RU2575039C2

RU2575039C2 - Сконструированное антитело против tslp

Info

Publication number: RU2575039C2
Application number: RU2012122816/10A
Authority: RU
Inventors: Леонард Г. ПРЕСТА
Original assignee: Мерк Шарп И Доум Корп.,
Priority date: 2009-11-04
Filing date: 2010-11-02
Publication date: 2016-02-10

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу, которое специфически связывает TSLP человека. Также раскрыты изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанное антитело, экспрессирующий вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, и клетка-хозяин, содержащая указанный вектор, для экспрессии вышеуказанного антитела. Раскрыты композиция для лечения TSLP-ассоциированного нарушения, содержащая терапевтически эффективное количество вышеуказанного антитела, способ получения указанного антитела, способ супрессии иммунного ответа при введении указанного антитела, применение указанного антитела для получении лекарственного средства. Изобретение позволяет эффективно лечить TSLP-ассоциированные заболевания. 10 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 9 табл., 7 пр.

Description

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США № 61/297008, которая подана 21 января 2010 года, и предварительной патентной заявке США № 61/258051, которая подана 4 ноября 2009 года, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в основном относится к специфическому антителу к тимическому стромальному лимфопоэтину (TSLP) и его применению, в частности при воспалительных и аллергических воспалительных нарушениях.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

TSLP представляет собой иммунный цитокин, который индуцирует опосредованные дендритными клетками CD4⁺ T-клеточные ответы, в которых DC с проаллогенным фенотипом, активируемые посредством TSLP, играют ключевую роль в индукции и поддержании ответов аллергических воспалительных Th2 и тучных клеток посредством продуцирования проаллергенных цитокинов, хемокинов и костимулирующих молекул, которые направляют превращение наивных T-клеток в Th2 клетки, продуцирующие ключевые медиаторы аллергического воспаления IL-4, IL-5 и IL-13. Сверхэкспрессия TSLP при атопическом дерматите (AtD), синдроме Незертона и астме указывает на ключевую роль этого цитокина в патогенезе этих аллергических воспалительных заболеваний. Это подтверждено с помощью моделей на животных, у которых трансгенная сверхэкспрессия TSLP в коже или легких, а также удаление посредством направленного воздействия на ген негативных регуляторов TSLP ведут к аллергическим воспалительным заболеваниям, которые близко схожи с атопическим дерматитом или астмой человека. Настоящее изобретение относится к сконструированным антителам к TSLP и их применению для лечения воспалительных и, в частности, аллергических воспалительных нарушений, включающих астму и атопический дерматит.

Настоящее изобретение избегает возможных проблем с дезамидированием у антител предшествующего уровня техники. Дезамидирование остатков Asn (N) представляет собой обыкновенное расщепление белков и оно может значительно влиять на структуру и функцию белка. В антителах Asn (N), расположенные в CDR, могут подвергаться быстрому дезамидированию, и это может вести к изменениям во взаимодействиях антитело-антиген и, следовательно, представляет серьезную проблему во время разработки терапевтических средств на основе антител. См., например, Vlaska et al., Analytical Biochemistry 392:145-154 (2009). Таким образом, важно избегать этих возможных проблем с дезамидированием в антителах, которые предназначены для разработки для применения у человека. Кроме того, важно избегать этих проблем без изменения каких-либо важных характеристик (таких как аффинность связывания) антитела.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к связывающему соединению, специфически связывающему TSLP человека, содержащему по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, при этом указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение также относится к связывающему соединению, которое специфически связывает TSLP человека, содержащему по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, при этом указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит по меньшей мере SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

Настоящее изобретение также относится к связывающему соединению, которое специфически связывает TSLP человека, содержащему по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, при этом указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

Связывающие соединения по изобретению могут дополнительно содержать одну вариабельную область легкой цепи антитела или его TSLP-связывающий фрагмент. В одном из вариантов осуществления вариабельная область легкой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 и 6. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, содержит по меньшей мере две последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 и 6. В других вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, содержит три последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6.

В некоторых вариантах осуществления описанных выше связывающих соединений, вся или по существу вся остальная часть вариабельной области тяжелой цепи представляет собой всю или по существу всю область Ig человека; и вся или по существу вся остальная часть вариабельной области легкой цепи представляет собой всю или по существу всю область Ig человека. В предпочтительных вариантах осуществления остальная часть вариабельной области тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи человека; и остальная часть вариабельной области легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи человека.

Настоящее изобретение также относится к связывающему соединению, которое специфически связывает TSLP человека, содержащему: вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 7; (ii) SEQ ID NO: 7 или варианта, содержащего вплоть до 3 модифицированных аминокислотных остатков; и (iii) последовательности, обладающей по меньшей мере 97% гомологией с SEQ ID NO: 7. В одном из вариантов осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления связывающее соединение по изобретению дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи. В одном из вариантов осуществления вариабельная область легкой цепи содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 8; (ii) SEQ ID NO: 8 или варианта, содержащего вплоть до 3 модифицированных аминокислотных остатков; и (iii) последовательности, обладающей по меньшей мере 97% гомологией с SEQ ID NO: 8. В одном из вариантов осуществления вариабельная область легкой цепи содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8.

В предпочтительном варианте осуществления связывающее соединение содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах осуществления связывающие соединения по изобретению также содержат константную область тяжелой цепи и/или константную область легкой цепи. В одном из вариантов осуществления константная область тяжелой цепи содержит константную область тяжелой цепи человека γ1, γ2, γ3 или γ4 или ее вариант. В других вариантах осуществления константная область легкой цепи содержит константную область легкой цепи человека κ или λ.

В некоторых вариантах осуществления связывающее соединение по изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В различных вариантах осуществления антитело или его фрагмент по настоящему изобретению является поликлональным, моноклональным, химерным, циноизированным, гуманизированным или полностью человеческим. В предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело или его фрагмент.

Настоящее изобретение также предполагает, что связывающий фрагмент представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 и диатела. Настоящее изобретение также предполагает, что связывающее соединение представляет собой нанотело, авимер или аптимер.

В одном из вариантов осуществления связывающее соединение представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 11. В одном из вариантов осуществления связывающее соединение содержит тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 11, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 12.

В другом предпочтительном варианте осуществления связывающее соединение по изобретению связывает TSLP человека и яванского макака.

В одном из вариантов осуществления связывающее соединение по изобретению можно экспрессировать из экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482.

В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит тяжелую цепь и легкую цепь, которые можно экспрессировать из экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482. В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, которые можно экспрессировать из экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482. В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит области CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 и CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 антитела, экспрессируемые посредством экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482.

В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит тяжелую цепь, которую можно экспрессировать из экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482. В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, которую можно экспрессировать из экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482. В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит области CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 антитела, экспрессируемые посредством экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482.

Настоящее изобретение также относится к изолированным нуклеиновым кислотам, кодирующим связывающее соединение по изобретению. В одном из вариантов осуществления изобретение содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи связывающего соединения (например, антитела или фрагмента антитела) по изобретению. В другом варианте осуществления изобретение содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую связывающее соединение, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, где указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления изобретение содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления изобретение содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую SEQ ID NO: 2. В одном из вариантов осуществления изобретение содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую экспрессирующим вектором, депонированным под номером депозита ATCC PTA-10482. Изобретение также предусматривает экспрессирующие векторы, содержащие нуклеиновые кислоты по изобретению, функционально связанные с управляющими последовательностями, которые распознает клетка-хозяин, когда клетку-хозяина трансфицируют вектором. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к экспрессирующему вектору, депонированному под номером депозита ATCC PTA-10482. Также предусмотрены клетки-хозяева, содержащие эти экспрессирующие векторы, и способы применения этих экспрессирующих векторов для получения полипептидов. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин содержит экспрессирующий вектор, депонированный под номером депозита ATCC PTA-10482. Способы получения полипептида содержат стадии: культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, в которых происходит экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты, тем самым получая полипептиды, содержащие вариабельные области легкой и тяжелой цепи; и извлечение полипептидов из клетки-хозяина или среды для культивирования. В одном из вариантов осуществления изобретение содержит способ получения полипептида, включающий стадии: культивирование клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, депонированный под номером депозита ATCC PTA-10482, в культуральной среде в условиях, в которых происходит экспрессия вектора, тем самым получая полипептиды, содержащие вариабельные области легкой и тяжелой цепи; и извлечение полипептидов из клетки-хозяина или среды для культивирования.

Настоящее изобретение относится к способу супрессии иммунного ответа у субъекта человека, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, связывающего соединения в соответствии с изобретением, которое специфически связывает TSLP человека, в количестве, эффективном для блокирования биологической активности TSLP. Настоящее изобретение также предполагает введение дополнительного иммуносупрессорного или противовоспалительного средства. В предпочтительном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой астму. В другом предпочтительном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой аллергическое воспаление. В другом предпочтительном варианте осуществления аллергическое воспаление представляет собой аллергический риносинусит, аллергическую астму, аллергический конъюнктивит или атопический дерматит. В другом предпочтительном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой фиброз, воспалительное заболевание кишечника или лимфому Ходжкина. в другом предпочтительном варианте осуществления связывающее соединение вводят в сочетании с другим иммуномодулирующим средством.

Связывающее соединение по настоящему изобретению может представлять собой композицию, содержащую связывающее соединение по изобретению (например, антитело или его фрагмент) в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. В дополнительном варианте осуществления композиция дополнительно содержит иммуносупрессорное или противовоспалительное средство.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к лекарственным средствам, содержащим связывающее соединение (например, антитело или его фрагмент) по настоящему изобретению. Например, данное изобретение относится к применению связывающего соединения, которое специфически связывает TSLP человека, для получения лекарственного средства для супрессии иммунного ответа. Настоящее изобретение относится к применению связывающего соединения, которое специфически связывает TSLP человека (например, любое одно из связывающих соединений в соответствии с изобретением), для получения лекарственного средства для лечения астмы. Настоящее изобретение относится к применению связывающего соединения, которое специфически связывает TSLP человека, для получения лекарственного средства для лечения воспалительного нарушения. В одном из вариантов осуществления воспалительное нарушение представляет собой аллергическое воспалительное нарушение. В одном из вариантов осуществления аллергическое воспалительное нарушение представляет собой аллергический риносинусит, аллергическую астму, аллергический конъюнктивит или атопический дерматит. В предпочтительном варианте осуществления аллергическое воспалительное нарушение представляет собой аллергическую астму. В другом предпочтительном варианте осуществления аллергическое воспалительное нарушение представляет собой атопический дерматит. Например, антитела и фрагмент по настоящему изобретению можно использовать для лечения человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУРЫ

Фиг.1 - выравнивание SEQ ID NO: 11 по текущей заявке относительно SEQ ID NO: 14 WO 2008/076321.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Как применяют в настоящем документе, включая приложенную формулу изобретения, формы слов в единственном числе включают соответствующие им ссылки на формы множественного числа до тех пор, пока контекст явно не диктует иное. Все цитируемые в данном документе ссылки включены посредством ссылки в такой же степени, как если бы конкретно и индивидуально указали, что каждая отдельная публикация, патентная заявка или патент включен путем ссылки.

I. Определения

«Активация», «стимуляция» и «лечение», как это применяют к клеткам или рецепторам, могут иметь такое же значение, например активация, стимуляция или лечение клетки или рецептора лигандом, если не указано иное с помощью контекста или в явной форме. «Лиганд» охватывает естественные и синтетические лиганды, например, цитокины, варианты цитокинов, аналоги, мутеины и связывающие композиции, полученные из антител. «Лиганд» также охватывает низкомолекулярные соединения, например, пептидомиметики цитокинов и пептидомиметики антител. «Активация» может относиться к активации клетки, которую регулируют посредством внутренних механизмов, а также посредством внешних факторов или факторов окружающей среды. «Ответ», например, клетки, ткани, органа или организма, охватывает изменение биохимического или физиологического состояния, например, концентрации, плотности, адгезии или миграции внутри биологического компартмента, уровня экспрессии гена или состояния дифференциации, где изменение коррелирует с активацией, стимуляцией или лечением или с внутренними механизмами, такими как генетическое программирование.

«Активность» молекулы может описывать или относиться к связыванию молекулы с лигандом или с рецептором, к каталитической активности; к способности стимулировать экспрессию гена или клеточную сигнализацию, дифференциацию или созревание; к антигенной активности, к модуляции активностей других молекул и т.п. «Активность» также может обозначать удельную активность, например [каталитическую активность]/[мг белка], или [иммунологическую активность]/[мг белка] концентрацию в биологическом компартменте или т.п.

«Введение» и «лечение», как это применяют к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологическому текучему веществу, относится к контакту экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологическим текучим веществом. «Введение» и «лечение» могут относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Лечение клетки включает контакт реактива с клеткой, а также контакт реактива с текучим веществом, где текучее вещество находится в контакте с клеткой. «Введение» и «лечение» также обозначают лечение in vitro и ex vivo, например, клетки, посредством реактива, диагностического средства, связывающей композиции или посредством другой клетки. «Лечение», как это применяют у человека, ветеринарного или исследовательского субъекта, относится к терапевтическому лечению, профилактическим или предупредительным мерам, к исследовательским и диагностическим применениям.

