된 DC는 알레르기성 염증의 중요한 매개 인자인 IL-4, IL-5 및 IL-13을 생산하면서, 미접촉 T 세포의 Th2 세포로의 분화를 지시하는 전동종 시토카인, 케모카인, 및 공자극성 분자의 생산에 의해 알레르기성 염증성 Th2의 유도 및 유지, 및 비만 세포 반응에서 중요한 역할을 한다. 아토피 피부염 (AtD), 네테르톤 증후군(Netherton Syndrome) 및 천식에서의 TSLP의 과다-발현은 이러한 알레르기성 염증성 질환의 발병 기전에서 있는 상기 시토카인의 중요한 역할을 시사한다. 이는 피부 또는 폐에서의 TSLP의 트랜스제닉성 과다-발현 뿐만 아니라, TSLP의 음성 조절 인자를 표적화하는 유전자의 제거로 인해 인간 아토피 피부염 또는 천식과 매우 유사한 알레르기성 염증성 질환이 유발되었다는 동물 모델을 통해 입증된다. 본 발명은 조작된 TSLP 항체, 및 천식 및 아토피 피부염을 비롯한, 염증성, 및 특히 알레르기성 염증성 장애를 치료하기 위한 상기 항체의 용도를 제공한다.

본 발명을 통해 선행 기술 항체가 가지고 있는 탈아미드화 문제를 회피할 수 있다. Asn (N) 잔기의 탈아미드화는 일반적인 단백질 분해로서, 이는 단백질의 구조와 기능에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 항체에서, CDR에 위치하는 Asn (N)은 빠르게 탈아미드화될 수 있고, 이로써, 항체-항원 상호작용에는 변화를 일으킬 수 있는 바, 따라서, 이는 항체-기반 치료제 개발시 심각한 우려를 나타낸다. 예를 들어, 문헌 [Vlaska et al., Analytical Biochemistry 392:145-154 (2009)]를 참조한다. 따라서, 인간용으로서 개발하고자 하는 항체에 있어 상기와 같은 잠재성이 있는 탈아미드화 문제를 회피하는 것이 중요하다. 추가로, 항체의 중요한 특징 (예를 들어, 결합 친화도) 중 어느 것도 변화시키지 않으면서 상기와 같은 문제들을 회피하는 것이 중요하다.

발명의 개요

본 발명은 서열 2를 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 결합 화합물, 또는 그의 TSLP-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 적어도 서열 2 및 서열 1, 또는 서열 2 및 서열 3을 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 결합 화합물, 또는 그의 TSLP-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 서열 1, 서열 2, 및 서열 3을 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 결합 화합물, 또는 그의 TSLP-결합 단편을 제공한다.

본 발명의 결합 화합물은 추가로 하나의 항체 경쇄 가변 영역, 또는 그의 TSLP-결합 단편을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 경쇄 가변 영역, 또는 그의 TSLP-결합 단편은 서열 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 경쇄 가변 영역, 또는 그의 TSLP-결합 단편은 서열 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체 경쇄 가변 영역, 또는 그의 TSLP-결합 단편은 서열 4, 5 및 6에 제시된 3개의 서열을 가진다.

상기 기재된 결합 화합물의 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역의 모든 또는 실질적으로 모든 잔여부는 인간 Ig 영역 모두 또는 실질적으로 모두이고; 경쇄 가변 영역의 모든 또는 실질적으로 모든 잔여부는 인간 Ig 영역 모두 또는 실질적으로 모두이다. 바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역의 잔여부는 인간 중쇄 아미노산 서열이고; 경쇄 가변 영역의 잔여부는 인간 경쇄 아미노산 서열이다.

본 발명은 또한 (i) 서열 7; (ii) 서열 7 또는 3개 이하의 변형된 아미노산 잔기를 포함하는 변이체; 및 (iii) 서열 7과 적어도 97%의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 제공한다. 한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 7에 제시된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 추가로 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 (i) 서열 8; (ii) 서열 8 또는 3개 이하의 변형된 아미노산 잔기를 포함하는 변이체; 및 (iii) 서열 8과 적어도 97%의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열 8에 제시된 서열을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 결합 화합물은 서열 7에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 8에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 또한 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 γ1, γ2, γ3, 또는 γ4 인간 중쇄 불변 영역 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 시노화(cyno-ized), 인간화된 또는 완전 인간 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 인간화된 항체 또는 그의 단편이다.

본 발명은 또한 결합 단편이 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')₂, 및 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편인 것을 고려한다. 본 발명은 또한 결합 화합물이 나노바디, 아비머 또는 압티머인 것을 고려한다.

한 실시양태에서, 결합 화합물은 서열 11을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체이다. 한 실시양태에서, 결합 화합물은 서열 11을 포함하는 중쇄 및 서열 12를 포함하는 경쇄를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 인간 및 시노 TSLP에 결합한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터로부터 발현될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터로부터 발현될 수 있는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터로부터 발현될 수 있는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터에 의해 발현된 항체의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 및 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 영역을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터로부터 발현될 수 있는 중쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터로부터 발현될 수 있는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터에 의해 발현된 항체의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 영역을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 결합 화합물을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 결합 화합물 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1, 서열 2 및 서열 3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 결합 화합물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 7을 코딩하는 핵산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2를 코딩하는 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터에 의해 코딩된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 포함한다. 본 발명은 또한 숙주 세포가 본 발현 벡터로 형질감염될 때 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터를 제공한다. 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 폴리펩티드를 생산하기 위해 이러한 발현 벡터를 사용하는 방법 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터를 포함한다. 폴리펩티드를 생산하는 방법은 핵산 서열이 발현되는 조건 하에 숙주 세포를 배양 배지 중에서 배양하여 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 단계; 및 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 벡터가 발현되는 조건 하에 ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양 배지 중에서 배양하여 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 단계; 및 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 생산하는 방법을 포함한다.

본 발명은 면역 반응 억제를 필요로 하는 인간 대상체에게 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 결합 화합물을 TSLP의 생물학적 활성을 차단시키는 데 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 면역 반응을 억제시키는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 추가의 면역억제성 작용제 또는 항염증제를 투여하는 것을 고려한다. 바람직한 실시양태에서, 면역 반응은 천식이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 면역 반응은 알레르기성 염증이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 알레르기성 염증은 알레르기성 비부비동염, 알레르기성 천식, 알레르기성 결막염, 또는 아토피 피부염이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 면역 반응은 섬유증, 염증성 장 질환 또는 호지킨 림프종이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 결합 화합물은 또 다른 면역조절제와 함께 조합하여 투여된다.

본 발명의 결합 화합물은 본 발명의 결합 화합물 (예를 들어, 항체 또는 그의 단편)을 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 조합하여 포함하는 조성물 중에 존재할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 조성물은 추가로 면역억제성 작용제 또는 항염증제를 포함한다.

다양한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 결합 화합물 (예를 들어, 항체 또는 그의 단편)을 포함하는 의약에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 면역 반응을 억제시키는 의약의 제조를 위한 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 결합 화합물의 용도를 포함한다. 본 발명은 천식 치료용 의약의 제조를 위한 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 결합 화합물 (예를 들어, 본 발명에 따른 결합 화합물 중 어느 하나)의 용도를 포함한다. 본 발명은 염증성 장애 치료용 의약의 제조를 위한 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 결합 화합물의 용도를 포함한다. 한 실시양태에서, 염증성 장애는 알레르기성 염증성 장애이다. 한 실시양태에서, 알레르기성 염증성 장애는 알레르기성 비부비동염, 알레르기성 천식, 알레르기성 결막염, 또는 아토피 피부염이다. 바람직한 실시양태에서, 알레르기성 염증성 장애는 알레르기성 천식이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 알레르기성 염증성 장애는 아토피 피부염이다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및 단편은 인간을 치료하는 데 사용될 수 있다.

도 1. WO2008/076321의 서열 14와 비교하여 나타낸 본 출원의 서열 11의 정렬.

상세한 설명

첨부된 특허청구범위를 비롯한 본원에서 사용되는 바, 예를 들어, "하나" 및 "그"("a," "an," 및 "the")라는 단수 형태의 단어는 문맥상 명백히 달리 명시되지 않는 한, 그에 상응하는 복수 형태의 것도 포함한다. 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 공개 문헌, 특허 출원, 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 명시된 것과 동일한 정도로 참고로 포함된다.

I. 정의

세포 또는 수용체에 적용되는 바, "활성화," "자극," 및 "처리"는 문맥에 의해 달리 또는 명백하게 명시되지 않는 한, 동일한 의미, 예를 들어, 리간드를 사용한 세포 또는 수용체의 활성화, 자극, 또는 처리라는 의미를 가질 수 있다. "리간드"는 천연 및 합성 리간드, 예를 들어, 시토카인, 시토카인 변이체, 유사체, 뮤테인, 및 항체로부터 유래된 결합 조성물을 포함한다. 또한, "리간드"는 소형 분자, 예를 들어, 시토카인의 펩티드 모방체 및 항체의 펩티드 모방체를 포함한다. "활성화"는 내부 기전 뿐만 아니라, 외부 또는 환경적 요인에 의해 조절될 수 있는 세포 활성화를 의미할 수 있다. "반응," 예를 들어, 세포, 조직, 기관 또는 유기체의 반응은 생화학적 또는 생리학적 거동의 변화, 예를 들어, 생물학적 구획 내에서의 농도, 밀도, 부착 또는 이주에 있어서의 변화, 유전자 발현율 또는 분화 상태의 변화를 포함하며, 여기서, 변화는 활성화, 자극 또는 처리와 상관 관계가 있거나, 유전자 프로그래밍과 같은 내부 기전과 상관 관계가 있다.

분자의 "활성"은 분자의 리간드에의 또는 수용체에의 결합, 촉매 활성; 유전자 발현 또는 세포 신호전달, 분화 또는 성숙을 자극할 수 있는 능력; 항원 활성, 다른 분자의 활성의 조절 등을 설명하거나, 의미할 수 있다. "활성"은 또한 특이 활성, 예를 들어, [촉매 활성]/[mg 단백질] 또는 [면역학적 활성]/[mg 단백질], 생물학적 구획에서의 농도 등을 의미할 수 있다.

동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생체액에 적용되는 "투여" 및 "치료"는 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생체액에 외인성 제약, 치료제, 진단제 또는 조성물을 접촉시키는 것을 의미한다. "투여" 및 "치료" 는 예를 들어, 치료학적, 약동학적, 진단학적, 연구 및 실험 방법을 의미할 수 있다. 세포 치료는 시약을 세포에 접촉시키는 것 뿐만 아니라, 체액이 세포와 접촉하고 있는 경우, 시약을 체액에 접촉시키는 것도 포함한다. "투여" 및 "치료"는 또한 시약, 진단제, 결합 조성물에 의해 또는 또 다른 세포에 의해, 예를 들어, 세포를 시험관내 및 생체외에서 치료하는 것도 의미한다. 인간, 수의학적 대상체 또는 연구 대상체에 적용되는 "치료"는 치료학적 치료, 예방 또는 보호적 조치, 연구 및 진단 적용을 의미한다.

"결합 화합물"은 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 분자를 의미한다. 한 바람직한 실시양태에서, 결합 화합물은 항체, 바람직하게는 단리된 항체이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 결합 화합물은 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.

"결합 조성물"은 표적에 결합할 수 있는, 안정화제, 부형제, 염, 완충제, 용매, 또는 첨가제와 함께 조합된 TSLP-결합 화합물을 의미한다.

본 발명의 범주는 또한 TSLP 폴리펩티드 또는 그의 항원 단편과 복합체로 형성된 본 발명의 임의의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 포함한다. 복합체는 항체 또는 단편을 TSLP 폴리펩티드 또는 항원 단편과 접촉시킴으로써 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 원하는 생물학적 활성을 나타내는, 임의 형태의 항체 또는 그의 단편을 의미한다. 따라서, 이는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체 (전장의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편을 포함한다. "단리된 항체"란 정제된 상태의 결합 화합물을 의미하고, 그러한 맥락에서 단리된 항체란, 분자가 다른 생물학적 분자, 예를 들어, 핵산, 단백질, 지질, 당질, 또는 다른 물질, 예를 들어, 세포 잔해물 및 성장 배지를 실질적으로 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 일반적으로, "단리된"이라는 용어는 상기 물질, 또는 물, 완충제, 또는 염이 본원에 기재된 결합 화합물의 실험적 또는 치료학적 용도를 실질적으로 방해하는 양으로 존재하지 않는 한, 상기 물질이 완전하게 존재하지 않는다는 것 또는 물, 완충제, 또는 염이 존재하지 않는다는 것을 의미하는 것이 아니다.

"Fab 단편"은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된 것이다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.

"Fc" 영역은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 함유한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 이황화 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 결합되어 있다.