«Связывающее соединение» относится к молекуле, которая содержит одну или несколько аминокислотных последовательностей, которые специфически связываются с TSLP человека. В одном из предпочтительных вариантов осуществления связывающее соединение представляет собой антитело, предпочтительно изолированное антитело. В другом предпочтительном варианте осуществления связывающее соединение содержит антигенсвязывающий фрагмент антитела.

«Связывающая композиция» относится к TSLP-связывающему соединению в сочетании со стабилизатором, эксципиентом, солью, буфером, растворителем или добавкой, которое способно связываться с мишенью.

Объем настоящего изобретения также включает комплексы, содержащие любое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, образующие в комплекс с полипептидом TSLP или его антигенным фрагментом. Комплексы можно получать посредством приведения антитела или фрагмента в контакт с полипептидом TSLP или фрагментом антигена.

Как применяют в настоящем документе, термин «антитело» относится к любой форме антитела или его фрагменту, который проявляет желаемую биологическую активность. Таким образом, его используют в самом широком смысле и он в частности охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител при условии, что они проявляют желательную биологическую активность. «Изолированное антитело» относится к состоянию очистки связывающего соединения и в таком контексте обозначает, что молекула по существу освобождена от других биологических молекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы или другое вещество, такое как клеточный дебрис и среды для выращивания. В целом, термин «изолированный» не предназначен для того, чтобы указывать на полное отсутствие такого вещества или на отсутствие воды, буферов или солей до тех пор, пока они не присутствуют в количествах, которые по существу препятствуют экспериментальному или терапевтическому применению связывающего соединения, как описано в настоящем документе.

«Fab фрагмент» состоит из одной легкой цепи и CH1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь Fab молекулы не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи.

«Fc» область содержит два фрагмента тяжелой цепи, содержащие домены CH2 и CH3 антитела. Два фрагмента тяжелой цепи удерживаются вместе посредством двух или более дисульфидных связей и посредством гидрофобных взаимодействий доменов CH3.

«Фрагмент Fab'» содержит одну легкую цепь и часть или фрагмент одной тяжелой цепи, который содержит домен V_H и домен CH1, а также область между доменами CH1 и CH2 так, что межцепную дисульфидную связь можно сформировать между двумя тяжелыми цепями двух фрагментов Fab', чтобы сформировать молекулу F(ab')2.

«Фрагмент F(ab')2» содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие часть константной области между доменами CH1 и CH2, так что межцепную дисульфидную связь формируют между двумя тяжелыми цепями. Таким образом, фрагмент F(ab')2 состоит из двух фрагментов Fab', которые удерживаются вместе посредством дисульфидной связи между двумя тяжелыми цепями.

«Область Fv» содержит вариабельные области как из тяжелой, так и из легкой цепи, но не содержит константные области.

Как применяют в настоящем документе, термин «TSLP-связывающий фрагмент» или «его связывающий фрагмент» охватывает фрагмент или производное антитела (или другого связывающего вещества), которые по существу все еще сохраняют его биологическую активность ингибирования активности TSLP. Следовательно, термин «фрагмент антитела» или TSLP-связывающий фрагмент относится к части полноразмерного антитела, как правило, к его антигенсвязывающей или вариабельной области. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител, например, sc-Fv; доменные антитела; и полиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител. Типично, связывающий фрагмент или производно сохраняет по меньшей мере 10% его TSLP-ингибиторной активности. Предпочтительно, связывающий фрагмент или производное сохраняет по меньшей мере 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% (или более) его TSLP-ингибиторной активности, хотя будет полезен любой связывающий фрагмент с достаточной аффинностью для того, чтобы вызывать желаемый биологический эффект. Также предполагается, что TSLP-связывающий фрагмент может содержать консервативные аминокислотные замены, которые по существу не изменяют его биологическую активность.

Термин «моноклональное антитело», как применяют в настоящем документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е., отдельные антитела, входящие в состав популяции, идентичны за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высоко специфичны, направлены против одного антигенного эпитопа. В отличие от этого, препараты стандартных (поликлональных) антител типично содержат несколько антител, направленных против (или специфичных к) различных эпитопов. Определение «моноклональный» указывает на характер антител, как полученных из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует рассматривать в качестве требования получать антитела посредством какого-либо конкретного способа. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению в соответствии с настоящим изобретением, можно создавать с помощью гибридомного способа, впервые описанного авторами Kohler et al., (1975) Nature 256: 495, или можно создавать с помощью способов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» также можно изолировать из библиотек фаговых антител с применением способов, описанных, например, в Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628 и Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597.

Моноклональные антитела в настоящем документе, в частности, включают «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или субклассу антител, тогда как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от других видов или принадлежащих другому классу или субклассу антител, а также фрагменты таких антител при условии, что они проявляют желательной биологической активностью (патент США № 4816567; и Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 6851-6855).

«Доменное антитело» представляет собой иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи. В некоторых случаях, две или более области V_H ковалентно соединены с пептидным линкер для создания бивалентного доменного антитела. Две области V_H бивалентного доменного антитела могут быть нацелены на одинаковые или различные антигены.

«Бивалентное антитело» содержит два антигенсвязывающих участка. В некоторых случаях два сайта связывания обладают одинаковыми антигенными специфичностями. Однако бивалентные антитела могут быть биспецифическими.

Как применяют в настоящем документе, термин «одноцепочечное Fv» или «scFv» антитело относится к фрагментам антител, содержащим V_H и V_L домены антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. В целом, Fv полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между V_H и V_L доменам, который позволяет sFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Обзор по sFv см. в Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315.

Моноклональные антитела в настоящем документе также включают камелизированные однодоменные антитела. См., например, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; патент США № 6005079, которые включены, таким образом, посредством ссылки в полном объеме). В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к однодоменным антителам, содержащим два V_H домена с такими модификациями, что они формируют однодоменные антитела.

Как применяют в настоящем документе, термин «диатела» относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, эти фрагменты содержат вариабельный домен (V_H) тяжелой цепи, соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной и той же полипептидной цепи (V_H-V_L или V_L-V_H). Используя линкер, который слишком короток для того, чтобы сделать возможным образование пар между двумя доменами одной цепи, домены заставляют образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Более полно диатела описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161; и Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. В целом, обзор по сконструированным вариантам антител см. в Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

Как применяют в настоящем документе, термин «гуманизированное антитело» относится к формам антител, которые содержат последовательности из нечеловеческих антител (например, антител мыши), а также антител человека. Такие антитела содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. В целом, гуманизированное антитело должно содержать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина и все или по существу все FR области представляют собой таковые последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также должно содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), типично таковой иммуноглобулина человека. Приставку «h», «hu» или «hum» добавляют к обозначению клона антитела, когда необходимо отличать гуманизированные антитела (например, «hu23B12») от родительских антител грызунов (например, rat 23B12 или «r23B12»). Гуманизированные формы антител грызунов, как правило, должны содержать те же последовательности CDR родительских антител грызунов, хотя определенные замены аминокислот могут быть включены для повышения аффинности или повышения стабильности гуманизированного антитела.

Антитела по настоящему изобретению также включают антитела с модифицированными (или блокированными) Fc-областями, чтобы обеспечить измененные эффекторные функции. См., например, патент США № 5624821; WO 2003/086310; WO 2005/120571; WO 2006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Такие модификации можно использовать для усиления или супрессии различных реакций иммунной системы, с возможными положительным воздействием в диагностике и терапии. Изменения Fc-области включают изменения аминокислот (замены, делеции и инсерции), гликозилирование или дегликозилирование и добавление нескольких Fc. Изменения в Fc также могут изменять время полужизни антител у терапевтических антител и более длительное время полужизни должно приводить к менее частому дозированию с сопутствующим повышенным удобством и пониженным применением вещества. См. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:131 на 734-35.

Термин «полностью антитело человека» относится к антителу, которое содержит только белковые последовательности иммуноглобулинов человека. Полностью антитело человека может содержать углеводные цепи мыши, если его продуцирует мышь, клетка мыши или гибридома, полученная из клетки мыши. Аналогичным образом «антитело мыши» относится к антителу, которое содержит только последовательности иммуноглобулинов мыши.

Как применяют в настоящем документе, термин «гипервариабельная область» относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (например, остатки 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) и 89-97 (CDRL3) в вариабельном домене легкой цепи и остатки 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) и 95-102 (CDRH3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) и/или такие остатки из «гипервариабельной петли» (т.е. остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Как применяют в настоящем документе, термин «каркасные» или «FR» остатки относится к тем остаткам вариабельного домена, которые отличаются от остатков гипервариабельной области, определяемых в настоящем документе как остатки CDR. Приведенная выше нумерация остатков относится к системе нумерации по Kabat и не обязательно точно соответствует нумерации в последовательностях в сопроводительном списке последовательностей.

«Связывание» относится к образованию связи между связывающей композицией и мишенью, где образование связи ведет к снижению нормального броуновского движения связывающей композиции в случаях, когда связывающая композиция может быть растворена или суспендирована в растворе.

«Консервативно модифицированные варианты» или «консервативные замены» относятся к заменам аминокислот, которые известны специалистам в данной области и могут быть созданы, как правило, без изменения биологической активности полученной молекулы. Специалисты в данной области признают, в целом, что одиночные замены аминокислот не в важных областях полипептида, по существу, не изменяют биологическую активность (см., например, Watson, et al, Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987)). Такие образцовые замены предпочтительно создают в соответствии с теми, что приведены в следующей таблице 1:

Таблица 1 Образцовые консервативные аминокислотные замены
Исходный остаток	Консервативная замена
Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys; His
Asn (N)	Gln; His
Asp (D)	Glu; Asn
Cys (C)	Ser; Ala
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp; Gln
Gly (G)	Ala
His (H)	Asn; Gln
Ile (I)	Leu; Val
Leu (L)	Ile; Val
Lys (K)	Arg; His
Met (M)	Leu; Ile; Tyr
Phe (F)	Tyr; Met; Leu
Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe
Tyr (Y)	Trp; Phe
Val (V)	Ile; Leu

«Эффективное количество» охватывает количество, достаточное для того, чтобы улучшать или предотвращать симптом или признак медицинского состояния. Эффективное количество также обозначает количество, достаточное для того, чтобы сделать возможным или облегчить диагностику. Эффективное количество для конкретного пациента или ветеринарного субъекта может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние, которое лечат, общее состояние здоровья пациента, путь и доза для способа введения и тяжесть побочных эффектов (см., например, патент США № 5888530, выданный Netti, et al.). Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или протокол дозирования, который избегает значительных побочных эффектов или токсических эффектов. Эффект должен приводить к улучшению диагностической меры или параметра по меньшей мере на 5%, обычно по меньшей мере на 10%, более обычно по меньшей мере на 20%, наиболее обычно по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 60%, идеально по меньшей мере 70%, более идеально по меньшей мере 80% и наиболее идеально по меньшей мере на 90%, где 100% определяют как диагностический параметр, который проявляет нормальный субъект (см., например, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK).

Как применяют в настоящем документе, термин «изолированная молекула нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которую идентифицируют и отделяют по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, вместе с которой она, как правило, ассоциирована в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или окружения, в которых ее находят в природе. Следовательно, изолированные молекулы нуклеиновой кислоты отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, как она существует в естественных клетках. Однако, изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые как правило, экспрессируют антитело, где, например, молекула нуклеиновой кислоты находится в хромосомной локализации, отличающееся от таковой в естественной клетке.

Выражение «управляющие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Управляющие последовательности, которые подходят для прокариотов, например, содержат промотор, необязательно последовательность оператора и участок связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК для полипептида, если происходит ее экспрессия в виде белка-предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен с тем, чтобы облегчать трансляцию. В целом, «функционально связанные» обозначает, что последовательности ДНК, являющиеся связанными, смежны, и, в случае секреторной лидерной последовательности смежны и в фазе считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Связывание осуществляют посредством лигирования в удобных участках рестрикции. Если такие сайты не существуют, синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры используют в соответствии со стандартной практикой.

Как применяют в настоящем документе, выражения «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используют взаимозаменяемо и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичную рассматриваемую клетку и культуры, полученные из нее без учета числа переносов. Также понимают, что все потомство может быть не точно идентично по содержащейся ДНК вследствие преднамеренных или случайных мутаций. Также включено мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, по которой проводили скрининг исходно трансформированной клетки. Из контекста будет ясно, где нужны четкие обозначения.