"Fab' 단편"은 하나의 경쇄, 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 하나의 중쇄의 일부 또는 단편 및 추가로 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는데, 이로써 2개의 Fab' 단편의 두 중쇄 사이에 쇄간 이황화 결합이 형성됨으로써 F(ab')2 분자가 형성될 수 있다.

"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 2개의 중쇄를 함유하며, 이로써, 두 중쇄 사이에 쇄간 이황화 결합이 형성된 것이다. 따라서, F(ab')2 단편은 두 중쇄 사이의 이황화 결합에 의해 함께 결합되어 있는 2개의 Fab' 단편으로 구성된 것이다.

"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 모두로부터의 가변 영역은 포함하나, 불변 영역은 포함하지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "TSLP 결합 단편" 또는 "그의 결합 단편"이라는 용어는 TSLP 활성을 억제시키는 항체의 생물학적 활성을 실질적으로 계속하여 보유하는 항체 (또는 또 다른 결합 물질)의 단편 또는 유도체를 포함한다. 따라서, "항체 단편" 또는 TSLP 결합 단편이라는 용어는 전장의 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 의미한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자, 예를 들어, sc-Fv; 도메인 항체; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 전형적으로, 결합 단편 또는 유도체는 그의 TSLP 억제 활성을 적어도 10% 보유한다. 바람직하게는, 비록 원하는 생물학적 효과를 발휘하는 데 충분한 친화도를 가진 임의의 결합 단편이 유용하기는 하지만, 결합 단편 또는 유도체는 그의 TSLP 억제 활성을 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% (또는 그 초과) 보유한다. 또한, TSLP 결합 단편은 그의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있는 것으로 한다.

본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하며, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일의 항원 에피토프에 대해 유도되는, 고도로 특이적인 항체이다. 대조적으로, 통상의 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 유도되는 (또는 그에 특이적인) 다수의 항체를 포함한다. 수식어구 "모노클로날"은 실질적인 동질인 항체 집단으로부터 수득된 것이라는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의해 항체를 생산하여야 한다는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., (1975) Nature 256: 495]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 [Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628] 및 [Marks et al., (1991) J. Mol . Biol. 222: 581-597]에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 그의 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래된 것이거나, 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 쇄(들)의 잔여부는, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 또 다른 종으로부터 유래된 것이거나, 또는 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 및 그러한 항체의 단편 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인, "키메라" 항체 (이뮤노글로불린)를 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., (1984) Proc . Natl . Acad Sci. USA 81:6851-6855]).

"도메인 항체"는 오직 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역학상 기능성인 이뮤노글로불린 단편이다. 일부 경우에서, 2개 이상의 V_H 영역은 펩티드 링커와 공유적으로 결합하여 2가 도메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 두 V_H 영역은 동일하거나 상이한 항원을 표적화할 수 있다.

"2가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에서, 2개의 결합 부위가 동일한 항원 특이성을 가진다. 그러나, 2가 항체는 이중특이적일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체라는 용어는 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재하는 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하는 항체 단편을 의미한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 하는, V_H와 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 개관에 대해서는 문헌 [Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]를 참조한다.

본원에서 모노클로날 항체는 또한 카멜화된 단일 도메인 항체를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Muyldermans et al., (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230]; [Reichmann et al., (1999) J. Immunol . Methods 231:25]; WO 94/04678; WO 94/25591; 미국 특허 번호 6,005,079 (상기 문헌들은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 단일 도메인 항체가 형성될 수 있도록 하기 위해 변형된 2개의 V_H 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체를 제공한다.

본원에서 사용되는 바, "디아바디"라는 용어는 동일한 폴리펩티드 쇄 (V_H-V_L 또는 V_L-V_H)에서 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 가진 소형 항체 단편을 의미한다. 동일한 쇄에서 2개의 도메인 사이에 쌍이 형성될 수 있도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들을 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성한다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Holliger et al., (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448]에 보다 상세하게 기재되어 있다. 조작된 항체 변이체에 대한 개관을 위해서는 일반적으로 문헌 [Holliger and Hudson (2005) Nat . Biotechnol. 23:1126-1136]을 참조한다.

본원에서 사용되는 바, "인간화된 항체"라는 용어는 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체 뿐만 아니라, 인간 항체로부터 유래된 서열을 함유하는 항체 형태를 의미한다. 그러한 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 서열을 최소로 함유한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 1개 이상, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이며, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 일부를 포함할 것이다. 인간화된 항체(예를 들어, "hu23B12")를 모체 설치류 항체(예를 들어, 래트 23B12, 또는 "r23B12")와 구별해야 할 경우, 접두사 "h", "hu" 또는 "hum"을 항체 클론 표기에 부가한다. 인간화된 항체의 친화도 증가 또는 안정성 증가를 위해 특정 아미노산 치환이 포함될 수 있기는 하지만, 인간화된 형태의 설치류 항체는 일반적으로 모체 설치류 항체의 동일한 CDR 서열을 포함할 것이다.

본 발명의 항체는 또한 효과기 기능이 변경된, 변형된 (또는 차단된) Fc 영역을 가진 항체를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,624,821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702; 문헌 [Presta (2006) Adv . Drug Delivery Rev. 58:640-656]을 참조한다. 이러한 변형은 면역계의 다양한 반응을 증진시키거나 또는 억제시키는 데 사용될 수 있으며, 가능하게는 진단 및 치료법에 이로운 효과를 가질 수 있다. Fc 영역의 변경은 아미노산 변화 (치환, 결실 및 삽입), 당화 또는 탈당화 및 다중 Fc 부가를 포함한다. Fc에 대한 변화로는 또한 치료학적 항체에서의 항체 반감기 변경를 포함하고, 보다 장기간의 반감기는 투약 빈도를 감소시킴으로써 편의를 증가시키는 동시에 물질의 사용을 감소시킬 것이다. 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin . Immunol. 116:131 at 734-35]를 참조한다.

"완전 인간 항체"라는 용어는 오직 인간 이뮤노글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다. 완전 인간 항체는, 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 유래된 하이드리도마에서 생산된 경우라면, 뮤린 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체"는 오직 마우스 이뮤노글로불린 서열만을 포함하는 항체를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "초가변 영역"이란 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인내 잔기 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) 및 89-97 (CDRL3) 및 중쇄 가변 도메인내 잔기 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) 및 95-102 (CDRH3); 문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인내 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인내 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk, (1987) J. Mol . Biol. 196: 901-917])를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "프레임워크" 또는 "FR" 잔기라는 용어는 본원에서 CDR 잔기로 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 상기 번호화된 잔기는 카바트 (Kabat) 번호화 체계와 관련되고, 첨부한 서열 목록에서의 서열 번호화와 반드시 상세하게 상응하는 것은 아니다.

"결합"이란 결합 조성물과 표적과의 회합을 의미하는 것으로, 여기서, 결합 조성물이 용액에 용해되거나 현탁될 수 있는 경우, 상기 회합에 의해 결합 조성물의 정상적인 브라운 운동은 감소하게 된다.

"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 당업자에게 공지되어 있으며, 일반적으로는 생성된 분자의 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 이루어질 수 있는 아미노산의 치환을 의미한다. 당업자는 일반적으로 폴리펩티드의 비-필수 영역내 단일 아미노산 치환이 실질적으로 생물학적 활성을 변경시키지 않는다는 것을 인지하고 있다 (예를 들어, 문헌 [Watson, et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin / Cummings Pub . Co., p. 224 (4th Edition 1987)] 참조). 그러한 예시적인 치환은 바람직하게는 하기와 같이 표 1에 제시된 바에 따라 이루어진다:

"유효량"은 의학적 상태의 증상 또는 징후를 호전시키거나 예방하는 데 충분한 양을 포함한다. 유효량은 또한 진단을 가능하게 하거나 촉진시키는 데 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 수의학적 대상체에 대한 유효량은 인자, 예컨대 치료되는 병태, 환자의 전반적인 건강 상태, 투여 방법 경로, 투여량 및 부작용의 중증도에 따라 달라질 수 있다 (예를 들어, 등록된 미국 특허 번호 5,888,530 (네티(Netti) 등) 참조). 유효량은 상당한 부작용 또는 독성 효과를 피하는 최대 용량 또는 투약 프로토콜일 수 있다. 효과는 진단학적 척도 또는 파라미터를 적어도 5% 만큼, 통상적으로 적어도 10% 만큼, 더욱 통상적으로 적어도 20% 만큼, 가장 통상적으로 적어도 30% 만큼, 바람직하게는 적어도 40% 만큼, 더욱 바람직하게는 적어도 50% 만큼, 가장 바람직하게는 적어도 60% 만큼, 이상적으로 적어도 70% 만큼, 더욱 이상적으로 적어도 80% 만큼, 및 가장 이상적으로 적어도 90% 만큼 개선시킬 것이며, 여기서, 100%는 정상적인 대상체에 의해 나타나는 진단학적 파라미터로서 정의된다 (예를 들어, 문헌 [Maynard, et al., (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL]; [Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice , Urch Publ., London, UK] 참조).

본원에서 사용되는 바, "단리된 핵산 분자"라는 용어는 보통은 항체 핵산의 천연 공급원에서 그와 회합하고 있는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정되고, 분리된 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 구성 이외의 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 있는, 항체를 통상 발현하는 세포에 함유되어 있는 핵산 분자를 포함한다.

"제어 서열"이라는 표현은 특정 숙주 유기체 내에 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵세포에 적합한 제어 서열로는 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 사용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치되는 경우, "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전단백질로서 발현되는 경우, 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치하는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"이란, 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우, 연속적이며 판독 상에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성된다. 그러한 부위가 존재하지 않을 경우, 통상의 실시에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 사용된다.

본원에서 사용되는 바, "세포," "세포주," 및 "세포 배양물"이라는 표현은 상호교환적으로 사용되고, 모든 이러한 정의는 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어는 1차 대상체 세포, 및 전이 횟수와는 상관없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손이 의도적인 또는 우연한 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정확하게 동일하지는 않을 수 있는 것으로 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이체 자손도 포함된다. 뚜렷이 명시하고자 하는 경우, 이는 문맥을 통해 자명해질 것이다.

본원에서 사용되는 바, "폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 예를 들어, 미국 특허 번호 4,683,195에 기재된 바와 같이, 핵산, RNA 및/또는 DNA의 특정 조각 소량을 증폭시키는 방법 또는 기법을 의미한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하기 위해서는 관심의 대상이 되는 영역의 말단 또는 이를 초과하는 영역으로부터의 서열 정보가 이용되어야 하며; 이들 프라이머는 증폭시키고자 하는 주형의 반대쪽 가닥의 서열과 동일하거나 유사할 것이다. 2개의 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭된 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR을 사용하여 전체 게놈 DNA로부터의 특정 RNA 서열, 특정 DNA 서열, 및 전체 세포 RNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열로부터 전사된 cDNA 등을 증폭시킬 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Mullis et al., (1987) Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol. 51:263]; [Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)]를 참조한다. 본원에서 사용되는 바, PCR은 프라이머 및 핵산 폴리머라제로서 공지된 핵산을 사용하여 핵산의 특정 조각을 증폭시키거나 생성시키는 것을 포함하는 핵산 시험 샘플을 증폭시키기 위한 핵산 폴리머라제 반응 방법의 일례 중 하나로 간주되지만, 유일의 것은 아니다.

본원에서 사용되는 바, "배선 서열"이라는 용어는 재배열되지 않은 이뮤노글로불린 DNA 서열의 서열을 의미한다. 재배열되지 않은 이뮤노글로불린 DNA의 적합한 공급원이 사용될 수 있다.

"억제제"란 예를 들어, 유전자, 단백질, 리간드, 수용체 또는 세포를 감소, 차단, 방지, 활성화 지연, 불활성화, 탈감작화 또는 하향조절하는 화합물이다. 억제제는 또한 구성적 활성을 감소, 차단 또는 불활성화시키는 조성물로서 정의될 수 있다. "길항제"는 효능제의 작용을 거스르는 화합물이다. 길항제는 효능제의 활성을 방지, 감소, 억제 또는 중화시킨다. 길항제는 또한 확인된 효능제가 없는 경우에라도, 표적, 예를 들어, 표적 수용체의 구성적 활성을 방지, 억제 또는 감소시킬 수 있다.

억제 정도를 조사하기 위해, 예를 들어, 소정의, 예를 들어, 단백질, 유전자, 세포 또는 유기체를 포함하는 샘플 또는 검정물을 잠재능이 있는 활성화제 또는 억제제로 처리하고, 상기 작용제로 처리되지 않은 대조군 샘플과 비교한다. 대조군 샘플, 즉, 작용제로 처리되지 않은 샘플에 대해 100%의 상대 활성값을 할당한다. 억제는 대조군과 비교하여 활성값이 약 90% 이하, 전형적으로 85% 이하, 더욱 전형적으로 80% 이하, 가장 전형적으로 75% 이하, 일반적으로 70% 이하, 더욱 일반적으로 65% 이하, 가장 일반적으로 60% 이하, 전형적으로 55% 이하, 보통 50% 이하, 더욱 보통 45% 이하, 가장 보통 40% 이하, 바람직하게는 35% 이하, 더욱 바람직하게는 30% 이하, 더욱 더 바람직하게는 25% 이하, 및 가장 바람직하게는 25% 미만인 경우에 달성된다.