Как применяют в настоящем документе, «полимеразная цепная реакция» или «ПЦР» относится к процедуре или способу, в котором малые количества конкретного фрагмента нуклеиновой кислоты, РНК и/или ДНК, амплифицируют, как описано, например, в патенте США № 4683195. В целом, информация о последовательностях концов области, представляющей интерес, или за ее пределами должна быть доступна, чтобы можно было сконструировать олигонуклеотидные праймеры; эти праймеры должны быть идентичны или схожи по последовательности противоположным цепям матрицы, подлежащей амплификации. 5'-концевые нуклеотиды двух праймеров могут совпадать с концами амплифицируемого вещества. ПЦР можно использовать для амплификации конкретных последовательностей РНК, конкретных последовательностей ДНК из полной геномной ДНК и кДНК, транскрибированной с общей клеточной РНК, последовательности бактериофага или плазмиды и т.д. В целом, см. Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) Как применяют в настоящем документе, ПЦР рассматривают в качестве одного, но не единственного, примера способа полимеразной реакции нуклеиновой кислоты для амплификации тестируемого образца нуклеиновой кислоты, включающего применение известной нуклеиновой кислоты в качестве праймера и полимеразы нуклеиновой кислоты для амплификации или создания конкретного фрагмента нуклеиновой кислоты.

Как применяют в настоящем документе, термин «последовательность зародышевой линии» относится к последовательности неперестроенной последовательности ДНК иммуноглобулина. Можно использовать любой подходящий источник неперестроенной ДНК иммуноглобулина.

«Ингибиторы» представляют собой соединения, которые снижают, блокируют, предотвращают, задерживают активацию, инактивируют, десенсибилизируют или подавляют, например, ген, белок, лиганд, рецептор или клетку. Ингибитор также можно определить как композицию, которая снижает, блокирует или интактивирует конститутивную активность. «Антагонист» представляет собой соединение, которое по действию противоположно агонисту. Антагонист предотвращает, снижает, ингибирует или нейтрализует активность агониста. Антагонист также может предотвратить, ингибировать или снизить конститутивную активность мишени, например, рецептора-мишени, даже когда агонист не идентифицирован.

Чтобы проверить степень ингибирования, например, образцы или анализы, содержащие заданный, например, белок, ген, клетку или организм, лечат потенциальным активирующим или ингибирующим средством и сравнивают с контрольными образцами без этого средства. Контрольным образцам, т.е. которые не лечили средством, присваивают значение относительной активности 100%. Ингибирование достигают, когда значение активности относительно контроля составляет приблизительно 90% или менее, типично 85% или менее, более типично 80% или менее, наиболее типично 75% или менее, обычно 70% или менее, более обычно 65% или менее, наиболее обычно 60% или менее, типично 55% или менее, обыкновенно 50% или менее, более обыкновенно 45% или менее, наиболее обыкновенно 40% или менее, предпочтительно 35% или менее, более предпочтительно 30% или менее, еще более предпочтительно 25% или менее и наиболее предпочтительно менее чем 25%.

Мониторинг конечных точек в ингибировании можно осуществлять следующим образом. Можно осуществлять мониторинг ингибирования и ответ на лечение, например, клетки, физиологического текучего вещества, ткани, органа и субъекта животного или человека, с помощью конечной точки. Конечная точка может содержать предварительно определяемое количество или процентную долю, например, показатели воспаления, онкогенности или дегрануляции или секреции клеток, такие как высвобождение цитокина, токсического кислорода или протеазы. Конечная точка может содержать, например, предварительно определяемое количество потока или транспорта ионов; клеточную миграцию; клеточную адгезию; клеточную пролиферацию; потенциал метастазирования; дифференциацию клеток; и изменение фенотипа, например, в экспрессии гена, связанного с воспалением, апоптозом, трансформацией, клеточным циклом или метастазом (см., например, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood and Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins and Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady and Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic and Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126).

Конечная точка ингибирования как правило составляет 75% от контроля или менее, предпочтительно 50% от контроля или менее, более предпочтительно 25% от контроля или менее и наиболее предпочтительно 10% от контроля или менее. В целом, конечная точка активации составляет по меньшей мере 150% от контроля, предпочтительно по меньшей мере в два раза превышает контроль, более предпочтительно по меньшей мере в четыре раза превышает контроль и наиболее предпочтительно по меньшей мере в 10 раз превышает контроль.

«Специфическое» или «избирательное» связывание, когда относится к лиганду/рецептору, антителу/антигену или другой связывающейся паре, обозначает реакцию связывания, по которой определяют присутствие белка, например, TSLP, в гетерогенной популяции белков и/или других биологических веществ. Таким образом, при обозначенных условиях, точно определенный лиганд/антиген связывается с конкретным рецептором/антителом и не связывается в значимом количестве с другими белками, присутствующими в образце.

Антитело или связывающая композиция, полученная из антигенсвязывающего участка антитела, по рассмотренному способу связывается с его антигеном с аффинностью, которая по меньшей мере в десять раз превышает, более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз превышает и наиболее предпочтительно по меньшей мере в 50 раз превышает аффинность с неродственными антигенами. В предпочтительном варианте осуществления антитело должно иметь аффинность, которая больше, чем приблизительно 10⁹ л/моль, как определяют, например, с помощью анализа Скетчарда (Munsen, et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239).

Как применяют в настоящем документе, термин «воспалительное нарушение» относится к любому заболеванию или нарушению, отличающемуся местным воспалением в месте повреждения или инфекции и без ограничения содержит аллергическое воспаление, аутоиммунные заболевания и другие нарушения, отличающееся нежелательным накоплением иммунных клеток в локальном участке ткани.

Как применяют в настоящем документе, термин «иммуномодулирующее средство» относится к естественным или синтетическим средствам, которые супрессируют или модулируют иммунный ответ. Иммунный ответ может представлять собой гуморальный или клеточный ответ. Иммуномодулирующие средства охватывают иммуносупрессорные или противовоспалительные средства.

«Иммуносупрессорные средства», «иммуносупрессорные лекарственные средства» или «иммуносупрессанты», как применяют в настоящем документе, представляют собой терапевтические средства, которые используют в иммуносупрессорной терапии для того, чтобы ингибировать или предотвратить активность иммунной системы. Клинически их используют для предотвращения отторжения трансплантированных органов и тканей (например, костного мозга, сердца, почки, легкого) и/или в лечении аутоиммунных заболеваний или заболеваний, которые вероятнее всего имеют аутоиммунное происхождение (например, ревматоидный артрит, миастения гравис, системная красная волчанка, язвенный колит, рассеянный склероз). Иммуносупрессорные лекарственные средства можно разделить на четыре группы: глюкокортикоидные цитостатики; антитела (включая модификаторы биологического ответа или DMARD); лекарственные средства, действующие на иммунофилины; другие лекарственные средства, включая известные химеотерапевтические средства, используемые в лечении пролиферативных нарушений. В частности, при рассеянном склерозе антитела по настоящему изобретению можно вводить в сочетании с новым классом миелинсвязывающий белок-подобных терапевтических средств, известным как копаксоны.

«Противовоспалительные средства» или «противовоспалительные лекарственные средства» используют для обозначения как стероидных, так и нестероидных терапевтических средств. Стероиды, также известные как кортикостероиды, представляют собой лекарственные средства, которые близко походят на кортизол, гормон, который в природе продуцируют надпочечники. Стероиды используют в качестве основного лечения для определенных воспалительных состояний, таких как: системный васкулит (воспаление кровеносных сосудов); и миозит (воспаление мышц). Стероиды также можно использовать избирательно для лечения воспалительных состояний, таких как: ревматоидный артрит (хронический воспалительный артрит, проявляющийся в суставах на обеих сторонах тела); системная красная волчанка (генерализованное состояние, обусловленное аномальной функцией иммунной системы); синдром Шегрена (хроническое нарушение, которое обуславливает сухость глаз и сухость во рту).

Нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, обыкновенно сокращаемые до НПВС, представляют собой лекарственные средства с аналгетическим, жаропонижающим и противовоспалительным эффектами - они снижают боль, жар и воспаление. Термин «нестероидный» используют для того, чтобы отличать эти лекарственные средства от стероидов, которые (среди широкого диапазона других эффектов) имеют схожее подавляющее эйкозаноиды противовоспалительное действие. Как правило, НПВС показаны для облегчения симптомов следующих состояний: ревматоидный артрит; остеоартрит; воспалительные артропатии (например, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит, синдром Рейтера); острая кишка; дисменорея; метастатическая боль в костях; головная боль и мигрень; послеоперационная боль; боль от легкой до умеренной вследствие воспаления и повреждения ткани; пирексия; и почечная колика. НПВС включают салицилаты, арилалконовые кислоты, 2-арилпропановые кислоты (профены), N-арилантраниловые кислоты (фенамовые кислоты), оксикамы, коксибы (избирательные ингибиторы ЦОГ-2), сульфонанилиды, диклофенак, дифлунизал, этодолак, фенопрофен, флурбипрофен, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, кеторолак, мефенамовая кислота, мелоксикам, набуметон, напроксен, оксапрозин, пироксикам, салсалат, сулиндак или толметин.

II. Общие сведения

Настоящее изобретение относится к сконструированным антителам против TSLP и их применению для лечения воспалительных и, в частности, аллергических воспалительных нарушений. В предпочтительном варианте осуществления воспалительное нарушение представляет собой астму. В предпочтительном варианте осуществления аллергическое воспалительное нарушение представляет собой аллергический риносинусит, аллергическую астму, аллергический конъюнктивит или атопический дерматит. Настоящее изобретение также относится к сконструированным антителам против TSLP для лечения фиброза, воспалительного заболевания кишечника или лимфомы Ходжкина.

Как используют в настоящем документе, термин «TSLP» включает варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги TSLP. Аминокислотная последовательность TSLP человека приведена в SEQ ID NO: 4 международной публикации № WO 00/17362.

ΙΙΙ. Сконструированные антитела со специфичностью к TSLP по изобретению

Изобретение относится к сконструированным антителам против TSLP, содержащим точно определенные области CDR.

Способы рекомбинантного конструирования антител описаны, например, авторами Boss et al. (патент США № 4816397), Cabilly et al. (патент США № 4816567), Law et al. (публикация европейской патентной заявки № 438310) и Winter (публикация европейской патентной заявки № 239400).

Сконструированные антитела по изобретению включают те, в которых выполнены модификации в каркасных остатках в V_H и/или V_L, например, для того, чтобы усовершенствовать свойства антитела. Типично такие модификации каркаса выполняют для снижения иммуногенности антитела. Например, один подход заключается в «обратном мутировании» одного или нескольких каркасных остатков в соответствующую последовательность зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое подверглось соматической мутации, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которой получено антитело. Такие остатки можно идентифицировать посредством сравнения каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, из которой получено антитело.

В другой тип модификации каркаса вовлечено мутирование одного или нескольких остатков внутри каркасной области или даже внутри одной или нескольких областей CDR, чтобы удалить T-клеточные эпитопы, тем самым снижая возможную иммуногенность антитела. Этот подход также обозначают как «деиммунизация» и он описан более подробно в публикации патента США № 20030153043.

Кроме того или в качестве альтернативы модификациям, выполняемым внутри каркаса или областей CDR, антитела по изобретению можно сконструировать для того, чтобы они содержали модификации внутри Fc-области, типично для того, чтобы изменить одно или несколько функциональных свойств антитела, таких как время полужизни в сыворотке, связывание комплемента, связывание Fc рецептора и/или антиген-зависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело по изобретению можно модифицировать химически (например, к антителу можно присоединить один или несколько химических фрагментов) или можно модифицировать для того, чтобы изменить его гликозилирование, также для того, чтобы изменить одно или несколько функциональных свойств антитела. Каждый из этих вариантов осуществления описан более подробно ниже. Нумерация остатков в Fc-области представляет собой таковую по индексу EU Kabat'a.

В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело изотипа IgG4, содержащее мутацию серина в пролин в положении, соответствующем положению 228 (S228P; индекс EU) в шарнирной области константной области тяжелой цепи. Сообщалось, что эта мутация устраняет гетерогенность дисульфидных мостиков между тяжелыми цепями в шарнирной области (Angal et al. выше; положение 241 на основе системы нумерации по Kabat).

В одном из вариантов осуществления шарнирную область CH1 модифицируют так, что изменяют число остатков цистеина в шарнирной области, например, увеличивают или уменьшают. Этот подход дополнительно описан в патенте США № 5677425. Число остатков цистеина в шарнирной области CH1 изменяют, например, для того, чтобы облегчить сборку легкой и тяжелой цепей или для того, чтобы повысить или понизить стабильность антитела.

В другом варианте осуществления в Fc шарнирную область антитела вводят мутации для уменьшения биологического времени полужизни антитела. Более конкретно, мутации одной или нескольких аминокислот вводят в область контакта домена CH2-CH3 Fc-шарнирного фрагмента так, что антитело имеет ослабленное связывание со стафилококковым белком A (SpA) по отношению к связыванию SpA нативного Fc-шарнирного домена. Этот подход описан более подробно в патенте США № 6165745.

В другом варианте осуществления антитело модифицируют для того, чтобы увеличить его биологическое время полужизни. Возможны различные подходы. Например, можно вводить одну или несколько следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в патенте США № 6277375. Альтернативно, для увеличения биологического времени полужизни антитело можно изменить внутри области CH1 или CL, чтобы оно содержало эпитоп связывания рецептора спасения, заимствованный из двух петель домена CH2 Fc-области IgG, как описано в патентах США №№ 5869046 и 6121022.