억제에 있어서의 종점은 하기와 같이 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 세포, 생리학적 체액, 조직, 기관, 및 동물 또는 인간 대상체의 처리에 대한 억제 및 반응은 종점에 의해 모니터링될 수 있다. 종점은, 예를 들어, 염증, 발암성 또는 세포 탈과립 또는 분비, 예를 들어, 시토카인, 독성 산소 또는 프로테아제의 방출이라는 지표의 예정된 양 또는 백분율을 포함할 수 있다. 종점은, 예를 들어, 이온 유동 또는 수송; 세포 이주; 세포 유착; 세포 증식; 전이에 대한 가능성; 세포 분화; 및 표현형의 변화, 예를 들어, 염증, 아폽토시스, 형질전환, 세포 주기 또는 전이와 관련한 유전자 발현의 변화의 예정된 양을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Knight (2000) Ann . Clin . Lab . Sci. 30:145-158]; [Hood and Cheresh (2002) Nature Rev . Cancer 2:91-100]; [Timme, et al., (2003) Curr . Drug Targets 4:251-261]; [Robbins and Itzkowitz (2002) Med . Clin . North Am . 86:1467-1495]; [Grady and Markowitz (2002) Annu . Rev . Genomics Hum . Genet. 3:101-128]; [Bauer, et al., (2001) Glia 36:235-243]; [Stanimirovic and Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126] 참조).

억제의 종점은 일반적으로 대조군의 75% 이하, 바람직하게는 대조군의 50% 이하, 더욱 바람직하게는 대조군의 25% 이하, 및 가장 바람직하게는 대조군의 10% 이하이다. 일반적으로, 활성화의 종점은 대조군의 적어도 150%, 바람직하게는 대조군의 적어도 2배, 더욱 바람직하게는 대조군의 적어도 4배, 및 가장 바람직하게는 대조군의 적어도 10배이다.

리간드/수용체, 항체/항원 또는 다른 결합 쌍을 언급할 때, "특이적으로" 또는 "선택적으로" 결합한다라는 것은 단백질 및/또는 다른 생체 물질로 이루어진 이종성 집단 중 단백질, 예를 들어, TSLP의 존재를 결정짓는 결합 반응을 나타낸다. 따라서, 지정된 조건 하에서 명시된 리간드/항원은 특정 수용체/항체에 결합하며, 샘플에 존재하는 다른 단백질에는 상당량으로 결합하지 않는다.

고려되는 방법의 항체, 또는 항체의 항원 결합 부위로부터 유래된 결합 조성물은 관련없는 항원과의 친화도보다 적어도 10배 더 큰, 더욱 바람직하게는 적어도 20배 더 큰, 및 가장 바람직하게는 적어도 50배 더 큰 친화도로 그의 항원에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 예를 들어, 스캐차드 분석(Scatchard analysis)에 의한 측정시, 약 10⁹ ℓ/mol보다 더 큰 친화도를 가질 것이다 (문헌 [Munsen, et al., (1980) Analyt . Biochem. 107:220-239]).

본원에서 사용되는 바, "염증성 장애"라는 용어는 손상 또는 감염 부위에서의 국소 염증을 특징으로 하는 임의의 질환 또는 장애를 의미하며, 제한없이, 알레르기성 염증, 자가면역 질환, 및 국소 조직 부위에의 비바람직한 면역 세포 축적을 특징으로 하는 다른 장애를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "면역조절제"라는 용어는 면역 반응을 억제 또는 조절하는 천연 또는 합성 작용제를 의미한다. 면역 반응은 체액성 또는 세포성 반응일 수 있다. 면역조절제는 면역억제성 작용제 또는 항염증제를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "면역억제성 작용제," "면역억제성 약물," 또는 "면역억제제"란 면역계의 활성을 억제 또는 예방하기 위해 면역억제성 치료 요법에서 사용되는 치료제이다. 임상적으로, 이들은 이식된 기관 및 조직 (예를 들어, 골수, 심장, 신장, 간)의 거부 예방 및/또는 자가면역 질환 또는 자가면역 기원일 가능성이 높은 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 중증 근육무력증, 전신 홍반성 루푸스, 궤양성 대장염, 다발성 경화증)의 치료에 사용된다. 면역억제성 약물은 4개의 군으로 분류될 수 있다: 글루코코르티코이드 세포증식억제제; 항체 (생물학적 반응 개질제 또는 DMARD 포함); 이뮤노필린에 작용하는 약물; 증식성 장애의 치료에 사용되는 공지의 화학요법제를 비롯한 다른 약물. 다발성 경화증의 경우, 특히 본 발명의 항체는 코팍손으로 공지된 새로운 부류의 마이엘린 결합 단백질-유사 치료제와 함께 투여될 수 있다.

"항염증제" 또는 "항염증성 약물"은 스테로이드성 및 비-스테로이드성 치료제 둘 모두를 나타내는 데 사용된다. 코르티코스테로이드로서도 공지된 스테로이드는 부신에 의해 천연적으로 생산되는 호르몬인 코르티솔과 매우 유사한 약물이다. 스테로이드는 특정 염증성 병태, 예를 들어, 전신성 맥관염 (혈관 염증); 및 근육염 (근육 염증)의 주요 치료제로서 사용된다. 또한, 스테로이드는 염증성 병태, 예를 들어, 류마티스 관절염 (신체의 양측 모두의 관절에 발생하는 만성 염증성 관절염); 전신 홍반성 루푸스 (비정상적인 면역계 기능에 의해 야기되는 전신 질환); 쇼그렌 증후군 (건성안 및 구강 건조를 유발하는 만성 장애)을 치료하는 데 선택적으로 사용될 수 있다.

보통 NSAID로 약칭되는 비-스테로이드성 항염증성 약물은 진통, 해열 및 항염증성 효과를 가진 약물이다 - 이들은 통증, 열 및 염증을 감소시킨다. "비-스테로이드성"이라는 용어는 이들 약물을 스테로이드로부터 구분하기 위해 사용되며, 이는 (광범위한 다른 효과들 중에서도) 유사한 에이코사노이드-억제 항염증성 작용을 갖는다. NSAID는 일반적으로 하기 병태의 증후성 완화를 위해 지시된다: 류마티스 관절염; 골관절염; 염증성 관절병증 (예를 들어, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 라이터 증후군(Reiter's syndrome)); 급성 통풍; 월경통; 전이성 골 통증; 두통 및 편두통; 수술 후 통증; 염증 및 조직 손상으로 인한 경미한 정도 내지 중간 정도의 통증; 발열; 및 신상통. NSAID로는 살리실레이트, 아릴알카노산, 2-아릴프로피온산 (프로펜), N-아릴안트라닐산 (페남산), 옥시캄, 콕시브 (선택성 COX-2 억제제), 술폰아닐리드, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토로락, 메페남산, 멜록시캄, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 피록시캄, 살살레이트, 술린닥 또는 톨메틴을 포함한다.

II. 총체

본 발명은 염증성, 및 특히 알레르기성 염증성 장애를 치료하는 조작된 항-TSLP 항체 및 그의 용도를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 염증성 장애는 천식이다. 바람직한 실시양태에서, 알레르기성 염증성 장애는 알레르기성 비부비동염, 알레르기성 천식, 알레르기성 결막염, 또는 아토피 피부염이다. 본 발명은 또한 섬유증, 염증성 장 질환 또는 호지킨 림프종을 치료하는 조작된 항-TSLP 항체를 제공한다.

본원에서 사용되는 바, "TSLP"라는 용어는 TSLP의 변이체, 이소형, 동족체, 오르토로그 및 파라로그를 포함한다. 인간 TSLP의 아미노산 서열은 국제 공개공보 번호 WO00/17362의 서열 4에 제시된 것이다.

III. 본 발명의 조작된 TSLP 특이 항체

본 발명은 명시된 CDR 영역을 포함하는 조작된 항-TSLP 항체에 관한 것이다.

항체를 재조합적으로 조작하는 방법은 예를 들어, 보스(Boss) 등의 미국 특허 번호 4,816,397, 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 번호 4,816,567, 로(Law) 등의 유럽 특허 출원 공개 번호 438 310 및 윈터(Winter)의 유럽 특허 출원 공개 번호 239400에 기술되어 있다.

본 발명의 조작된 항체는 예를 들어, 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기를 변형시킨 것을 포함한다. 전형적으로, 그러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한가지 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀 돌연변이화"시키는 것이다. 더욱 구체적으로, 체세포 돌연변이를 거친 항체는 항체가 유래된 배선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 그러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다.

또 다른 유형의 프레임워크 변형으로는 프레임워크 영역 내, 또는 심지어는 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이화시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로 지칭되며, 이는 미국 특허 공개 번호 20030153043에 추가로 상세히 기술되어 있다.

프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 추가로, 또는 그에 대한 대안으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 예를 들어, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성과 같은 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하기 위하여 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 부분을 항체에 부착시킬 수 있음), 그의 당화를 변경시키고, 다시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경시키기 위하여 변형될 수 있다. 각각의 상기 실시양태는 하기에서 보다 상세하게 설명된다. Fc 영역에서 잔기의 번호화는 카바트의 EU 인덱스의 것이다.

한 실시양태에서, 항체는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역 내의 228번 위치에 대응하는 위치에 세린의 프롤린으로의 돌연변이 (S228P; EU 인덱스)를 포함하는 IgG4 이소형 항체이다. 상기 돌연변이는 힌지 영역 내의 중쇄간 이황화 가교의 이종성을 없애는 것으로 보고되었다 (문헌 [Angal et al., 상기 문헌 동일]; 241번 위치는 카바트 번호화 체계를 기초로 한다).

한 실시양태에서, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어, 증가 또는 감소될 수 있도록 CH1의 힌지 영역을 변형시킨다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425에 추가로 설명되어 있다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 촉진시키거나, 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해, CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수를 변경시킨다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 항체의 Fc 힌지 영역을 돌연변이화시킨다. 더욱 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입하면, 항체는 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코커스 단백질 A (SpA) 결합에 비하여 손상된 SpA 결합을 나타내게 된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745에 추가로 상세하게 설명되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 생물학적 반감기가 증가시키기 위해 항체를 변형시킨다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375에 기술되어 있는 바와 같이, 하기 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 별법으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해서, 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022에 기술되어 있는 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 유도된 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경시킬 수 있다.

또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체의 효과기 기능(들)을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 효과기 리간드에 대하여 변경된 친화도를 갖지만, 모체 항체의 항원 결합능은 보유하도록, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 그에 대한 친화도가 변경된 효과기 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260에 추가로 상세하게 설명되어 있다.

또 다른 예에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 폐지된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551에 추가로 상세하게 설명되어 있다.

또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시킬 수 있는 항체의 능력을 변경시킬 수 있다. 이러한 접근법은 PCT 공개공보 WO 94/29351에 추가로 설명되어 있다.

추가의 또 다른 예에서, 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개할 수 있는 항체의 능력을 증가시키고/거나, Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 하기 위치에 있는 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 Fc 영역을 변형시킨다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439번 위치. 이러한 접근법은 PCT 공개공보 WO 00/42072에 추가로 설명되어 있다. 또한, 인간 IgG1 상의 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부위는 지도화되어 있으며, 결합이 개선된 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조). 256, 290, 298, 333, 334 및 339번 위치에서 발생한 특이적 돌연변이는 FcγRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 하기 조합 돌연변이체도 FcγRIII 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.

또 다른 실시양태에서, 항체의 당화를 변형시키거나 변경시켜 탄수화물 부분을 결실시키거나, 또는 그를 항체에 부가할 수 있다. 예를 들어, 비당화된 항체를 제조할 수 있다 (즉, 당화가 결여된 항체). 당화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도가 증가하도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 이상의 당화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산을 치환시켜 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 당화 부위를 제거함으로써 이 부위에서 당화가 일어나지 않도록 만들 수 있다. 이러한 비당화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861을 참조한다.

추가로 또는 별법으로, 당화 유형이 변경된 항체, 예를 들어, 푸코실 잔기의 양이 감소된 저푸코실화 항체 또는 이분화 GlcNAc 구조가 증가한 항체를 제조할 수 있다. 이와 같이 변경된 당화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 변경된 당화 기구를 가진 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 이루어질 수 있다. 변경된 당화 기구를 가진 세포는 당업계에 기술되어 있으며, 이는 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 당화가 변경된 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709에는 푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 (α(1,6)푸코실트랜스퍼라제)이 없는 바, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체의 탄수화물 상에는 푸코스가 존재하지 않는다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 대체 벡터를 사용한 CHO/DG44 세포 내의 FUT8 유전자의 표적화된 파기에 의해 생성되었다 (미국 특허 공개 번호 20040110704 및 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22] 참조). 또 다른 예로서, EP 1,176,195에는 α-1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거함으로써 세포주에서 발현된 항체가 저푸코실화를 보이도록 한, 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 기능상 파괴되어 있는 세포주가 기술되어 있다. 또한, EP 1,176,195에는 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 효소 활성이 낮은 세포주, 또는 그러한 효소 활성을 갖지 않는 세포주, 예를 들어, 래트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)이 기술되어 있다. PCT 공개공보 WO 03/035835에는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되고, 또한 이로써 해당 숙주 세포에서 발현된 항체가 저푸코실화된 것인 변이체 CHO 세포주인 Lec13 세포가 기술되어 있다 (또한, 문헌 [Shields et al., (2002) J. Biol . Chem . 277:26733-26740] 참조). 또한, 당화 프로파일이 변형된 항체는 PCT 공개공보 WO 06/089231에 기술된 바와 같이 계란에서 생산될 수 있다. 별법으로, 당화 프로파일이 변형된 항체는 식물 세포, 예를 들어, 렘나(Lemna)에서 생산될 수 있다. PCT 공개공보 WO 99/54342에는 조작된 세포주에서 발현된 항체의 이분화 GlcNAc 구조를 증가시켜, 이로써 항체의 ADCC 활성이 증가하도록 만들기 위해 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주가 기술되어 있다 (또한, 문헌 [Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 별법으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단 제거될 수 있다; 예를 들어, 푸코시다제 α-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다 (문헌 [Tarentino et al., (1975) Biochem . 14:5516-23]).

본 개시내용에 의해 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형으로는 페길화가 있다. 항체를 페길화하여, 예를 들어, 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 일반적으로 항체 또는 그의 단편을, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에서 PEG, 예를 들어, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 바람직하게, 페길화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에서 사용되는 바,"폴리에틸렌 글리콜"이라는 용어는 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용된 임의의 형태의 PEG, 예를 들어, 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 것으로 한다. 특정 실시양태에서, 페길화되는 항체는 비당화된 항체이다. 단백질을 페길화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 및 EP 0 401 384를 참조한다.

본 발명의 인간화된 항-TSLP 항체의 아미노산 서열 변이체는 인간화된 항-TSLP 항체 DNA 내로 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 변이체는 본원에 개시되고, 본원에서 청구되는 인간화된 항-TSLP 항체에 대해 제시된 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 단, 최종 구축물이 원하는 특징을 갖는 한, 최종 구축물에 도달하기 위해서는 결실, 삽입, 및 치환의 어떠한 조합도 이루어질 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 아미노산 변화는 또한 예를 들어, 당화 부위의 위치 또는 수를 변화시키는 등, 인간화된 항-TSLP 항체의 번역 후 과정을 변경시킬 수 있다.

돌연변이 유발에 바람직한 위치인 인간화된 항-TSLP 항체 폴리펩티드의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085]에 기술된 바와 같은, "알라닌 스캐닝 돌연변이유발법"으로 언급된다. 여기서, 표적 잔기의 잔기 또는 기를 확인하고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예를 들어, Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu), 아미노산과 TSLP 항원과의 상호작용에 영향을 미칠 수 있도록 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시킨다. 이어서, 치환 부위에서, 또는 치환 부위를 위해 추가의 또는 다른 변이체를 도입시킴으로써 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 잔기를 세밀히 구별짓는다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정된 반면, 돌연변이 그 자체의 성질이 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해서, Ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발법을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 인간화된 항-TSLP 항체 변이체를 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 범위의 길이를 가진 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합 뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입도 포함한다. 말단 삽입의 예로는 에피토프 태그에 융합된 항체 또는 N-말단 메티오닐 잔기를 가진 인간화된 항-TSLP 항체를 포함한다. 인간화된 항-TSLP 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드의, 인간화된 항-TSLP 항체의 N-또는 C-말단에의 융합을 포함한다.

또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체에서는 인간화된 항-TSLP 항체 분자 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고, 그 자리에 다른 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이유발법을 위해 가장 큰 관심의 대상이 되는 부위로는 초가변 루프가 있지만, FR 변경도 또한 고려된다. 항원 결합에 관여하는 초가변 영역 잔기 또는 FR 잔기는 일반적으로 상대적으로 보존적인 방식으로 치환된다.

추가의 또 다른 유형의 아미노산 변이체는 최종 인간화된 항체의 화학적 안정성을 보다 크게 하기 위해 제공되는 잔기 치환에 의해 이루어진 것이다.

특정 실시양태에서, 최종 항체의 화학적 안정성을 보다 크게 하기 위해 하기와 같이, 노출된 측쇄를 함유하는 특정 아미노산을 또 다른 아미노산 잔기로 변경시키는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, CDR 내 임의의 Asn-Gly 서열에서의 이소아스파르테이트가 형성될 수 있는 잠재성을 감소시키기 위해 아스파라긴 (Asn) 잔기를 Gln 또는 Ala으로 변경시킬 수 있다. Asp-Gly 서열에서도 유사한 문제가 발생할 수 있다 (문헌 [Reissner and Aswad (2003) Cell . Mol . Life Sci. 60:1281]). 이소아스파르테이트 형성은 항체의, 그의 표적 항원에의 결합을 약화시키거나, 완전하게 제거할 수 있다. 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin . Immunol . 116:731 at 734]를 참조한다. 한 실시양태에서, 아스파라긴을 글루타민 (Gln)으로 변경시킨다. 탈아미드화의 가능성을 감소시키기 위해 아스파라긴 (Asn) 또는 글루타민 (Gln) 잔기에 인접한 아미노산을 변경시키는 것이 또한 바람직할 수 있는데, 이는 소형 아미노산이 아스파라긴 또는 글루타민에 인접하여 존재할 경우, 더 큰 비율로 발생한다. 문헌 [Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261]을 참조한다. 추가로, 항원 결합 친화도를 감소시키며, 또한 최종 항체 제제에서의 분자 이종성의 원인이 되는, 메티오닌의 황이 산화될 수 있는 가능성을 감소시키기 위해 CDR 중 임의의 메티오닌 잔기 (전형적으로 용매에 노출된 Met)를 Lys, Leu, Ala, 또는 Phe로 변경시킬 수 있다. 동일하게, 한 실시양태에서, 메티오닌을 알라닌 (Ala)으로 변경시킨다. 추가로, 잠재적으로 분리되기 쉬운 Asn-Pro 펩티드 결합을 방해하거나 최소화시키기 위해, CDR 에서 발견되는 임의의 Asn-Pro 조합을 Gln-Pro, Ala-Pro, 또는 Asn-Ala로 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 이어서, 상기와 같이 치환된 항체를 스크리닝하여 상기 치환으로 인해 TSLP 결합 친화도 또는 다른 원하는 생물학적 활성이 허용되지 않는 수준으로까지 감소되지 않도록 한다.

추가로, 항원 결합 친화도를 감소시키고, 또한 최종 항체 제제에서의 분자 이종성의 원인이 되는, 메티오닌의 황이 산화될 수 있는 가능성을 감소시키기 위해 설치류 CDR 중 메티오닌 잔기를 변경시킬 수 있다. 동일하게, 한 실시양태에서, 메티오닌을 알라닌 (A)으로 변경시킨다. 이어서, 상기와 같이 치환된 항체를 스크리닝하여 상기 치환으로 인해 TSLP 결합 친화도가 허용되지 않는 수준으로까지 감소되지 않도록 한다.

인간화된 TSLP 특이 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법으로는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연적으로 발생된 아미노산 서열 변이체인 경우) 또는 올리고뉴클레오티드 매개된 (또는 부위 지시된) 돌연변이유발법, PCR 돌연변이유발법, 및 인간화된 항-TSLP 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태에 대한 카세트 돌연변이유발법에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

보통, 인간화된 항-TSLP 항체의 아미노산 서열 변이체는 중쇄 또는 경쇄의 원래의 인간화된 항체 아미노산 서열과 적어도 97%의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 이러한 서열과 관련하여 동일성 또는 상동성이란 본원에서는 서열을 정렬하고, 필요할 경우, 서열 동일성(%)이 최대가 되도록 하기 위해 갭을 도입한 후, 어떤 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않았을 때, 인간화된 항-TSLP 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. N-말단, C-말단, 또는 내부 확장, 결실, 또는 항체 서열 내로의 삽입 중 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로서 해석되지 않아야 한다.

인간화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA, 및 IgE를 비롯한, 임의 부류의 이뮤노글로불린으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 항체는 IgG 항체이다. IgG₁, IgG₂, IgG₃, 및 IgG4를 비롯한 임의 이소형의 IgG가 사용될 수 있다. IgG 이소형의 변이체 또한 고려시 된다. 인간화된 항체는 1 초과의 부류 또는 이소형으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 하기 기재하는 생물검정법으로 항체를 스크리닝함으로써 원하는 생물학적 활성을 생성하는 데 필요한 불변 도메인 서열을 쉽게 최적화시킬 수 있다.

유사하게, 임의 부류의 경쇄가 본원의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 카파, 람다, 또는 그의 변이체가 본 발명의 조성물 및 방법에 유용하다.

비-인간 항체로부터의 CDR 서열 중 임의의 적합한 일부가 사용될 수 있다. CDR 서열은 사용된 인간 및 비-인간 항체 서열로부터 CDR 서열이 구별되도록 하기 위해 하나 이상의 잔기의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이화될 수 있다. 그러한 돌연변이는 최소가 되도록 고려된다. 전형적으로, 인간화된 항체 잔기의 적어도 95%, 가장 바람직하게는 97% 초과가 비-인간 CDR 잔기에 상응할 것이다.

인간 항체로부터의 FR 서열 중 임의의 적합한 일부가 사용될 수 있다. FR 서열은 사용된 인간 및 비-인간 항체 서열로부터 FR 서열이 구별되도록 하기 위해 하나 이상의 잔기의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이화될 수 있다. 그러한 돌연변이는 최소가 되도록 고려된다. 전형적으로, 인간화된 항체 잔기의 적어도 75%, 더욱 빈번하게는 90%, 및 가장 바람직하게는 95% 초과가 인간 FR 잔기의 것에 상응할 것이다.

CDR 및 FR 잔기는 카바트의 표준 서열 정의에 따라 결정된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987)]).

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 결합 조성물은 하기 서열 중 하나 이상을 포함한다:

· CDR-H1 서열 GYIFTDYAMH (서열 1).

· CDR-H2 서열 TFIPLLDTSDYAQKFQG (서열 2).

· CDR-H3 서열 MGVTHSYVMDA (서열 3).

· CDR-L1 서열 RASQPISISVH (서열 4).

· CDR-L2 서열 FASQSIS (서열 5).

· CDR-L3 서열 QQTFSLPYT (서열 6).

· 서열 7에 제시된 중쇄 가변 아미노산 서열.

· 서열 8에 제시된 경쇄 가변 아미노산 서열.

· 서열 9에 제시된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열.

· 서열 10에 제시된 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열.

· 서열 11에 제시된 중쇄 아미노산 서열. 본 서열은 추가로 하기 리더 서열: MAVLGLLFCLVTFPSCVLS (서열 15)를 포함할 수 있다.

· 서열 12에 제시된 경쇄 아미노산 서열. 본 서열은 추가로 하기 리더 서열: MAPVQLLGLLVLFLPAMRC (서열 16)를 포함할 수 있다.

· 중쇄를 코딩하는 핵산 서열은 서열 13에 제시되어 있다. 본 서열은 리더 서열, 바람직하게, 하기 리더 서열: MAVLGLLFCLVTFPSCVLS (서열 15)를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.

· 경쇄를 코딩하는 핵산 서열은 서열 14에 제시되어 있다. 본 서열은 리더 서열, 바람직하게, 하기 리더 서열: MAPVQLLGLLVLFLPAMRC (서열 16)를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명은 (상기 제시된 바와 같은) CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 이뮤노글로불린 및 (상기 제시된 바와 같은) CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 이뮤노글로불린을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 서열 8 또는 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 이뮤노글로불린 가변 영역 및 서열 7 및 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 이뮤노글로불린 가변 영역 (예를 들어, 서열 7은 서열 8과 쌍을 형성하거나; 또는 서열 11은 서열 12와 쌍을 형성)을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기와 같은 항체 또는 단편은 예를 들어, IgG (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)와 함께 이뮤노글로불린 불변 도메인에 연결되어 있을 수 있다. 상기 항체 또는 단편, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 그의 제약 조성물 또한 본 발명의 일부이다.