В других вариантах осуществления Fc-область изменяют посредством замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток для того, чтобы изменить эффекторную функцию(и) антитела. Например, одну или несколько аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 можно заменять на другой аминокислотный остаток так, чтобы антитело имело измененную аффинность к эффекторному лиганду, но сохраняло антигенсвязывающую способность родительского антитела. Эффекторный лиганд, аффинность к которому изменяют, может представлять собой, например, Fc рецептор или C1 компонент комплемента. Этот подход описан более подробно в патентах США №№ 5624821 и 5648260.

В другом примере одну или несколько аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, можно заменять на другой аминокислотный остаток так, чтобы антитело обладало измененным связыванием C1q и/или сниженной или устраненной комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC). Этот подход описан более подробно в патенте США № 6194551.

В другом примере один или несколько аминокислотных остатков внутри аминокислотных положений 231 и 239 изменяют для того, чтобы тем самым изменить способность антитела связывать комплемент. Этот подход дополнительно описан в публикации PCT WO 94/29351.

В еще одном другом примере Fc-область модифицируют для того, чтобы повысить способность антитела опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или для того, чтобы повысить аффинность антитела к рецептору Fcγ посредством модификации одной или нескольких аминокислоты в следующих положениях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Этот подход дополнительно описан в публикации PCT WO 00/42072. Кроме того, картированы сайты связывания на IgG1 человека для FcγRI, FcγRII, FcγRIII и FcRn и описаны варианты с улучшенным связыванием (см. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Показано, что конкретные мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с FcγRIII. Дополнительно, следующие комбинаторные мутанты показывают улучшенное связывание FcγRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A и S298A/E333A/K334A.

В другом варианте осуществления гликозилирование антитела модифицируют или изменяют для того, чтобы удалить или добавить молекулы углеводов к антителам. Например, можно создать агликозилированное антитело (т.е., антитело без гликозилирования). Гликозилирование можно изменить, например, для того, чтобы повысить аффинность антитела к антигену. Такие модификации углеводов можно выполнять, например, посредством изменения одного или нескольких сайтов гликозилирования внутри последовательности антитела. Например, можно создать одну или несколько замен аминокислот, которые ведут к устранению одного или нескольких участков гликозилирования каркаса вариабельной области для того, чтобы тем самым устранить гликозилирование в этом сайте. Такое агликозилирование может повышать аффинность антитела к антигену. См., например, патенты США №№ 5714350 и 6350861.

Дополнительно или альтернативно можно создать антитело, которое имеет измененный тип гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, которое содержит уменьшенные количества остатков фукозы, или антитело, которое содержит увеличенные ветвящиеся структуры GlcNac. Продемонстрировано, что такие измененные паттерны гликозилирования повышают способность антител к ADCC. Такие модификации углеводов можно выполнять, например, посредством экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования описаны в данной области и их можно использовать в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируют рекомбинантные антитела по изобретению, чтобы тем самым получить антитело с измененным гликозилированием. Например, клеточные линии Ms704, Ms705 и Ms709 не содержат ген фукозилтрансферазы, FUT8 (α(1,6)-фукозилтрансферазы), так что углеводы на антителах, экспрессируемых в клеточных линиях Ms704, Ms705 и Ms709, не содержат фукозу. Клеточные линии Ms704, Ms705, и Ms709 FUT8-/- созданы посредством нацеленного разрушения гена FUT8 в клетках CHO/DG44 с применением двух векторов замещения (см. публикацию патента США № 20040110704 и Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). В качестве другого примера в EP 1176195 описана клеточная линия с функционально нарушенным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, так что антитела, экспрессируемые в такой клеточной линии, проявляют гипофукозилирование посредством уменьшения или устранения фермента, связанного с α-1,6-связью. В EP 1176195 также описана клеточная линия человека, которая обладает низкой ферментативной активностью по добавлению фукозы к N-ацетилглюкозамину, который связывается с Fc-областью антитела или не обладает ферментативной активностью, например, линия клеток миеломы крысы YB2/0 (ATCC CRL 1662). В публикации PCT WO 03/035835 описан вариант клеточной линии CHO, клетки Lec13, с сниженной способностью прикреплять фукозу к связанным с Asn(297) углеводам, что также ведет к гипофукозилированию антитела, экспрессируемого в этой клетке-хозяине (см. также Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Антитела с модифицированным профилем гликозилирования также можно продуцировать в куриных яйцах, как описано в публикации PCT WO 06/089231. Альтернативно антитела с модифицированным профилем гликозилирования можно продуцировать в клетках растений, таких как Lemna. В публикации PCT WO 99/54342 описаны клеточные линии, сконструированные для экспрессии модифицирующих гликопротеины гликозилтрансфераз (например, β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы ΙΙΙ (GnTIII)) так, что антитела, экспрессируемые в сконструированных клеточных линиях, проявляют увеличенные ветвящиеся структуры GlcNac, что ведет к повышенной ADCC активности антител (также см. Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Альтернативно остатки фукозы в антителах можно отщеплять с применением фермента фукозидазы; например, фукозидаза α-L-фукозидаза устраняет остатки фукозы с антител (Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

Другая модификация антител в настоящем документе, которая предусмотрена этим раскрытием, представляет собой пегилирование. Антитело можно пегилировать, например, для того, чтобы повысить биологическое время полужизни антитела (например, в сыворотке). Чтобы пегилировать антитело, типично проводят реакцию антитела или его фрагмента с полиэтиленгликолем (PEG), таким как реакционноспособное сложноэфирное или альдегидное производное PEG в условиях, в которых одна или несколько групп PEG прикрепляются к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно, пегилирование осуществляют через реакцию ацилирования или реакцию алкилирования с реакционноспособной молекулой PEG (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). Как применяют в настоящем документе, термин «полиэтиленгликоль» предназначен для того, чтобы охватывать любые формы PEG, которые используют для получения производных других белков, такие как моно(C₁-C₁₀)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликольмалеимид. В определенных вариантах осуществления антитело, подлежащее пегилированию, представляет собой агликозилированное антитело. Способы пегилирования белков известны в данной области и их можно применять к антителам по изобретению. См., например, EP 0154316 и EP 0401384.

Варианты аминокислотной последовательности гуманизированного антитела против TSLP по изобретению можно получать посредством введения соответствующих нуклеотидных замен в ДНК гуманизированного антитела против TSLP или посредством синтеза пептидов. Такие варианты включают, например, делеции и/или инсерции и/или замены остатков внутри аминокислотных последовательностей, приведенных для гуманизированных антител против TSLP, которые раскрыты и заявлены в настоящем документе. Любое сочетание делеции, инсерции и замены можно выполнить для того, чтобы прийти к конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками. Как указано выше, изменения аминокислот также могут изменять посттрансляционные процессы гуманизированного антитела против TSLP, такие как изменение числа или положения участков гликозилирования.

Эффективный способ идентификации определенных остатков или областей полипептида гуманизированного антитела против TSLP, которые представляют собой предпочтительные положения для мутагенеза, называют «сканирующим аланиновым мутагенезом», как описано авторами Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085. Здесь идентифицируют остаток или группу остатков мишени (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) и заменяют нейтральными или отрицательно заряженными аминокислотами (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином), чтобы воздействовать на взаимодействие аминокислот с антигеном TSLP. Затем аминокислотные остатки, демонстрирующие функциональную чувствительность к заменам, уточняют посредством введения дополнительных или других вариантов в сайты замены или для них. Таким образом, несмотря на то, что предварительно определяют сайт для введения вариации аминокислотной последовательности, свойства мутации per se не нужно определять предварительно. Например, чтобы анализировать характеристики мутации в заданном сайте, в кодоне-мишени или области-мишени проводят сканирующий аланиновый или случайный мутагенез и осуществляют скрининг экспрессируемых гуманизированных вариантов антител против TSLP на желаемую активность.

Инсерции аминокислотной последовательности включают N- и/или C-концевые слияния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сотни или более остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых инсерций включают гуманизированное антитело против TSLP с N-концевым остатком метионина или антитело, слитое с эпитопной меткой. Другие варианты инсерций в молекуле гуманизированного антитела против TSLP включают слияние N- или C-конца гуманизированного антитела против TSLP с ферментом или полипептидом, который увеличивает время полужизни в сыворотке антитела.

Другой тип варианта представляет собой вариант с заменой аминокислоты. Эти варианты имеют по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток в молекуле гуманизированного антитела против TSLP и другой остаток, вставленный вместо него. Сайты, представляющие наибольший интерес для заменяющего мутагенеза, включают гипервариабельные петли, но изменения FR также предусмотрены. Остатки гипервариабельной области или остатки FR, участвующие в связывании антигена, как правило, заменяют относительно консервативным образом.

Другой тип варианта аминокислоты представляет собой замену остатков для того, чтобы обеспечить более высокую химическую стабильность конечного гуманизированного антитела.

В определенных вариантах осуществления будет желательно следующим образом изменить определенные аминокислоты, содержащие выступающие боковые цепи, на другой аминокислотный остаток для того, чтобы обеспечить более высокую химическую стабильность конечного антитела. Например, остаток аспарагина (Asn) можно изменить на Gln или Ala, чтобы снизить возможность образования изоаспартата в любой последовательности Asn-Gly внутри CDR. Схожая проблема может возникнуть в последовательности Asp-Gly. Reissner and Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281. Образование изоаспартата может ослаблять или полностью устранять связывание антитела с его антигеном-мишенью. См., Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 на 734. В одном из вариантов осуществления аспарагин изменяют на глуамин* (Gln). Также может быть желательным изменить аминокислоту, смежную с остатком аспарагина (Asn) или глутамина (Gln), чтобы снизить вероятность дезамидирования, которое возникает в более значительной степени, когда маленькие аминокислоты оказываются смежными с аспарагином или глутамином. См. Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261. Кроме того, любые остатки метионина (типично Met, доступный для растворителя) в CDR можно изменять на Lys, Leu, Ala или Phe для того, чтобы снизить возможность того, что сера метионина будет окисляться, что может снизить аффинность связывания с антигеном, а также вносит вклад в молекулярную гетерогенность в конечном препарате антитела. Id. В одном из вариантов осуществления метионин изменяют на аланин (Ala). Дополнительно, для того чтобы предотвратить или минимизировать потенциальные расщепляющиеся пептидные связи Asn-Pro, может быть желательно изменить любые комбинации Asn-Pro, найденные в CDR на Gln-Pro, Ala-Pro или Asn-Ala. Впоследствии проводят скрининг антител с такими заменами, чтобы гарантировать, что замены не снижают аффинность связывания с TSLP или другую желаемую биологическую активность до неприемлемых уровней.

Таблица 2 Образцовые стабилизирующие варианты CDR
Остаток CDR	Последовательность стабилизирующего варианта
Asn-Gly (N-G)	Gln-Gly, Ala-Gly или Asn-Ala (Q-G), (A-G) или (N-A)
Asp-Gly (D-G)	Glu-Gly, Ala-Gly или Asp-Ala (E-G), (A-G) или (D-A)
Met (типично доступный для растворителя) (M)	Lys, Leu, Ala или Phe (K), (L), (A) или (F)
Asn (N)	Gln или Ala (Q) или (A)
Asn-Pro (N-P)	Gln-Pro, Ala-Pro или Asn-Ala (Q-P), (A-P) или (N-A)

Кроме того, остатки метионина в CDR грызунов можно изменять для снижения вероятности того, что сера метионина будет окисляться, что может снизить аффинность связывания с антигеном, а также вносит вклад в молекулярную гетерогенность в конечном препарате антитела. Id. В одном из вариантов осуществления метионин изменяют на аланин (A). Впоследствии осуществляют скрининг антител с такими заменами, чтобы гарантировать, что замены не снизили аффинность связывания с TSLP до неприемлемых уровней.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислотной последовательности гуманизированного антитела со специфичностью к TSLP, получают с помощью различных известных в данной области способов. Эти способы включают в качестве неограничивающих примеров выделение из природного источника (в случае встречающихся в природе вариантов аминокислотной последовательности) или получение с помощью опосредованного олигонуклеотидами (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученного варианта или невариантной версии гуманизированного антитела против TSLP.

Обычно варианты аминокислотной последовательности гуманизированного антитела против TSLP должны иметь аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 97% идентичностью аминокислотных последовательностей с исходными аминокислотными последовательностями одной из тяжелой или легкой цепи гуманизированного антитела, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%. Идентичность или гомология в отношении этой последовательности определяют в настоящем документе как процентную долю аминокислотных остатков в рассматриваемой последовательности, которые идентичны остаткам гуманизированного антитела против TSLP, после выравнивания последовательностей и введения пропусков, в случае необходимости, чтобы достичь максимального процента идентичности последовательностей, и без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательностей. N-концевые, C-концевые или внутренние расширения, делеции или инсерции в последовательности антитела не следует рассматривать в качестве влияющих на идентичность или гомологию последовательностей.

Гуманизированное антитело можно выбирать из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE. Предпочтительно антитело представляет собой антитело IgG. Можно использовать любой изотип IgG, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Также предусмотрены варианты изотипов IgG. Гуманизированное антитело может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа. Оптимизации необходимых последовательностей константного домена для создания желаемой биологической активности легко добиваются посредством скрининга антител в биологических анализах, описанных ниже.