일부 실시양태에서, 상이한 불변 도메인이 본원에서 제공하는 인간화된 V_L 및 V_H 영역에 추가될 수 있다. 예를 들어, 변경된 효과기 기능을 위해 본 발명의 항체 (또는 단편)의 특정의 의도된 사용이 요청되는 경우, IgG1 이외의 중쇄 불변 도메인이 사용될 수 있다. 비록 IgG1 항체가 장기간의 반감기 및 효과기 기능, 예를 들어, 보체 활성화 및 항체-의존성 세포성 세포독성을 제공하기는 하지만, 그러한 활성이 항체의 모든 용도에 바람직한 것은 아닐 수 있다. 그러한 경우, 예를 들어, IgG4 불변 도메인이 사용될 수 있다.

IV. 항체 접합체

본 발명의 결합 화합물, 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 또한 화학적 모이어티에 접합될 수 있다. 특히, 화학적 모이어티는 중합체, 방사성핵종 또는 세포독성 인자일 수 있다. 바람직하게, 화학적 모이어티는 대상체의 체내에서 항체 분자의 반감기를 증가시키는 중합체이다. 적합한 중합체로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (예를 들어, 분자량이 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa 또는 40 kDa인 PEG), 덱스트란 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 문헌 [Lee, et al., (1999) (Bioconj . Chem. 10:973-981)]에는 PEG 접합된 단일-쇄 항체가 개시되어 있다. 문헌 [Wen, et al., (2001) (Bioconj . Chem. 12:545-553)]에는 항체를, 방사성금속 킬레이트제 (디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA))에 부착된 PEG와 접합시키는 것이 개시되어 있다.

본 발명의 항체 및 항체 단편은 또한 표지, 예를 들어, ⁹⁹Tc, ⁹⁰Y, ¹¹¹In, ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, ¹³¹I, ¹¹C, ¹⁵O, ¹³N, ¹⁸F, ³⁵S, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ²²⁶Ra, ⁶⁰Co, ⁵⁹Fe, ⁵⁷Se, ¹⁵²Eu, ⁶⁷CU, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd, ²³⁴Th, 및 ⁴⁰K, ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ⁵²Tr 및 ⁵⁶Fe에 접합될 수 있다.

본 발명의 항체 및 항체 단편은 또한 형광단, 예를 들어, 희토류 킬레이트, 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 플루오레사민, ¹⁵²Eu, 단실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 에쿼린 표지, 2,3-디히드로프탈라진디온, 비오틴/아비딘, 스핀 표지 및 안정한 자유 라디칼을 비롯한, 형광성 또는 화학발광성 표지에 접합될 수 있다.

항체 분자는 또한 세포독성 인자, 예를 들어, 디프테리아 독소, 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질 및 화합물 (예를 들어, 지방산), 디안틴 단백질, 피토락카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질 PAPI, PAPII, 및 PAP-S, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(saponaria officinalis) 억제제, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신에 접합될 수도 있다.

문헌 [Hunter, et al., (1962) Nature 144:945]; [David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014]; [Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219]; 및 [Nygren, J., (1982) Histochem . and Cytochem. 30:407]에 기술된 방법들을 비롯한, 본 발명의 항체 분자를 각종 모이어티에 접합시키기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 항체 접합 방법은 통상적인 것으로, 당업계에는 매우 잘 알려져 있다.

또 다른 실시양태에서, 상이한 불변 도메인이 본원에서 제공하는 CDR로부터 유래된 인간화된 V_L 및 V_H 영역에 추가될 수 있다. 예를 들어, 변경된 효과기 기능을 위해 본 발명의 항체 (또는 단편)의 특정의 의도된 사용이 요청되는 경우, IgG1 이외의 중쇄 불변 도메인이 사용될 수 있거나, 하이브리드 IgG1/IgG4가 사용될 수 있다.

비록 IgG1 항체가 장기간의 반감기 및 효과기 기능, 예를 들어, 보체 활성화 및 항체-의존성 세포성 세포독성을 제공하기는 하지만, 그러한 활성이 항체의 모든 용도에 바람직한 것은 아닐 수 있다. 그러한 경우, 예를 들어, IgG4 불변 도메인이 사용될 수 있다. hu Mab8D5에서 IgG4 불변 도메인은 108번 위치에서 천연 인간 IgG4 불변 도메인과는 상이한데 (스위스-프로트(Swiss-Prot) 기탁 번호 P01861.1, 그의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨), 여기서 적절한 쇄내 이황화 결합 형성을 방해할 수 있는 Cys106과 Cys109 사이의 잠재적 가능성이 있는 쇄간 이황화 결합을 막기 위해 천연 Ser108이 Pro로 대체되어 있다. 문헌 [Angal et al (1993) Mol Imunol 30:105]를 참조한다.

V. 본 발명의 결합 화합물의 생물학적 활성

본원에서 인간화된 항-TSLP 항체에서 바람직한 것으로 확인된 특징을 가진 결합 화합물을 시험관내에서의 억제성 생물학적 활성 또는 적합한 결합 친화도에 대해 스크리닝할 수 있다.

(예를 들어, 인간 TSLP에 대한) 항체의 친화도는 표준 분석법을 사용하여 측정할 수 있다. 바람직한 인간화 항체는 약 1x10^-7 M 이하; 바람직하게는, 약 1x10^-8 M 이하; 더욱 바람직하게는, 약 1x10^-9 M 이하; 및 가장 바람직하게는, 약 1x10^-10 M 이하인 K_D 값으로 인간 TSLP에 결합하는 항체이다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 항체 및 그의 단편은 생물학상 활성인 항체 및 단편이다. 본원에서 사용되는 바, "생물학상 활성"이라는 용어는 원하는 항원성 에피토프에 결합할 수 있고, 생물학적 효과를 직접 또는 간접적으로 발휘할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 의미한다. 전형적으로, 이러한 효과는 TSLP가 그의 수용체에 결합하지 못함으로써 발생되는 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 항체 및 그의 단편은 hTSLP-수용체 및 IL-7R알파로 형질감염된 Baf-3 세포주의 hTSLP 유도성 증식; TSLP-수용체 및 루시퍼라제 리포터 시스템으로 형질감염된 Baf-3 세포주로부터의 hTSLP 유도성 루시퍼라제 발현; PBMC로부터 단리된 인간 1차 단핵구로부터의 hTSLP 유도성 TARC 분비; 및 Th2 분화의 유도를 억제한다.

본원에서 사용되는 바, "특이적"이라는 용어는 표적 항원 에피토프에 대한 항체의 선택적인 결합을 의미한다. 항체는 주어진 조건들 하에서 TSLP에 대한 결합을 관계없는 항원 또는 항원 혼합물에 대한 결합과 비교함으로써 결합 특이성에 대해 시험될 수 있다. 항체가 관계없는 항원 또는 항원 혼합물에 대한 결합보다 적어도 10배, 바람직하게는 20 또는 50배 더 큰 정도로 TSLP에 결합할 경우에, 이는 특이적인 것으로 간주된다. TSLP에 "특이적으로 결합"하는 항체는 TSLP-유래 서열을 포함하지 않는 단백질에는 결합하지 않고, 즉, 본원에서 사용되는 바, "특이성"이란 TSLP 특이성에 관한 것이지, 해당 단백질에서 존재할 수 있는 다른 서열에 관한 것은 아니다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바, TSLP에 "특이적으로 결합"하는 항체는 전형적으로 TSLP 및 FLAG^® 펩티드 태그를 포함하는 융합 단백질인, FLAG-h TSLP에 결합하지만, FLAG^® 펩티드 태그 단독 또는 TSLP 이외의 단백질에 융합된 경우에는 결합하지 않는다.

VI. 제약 조성물

제약 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 항체 또는 그의 단편을 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합한다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia : National Formulary , Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]를 참조한다. 치료제 및 진단제 제형물은 생리학상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제와 혼합함으로써 예를 들어, 동결건조된 분말제, 슬러리, 수용액 또는 현탁액 형태로 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman , et al ., (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY]; [Gennaro (2000) Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY]; [Avis, et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms : Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms : Tablets , Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms : Disperse Systems, Marcel Dekker, NY]; [Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety , Marcel Dekker, Inc., New York, NY] 참조).

단독으로 또는 면역억제성 작용제와 함께 조합하여 투여된 항체 조성물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 시험 동물에서, 예를 들어, LD₅₀ (집단의 50%가 치사되는 용량) 및 ED₅₀ (집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 측정하기 위한 표준 제약 절차로 측정할 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, 이는 LD₅₀ 및 ED₅₀ 사이의 비로 표시될 수 있다. 치료 지수가 높은 항체가 바람직하다. 이러한 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득한 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위로 제형화하는 데 사용될 수 있다. 상기 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위내에서 달라질 수 있다.

적합한 투여 경로로는 비경구 투여, 예를 들어, 근육내, 정맥내 또는 피하 투여를 포함한다. 본 발명의 제약 조성물에 사용되거나 또는 본 발명의 방법을 수행하는 데 사용되는 항체의 투여는 경구 섭취, 흡입, 국소 적용 또는 피부, 피하, 복강내, 비경구, 동맥내 또는 정맥내 주사와 같은 각종의 통상적인 방식으로 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 정맥내로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 피하로 투여된다.

별법으로, 전신 방식보다는 국소로, 예를 들어, 흔히 데포 또는 지속 방출 제형으로 면역병리학적 성질을 특징으로 하는 병원체-유발 병변 또는 관절염성 관절 내로 직접 항체를 주사하는 것과 같이 항체를 투여할 수 있다. 추가로, 표적화된 약물 전달 시스템 중의, 예를 들어, 면역병리학적 성질을 특징으로 하는 병원체-유발 병변 또는 관절염성 관절을 표적화하는, 조직-특이적인 항체로 코팅된 리포솜 중의 항체를 투여할 수 있다. 리포솜은 이환 조직으로 표적화되고, 그에 의해 선택적으로 취해질 것이다.

치료용 투여 요법을 선택하는 것은 물질의 혈청 또는 조직 전환율, 증상 수준, 물질의 면역원성 및 생물학적 기질에서의 표적 세포의 접근성을 비롯한 여러 인자에 따라 달라진다. 바람직하게, 투여 요법은 허용되는 수준의 부작용에 부합하면서 환자에게 전달된 치료제의 양을 최대화시킨다. 따라서, 전달되는 생물제제의 양은 부분적으로는 특정 물질 및 치료되는 병태의 중증도에 따라 달라진다. 항체, 시토카인 및 소형 분자의 적절한 용량을 선택하는 것에 관한 지침이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK]; [Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY]; [Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY]; [Baert, et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608]; [Milgrom, et al., (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973]; [Slamon, et al., (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792]; [Beniaminovitz, et al., (2000) New Engl . J. Med . 342:613-619]; [Ghosh, et al., (2003) New Engl . J. Med . 348:24-32]; [Lipsky, et al., (2000) New Engl . J. Med . 343:1594-1602] 참조).

적절한 용량은 예를 들어, 치료에 영향을 미치는 것으로 당업계에 공지되어 있거나 그러한 것으로 의심되거나, 또는 치료에 영향을 미칠 것으로 예측되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 결정된다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 약간 적은 양에서 시작하며, 그후 임의의 부정적인 부작용에 비해 바람직하거나 최적인 효과가 달성될 때까지 소량씩 증가시킨다. 중요한 진단 척도로는, 예를 들어, 염증의 증상 또는 생산된 염증성 시토카인의 수준이 포함된다. 바람직하게는, 사용될 생물제제는 치료를 위해 표적화된 동물과 동일한 종으로부터 유래된 것이며, 이에 의해 시약에 대한 염증, 자가면역 또는 증식 반응은 최소화된다.

항체, 항체 단편 및 시토카인은 연속 주입에 의해 제공되거나, 예를 들어, 1일, 1주, 또는 주당 1-7회 간격으로 투여되는 투약으로 제공될 수 있다. 정맥내, 피하, 국소, 경구, 비강, 직장, 근육내, 뇌내, 척수내 또는 흡입에 의해 투약이 이루어질 수 있다. 바람직한 투약 프로토콜은 상당히 바람직하지 않은 부작용을 회피할 수 있는 최대 용량 또는 투약 빈도를 포함하는 프로토콜이다. 주당 총 용량은 일반적으로 적어도 0.05 ㎍/kg (체중), 더욱 일반적으로 적어도 0.2 ㎍/kg, 가장 일반적으로는 적어도 0.5 ㎍/kg, 전형적으로 적어도 1 ㎍/kg, 더욱 전형적으로 적어도 10 ㎍/kg, 가장 전형적으로는 적어도 100 ㎍/kg, 바람직하게는 적어도 0.2 mg/kg, 더욱 바람직하게는 적어도 1.0 mg/kg, 가장 바람직하게는 적어도 2.0 mg/kg, 최적으로 적어도 10 mg/kg, 더욱 최적으로 적어도 25 mg/kg, 및 가장 최적으로는 적어도 50 mg/kg이다 (예를 들어, 문헌 [Yang, et al., (2003) New Engl . J. Med. 349:427-434]; [Herold, et al., (2002) New Engl . J. Med . 346:1692-1698; [Liu, et al., (1999) J. Neurol . Neurosurg . Psych . 67:451-456; [Portielji, et al., (20003) Cancer Immunol . Immunother . 52:133-144] 참조). 소형 분자 치료제, 예를 들어, 펩티드 모방체, 천연 생성물, 또는 유기 화합물질의 바람직한 용량은 몰수/kg 기준으로 항체 또는 폴리펩티드에 대한 것과 거의 동일하다.