Аналогичным образом, в композициях и способах в настоящем документе можно использовать любой класс легкой цепи. В частности, κ, λ или их варианты можно использовать в настоящих композициях и способах.

Можно использовать любую подходящую часть последовательностей CDR из не принадлежащего человеку антитела. Можно осуществлять мутагенез последовательностей CDR посредством замены, инсерции или делеции по меньшей мере одного остатка так, чтобы последовательность CDR отличалась от используемых последовательностей антител, принадлежащих и не принадлежащих человеку. Предусмотрено, что такие мутации должны быть минимальными. Типично, по меньшей мере 95% остатков гуманизированного антитела должны соответствовать таковым остаткам CDR, не принадлежащей человеку и наиболее предпочтительно более чем 97%.

Можно использовать любую подходящую часть последовательностей FR из антитела человека. Можно осуществлять мутагенез последовательностей FR посредством замены, инсерции или делеции по меньшей мере одного остатка так, чтобы последовательность FR отличалась от используемых последовательностей антител, принадлежащих и не принадлежащих человеку. Предусмотрено, что такие мутации должны быть минимальными. Типично, по меньшей мере 75% остатков гуманизированного антитела должны соответствовать таковым остаткам FR человека, более обычно 90% и наиболее предпочтительно более чем 95%.

Остатки CDR и FR определяют в соответствии со стандартным определением последовательностей по Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987).

В предпочтительном варианте осуществления связывающая композиция в соответствии с изобретением содержит одну или несколько из следующих последовательностей:

- последовательность CDR-H1 GYIFTDYAMH (SEQ ID NO: 1).

- последовательность CDR-H2 TFIPLLDTSDYAQKFQG (SEQ ID NO: 2).

- последовательность CDR-H3 MGVTHSYVMDA (SEQ ID NO: 3).

- последовательность CDR-L1 RASQPISISVH (SEQ ID NO: 4).

- последовательность CDR-L2 FASQSIS (SEQ ID NO: 5).

- последовательность CDR-L3 QQTFSLPYT (SEQ ID NO: 6).

- аминокислотная последовательность вариабельной тяжелой цепи, приведенная в SEQ ID NO: 7.

- аминокислотная последовательность вариабельной легкой цепи, приведенная в SEQ ID NO: 8.

- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную тяжелую цепь, приведенную в SEQ ID NO: 9.

- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную легкую цепь, приведенную в SEQ ID NO: 10.

- аминокислотная последовательность тяжелой цепи, приведенная в SEQ ID NO: 11. Эта последовательность может дополнительно содержать следующую лидерную последовательность: MAVLGLLFCLVTFPSCVLS (SEQ ID NO: 15).

- аминокислотная последовательность легкой цепи, приведенная в SEQ ID NO: 12. Эта последовательность может дополнительно содержать следующую лидерную последовательность: MAPVQLLGLLVLFLPAMRC (SEQ ID NO: 16).

- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь, приведена в SEQ ID NO: 13. Эта последовательность может дополнительно содержать последовательность, кодирующую лидерную последовательность, предпочтительно следующую лидерную последовательность: MAVLGLLFCLVTFPSCVLS (SEQ ID NO: 15).

- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, приведена в SEQ ID NO: 14. Эта последовательность может дополнительно содержать последовательность, кодирующую лидерную последовательность, предпочтительно следующую лидерную последовательность: MAPVQLLGLLVLFLPAMRC (SEQ ID NO: 16).

Например, настоящее изобретение относится к изолированному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему легкую цепь иммуноглобулина, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 (как изложено выше), и тяжелую цепь иммуноглобулина, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 (как изложено выше). Настоящее изобретение также относится к изолированному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8 или 12, и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7 и 11 (например, SEQ ID NO: 7, спаренная с SEQ ID NO: 8; или SEQ ID NO: 11, спаренная с SEQ ID NO: 12). В одном из вариантов осуществления изобретения такое антитело или фрагмент можно связать с константным доменом иммуноглобулина, такого как IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Его фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело или фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель, также является частью настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления различные константные домены можно прибавлять к гуманизированным областям V_L и V_H, предоставленным в настоящем документе. Например, если конкретное предполагаемое применение антитела (или фрагмента) по настоящему изобретению состояло в том, чтобы вызывать измененные эффекторные функции, можно использовать константный домен тяжелой цепи, отличный от IgG1. Несмотря на то, что антитела IgG1 обеспечивают длительное время полужизни и эффекторные функции, такие как активация комплемента и антителозависимая клеточная цитотоксичность, такие активности могут не быть желательными для всех применений антитела. В таких случаях можно использовать, например, константный домен IgG4.

IV. Конъюгаты антител

Связывающие соединения по изобретению, например антитело или фрагменты антител по изобретению, также можно конъюгировать с химическим фрагментом. Химический фрагмент может представлять собой, inter alia, полимер, радионуклид или цитотоксический фактор. Предпочтительно химический фрагмент представляет собой полимер, который увеличивает время полужизни молекулы антитела в организме субъекта. Подходящие полимеры включают в качестве неограничивающих примеров полиэтиленгликоль (PEG) (например, PEG с молекулярной массой 2 кДа, 5 кДа, 10 кДа, 12 кДа, 20 кДа, 30 кДа или 40 кДа), декстран и монометоксиполиэтиленгликоль (mPEG). Lee, et ah, (1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981) раскрывают одноцепочечные антитела, конъюгированные с PEG. Wen, et al., (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553) раскрывают антитела, конъюгированные с PEG, которые присоединены к хелатору радиометалла (диэтилентриаминпентауксусной кислоте (DTPA)).

Антитела и фрагменты антител по изобретению также можно конъюгировать с метками, такими как ⁹⁹Tc, ⁹⁰Y, ¹¹¹In, ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, ¹³¹I, ¹¹C, ¹⁵O, ¹³N, ¹⁸F, ³⁵S, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ²²⁶Ra, ⁶⁰Co, ⁵⁹Fe, ⁵⁷Se, ¹⁵²Eu, ⁶⁷Cu, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd, ²³⁴Th и ⁴⁰K, ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ⁵²Tr и ⁵⁶Fe.

Антитела и фрагменты антител по изобретению также можно конъюгировать с флуоресцентными или хемилюминесцентными метками, включая флуорофоры, такие как редкоземельные хелаты, флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, изотиоцианат, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальальдегид, флуорескамин, ¹⁵²Eu, дансил, умбеллиферон, люциферин, люминаловую метку, изолюминаловую метку, метку ароматического эфира акридиния, имидазоловую метку, метку соли акридиния, оксалатную эфирную метку, метку экворин, 2,3-дигидрофталазиндионы, биотин/авидин, спиновые метки и стабильные свободные радикалы.

Молекулы антител также можно конъюгировать с цитотоксическим фактором, таким как токсин дифтерии, цепь A экзотоксина Pseudomonas aeruginosa, цепь A рицина, цепь A абрина, цепь A модессина, α-сарцин, белки и соединения Aleurites fordii (например, жирные кислоты), диантиновые белки, белки Phytolacca americana PAPI, PAPII и PAP-S, ингибитор момордики харантской, курцин, кротин, ингибитор Saponaria officinalis, митогеллин, рестриктоцин, феномицин и еномицин.

Можно использовать любой известный в данной области способ получения конъюгатов молекул антител по изобретению с различными фрагментами, включая те способы, которые описаны авторами Hunter, et al, (1962) Nature 144:945; David, et al, (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al, (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; и Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. Способы получения конъюгатов антител являются стандартными и очень хорошо известны в данной области.

В других вариантах осуществления различные константные домены можно присоединять к гуманизированным областям V_L и V_H, полученным из CDR, предусмотренных в настоящем документе. Например, если конкретное предполагаемое применение антитела (или фрагмента) по настоящему изобретению состоит в том, чтобы вызывать измененные эффекторные функции, можно использовать константный домен тяжелой цепи, отличный от IgG1, или можно использовать гибрид IgG1/IgG4.

Несмотря на то, что антитела IgG1 обеспечивают длительно время полужизни и эффекторные функции, такие как активация комплемент и антителозависимая клеточная цитотоксичность, такие активности могут не быть желательными для всех применений антитела. В таких случаях можно использовать, например, константный домен IgG4. В hu Mab8D5, константный домен IgG4 отличается от нативного константного домена IgG4 человека (Swiss-Prot № доступа P01861.1, раскрытие которого, таким образом, включено посредством ссылки) в положении 108, где нативный Ser108 заменен на Pro, для того, чтобы предотвратить межцепую дисульфидную связь между Cys106 и Cys109, которая может препятствовать формированию правильной межцепной дисульфидной связи. См. Angal et al (1993) Mol Imunol 30:105.

V. Биологическая активность связывающих соединений по изобретению

Можно осуществлять скрининг связывающих соединений, обладающих характеристиками, идентифицируемыми в настоящем документе в качестве желательных в гуманизированном антителе против TSLP, на ингибирующую биологическую активность in vitro или на подходящую аффинность связывания.

Аффинности антител (например, к TSLP человека) можно определять с применением стандартного анализа. Предпочтительными гуманизированными антителами являются те, которые связывают TSLP человека со значением K_D не более чем приблизительно 1×10^-7 M; предпочтительно не более чем приблизительно 1×10^-8 M; более предпочтительно не более чем приблизительно 1×10^-9 M; и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 1×10^-10 M.

Антитела и их фрагменты, которые можно использовать в настоящих композициях и способах, являются биологически активными антителами и фрагментами. Как применяют в настоящем документе, термин «биологически активный» относится к антителу или фрагменту антитела, которые способны связывать желаемые антигенные эпитопы и проявлять биологический эффект непосредственно или опосредованно. Типично, эти эффекты возникают в результате неспособности TSLP связываться со своим рецептором. В одном из вариантов осуществления антитело и его фрагменты, которые можно использовать в настоящих композициях и способах, ингибируют: индуцируемую hTSLP пролиферацию клеточной линии Baf-3, трансфицированной hTSLP-рецептором и IL-7Rα; индуцируемую hTSLP экспрессию люциферазы клеточной линией Baf-3, трансфицированной TSLP-рецептором и люциферазной репортерной системой; индуцируемую hTSLP секрецию TARC первичными моноцитами человека, изолированными из PBMC; и индукцию дифференциации Th2.

Как применяют в настоящем документе, термин «специфическое» относится к избирательному связыванию антитела с эпитопом антигена-мишени. Антитела можно тестировать на специфичность связывания посредством сравнения связывания с TSLP со связыванием с неподходящим антигеном или смесью антигенов при заданной совокупности условий. Если антитело связывается с TSLP по меньшей мере в 10 и предпочтительно в 20 или в 50 раз более сильно, чем с неподходящим антигеном или смесью антигенов, тогда его считают специфичным. Антитело, которое «специфически связывается» с TSLP, не связывается с белками, которые не содержат полученные из TSLP последовательности, т.е. «специфичность», как применяют в настоящем документе, относится к специфичности к TSLP и не к какой-либо другой последовательности, которая может присутствовать в рассматриваемом белке. Например, как применяют в настоящем документе, антитело, которое «специфически связывается» с TSLP, типично должно связываться с FLAG-h TSLP, который представляет собой слитный белок, содержащий TSLP и пептидную метку FLAG®, но не должно связываться с пептидной меткой FLAG® отдельно или когда она слита с белком, отличным от TSLP.

VI. Фармацевтические композиции

Для получения фармацевтических или стерильных композиций, антитело или его фрагмент смешивают с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом, см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences и U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984). Составы терапевтических и диагностических средств можно получать посредством смешивания с физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами в форме, например, лиофилизированных порошков, суспензий, водных растворов или суспензий (см., например, Hardman, et al. (2001) Goodman and Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeuticals, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY).

Токсичность и терапевтическая эффективность композиций антител, вводимых отдельно или в сочетании с иммуносупрессорным средством, можно определить посредством стандартных фармацевтических процедур в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, для определения LD₅₀ (летальной дозы для 50% популяции) и ED₅₀ (терапевтически эффективной дозы у 50% популяции). Отношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс и его можно выразить в виде отношения между LD₅₀ и ED₅₀. Антитела, обладающие высокими терапевтическими индексами, являются предпочтительными. Данные, полученные из анализов клеточных культур и исследований на животных, можно использовать при составлении диапазона доз для применения у человека. Доза таких соединений предпочтительно лежит внутри диапазона циркулирующих концентраций, который содержит ED₅₀ с небольшой или нулевой токсичностью. Доза может варьировать внутри этого диапазона в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения.

Подходящие пути введения включают парентеральное введение, такое как внутримышечное, внутривенное или подкожное введение. Введение антитела, используемого в фармацевтической композиции или для практического осуществления способа по настоящему изобретению, можно осуществлять различными стандартными путями, такими как пероральный прием внутрь, ингаляция, местное нанесение или кожная, подкожная, интраперитонеальная, парентеральная, внутриартериальная или внутривенная инъекция. В одном из вариантов осуществления связывающее соединение по изобретению вводят внутривенно. В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению вводят подкожно.

Попеременно можно вводить антитело местно вместо системного введения, например, путем инъекции антитела непосредственно в сустав, пораженный артритом, или вызванное патогеном повреждение, характеризующееся иммунопатологией, часто в депо-составе или составе с замедленным высвобождением. Кроме того, можно вводить антитело в направленной системе доставки лекарственного средства, например, в липосоме, покрытой тканеспецифическим антителом, нацеленным, например, на сустав, пораженный артритом, или вызванное патогеном повреждение, характеризующееся иммунопатологией. Липосомы будут нацелены на пораженную ткань и будут избирательно захватываться ею.

Выбор режима введения терапевтического средства зависит от нескольких факторов, включая скорость оборота объекта в сыворотке или ткани, уровень симптомов, иммуногенность объекта и доступность клеток-мишеней в биологической среде. Предпочтительно, режим введения максимизирует количество терапевтического средства, доставляемого пациенту, в соответствии с приемлемым уровнем побочных эффектов. Соответственно, доставленное количество биологического средства частично зависит от конкретного объекта и тяжести состояния, подлежащего лечению. Доступно руководство по выбору подходящих доз антител, цитокинов и низкомолекулярных соединений (см., например, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Disorders, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky, et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602).

Определение подходящей дозы осуществляет клиницист, например, используя параметры или факторы, известные или предполагаемые в данной области для воздействия на лечение или предсказанные для воздействия на лечение. В целом, доза начинается с количества, которое несколько ниже, чем оптимальная доза, и впоследствии ее повышают небольшими шагами, пока не будет достигнут желаемый или оптимальный эффект по отношению к каким-либо негативным побочным эффектам. Важные диагностические критерии включают таковые симптомы, например, воспаления, или уровень продуцируемых воспалительных цитокинов. Предпочтительно, биологическое средство, которое следует использовать, получают от тех же видов, что и животное, которое планируют лечить, тем самым минимизируя воспалительный, аутоиммунный или пролиферативный ответ на реактив.

Антитела, фрагменты антител и цитокины можно предоставлять посредством непрерывной инфузии или посредством доз с интервалами, например, одни сутки, одна неделя или 1-7 раз в неделю. Дозы можно предоставлять внутривенно, подкожно, местно, перорально, назально, ректально, внутримышечно, интрацеребрально, интраспинально или посредством ингаляции. Предпочтительным протокол дозирования является тот, в котором используют максимальную дозу или частоту доз, которая избегает значимых нежелательных побочных эффектов. Общая недельная доза, как правило, составляет по меньшей мере 0,05 мкг/кг массы тела, более обычно по меньшей мере 0,2 мкг/кг, наиболее обычно по меньшей мере 0,5 мкг/кг, типично по меньшей мере 1 мкг/кг, более типично по меньшей мере 10 мкг/кг, наиболее типично по меньшей мере 100 мкг/кг, предпочтительно по меньшей мере 0,2 мг/кг, более предпочтительно по меньшей мере 1,0 мг/кг, наиболее предпочтительно по меньшей мере 2,0 мг/кг, оптимально по меньшей мере 10 мг/кг, более оптимально по меньшей мере 25 мг/кг и наиболее оптимально по меньшей мере 50 мг/кг (см., например, Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144). Желаемая доза низкомолекулярного терапевтического средства, например, пептидомиметика, естественного продукта или органического химического вещества составляет приблизительно столько же, сколько для антитела или полипептида, в пересчете на моль/кг.

Как применяют в настоящем документе, «ингибировать» или «лечить» или «лечение» включает отсрочивание развития симптомов, ассоциированных с аутоиммунным заболеванием или индуцированной патогеном иммунопатологией, и/или снижение тяжести таких симптомов, которые будут или предположительно будут развиваться. Кроме того, термины включают улучшение существующих неконтролируемых или нежелательных аутоиммунных или индуцированных патогеном симптомов иммунопатологии, предотвращение дополнительных симптомов и улучшение или предотвращение первопричин таких симптомов. Таким образом, термины указывают на то, что позвоночный субъект с воспалительным заболеванием получил полезный результат.

Как применяют в настоящем документе, термин «терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» относится к количеству антитела против TSLP или его фрагмента, которое при введении отдельно или в сочетании с дополнительным терапевтическим средством в клетку, ткань или субъекту эффективно предотвращает или улучшает аутоиммунное заболевание или заболевание или состояние, ассоциированное с индуцированной патогеном иммунопатологией, или развитие заболевания. Терапевтически эффективная доза дополнительно относится к тому количеству соединения, которое достаточно для того, чтобы привести к улучшению симптомов, например, лечению, излечению, предотвращению или улучшению соответствующего медицинского состояния или увеличению скорости лечения, излечения, предотвращения или улучшения таких состояний. Когда применяют к отдельному активному ингредиенту, вводимому отдельно, терапевтически эффективная доза относится отдельно к этому ингредиенту. Когда применяют к комбинации, терапевтически эффективная доза относится к комбинированным количествам активных ингредиентов, приводящих к терапевтическому эффекту, вводят ли их в комбинации, последовательно или одновременно. Эффективное количество терапевтического средства должно снижать симптомы типично по меньшей мере на 10%; обыкновенно по меньшей мере на 20%; предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%; более предпочтительно по меньшей мере на 40% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 50%.

Способы совместного введения или лечения антителом против TSLP или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению и второго терапевтического средства, например, цитокина, стероида, химиотерапевтического средства, антибиотика или излучения (или любого такого средства, рассмотренного в настоящем документе) образуют часть настоящего изобретения, в целом см., например, Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeuticals, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeuticals for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy и Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA. Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты и их фармацевтические композиции по изобретению также могут содержать другие иммуносупрессорные или иммуномодулирующие средства. Можно использовать любое подходящее иммуносупрессорнее средство, включая в качестве неограничивающих примеров противовоспалительные средства, кортикостероиды, циклоспорин, такролимус (т.е., FK-506), сиролимус, интерфероны, растворимые рецепторы цитокинов (например, sTNRF и sIL-1R), средства, нейтрализующие активность цитокинов (например, инфликсмаб, адалимумаб, голимумаб, этанерцепт), микофенолат мофетил, 15-дезоксиспергуалин, талидомид, глатирамер, азатиоприн, лефлуномид, циклофосфамид, метотрексат и т.п. Нестероидные противовоспалительные лекарственные средства также можно предоставлять с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или его фармацевтической композицией по настоящему изобретению. Фармацевтическую композицию также можно использовать с другими терапевтическими модальностями, такими как фототерапия и излучение. Объем настоящего изобретения включает композиции, содержащие любое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению и любое второе терапевтическое средство (например, как рассмотрено в настоящем документе, например, где антитело или фрагмент формулируют раздельно из второго терапевтического средства или где их формулируют вместе).

Типичные ветеринарные, экспериментальные или исследуемые субъекты включают обезьян, собак, кошек, крыс, мышей, кроликов, морских свинок, лошадей и человека.

VII. Получение антител

Для рекомбинантного получения антител по настоящему изобретению нуклеиновые кислоты, кодирующие две цепи, выделяют и встраивают в один или несколько реплицируемых векторов для дальнейшего клонирования (амплификация ДНК) или для экспрессии. ДНК, кодирующую моноклональное антитело, легко выделяют и секвенируют с применением стандартных процедур (например, посредством применения олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфически с генами, кодирующим тяжелые и легкие цепи антител). Доступно множество векторов. Компоненты векторов, как правило, включают в качестве неограничивающих примеров, одно или несколько из следующего: сигнальная последовательность, участок начала репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции. В одном из вариантов осуществления как легкую, так и тяжелую цепи гуманизированного антитела против TSLP по настоящему изобретению экспрессируют с одного и того же вектора, например, с плазмиды или аденовирусного вектора.

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению можно получать любым известным в данной области способом. В одном из вариантов осуществления антитела экспрессируют в клетках млекопитающих или насекомых в культуре, таких как клетки яичника китайского хомяка (CHO), клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293, клетки миеломы мыши NSO, клетки почки детеныша хомяка (BHK), клетки яичника Spodoptera frugiperda (Sf9). В одном из вариантов осуществления изобретения антитела и их антигенсвязывающие фрагменты получают в клетках грибов, таких как клетки Pichia, клетки Pichia pastoris, клетки Pichia flnlandica, клетки Pichia trehalophila, клетки Pichia koclamae, клетки Pichia membranaefaciens, клетки Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), клетки Pichia opuntiae, клетки Pichia thermotolerans, клетки Pichia salictaria, клетки Pichia guercuum, клетки Pichia pijperi, клетки Pichia stiptis, клетки Pichia methanolica, клетки Saccharomyces cerevisiae, клетки Saccharomyces, клетки Hansβnula polymorpha, клетки Kluyveromyces, клетки Kluyveromyces lactis, клетки Candida albicans, клетки Aspergillus nidulans, клетки Aspergillus niger, клетки Aspergillus oryzae, клетки Trichoderma reesei, клетки Chrysosporium lucknowense, клетки Fusaηum gramineum, клетки Fusarium gramineum, клетки Fusarium venenatum или клетки Neuraspora crassa.

В одном из вариантов осуществления антитела, секретируемые клетками CHO, извлекают и очищают стандартными хроматографическими способами, такими как хроматография с белком A, катионообменная хроматография, анионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и гидроксиапатитная хроматография. Получаемые антитела концентрируют и хранят в 20 мМ ацетате натрия, pH 5,5.

В другом варианте осуществления антитела по настоящему изобретению получают в дрожжах в соответствии со способами, описанными в WO 2005/040395. В кратком изложении, векторы, кодирующие отдельные легкие или тяжелые цепи антитела, представляющего интерес, вводят в различные гаплоидные клетки дрожжей, например, в дрожжи Pichia pastoris с различными типами спаривания, эти гаплоидные клетки дрожжей необязательно представляют собой комплементарные ауксотрофы. Затем трансформированные гаплоидные клетки дрожжей можно спаривать или сливать для того, чтобы получить диплоидную клетку дрожжей, способную продуцировать как тяжелые, так и легкие цепи. Тогда диплоидный штамм способен секретировать полностью собранное и биологически активное антитело. Относительные уровни экспрессии двух цепей можно оптимизировать, например, используя векторы с различным числом копий, используя транскрипционные промоторы с различными интенсивностями или индуцируя экспрессию с индуцибельных промоторов, управляющих транскрипцией генов, кодирующих одну или обе цепи.

В одном из вариантов осуществления соответствующие тяжелые и легкие цепи антитела против TSLP вводят в гаплоидные клетки дрожжей для того, чтобы создать библиотеку гаплоидных штаммов дрожжей с одним типом спаривания, которые экспрессируют множество легких цепей, и библиотеку гаплоидных штаммов дрожжей с другим типом спаривания, которые экспрессируют множество тяжелых цепей. Эти библиотеки гаплоидных штаммов можно скрещивать (или сливать в виде сферопластов), чтобы получить ряд диплоидных клеток дрожжей, экспрессирующих комбинаторную библиотеку антител, состоящих из различных возможных комбинаций легких и тяжелых цепей. Затем можно осуществлять скрининг комбинаторной библиотеки антител для того, чтобы определить, имеет ли любое из антител свойства, которые превосходят (например, более высокая аффинность к TSLP) таковые исходных антител. См., например, WO 2005/040395.

В другом варианте осуществления антитела по настоящему изобретению представляют собой доменные антитела человека, в которых части вариабельного домена антитела соединены в полипептид с молекулярной массой приблизительно 13 кДа. См., например, публикацию патента США № 2004/0110941. Такие однодоменные низкомолекулярные средства обеспечивают множество преимуществ в отношении простоты синтеза, стабильности и пути введения.

VIII. Применение

Настоящее изобретение относится к способам применения сконструированных средств против TSLP для лечения и диагностики воспалительных нарушений (например, у млекопитающих, таких как человек).

В предпочтительном варианте осуществления воспалительное нарушение представляет собой астму.

В другом предпочтительном варианте осуществления воспалительное нарушение представляет собой аллергическое воспалительное нарушение. В предпочтительном варианте осуществления аллергическое воспалительное нарушение представляет собой аллергический риносинусит, аллергическую астму, аллергический конъюнктивит или атопический дерматит.

Настоящее изобретение относится к способам применения сконструированного средства против TSLP для лечения и диагностики фиброза, воспалительного заболевания кишечника, лимфомы Ходжкина, респираторной вирусной инфекции или других вирусных инфекций, ревматоидного артрита или любого другого нарушения, характеризующегося воспалением в месте воспаления.

Пределы объема данного изобретения лучше всего понять с помощью ссылки на следующие примеры, которые не предназначены для ограничения изобретения конкретными вариантами осуществления.

Все ссылки в настоящем документе включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы конкретно и отдельно указали, что каждая отдельная публикация или патентная заявка включена посредством ссылки.

Многие модификации и вариации данного изобретения можно выполнять, не отступая от сущности и объема, как будет ясно специалистам в данной области. Конкретные варианты осуществления, описанные в настоящем документе, предложены только в качестве примера, а изобретение ограничено положениями приложенной формулы изобретения наряду с полным объемом эквивалентов, на которые дает право такая формула изобретения; и изобретение не должно быть ограничено конкретными вариантами осуществления, которые представлены в настоящем документе в качестве примера.