본원에서 사용되는 바, "억제시키다" 또는 "치료하다" 또는 "치료"라는 것은 자가면역 질환 또는 병원체-유도성 면역병리학적 상태와 관련된 증상 발병의 지연 및/또는 발병될 또는 발병될 것으로 예측되는 상기 증상의 중증도의 감소를 포함한다. 상기 용어는 추가로 기존의 조절되지 않거나 원치않는 자가면역-관련된 또는 병원체-유도된 면역병리학적 증상을 호전시키고, 추가의 증상을 예방하며, 그러한 증상의 근본적인 원인을 호전시키거나 예방하는 것을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 염증성 질환을 앓는 척추동물 대상체에 유리한 결과를 부여한 것을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, "치료학상 유효량", 또는 "유효량"이라는 용어는 단독으로 투여되거나, 또는 추가의 치료체와 함께 조합하여 세포, 조직 또는 대상체에게 투여되었을 때, 자가면역 질환 또는 병원체-유도성 면역병리학적 상태와 관련된 질환 또는 병태 또는 상기 질환의 진행을 예방하거나 호전시키는 데 효과적인, 항-TSLP 항체 또는 그의 단편의 양을 의미한다. 치료적으로 유효한 투여량은 추가로 증상들을 호전시키는 데, 예를 들어, 관련 의학적 상태를 치료, 치유, 예방 또는 호전시키거나, 또는 그러한 병태의 치료, 치유, 예방 또는 호전율을 증가시키는 데 충분한 화합물의 양을 의미한다. 단독 투여되는 개별 활성 성분에 적용되는 경우, 치료적으로 유효한 투여량은 상기 성분을 단독으로 나타낸다. 조합물에 적용되는 경우, 치료적으로 유효한 투여량은 조합하여, 연속으로 또는 동시에 투여되는 것에 상관없이 치료 효과를 야기하는 활성 성분의 조합된 양을 나타낸다. 유효량의 치료제는 전형적으로 증상을 10% 이상; 보통 20% 이상; 바람직하게는 약 30% 이상; 더욱 바람직하게는 40% 이상, 및 가장 바람직하게는 50% 이상 감소시킬 것이다.

본 발명의 항-TSLP 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 제2 치료제, 예를 들어, 시토카인, 스테로이드, 화학요법제, 항생제 또는 방사선 조사 (또는 본원에서 논의된 상기와 같은 임의의 작용제)를 함께 공동-투여하는 방법, 또는, 그를 사용하는 치료 방법이 본 발명의 일부를 형성한다 (일반적으로, 예를 들어, 문헌 [Hardman, et al., (eds.) (2001) Goodman and G ilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10^th ed., McGraw-Hill, New York, NY]; [Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice : A Practical Approach , Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA]; [Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy , Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA] 참조). 본 발명의 항체 및 그의 항원 결합 단편 및 그의 제약 조성물은 또한 다른 면역억제성 작용제 또는 면역조절제를 함유할 수 있다. 항염증제, 코르티코스테로이드, 시클로스포린, 타크롤리무스 (즉, FK-506), 시롤리무스, 인터페론, 가용성 시토카인 수용체 (예를 들어, sTNRF 및 sIL-1R), 시토카인 활성을 중화시키는 작용제 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 에타너셉트), 마이코페노레이트 모페틸, 15-데옥시스페르구알린, 탈리도마이드, 글라티라머, 아자티오프린, 레플루노마이드, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 면역억제성 작용제가 사용될 수 있다. 비-스테로이드성 항염증성 약물 또한 본 발명의 항체 및 그의 항원 결합 단편 및 그의 제약 조성물과 함께 제공될 수 있다. 제약 조성물은 또한 다른 치료학적 기법, 예를 들어, 광선요법 및 방사선 조사와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 범주는 본 발명의 임의의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 임의의 제2 치료제 (예를 들어, 본원에서 논의된 것, 예를 들어, 항체 또는 단편은 제2 치료제와는 별도로 제형화되거나, 또는 이들은 함께 제형화될 수 있음)를 포함하는 조성물을 포함한다.

전형적인 수의학적 대상체, 실험 대상체 또는 연구 대상체로는 원숭이, 개, 고양이, 래트, 마우스, 토끼, 기니아 피그, 말 및 인간을 포함한다.

VII. 항체 생산

본 발명의 항체를 재조합적으로 생산하기 위해, 2개 쇄를 코딩하는 핵산을 단리시키고, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 하나 이상의 복제 가능한 벡터 내로 삽입한다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리시키고, 서열 분석한다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 구성성분에는 일반적으로 하기 중의 하나 이상이 포함되나, 이에 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열. 한 실시양태에서, 본 발명의 인간화된 항-TSLP 항체의 경쇄 및 중쇄 둘 모두는 동일한 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 아데노바이러스 벡터로부터 발현된다.

본 발명의 항체 및 그의 항원 결합 단편은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 배양물 중의 포유동물 또는 곤충 세포에서, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포, 마우스 골수종 NSO 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 난소 (Sf9) 세포에서 발현된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 및 그의 항원 결합 단편은 진균 세포, 예를 들어, 피치아(Pichia) 세포, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포, 피치아 핀란디카(Pichia finlandica) 세포, 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila) 세포, 피치아 코클라마에(Pichia koclamae) 세포, 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens) 세포, 피치아 미누타(Pichia minuta) 세포 (오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피치아 린드네리(Pichia lindneri)), 피치아 오펀티에(Pichia opuntiae) 세포, 피치아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans) 세포, 피치아 살릭타리아(Pichia salictaria) 세포, 피치아 구에르쿰(Pichia guercuum) 세포, 피치아 피즈페리(Pichia pijperi) 세포, 피치아 스팁티스(Pichia stiptis) 세포, 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica) 세포, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 세포, 사카로마이세스(Saccharomyces) 세포, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 세포, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 세포, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 세포, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 세포, 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 세포, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 세포, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 세포, 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 세포, 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense) 세포, 푸사리움(Fusarium) 세포, 푸사리움 그라미네움(Fusarium gramineum) 세포, 푸사리움 베네나텀(Fusarium venenatum) 세포, 또는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 세포에서 생산된다.

한 실시양태에서, CHO 세포로부터 분비된 항체를 회수하고, 표준 크로마토그래피 방법, 예를 들어, 단백질 A, 양이온 교환, 음이온 교환, 수소성 상호작용, 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 의해 정제한다. 생성된 항체를 농축시키고, 20 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5)에서 보관한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 WO2005/040395에 기술된 방법에 따라 효모에서 생산된다. 간략하면, 관심의 대상이 되는 항체의 개별 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 벡터를, 임의로 상보성 영양요구 균주인 상이한 효모 반수체 세포, 예를 들어, 상이한 교배형의 효모 피치아 파스토리스에 도입한다. 이어서, 형질전환된 반수체 효모 세포를 교배 또는 융합시켜 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 생산할 수 있는 이배체 효모 세포를 수득할 수 있다. 이어서, 이배체 균주는 완전 조립되고 생물학상 활성인 항체를 분비할 수 있다. 상기 2가지 쇄의 상대적인 발현 수준은, 예를 들어, 상이한 카피수를 가진 벡터를 사용하거나, 상이한 강도의 전사 프로모터를 사용하거나, 쇄 중 하나 또는 둘 모두를 코딩하는 유전자의 전사를 추진하는 유도성 프로모터로부터 발현을 유도함으로써 최적화될 수 있다.

한 실시양태에서, 항-TSLP 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄를 효모 반수체 세포 내로 도입하여 다수의 경쇄를 발현하는 한 교배형의 반수체 효모 균주로 이루어진 라이브러리 및 다수의 중쇄를 발현하는 다른 교배형의 반수체 효모 균주로 이루어진 라이브러리를 생성한다. 이러한 반수체 균주의 라이브러리는 교배 (또는 스페로플라스트로서 융합)되어 경쇄 및 중쇄의 각종 가능한 순열로 이루어진 항체의 조합 라이브러리를 발현하는 일련의 이배체 효모 세포를 생산할 수 있다. 이어서, 항체의 조합 라이브러리를 스크리닝하여 항체 중 임의의 것이 원래의 항체보다 우수한 특성 (예를 들어, TSLP에 대해 보다 높은 친화도)을 가지는지 결정할 수 있다 (예를 들어, WO2005/040395 참조).

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항체 가변 도메인의 일부가, 분자량이 대략 13 kDa인 폴리펩티드 내에 연결되어 있는 인간 도메인 항체이다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2004/0110941을 참조한다. 그러한 단일 도메인의 저분자량 작용제는 합성의 용이성, 안정성 및 투여 경로 측면에서 다수의 이점을 제공한다.

VIII. 용도

본 발명은 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간에서) 염증성 장애를 치료 및 진단하기 위해 조작된 항-TSLP를 사용하는 방법을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 염증성 장애는 천식이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 염증성 장애는 알레르기성 염증성 장애이다. 바람직한 실시양태에서, 알레르기성 염증성 장애는 알레르기성 비부비동염, 알레르기성 천식, 알레르기성 결막염, 또는 아토피 피부염이다.

본 발명은 섬유증, 염증성 장 질환, 호지킨 림프종, 호흡기 바이러스 감염 또는 다른 바이러스 감염, 류마티스 관절염, 또는 손상 부위의 염증을 특징으로 하는 임의의 다른 장애를 치료 및 진단하기 위해 조작된 항-TSLP를 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 광범위한 범주는 하기 실시예를 참고로 하여 가장 잘 이해될 것이며, 하기 실시예는 본 발명을 구체적인 실시양태로 제한하고자 하는 것은 아니다.

본 발명의 모든 인용은 각각의 개별 공개 문헌 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 명시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.

당업자에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 정신 및 범주에서 벗어나지 않고 본 발명에 대한 많은 수정 및 변형이 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 구체적인 실시양태는 단지 일례로 제공되는 것이며, 본 발명은 첨부된 청구항의 자격이 있는 전 범주의 등가물과 함께 첨부된 특허청구범위 측면에서 제한되어지며; 본 발명은 본원에서 일례로 제시된 구체적인 실시양태로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

일반적인 방법

분자 생물학에서의 표준 방법이 문헌 ([Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning , 3 ^rd ed ., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Wu (1993) 재조합 DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA])에 기재되어 있다. 표준 방법은 또한 박테리아 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발법 (Vol. 1), 포유동물 세포 및 효모에서의 클로닝 (Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현 (Vol. 3) 및 생물정보학 (Vol. 4)이 기술되어 있는 문헌 [Ausbel et al., (2001) Current Protocols in Molecular Biology , Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에도 기재되어 있다.

면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 및 결정화를 비롯한 단백질 정제 방법은 문헌 ([Coligan et al., (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol . 1, John Wiley and Sons, Inc., New York])에 기재되어 있다. 화학적 분석, 화학적 변형, 번역 후 변형, 융합 단백질의 생산 및 단백질의 당화도 문헌에 기술되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Coligan et al., (2000) Current Protocols in Protein Science , Vol . 2, John Wiley and Sons, Inc., New York]; [Ausubel et al., (2001) Current Protocols in Molecular Biology , Vol . 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17]; [Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research , St. Louis, MO; pp. 45-89]; [Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391] 참조). 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 생산, 정제 및 단편화도 기술되어 있다 (문헌 [Coligan et al., (2001) Current Protcols in Immunology , Vol . 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]; [Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Harlow and Lane, 상기 문헌 동일]). 리간드/수용체 상호작용의 특징을 규명하는 표준 기법도 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Coligan et al., (2001) Current Protcols in Immunology , Vol . 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).

단일 쇄 항체 및 디아바디도 기술되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Malecki et al., (2002) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99:213-218]; [Conrath et al., (2001) J. Biol . Chem . 276:7346-7350]; [Desmyter et al., (2001) J. Biol . Chem . 276:26285-26290]; [Hudson and Kortt (1999) J. Immunol . Methods 231:177-189]; 및 미국 특허 번호 4,946,778 참조). 이관능성 항체가 제시되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Mack, et al., (1995) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92:7021-7025]; [Carter (2001) J. Immunol . Methods 248:7-15]; [Volkel, et al., (2001) Protein Engineering 14:815-823]; [Segal, et al., (2001) J. Immunol . Methods 248:1-6]; [Brennan, et al., (1985) Science 229:81-83]; [Raso, et al., (1997) J. Biol . Chem. 272:27623]; [Morrison (1985) Science 229:1202-1207]; [Traunecker, et al., (1991) EMBO J. 10:3655-3659]; 및 미국 특허 번호 5,932,448, 5,532,210, 및 6,129,914 참조).