Пример 1

Основные способы

Описаны стандартные способы в молекулярной биологии (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Стандартные способы также присутствуют в Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, где описаны клонирование в бактериальных клетках и мутагенез ДНК (Vol. 1), клонирование в клетках млекопитающих и дрожжей (Vol. 2), гликоконъюгаты и экспрессия белков (Vol. 3) и биоинформатика (Vol. 4).

Описаны способы очистки белков, включая иммунопреципитацию, хроматографию, электрофорез, центрифугирование и кристаллизацию, (Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). Описан химический анализ, химические модификации, посттрансляционные модификации, получение слитных белков, гликозилирование белков (см., например, Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16,0,5-16,22,17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391). Описано получение, очистка и фрагментация поликлональных и моноклональных антител (Coligan et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, выше). Доступны стандартные способы определения характеристик взаимодействий лиганд/рецептор (см., например, Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York).

Описаны одноцепочечные антитела и диатела (см., например, Malecki et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson and Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231:177-189; и патент США № 4946778). Предусмотрены бифункциональные антитела (см., например, Mack, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel, et al. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal, et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan, et al. (1985) Science 229:81-83; Raso, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker, et al. (1991) EMBO J. 10:3655-3659; и патенты США №№ 5932448, 5532210 и 6129914).

Также предусмотрены биспецифические антитела (см., например, Azzoni et al. (1998) J. Immunol. 161:3493; Kita et al. (1999) J. Immunol. 162:6901; Merchant et al. (2000) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng et al. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst et al. (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875).

Можно создавать конъюгаты антител, например, с малыми лекарственными молекулами, ферментами, липосомами, полиэтиленгликолем (PEG). Антитела можно использовать для терапевтических, диагностических целей, наборов или других целей и они включают антитела, соединенные, например, с красителями, радиоизотопами, ферментами или металлами, например, коллоидным золотом (см., например, Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing и Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889).

Доступны способы проточной цитометрии, включая сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS) (см., например, Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Доступны флуоресцентные реактивы, подходящие для модификации нуклеиновых кислот, включая праймеры и зонды из нуклеиновых кислот, полипептиды и антитела, для применения, например, в качестве диагностических реактивов (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

Описаны стандартные способы гистологии иммунной системы (см., например, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY).

Доступны программные пакеты и базы данных для определения, например, антигенных фрагментов, лидерных последовательностей, укладки белка, функциональных доменов, участков гликозилирования и выравнивания последовательностей (см., например, GenBank, Vector NTJ® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).

Пример 2

Оптимизация последовательности антитела против TSLP, чтобы избежать проблем дезамидирования

Гуманизированное антитело, которое связывается с TSLP человека и яванского макака, раскрыто в международной публикации патента WO 2008/076321. После дополнительного анализа этой последовательности автор настоящего изобретения установил, что CDR-H2 этого антитела содержит два остатка аспарагина (N) в положениях 61 и 63 в SEQ ID NO: 4 из WO 2008/076321, которые вероятно могут дезамидироваться и тем самым нарушить структуру антитела, вероятно вызывая тяжелые непредусмотренные проблемы, влияющие на безопасность и/или эффективность антитела. Во избежание этих проблем авторы настоящего изобретения создали усовершенствованное антитело, которое избегает этих проблем дезамидирования, при этом сохранив аффинность к TSLP человека и яванского макака и избежав дополнительных проблем, относящихся к иммуногенности. Это усовершенствованное антитело содержит аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи SEQ ID NO: 7. CDR-H2 этой аминокислотной последовательности соответствует SEQ ID NO: 2.

На фиг.1 предоставлено выравнивание SEQ ID NO: 11 из настоящей заявки против SEQ ID NO: 14 из WO 2008/076321 (т.е., выравнивание тяжелых цепей антитела, заявленного в настоящем документе, и антитела, раскрытого в WO 2008/076321. На фиг. 1, «Последовательность 1» соответствует SEQ ID NO: 11 из настоящей заявки и «Последовательность 2» соответствует SEQ ID NO: 14 из WO 2008/076321. В антителе, заявленном в настоящем документе, аспарагин (N) в положении в положении 61 SEQ ID NO: 14 из WO 2008/076321 изменяли на аланин (А) и аспарагин в положении 63 SEQ ID NO: 14 изменяли на лизин (К). Эти изменения выполняли для того, чтобы избежать возможного дезамидирования этих остатков. Дополнительно лизин (К) в положении 65 SEQ ID NO: 14 из WO 2008/076321 изменяли на глутамин (Q). Это изменение выполняли для того, чтобы снизить шанс создания иммуногенности. Дополнительное изменение выполняли в положении 72 SEQ ID NO: 14 из WO 2008/076321, где треонин (Т) изменяли на аланин (А). Это изменение выполняли для того, чтобы улучшить аффинность связывания антитела.

К удивлению обнаружено, что изменения в CDR-H2, по существу, не влияют на аффинность связывания получаемого антитела.

Вектор, содержащий гены, кодирующие тяжелую и легкую цепь антитела, описанные в настоящем документе, депонирован в АТСС, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, 17 ноября 2009 года и получил номер депозита АТСС РТА-10482. Этот депозит создан согласно условиям, предусмотренным Будапештским соглашением. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие легкую и тяжелю цепи (включая сигнальные пептиды), находятся в одной плазмиде и оба гена экспрессируют с промотора цитомегаловируса человека (CMV). Плазмида также содержит ген устойчивости к ампициллину для отбора в клетках млекопитающих и ген DHFR для амплификации гена.

Пример 3

Определение равновесной константы диссоциации (K _D ) для гуманизированного средства против TSLP человека с применением технологии KinExA

Равновесную константу диссоциации (K_D) определяли с использованием прибора KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc., www.sapidyne.com). В KinExA использован принцип способа кинетического эксклюзионного анализа на основе измерения концентрации антитела, не образующего комплекс, в смеси антитела, антигена и комплекса антитело-антиген. Концентрацию свободного антитела измеряют посредством воздействия на смесь антигеном, иммобилизованном на твердой фазе, в течение очень короткого периода времени. На практике это осуществляют посредством протекания растворенной фазы смеси антиген-антитело через покрытые антигеном частицы, заключенные в проточную кювету. Данные, генерируемые прибором, анализировали с использованием посредством специального программного обеспечения. Константы равновесия вычисляли с использованием математической теории, основываясь на следующих допущениях:

1. Связывание подчиняется уравнению обратимого связывания для равновесия:

k_on[Ab] [Ag] = k_off[AbAg]

2. Антитело и антиген связываются 1:1 и общее антитело равно сумме комплекса антиген-антитело и свободного антитела.

3. Сигнал прибора линейно зависит от концентрации свободного антитела.

Вещества

Антитела:

- Антитело 1: Родительское антитело крысы 23B12

- Антитело 2: Гуманизированное mAb 23B12 против hu TSLP (содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 14 и легкую цепь SEQ ID NO: 16 из WO 2008/076321)

- Антитело 3: Гуманизированное mAb 23B12 против hu TSLP (содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 14 с мутацией в положении 72 с T на A и легкую цепь SEQ ID NO: 16 из WO 2008/076321

- Антитело 4: Гуманизированное mAb 23B12 против hu TSLP (содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 11 и легкую цепь SEQ ID NO: 12 из настоящей заявки)

Антигены:

- Рекомбинантный TSLP человека

Биотинилированные антигены:

- Биотинилированный TSLP человека

Другие реактивы:

- Частицы PMMA, 98 мкм (Sapidyne, № по каталогу 440198)

- Нейтравидин (Pierce, № по каталогу 31000)

- Cy5-конъюгированное антитело козы против IgG крысы (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories № по каталогу 112-175-167, партия 60306)

- Cy5-конъюгированное антитело козы против HuIgG (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories № по каталогу 109-175-088, партия 49069 и партия 58552)

Условия эксперимента:

Частицы PMMA покрывали биотинилированным TSLP человека в соответствии с «Protocol for coating PMMA particles with biotinylated ligands having short or nonexistent linker arms» Sapidyne. Все экспериментальные процедуры выполняли в соответствии с руководством к KinExA 3000. Все эксперименты выполняли дважды.

Использовали следующие условия:

Объем образца: 2 мл

Скорость потока образца: 0,25 мл/мин

Объем метки: 1 мл

Скорость потока метки: 0,25 мл/мин

Концентрация антитела: 0,1 нМ

Самая высокая концентрация антигена: 10 нМ

Самая низкая концентрация антиген: 10 пМ

Получали двукратные серийные разведения антигена и смешивали их с антителом при постоянной концентрации. Смесь инкубировали в течение 2 часов при 25°C для достижения равновесия.

Таблица 3 Значения K_D, которые определили с помощью KinExa
mAb	TSLP	Экспрессия	KD (пМ)
Антитело 1	человек	HEK293	1,1
Антитело 2	человек	HEK293	7,7
Антитело 3	человек	HEK293	1,6
Антитело 4	человек	HEK293	3,2

Пример 4

Аффинность антител к TSLP человека и яванского макака

Активности кинетического связывания родительского антитела крысы и различных гуманизированных производных антител к TSLP человека против TSLP как человека (hu), так и яванского макака (cyno), измеряли посредством поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы BIAcore T100 (BIAcore AB, Upsalla, Sweden). Приблизительно 100 RU TSLP человека или TSLP яванского макака иммобилизовали с помощью реакции связывания аминов на сенсорном чипе CM5 (марки для исследований, BR-1006-68). Буфер HBS-EP (BR-1006-69) использовали в качестве подвижного буфера со скоростью потока 30 мкл/мин. Крысиные и гуманизированные 23B12 антитела при различных концентрациях в диапазоне от 0,82 до 600 нМ инъецировали на поверхности с иммобилизованными TSLP hu или яванского макака со скоростью потока 30 мкл/мин. После каждого цикла инъекций поверхность чипа CM5 восстанавливали с применением ряда растворов (10 мМ глицин pH 1,5 и 25 мМ NaOH соответственно) при скорости потока 75 мкл/мин.

Сенсограммы связывания с вычитанием фона использовали для анализа константы скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd) и равновесной константы диссоциации K_D. Получаемые наборы данных согласовывались с моделью бивалентного анализируемого вещества с использованием программного обеспечения BIAevaluation (версии 1.0). K_D, которые определяли для различных антител, приведены в таблице 4. Результаты отдельных экспериментов приведены в отдельных строках.

Таблица 4 Анализ BIAcore
TSLP	K_D (пМ)
TSLP	Антитело 1	Антитело 2	Антитело 3	Антитело 4
Человек	141	Не определено	Не определено	172

Человек	130	150	128	Не определено
Человек	Не определено	Не определено	Не определено	155, 142, 339, 170, 153
Человек*	Не определено	Не определено	Не определено	339
Человек, *	Не определено	Не определено	Не определено	299
Цино	159	Не определено	Не определено	138, 80, 115
Цино	Не определено	Не определено	Не определено	127
Цино**	Не определено	Не определено	Не определено	381
* В этом конкретном эксперименте использовали TSLP, приобретенный в R&D и экспрессированный в E. coli. Другие эксперименты проводили с TSLP, экспрессированным в клетках HEK293. ** Эти эксперименты проводили при 37°C. Все остальные эксперименты проводили при комнатной температуре. Антитело 1: Родительское антитело крысы 23B12 Антитело 2: Гуманизированное mAb 23B12 против hu TSLP (содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 14 и легкую цепь SEQ ID NO: 16 из WO 2008/076321) Антитело 3: Гуманизированное mAb 23B12 против hu TSLP (содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 14 с мутацией в положении 72 с T на A; и легкую цепь SEQ ID NO: 16 из WO 2008/076321) Антитело 4: Гуманизированное mAb 23B12 против hu TSLP (содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 11 и легкую цепь SEQ ID NO: 12 из настоящей заявки)

Пример 5

Биологический анализ пролиферации для оценки нейтрализующего антитела против TSLP

Способность различных антител против TSLP к биологической нейтрализации TSLP человека и яванского макака оценивали посредством применения биологических анализов кратковременной пролиферации, в которых используют клетки, которые экспрессируют рекомбинантные рецепторы TSLP человека и яванского макака. Клетки трансфектанта Ba/F3-TSLPR-IL7Ra пролиферируют в ответ на TSLP и ответ можно ингибировать посредством нейтрализующих антител против TSLP. Каждое антитело титровали против концентрации TSLP, выбранной внутри линейной области кривой доза TSLP-ответ, близко с плато и выше TSLP EC₅₀. Пролиферацию или ее отсутствие измеряют с помощью колориметрического средства с применением Alamar Blue, красителя-индикатора роста, основываясь на обнаружении метаболической активности. Способность антитела нейтрализовать TSLP оценивали с помощью его значения EC₅₀ или концентрации антитела, которая вызывает полумаксимальное ингибирование TSLP пролиферации.

Трансфектанты Ba/F3 поддерживали в среде RPMI-1640, 10% фетальная телячья сыворотка, 50 мкМ 2-меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамин, 50 мкг/мл пенициллин-стрептомицин и 10 нг/мл IL-3 мыши.

Биологические анализы пролиферации Ba/F3 осуществляли в среде RPMI-1640, 10% фетальная телячья сыворотка, 50 мкМ 2-меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамин и 50 мкг/мл пенициллин-стрептомицин.

Анализ осуществляли в 96-луночных плоскодонных планшетах (Falcon 3072 или подобный). Во всех препаратах реактивов и клеточных суспензий использовали подходящую среду для биологического анализа. Объем анализа составляет 150 мкл на лунку. Титрации антитела против TSLP предварительно инкубировали с TSLP в течение 30-60 минут при комнатной температуре, а в это время получали клетки. Клетки добавляли в планшеты после предварительного инкубирования антитела-цитокина. Планшеты с биологическим анализом инкубировали в увлажненной камере для тканевой культуры (37°C, 5% CO₂) в течение 40-48 часов. В конце времени культивирования, Alamar Blue (Biosource № по каталогу DAL1100) добавляли и позволяли развиваться в течение 8-12 часов. Затем считывали поглощение при 570 нм и 600 нм (считыватель микропланшетов VERSAmax, Molecular Probes) и получали OD_570-600. Рекомендовано повторение два или три раза.

Клетки использовали в состоянии здорового роста, как правило, при плотностях 3-8×10⁵/мл. Клетки считали, осаждали, дважды промывали в среде для биологического анализа и суспендировали до плотности, подходящей для посева.

Получали TSLP с рабочей концентрацией и добавляли 75 мкл в первую лунку. Серийные разведения 1:3 выполняли посредством титрования 25:50 мкл в среде для биологического анализа по всем лункам, оставляя 50 мкл/лунка. Клетки суспендировали до подходящей плотности для посева по 100 мкл на лунку.

Получали антитело в рабочей концентрацией и 75 мкл добавляли в первую лунку. Серийные разведения 1:3 выполняли посредством титрования 25:50 мкл в среде для биологического анализа по всем лункам, оставляя 50 мкл на лунку. TSLP с подходящей концентрацией добавляли по 50 мкл на лунку в лунки, содержащие титрованное антитело. Клетки суспендировали до подходящей плотности для посева по 50 мкл на лунку и добавляли после предварительного инкубирования антитела-цитокина.

Используя программное обеспечение GraphPad Prism 3.0, строили график зависимости поглощения от концентрации цитокина или антитела и определяли значения EC₅₀, используя нелинейную регрессию (подбор кривой) сигмовидной дозы-ответа.

Результаты анализа приведены в таблице 5. Результаты отдельных экспериментов приведены в отдельных строках.

Таблица 5 Ингибирование пролиферации
TSLP	EC₅₀ (мкг/мл)
TSLP	Антитело 1	Антитело 2	Антитело 3	Антитело 4
Человек	0,022	Не определено	Не определено	0,041
Человек	0,025	0,092	0,054	Не определено
Человек	0,014	Не определено	Не определено	0,024
Человек*	0,083	Не определено	Не определено	0,215, 0,137
Цино	0,064	Не определено	Не определено	0,117, 0,077
Цино	0,122	Не определено	Не определено	0,158
Цино**	0,054	Не определено	Не определено	0,067
* В этом конкретном эксперименте использовали TSLP, приобретенный в R&D и экспрессированный в E. coli. Другие эксперименты проводили с TSLP, экспрессированным в клетках HEK293. Антитело 1: Родительское антитело крысы 23B12 Антитело 2: Гуманизированное mAb 23B12 против hu TSLP (содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 14 и легкую цепь SEQ ID NO: 16 из WO 2008/076321) Антитело 3: Гуманизированное mAb 23B12 против hu TSLP (содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 14 с мутацией в положении 72 с T на A; и легкую цепь SEQ ID NO: 16 из WO 2008/076321) Антитело 4: Гуманизированное mAb 23B12 против hu TSLP (содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 11 и легкую цепь SEQ ID NO: 12 из настоящей заявки)

Сводка результатов, представленных в таблице 5, включающая средние значения и SD (стандартное отклонение), предоставлена в таблице 6. (Только значения, полученные с применением TSLP, экспрессированного в клетках HEK293, использовали для вычисления значений, предоставленных в таблице 6)

Таблица 6
	Биологический анализ (пМ) Трансфектант Ba/F3
	HTSLP (SD)	cTSLP (SD)
Антитело 1	120 (37)	528 (242)
Антитело 4	214 (80)	691 (274)

Пример 6

Нейтрализующая активность средства против TSLP, проявляемая на индуцированной TSLP продукции TARC первичными дендритными клетками человека

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли из лейкоцитарной пленки, полученной от здоровых доноров крови (Stanford Medical School Blood Center, Stanford, CA) посредством центрифугирования с фиколлом, и CD11c+ дендритные клетки получали с помощью MACS (Miltenyi Biotech, Auburn, CA), используя негативный отбор с последующей сортировкой клеток с применением FACS. Клетки негативной линии дифференцировки (Lin^-) получали посредством MACS-элиминации T-клеток, B клеток, NK клеток, красных клеток крови и моноцитов из PBMC с применением mAb мыши против CD3 человека (OKT3, DNAX) и mAb мыши против CD16 и магнитных бус, покрытых антителами козы против IgG мыши (Miltenyi Biotech), и с применением магнитных бус, непосредственно покрытых mAb против CD19, CD56 и CD14 (Miltenyi Biotech). Впоследствии Lin^- клетки окрашивали с применением TC против CD4 (Caltag, Burlingame, CA), PE против C11c и FITC против CD3, CD14, CD19, CD56, CD16 и CD20 (все из BD Biosciences, San Diego, CA) и CD11c+ DC сортировали на Vantage FACsorter™ (BD Biosciences) до чистоты > 99% CD11c+ CD4+ Lin^- клеток.

CD11c+ CD4+ DC культивировали непосредственно после сортировки в RPMI (Mediatech, Herndon, VA), содержащей 10% FCS и 1% пирувата (Mediatech), HEPES (Invitrogen, Grand Island, NY) и пенициллин-стрептомицин (Mediatech). Клетки высевали при 0,5×10⁶/мл в плоскодонные 96-луночные планшеты в присутствии только среды, TSLP (15 нг/мл, DNAX), или комбинации TSLP и нейтрализующего mAb против TSLP (клон 23B12) или моноклонального антитела против TSLPR или IgG2a крысы для изотипического контроля (R&D Systems, Minneapolis, MN). Супернатанты культуры DC собирали после 24 часов культивирования, хранили замороженными при -20°C и анализировали уровни белка TARC с помощью ELISA (R&D Systems).

Результаты суммированы в таблице 7. Результаты отдельных экспериментов приведены в отдельных строках.

Таблица 7
TSLP	EC₅₀ (мкг/мл)
TSLP	Антитело 1	Антитело 4
Человек	0,12	0,16
Человек	0,0069	0,0077
Человек	0,031	0,060
Человек (R&D)*	0,050	0,102, 0,126
Человек (R&D)*	0,113	0,067, 0,173
Человек (R&D)*	0,228	0,424
Человек (R&D)*	0,404	0,164
* В этих экспериментах использовали TSLP, приобретенные в R&D и экспрессированные в E. coli. Другие эксперименты проводили с применением TSLP, экспрессированного в клетках HEK293. Антитело 1: Родительское антитело 23B12 крысы Антитело 4: Гуманизированное mAb 23B12 против hu TSLP (содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 11 и легкую цепь SEQ ID NO: 12 из настоящей заявки)

Сводка результатов, представленных в таблице 7, включая средние значения и SD (стандартное отклонение), предоставлена в таблице 8.

Таблица 8
	Биологический анализ (пМ) Продукция TARC в DC человека
	hTSLP (SD)	hTSLP* (SD)
Антитело 1	345 (389)	1312 (1025)
Антитело 4	492 (502)	1161 (843)
* В этих экспериментах использовали TSLP, приобретенный в R&D и экспрессированный в E. coli. Другие эксперименты проводили с применением TSLP, экспрессированного в клетках HEK293.

Пример 7

Нейтрализующая активность антител против TSLP, проявляемая на индуцированной TSLP продукции MDC спленоцитами яванского макака

Полные суспензии спленоцитов получали из селезенки яванского макака посредством разрушения ткани и пропускания ее через сито 50 меш из ткани из нержавеющей стали (Bellco) с последующим пропусканием через 70 мкм нейлоновое сито для клеток (BD Falcon). Клеточные суспензии промывали в DPBS посредством центрифугирования и клеточные осадки ресуспендировали в предварительно нагретом до 37°C лизирующем буфере ACK (BioWhittaker) для того, чтобы лизировать красные клетки крови, и инкубировали в течение 5 минут при 37°C. Клетки разбавляли с применением DPBS, дважды промывали и ресуспендировали в культуральной среде.

Спленоциты культивировали в RPMI (Mediatech, Herndon, VA), содержащей 10% FCS и 1% пирувата (Mediatech), HEPES (Invitrogen, Grand Island, NY) и пенициллин-стрептомицин (Mediatech). Клетки высевали при 1,0×10⁶/мл в плоскодонные 96-луночные планшеты в присутствии только среды, TSLP (0,1 нг/мл) или комбинации TSLP и нейтрализующего mAb против TSLP (антитело 1 или антитело 4). Супернатанты культуры спленоцитов собирали после 120 часов культивирования, хранили замороженными при -20°C и анализировали уровни белка MDC с использованием Human MDC ELISA (R&D Systems).

Результаты суммированы в таблице 9. Результаты отдельных экспериментов приведены в отдельных строках.

Таблица 9
TSLP	IC₅₀ (мкг/мл)
TSLP	Антитело 1	Антитело 4
Цино	0,012	0,012
Цино	0,030	0,028, 0,008
Цино	0,018	0,054
Цино	0,033	0,023
Антитело 1: Родительское антитело 23B12 крысы Антитело 4: Гуманизированное mAb 23B12 против hu TSLP (содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 11 и легкую цепь SEQ ID NO: 12 из настоящей заявки)

Многие модификации и вариации данного изобретения можно выполнять, не отступая от его сущности и объема, как должно быть ясно специалистам в данной области. Конкретные варианты осуществления, описанные в настоящем документе, предложены только в качестве примера, и изобретение должно быть ограничено положениями приложенной формулы изобретения наряду с полным объемом эквивалентов, на которые дает право такая формула изобретения; и изобретение не должно быть ограничено конкретными вариантами осуществления, которые представлены в настоящем документе в качестве примера.

Цитирование приведенных выше публикаций или документов не предназначено в качестве признания того, что любое из предшествующего является относящимся к известному уровню техники, и также это не составляет какого-либо признания в отношении содержания или даты этих публикаций или документов. Патенты США и другие публикации, упомянутые в настоящем документе, таким образом, включены посредством ссылки.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящее изобретение относится к любому изолированному полипептиду или изолированной нуклеиновой кислоте, содержащей любые из следующих аминокислотных или нуклеотидных последовательностей, соответственно:

Claims

1. Антитело, которое специфически связывает TSLP человека, содержащее:
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: последовательность CDR-H1, содержащую SEQ ID NO:1, последовательность CDR-H2, содержащую SEQ ID NO:2, и последовательность CDR-H3, содержащую SEQ ID NO:3; и вариабельную область легкой цепи, содержащую:
последовательность CDR-L1, содержащую SEQ ID NO:4, последовательность CDR-L2, содержащую SEQ ID NO:5, и последовательность CDR-L3, содержащую SEQ ID NO:6.

2. Антитело по п. 1, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7.

3. Антитело по п. 1, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

4. Антитело по п. 1, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

5. Антитело по п. 1, которое содержит SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12.

6. Антитело по п. 1, которое можно экспрессировать из вектора, депонированного под номером депозита АТСС РТА-10482.

7. Антитело по любому из пп. 1-6, которое представляет собой гуманизированное антитело.

8. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из пп. 1-7.

9. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 8.

10. Клетка-хозяин для экспрессии антитела по любому из пп. 1-7, содержащая экспрессирующий вектор по п. 9.

11. Способ получения антитела по любому из пп. 1-7, включающий:
культивирование клетки-хозяина по п. 10 в культуральной среде в условиях, в которых происходит экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты, тем самым продуцируя полипептиды, содержащие вариабельные области легкой и тяжелой цепи; и
извлечение антитела из клетки-хозяина или среды для культивирования.

12. Способ супрессии иммунного ответа у субъекта-человека, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела по любому из пп. 1-7 в количестве, эффективном для блокирования биологической активности TSLP.

13. Композиция для лечения TSLP-ассоциированного нарушения, содержащая терапевтически эффективное количество антитела по любому из пп. 1-7 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

14. Применение антитела по любому из пп. 1-7 для получения лекарственного средства для супрессии иммунного ответа.

15. Экспрессирующий вектор, депонированный под номером депозита АТСС РТА-10482, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 8.

16. Клетка-хозяин для экспрессии антитела по любому из пп. 1-7, содержащая экспрессирующий вектор по п. 15.