이중특이적 항체 또한 제시되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Azzoni et al., (1998) J. Immunol. 161:3493]; [Kita et al., (1999) J. Immunol. 162:6901]; [Merchant et al., (2000) J. Biol . Chem. 74:9115]; [Pandey et al., (2000) J. Biol . Chem. 275:38633]; [Zheng et al., (2001) J. Biol. Chem . 276:12999]; [Propst et al., (2000) J. Immunol . 165:2214]; [Long (1999) Ann . Rev . Immunol . 17:875] 참조).

항체는 예를 들어, 소형 약물 분자, 효소, 리포좀, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 접합될 수 있다. 항체는 치료제, 진단제, 키트 또는 다른 목적으로 유용하며, 이는 예를 들어, 염료, 방사성동위원소, 효소, 또는 금속, 예를 들어, 금 콜로이드에 커플링된 항체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Le Doussal et al., (1991) J. Immunol. 146:169-175]; [Gibellini et al., (1998) J. Immunol . 160:3891-3898]; [Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811]; [Everts et al., (2002) J. Immunol . 168:883-889] 참조).

형광 활성 세포 분류법 (FACS)을 비롯한 유동 세포측정법이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Owens et al., (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice , John Wiley and Sons, Hoboken, NJ]; [Givan (2001) Flow Cytometry , 2 ^nd ed .; Wiley-Liss, Hoboken, NJ]; [Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ] 참조). 예를 들어, 진단 시약으로서 사용하기 위해, 핵산 프라이머 및 프로브를 포함한 핵산, 폴리펩티드 및 항체를 변형시키는 데 적합한 형광 시약이 이용가능하다 (문헌 [Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR]; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO]).

면역계에 대한 표준 조직학적 방법이 기술되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus : Histopathology and Pathology , Springer Verlag, New York, NY]; [Hiatt, et al., (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA]; [Louis, et al., (2002) Basic Histology : Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY] 참조).

예를 들어, 항원 단편, 리더 서열, 단백질 폴딩, 관능성 도메인, 당화 부위 및 서열 정렬을 측정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용가능하다 (예를 들어, 진뱅크(GenBank), 벡터 NTI^® 수트(Vector NTI^® Suite) (인포맥스 인크.(Informax, Inc.: 미국 메릴랜드주 베데스다); GCG 위스콘신 패키지(GCG Wisconsin Package) (엑셀레스 인크.(Accelrys, Inc.: 미국 캘리포니아주 샌디에고); 데사이퍼(DeCypher)^® (타임로직 코포레이션(TimeLogic Corp.: 미국 네바다주 크리스탈 베이); 문헌 [Menne et al., (2000) Bioinformatics 16: 741-742]; [Menne et al., (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742]; [Wren et al., (2002) Comput . Methods Programs Biomed. 68:177-181]; [von Heijne (1983) Eur. J. Biochem . 133:17-21]; [von Heijne (1986) Nucleic Acids Res . 14:4683-4690]).

실시예 2

탈아미드화 문제를 회피하기 위한 항-TSLP 항체 서열의 최적화

인간 및 시노 TSLP에 결합하는 인간화된 항체는 국제 특허 공개공보 WO2008/076321에서 개시된 바 있다. 상기 서열에 대한 추가 분석을 실시하였을 때, 본 발명자들은 상기 항체의 CDR-H2가, 잠재적으로는 탈아미드화될 수 있고, 이는 항체의 구조를 파괴시킴으로써, 잠재적으로는 항체의 안전성 및/또는 효능에 영향을 줄 수 있는 의도치 않은 심각한 문제를 유발할 수 있는 2개의 아스파라긴 (N) 잔기를 WO2008/076321의 서열 4의 61번 및 63번 위치에 함유하고 있다는 것을 확인하게 되었다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 본 발명자들은 상기 탈아미드화 문제는 회피하면서, 인간 및 시노 TSLP에 대한 친화성은 보존하고, 면역원성과 관련된 추가 문제들도 회피한 개선된 항체를 생성하였다. 이러한 개선된 항체는 서열 7의 중쇄 가변 아미노산 서열을 포함한다. 상기 아미노산 서열의 CDR-H2는 서열 2에 상응한다.

도 1은 WO2008/076321의 서열 14와 비교하여 나타낸 본 출원의 서열 11의 정렬 (즉, 본원에서 청구하는 항체 및 WO2008/076321에 개시된 항체의 중쇄에 대한 정렬)을 제공한다. 도 1에서, "서열 1"은 본 출원의 서열 11에 상응하고, "서열 2"는 WO2008/076321의 서열 14에 상응한다. 본원에서 청구하는 항체에서, WO2008/076321의 서열 14의 61번 위치에 있는 아스파라긴 (N)은 알라닌 (A)으로 변경되었고, 서열 14의 63번 위치에 있는 아스파라긴은 리신 (K)으로 변경되었다. 이러한 변경은 상기 잔기의 잠재적인 탈아미드화를 회피하기 위한 목적으로 이루어졌다. 추가로, WO2008/076321의 서열 4의 65번 위치에 있는 리신 (K)은 글루타민 (Q)으로 변경되었다. 이러한 변경은 면역원성이 형성될 수 있는 기회를 감소시키기 위한 목적으로 이루어졌다. WO2008/076321의 서열 14의 72번 위치에서는 트레오닌 (T)이 알라닌 (A)으로 변경되는 추가의 변경이 이루어졌다. 이러한 변경은 항체의 결합 친화성을 개선시키기 위한 목적으로 이루어졌다.

놀랍게도, CDR-H2에서의 변경이 생성된 항체의 결합 친화성에는 실질적으로 어떠한 영향도 주지 않는 것으로 밝혀졌다.

본원에 개시된 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터는 2009년 11월 17일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재한 ATCC에 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 PTA-10482를 받았다. 상기 기탁은 부다페스트 조약에 의해 제공되는 조건 하에서 이루어졌다. 경쇄 및 중쇄 (신호 펩티드 포함)를 코딩하는 핵산 서열은 단일 플라스미드에 존재하며, 두 유전자 모두 인간 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터로부터 발현된다. 상기 플라스미드는 또한 포유동물 세포에서의 선별을 위한 암피실린 내성 유전자 및 유전자 증폭을 위한 DHFR 유전자도 함유한다.

실시예 3

KinExA 기술을 사용한 인간화된 항-인간 TSLP에 대한

평형 해리 상수 (K_D) 측정

KinExA 3000 장치 (사피다인 인스트루먼츠 인크.(Sapidyne Instruments Inc.), www.sapidyne.com)를 사용하여 평형 해리 상수 (K_D)를 측정하였다. KinExA는 항체, 항원 및 항체-항원 복합체의 혼합물 중 복합체를 형성하지 못한 항체의 농도 측정에 기초하는 동역학적 배제 검정 방법의 원리를 이용한다. 유리 항체의 농도는 혼합물을 매우 짧은 기간 동안 고체-상에 고정된 항원에 노출시킴으로써 측정되었다. 실제로, 이는 유동 세포 내에 포획된 항원 코팅된 입자를 통과하는 용액상 항원-항체 혼합물의 유동으로 달성되었다. 상기 장치에 의해 생성된 데이터는 시판용 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 평형 상수는 다음 추정에 기초한 수학적 이론을 사용함으로써 계산되었다:

1. 결합은 평형에 대한 가역적 결합 방정식을 따른다:

K_온[Ab][Ag] = K_오프[AbAg]

2. 항체 및 항원은 1:1로 결합하며, 전체 항체는 항원-항체 복합체 + 유리 항체이다.

3. 장치 신호는 유리 항체 농도와 선형 관계이다.

물질

항체:

· 항체 1: 모체 래트 항체 23B12

· 항체 2: 인간화된 항-hu TSLP mAb 23B12 (WO2008/076321의 서열 14의 중쇄 및 서열 16의 경쇄 포함)

· 항체 3: 인간화된 항-hu TSLP mAb 23B12 (WO2008/076321의 서열 14의 중쇄로서 72번 위치에서의 T→A인 돌연변이를 포함하는 중쇄, 및 서열 16의 경쇄 포함)

· 항체 4: 인간화된 항-hu TSLP mAb 23B12 (본 출원의 서열 11의 중쇄 및 서열 12의 경쇄 포함).

항원:

· 재조합 인간 TSLP.

비오티닐화된 항원:

· 비오티닐화된 인간 TSLP.

다른 시약:

· PMMA 입자, 98 ㎛ (사피다인, 카탈로그 번호 440198)

· 뉴트라비딘(Neutravidin) (피어스(Pierce), 카탈로그 번호 31000)

· Cy5-접합된 염소 항-래트 IgG (H+L) (잭슨 이뮤노리서치 라보라토리즈(Jackson Immunoresearch Laboratories) 카탈로그 번호 112-175-167, 로트 60306)

· Cy5-접합된 염소 항-HuIgG (H+L) (잭슨 이뮤노리서치 라보라토리즈 카탈로그 번호 109-175-088, 로트 49069 및 로트 58552).

실험 조건:

PMMA 입자를 사피다인 ["Protocol for coating PMMA particles with biotinylated ligands having short or nonexistent linker arms"]에 따라 비오티닐화된 인간 TSLP로 코팅시켰다. 모든 실험 과정은 KinExA 3000 매뉴얼에 따라 수행하였다. 모든 수행은 2회에 걸쳐 중복 실시하였다.

하기 조건을 사용하였다:

샘플 부피: 2 mL

샘플 유속: 0.25 mL/min

표지 부피: 1 mL

표지 유속: 0.25 mL/min

항체 농도: 0.1 nM

최고 항원 농도: 10 nM

최저 항원 농도: 10 pM

항원의 2배 연속 희석물을 제조하고, 일정 농도의 항체와 혼합하였다. 혼합물이 평형화되도록 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.

실시예 4

인간 및 시노 TSLP에 대한 항체의 친화도

비아코어 T100 시스템(BIAcore T100 system) (비아코어 AB(BIAcore AB), 스웨든 웁살라)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명에 의해 인간 (hu) 및 시노몰구스 원숭이 (시노) TSLP 둘 모두에 대한 모체 래트 및 각종 인간화된 유도체 항-인간 TSLP 항체의 동역학적 결합 활성을 측정하였다. 대략 100 RU의 인간 TSLP 또는 시노 TSLP를 아민 커플링 화학을 통해 센서 칩 CM5(Sensor Chip CM5) (연구 등급, BR-1006-68) 상에 고정화시켰다. HBS-EP 완충제 (BR-1006-69)를 유속 30 ㎕/min의 전개 완충제로서 사용하였다. 0.82 내지 600 nM 범위의 다양한 농도의 래트 및 인간화된 23B12 항체를 고정된 hu 또는 시노 TSLP 표면 상에 유속 30 ㎕/min으로 주입하였다. 각각의 주입 주기 후, CM5 칩 표면을 유속 75 ㎕/min으로 일련의 용액(각각 10 mM 글리신 (pH 1.5) 및 25 mM NaOH)을 사용하여 재생시켰다.

배경 감산 결합 센서그램을 사용하여 회합 속도 상수 (ka) 및 해리 속도 상수 (kd), 및 평형 해리 상수 K_D를 분석하였다. 비아이벨류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어 (버전 1.0)를 사용하여 2가 분석물 모델로 피팅하였다. 다양한 항체에 대해 측정된 K_D는 하기 표 4에 제시되어 있다. 개별 실험 결과는 별개의 행에 제시되어 있다.

실시예 5

중화 항-TSLP 항체의 평가를 위한 증식 생물검정법

재조합 인간 및 시노 TSLP 수용체를 발현하는 세포를 사용하는 단기간 증식 생물검정법을 적용시킴으로써 인간 및 시노 TSLP를 생물학적으로 중화시킬 수 있는 각종 항-TSLP 항체의 능력에 대해 평가하였다. 형질감염체 Ba/F3-TSLPR-IL7Ra 세포는 TSLP에 대한 반응으로 증식하며, 이 반응은 중화 항-TSLP 항체에 의해 억제될 수 있다. 각각의 항체를 TSLP 용량-반응 곡선의 선형 영역 내에 고평부에 가까운 영역 및 TSLP EC₅₀ 초과의 영역에 대해 선택된 TSLP의 농도에 대해 적정하였다. 증식, 또는 그의 결손은 대사 활성의 검출을 기반으로 한 성장 지시 염료인, 알라마 블루(Alamar Blue)를 사용하여 비색계 수단으로 측정하였다. TSLP를 중화시킬 수 있는 항체의 능력은 그의 EC₅₀ 값, 또는 TSLP 증식의 최대 억제의 절반을 유도하는 항체의 농도로 평가되었다.

Ba/F3 형질감염체를 RPMI-1640 배지, 10% 소 태아 혈청, 50 μM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 50 ㎍/mL 페니실린-스트렙토마이신, 및 10 ng/mL 마우스 IL-3 중에 유지시켰다.

RPMI-1640 배지, 10% 소 태아 혈청, 50 μM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 및 50 ㎍/mL 페니실린-스트렙토마이신 중에서 Ba/F3 증식 생물검정법을 수행하였다.

편평 바닥 96-웰 플레이트 (팔콘(Falcon) 3072 또는 유사의 것)에서 검정을 수행하였다. 시약 및 세포 현탁액 모두 적절한 생물검정용 배지를 사용하여 제조하였다. 검정 부피는 웰당 150 ㎕였다. 항-TSLP 항체 적정물을 실온에서 30-60분 동안 TSLP와 함께 사전 인큐베이션시키고, 그 시간 동안 세포를 준비하였다. 항체-시토카인을 사전 인큐베이션시킨 후, 세포를 플레이트에 가하였다. 생물검정용 플레이트를 가습된 조직 배양 챔버 (37℃, 5% CO₂) 중에서 40-48시간 동안 인큐베이션시켰다. 배양 종결 시점에, 알라마 블루 (바이오소스(Biosource) 카탈로그 번호 DAL1100)를 첨가하고, 발색되도록 8-12시간 동안 그대로 두었다. 이어서, 570 nm 및 600 nm에서 흡광도를 판독하고 (베르사맥스 마이크로플레이트 판독기(VERSAmax Microplate Reader), 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)), OD_{570 -600}을 수득하였다. 2회 또는 3회에 걸친 중복 수행이 권장되었다.

세포는 건강한 성장 상태에서, 일반적으로 3-8 x 10⁵/mL의 밀도로 사용되었다. 세포를 계수하고, 펠릿화하고, 생물검정용 배지 중에서 2회에 걸쳐 세척하고, 플레이팅을 위해 적절한 밀도로 현탁시켰다.

TSLP를 작업 농도로 제조하고, 75 ㎕로 제1 웰에 첨가하였다. 웰 전체에서 생물검정용 배지 중 25:50 ㎕로 적정하여 1:3의 연속 희석물을 제조하고 50 ㎕/웰씩 남겨 두었다. 100 ㎕/웰씩 플레이팅하기 위해 세포를 적절한 밀도로 현탁시켰다.

항체를 작업 농도로 제조하고, 75 ㎕로 제1 웰에 첨가하였다. 웰 전체에서 생물검정용 배지 중 25:50 ㎕로 적정하여 1:3의 연속 희석물을 제조하고 50 ㎕/웰씩 남겨 두었다. 적절한 농도의 TSLP를 적정된 항체를 함유하는 웰에 50 ㎕/웰씩 첨가하였다. 50 ㎕/웰씩 플레이팅하기 위해 세포를 적절한 밀도로 현탁시키고, 이를 항체-시토카인의 사전-인큐베이션 후에 첨가하였다.

그래프패드 프리즘 3.0 소프트웨어(GraphPad Prism 3.0 software)를 사용하여, 시토카인 또는 항체 농도에 대해 흡광도를 플롯팅하고, S자형 용량-반응의 비-선형 회귀 (곡선 피트)를 사용하여 EC₅₀ 값을 측정하였다.

검정 결과는 하기 표 5에 제시되어 있다. 개별 실험 결과는 별개의 행에 제시되어 있다.

평균값 및 SD (표준 편차)를 포함한, 표 5에 제시된 결과에 대한 요약을 하기 표 6에서 제공한다 (오직 HEK293 세포에서 발현된 TSLP를 사용하여 수득한 값만을 이용하여 표 6에서 제공하는 값을 계산하였다).

실시예 6

인간 1차 수지상 세포에 의해 이루어지는 TSLP 유도성 TARC 생산에 대한

항-TSLP의 중화 활성

피콜(Ficoll) 원심 분리에 의해 건강한 혈액 기증자 (스탠포드 의과 대학 혈액 센터(Stanford Medical School Blood Center), 미국 캘리포니아주 스탠포드)로부터 수득한 백혈구 연층으로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리시키고, 음성 선별법, 이어서 FACS를 사용한 세포 분류법을 사용하여 MACS (밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotech), 미국 캘리포니아주 어번)에 의해 CD11c⁺ 수지상 세포를 수득하였다. 마우스 항-인간 CD3 mAb (OKT3, DNAX) 및 마우스 항-CD16 mAb 및 염소 항-마우스 IgG 코팅된 자기 비드 (밀테니이 바이오테크)를 사용하고, 항-CD19, CD56 및 CD14 mAb (밀테니이 바이오테크)로 직접 코팅된 자기 비드를 사용하여, PBMC로부터 T 세포, B 세포, NK 세포, 적혈구 세포 및 단핵구 형태 PBMC의 MACS 고갈에 의해 계통 음성 (Lin^-) 세포를 수득하였다. 이어서, Lin^- 세포를 TC-항-CD4 (칼택(Caltag), 미국 캘리포니아주 벌링게임), PE-항-CD11c 및 FITC-항-CD3, -CD14, -CD19, -CD56, -CD16, 및 -CD20 (모두 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 샌디에고)으로 염색하고, 밴티지 FAC 분류기(Vantage FACsorter)™ (비디 바이오사이언시즈) 상에서 CD11c⁺ DC를 순도 > 99%의 CD11c⁺ CD4⁺ Lin^- 세포로 분류하였다.

분류 후 즉시 CD11c⁺ CD4⁺ DC를, 10% FCS 및 1% 피루베이트 (메디아테크(Mediatech)), HEPES (인비트로겐(Invitrogen), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 및 페니실린-스트렙토마이신 (메디아테크)을 함유하는 RPMI (메디아테크, 미국 버지니아주 헤른돈) 중에서 배양하였다. 배지 단독의 존재 하에, TSLP (15 ng/ml, DNAX) 존재 하에, 또는 TSLP 및 중화 항-TSLP mAb (클론 23B12) 또는 항-TSLPR 모노클로날 항체 또는 이소형 대조군 래트 IgG2a (R&D 시스템즈(R&D Systems), 미국 미네소타주 미니애폴리스)의 조합물 중에서 편평 바닥 96-웰 플레이트 중에 0.5 x 10⁶/ml로 세포를 시딩하였다. 24 h 동안 배양한 후, DC 배양물 상청액을 수집하고, -20℃에서 냉동 보관하고, ELISA (R&D 시스템즈)에 의해 TARC 단백질 수준에 대해서 분석하였다.

결과는 하기 표 7에 요약되어 있다. 개별 실험 결과는 별개의 행에 제시되어 있다.

평균값 및 SD (표준 편차)를 포함한, 표 7에 제시된 결과에 대한 요약을 하기 표 8에서 제공한다.

실시예 7

시노몰구스 원숭이 비장세포에 의해 이루어지는 TSLP 유도성 MDC 생산에 대한 항-TSLP의 중화 활성

조직을 파괴시키고, 이를 50 메쉬 스테인레스 스틸 조직 체 (벨코(Bellco))를 통과시킨 후, 70 ㎛ 나일론 세포 스트레이너 (BD 팔콘)를 통과시켜 시노몰구스 원숭이 비장으로부터 전체 비장세포 현탁액을 제조하였다. 세포 현탁액을 원심분리에 의해 DPBS 중에서 세척하고, 세포 펠릿을 미리 가온된 37℃ ACK 용해 완충제 (바이오휘터커(BioWhittaker)) 중에 재현탁시켜 적혈구 세포를 용해시키고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 DPBS 중에 희석시키고, 2회에 걸쳐 세척하고, 배양 배지 중에서 재현탁시켰다.

비장세포를, 10% FCS 및 1% 피루베이트 (메디아테크), HEPES (인비트로겐, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 및 페니실린-스트렙토마이신 (메디아테크)을 함유하는 RPMI (메디아테크, 미국 버지니아주 헤른돈) 중에서 배양하였다. 배지 단독의 존재 하에, TSLP (0.1 ng/ml) 존재 하에, 또는 TSLP 및 중화 항-TSLP mAb (항체 1 또는 항체 4)의 조합물 중에서 편평 바닥 96-웰 플레이트 중에 1.0 x 10⁶/ml로 세포를 시딩하였다. 120 h 동안 배양한 후, 비장세포 배양물 상청액을 수집하고, -20℃에서 냉동 보관하고, 인간 MDC ELISA (R&D 시스템즈)에 의해 MDC 단백질 수준에 대해서 분석하였다.

결과는 하기 표 9에 요약되어 있다. 개별 실험 결과는 별개의 행에 제시되어 있다.

당업자에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 정신 및 범주에서 벗어나지 않고 본 발명에 대한 많은 수정 및 변형이 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 구체적인 실시양태는 단지 일례로 제공되는 것이며, 본 발명은 첨부된 청구항의 자격이 있는 전 범주의 등가물과 함께 첨부된 특허청구범위 측면에서 제한되어지며; 본 발명은 본원에서 일례로 제시된 구체적인 실시양태로 제한되는 것은 아니다.

상기 공개 문헌 또는 문서를 인용하는 것이 상기 내용 중 임의의 것이 선행 분야에 해당된다는 것을 승인하는 것으로 의도되는 것은 아니며, 이들 공개 문헌 또는 문서의 내용 또는 날짜에 대한 어떠한 승인을 구성하는 것도 아니다. 본원에서 인용된 미국 특허 및 다른 공개 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

서열 목록

본 발명은 각각 하기 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것을 포함하는 임의의 단리된 폴리펩티드 또는 단리된 핵산을 포함한다:

ATCC PTA-10482 20091117

SEQUENCE LISTING <110> SCHERING CORPORATION <120> ENGINEERED ANTI-TSLP ANTIBODY <130> BP2009.7093 <140> <141> <150> 61/297,008 <151> 2010-01-21 <150> 61/258,051 <151> 2009-11-04 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr Ala Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Thr Phe Ile Pro Leu Leu Asp Thr Ser Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Met Gly Val Thr His Ser Tyr Val Met Asp Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Arg Ala Ser Gln 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Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 12 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 12 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Ser Ile Ser 20 25 30 Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Phe Ser Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 13 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 13 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctccggcta catcttcacc gactacgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggacagg gcctggaatg gatgggcacc ttcatccctc tgctggacac ctctgactac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg accgccgaca cctccacctc caccgcctac 240 atggaactgc ggtccctgag atccgacgac accgccgtgt actactgcgc ccggatgggc 300 gtgacacact cctacgtgat ggacgcttgg ggccagggca ccctggtcac cgtgtcctcc 360 gctagcacca agggcccttc cgtgttccct ctggcccctt cctccaagtc tacctctggc 420 ggcaccgctg ctctgggctg tctggtcaag gactacttcc ctgagcctgt gacagtctct 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtctagt 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtcaca gtgccttcat catccctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagcct 660 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgccctg cccctgagct gctgggcgga 720 ccctccgtgt tcctgttccc tcctaagcct aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ctcgggagga acagtacaac 900 tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gaatacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ctatcgaaaa gaccatctcc 1020 aaggccaagg gccagccaag agaacctcag gtgtacaccc tgcctccctc tcgggacgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgacatgc ctggtcaagg gcttctaccc ttccgatatc 1140 gccgtggagt gggagtctaa cggccagcct gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca 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gc 642 <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 15 Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 16 Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala 1 5 10 15 Met Arg Cys

Claims (37)

1. 서열 1을 포함하는 CDR-H1 서열, 서열 2를 포함하는 CDR-H2 서열, 및 서열 3을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 그의 TSLP-결합 단편; 및
   서열 4를 포함하는 CDR-L1 서열, 서열 5를 포함하는 CDR-L2 서열, 및 서열 6을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 TSLP-결합 단편
   을 포함하는, 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 결합 화합물.
2. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 화합물.
3. 제1항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 화합물.
4. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 화합물.
5. 제1항에 있어서, 서열 11 및 서열 12를 포함하는 항체인 결합 화합물.
6. 제1항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 벡터로부터 발현될 수 있는 결합 화합물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 항체 또는 그의 TSLP-결합 단편인 결합 화합물.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')₂, 및 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택된 TSLP-결합 항체 단편인 결합 화합물.
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 결합 화합물을 코딩하는 단리된 핵산.
10. 제9항의 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
11. 제10항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
12. 핵산 서열이 발현되는 조건 하에 제11항의 숙주 세포를 배양 배지 중에서 배양하여 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 단계; 및
    숙주 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는, 폴리펩티드를 생산하는 방법.
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16. ATCC 기탁 번호 PTA-10482 하에 기탁된 발현 벡터.
17. 제16항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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